Artykuł metodologiczny

Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58576

⸱

9 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Belgium, 2Department of Hematopoiesis, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, The Netherlands, 3Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, The Netherlands, 4Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Streszczenie

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującym stanem neurodegeneracyjnym, w którym zagregowane białka tau i amyloidu gromadzą się w mózgu, powodując dysfunkcję neuronów, co ostatecznie prowadzi do pogorszenia funkcji poznawczych. Uważa się, że hiperfosforylowane agregaty tau w neuronach powodują większość patologii związanych z chorobą Alzheimera. Zakłada się, że agregaty te są uwalniane do przedziału zewnątrzkomórkowego i pobierane przez sąsiednie zdrowe neurony, gdzie indukują dalszą agregację tau. To "podobne do prionów" rozprzestrzenianie się może zostać przerwane przez przeciwciała zdolne do wiązania i "neutralizowania" zewnątrzkomórkowych agregatów tau, jak wykazano w przedklinicznych mysich modelach AD. Jednym z proponowanych mechanizmów, za pomocą których przeciwciała terapeutyczne zmniejszają patologię, jest wychwyt i usuwanie patologicznych zagregowanych form tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej. W tym miejscu opisujemy ilościowy test komórkowy do oceny wychwytu tau przez mikroglej. Test ten wykorzystuje mysią linię komórek mikrogleju BV-2, pozwala na wysoką specyficzność, niską zmienność i średnią przepustowość. Dane uzyskane za pomocą tego testu mogą przyczynić się do lepszej charakterystyki funkcji efektorów przeciwciał anty-tau.

Wprowadzenie

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną charakteryzującą się zmianą konformacyjną i samoorganizacją peptydu amyloidu β i białka tau w patologiczne agregaty. Normalnie rozpuszczalny peptyd β amyloidu jest przekształcany w oligomeryczny i fibrylarny β amyloidowy, podczas gdy nieprawidłowo ufosforylowane tau gromadzi się w postaci oligomerów i splątków neurofibrylarnych1,2. Te agregaty białkowe powodują śmierć neuronów, co prowadzi do utraty pamięci, a następnie postępującego spadku funkcji poznawczych. Inne czynniki, w tym nieproduktywne zapalenie nerwów i zmniejszona zdolność do usuwania nieprawidłowo sfałdowanych białek, mogą zaostrzyć i przyspieszyć chorobę. Obecnie strategie interwencyjne przeciwko chorobie Alzheimera zapewniają w dużej mierze ulgę objawową, ale nie ma lekarstwa ani profilaktyki modyfikującej przebieg choroby.

Coraz więcej dowodów wskazuje na kluczową rolę hiperfosforylowanych agregatów tau w patologii AD. W stanie niepatologicznym tau jest natywnie rozwiniętym białkiem, które wiąże się z mikrotubulami i wspomaga ich składanie się w cytoszkielecie neuronalnym. Kiedy tau ulega hiperfosforylacji, odrywa się od cytoszkieletu i grupuje się w agregaty tau w neuronach, które, jak się uważa, powodują większość patologii związanych z AD3. Zagregowane tau zaczyna gromadzić się najpierw wewnątrzkomórkowo, ale wraz z postępem choroby zakłada się, że jest uwalniane z dotkniętych neuronów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, z której może być pobierane przez sąsiednie lub synaptycznie połączone zdrowe neurony w "sposób podobny do prionów". Po zinternalizowaniu, agregat tau indukuje dalszą agregację tau poprzez szablonową zmianę konformacyjną4.

Zgodnie z tą hipotezą, terapie zdolne do przerwania wysiewu tau mogą spowolnić lub odwrócić przebieg choroby neurodegeneracyjnej, w której pośredniczy tau. Na poparcie tego faktu, myszy podatne na tauopatię w wyniku mutacji genetycznej i pasywnie wstrzyknięte przeciwciała anty-tau wykazują zmniejszoną patologię tau i poprawę funkcji poznawczych5,6,7,8,9. Jednak mechanizmy, za pomocą których przeciwciała terapeutyczne zmniejszają patologię, nadal pozostają nieuchwytne.

Jednym z proponowanych mechanizmów jest wychwyt i usuwanie patologicznych zagregowanych form tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej, rezydujące w mózgu komórki odpornościowe. Ostatnie publikacje sugerują, że mikroglej może skutecznie internalizować i degradować patologiczne gatunki tau, a zdolność ta jest wzmacniana przez przeciwciała anty-tau poprzez mechanizm zależny od Fc, w którym receptory Fc ulegają ekspresji na powierzchni mikrogleju i fagocytoza za pośrednictwem receptora10,11. Dane te identyfikują mikroglej jako potencjalnie ważne efektory przeciwciał terapeutycznych.

Opisujemy tutaj test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej. Dane uzyskane za pomocą tego testu mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów działania przeciwciał anty-tau, stanowiąc tym samym użyteczne narzędzie do rozwoju przeciwciał anty-tau jako potencjalnego leczenia choroby Alzheimera.

Protokół

1. Hodowla komórek BV-2

UWAGA: Przechowuj komórki BV-2 pod zabezpieczeniem na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Linia komórkowa BV-2 wytwarza otoczkowy rekombinowany retrowirus ekotropowy (zdolny do infekowania tylko komórek mysich)12; Takie wirusy są znane ze swojej zdolności do przekształcania in vitro i potencjału rakotwórczego in vivo.

  1. Hodowla komórek BV-2 w zmodyfikowanym pożywce orła o wysokim poziomie glukozy Dulbecco (DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (od teraz określanej jako pożywka hodowlana) poprzez wysiewanie komórek w proporcji 4 x 104 komórek/ml.
  2. Utrzymywać kultury w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: komórki rosną luźno połączone i w zawiesinie.

2. Oznacz rekombinowane agregaty Tau za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na pH

UWAGA: Agregaty Tau zostały przygotowane zgodnie z opisem w Apetri et al.13 z tą różnicą, że do bufora reakcyjnego nie dodano tioflawiny T (ThT). Zagregowane próbki pobrano w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Końcowy sygnał fluorescencji sprawdzono, mieszając 118 μl próbki basenowej z 12 μl roztworu 50 μM ThT. Agregaty rozdzielano przez odwirowanie mieszaniny reakcji agregacji w temperaturze 20 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Supernatant został przeanalizowany przez SEC-MALS w celu potwierdzenia, że cały monomeryczny tau został przekształcony w agregaty. Granulki (kruszywa tau) zamrażano błyskawicznie i przechowywano w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

  1. Zawiesić agregaty tau w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu (NaHCO3) o pH 8,5 do stężenia 1 mg/ml (~ 20 μM).
    UWAGA: Stężenie agregatów tau opiera się na początkowym stężeniu monomerów ocenianym na podstawie absorpcji monomerów tau przy 280 nm przy zastosowaniu współczynnika ekstynkcji 0,31 mLmg-1 cm-1.
  2. Sonizuj ponownie zawieszone agregaty za pomocą sonografu sondowego, trzymając się lodu, aby uniknąć przegrzania.
    1. Użyj amplitudy 65% (z sonikatorem o mocy 250 W).
    2. Wykonaj 8 impulsów po 3 s z przerwami 15 s między impulsami, aby uniknąć przegrzania.
  3. Przygotować 8,9 mM roztwór podstawowy barwnika wrażliwego na pH (zwanego dalej barwnikiem pH) w dimetylosulfotlenku (DMSO) zgodnie z instrukcją producenta.
    Uwaga: Zawsze przygotuj świeży roztwór i używaj go tylko w dniu przygotowania.
  4. Dodaj 10 moli barwnika na mol białka do końcowego stężenia barwnika wynoszącego 0,2 mM.
  5. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  6. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 45–60 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  7. W międzyczasie zamontuj usieciowaną kolumnę odsalającą żel dekstranowy zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Zrównoważyć kolumnę z 25 ml 0,1 M NaHCO3 bufor o pH 8,5 zawierający 3% DMSO. Odrzuć przepływ.
  9. Dodać produkt reakcji znakowania kruszywa tau do kolumny w całkowitej objętości 2,5 ml. Jeśli próbka jest mniejsza niż 2,5 ml, dodaj bufor, aż do uzyskania całkowitej objętości 2,5 ml.
  10. Pozwól, aby próbka całkowicie weszła do wypełnionego żelu, odrzuć przepływ.
  11. Eluować za pomocą 3,5 ml 0,1 M NaHCO3 bufor o pH 8,5 zawierającym 3% DMSO i zebrać eluat w 4 równoważnych frakcjach w probówkach o pojemności 2 ml.
  12. Oznaczyć stężenia białek w 4 frakcjach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
  13. Przechowuj oznakowane białko w zamrażarce w temperaturze -20 °C.

3. Test absorpcji z odczytem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

  1. Dzień 1 – Zasień komórki
    1. Przemyć komórki BV-2 w kolbie, usuwając pożywkę hodowlaną i dodając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
      UWAGA: Objętość prania będzie się różnić w zależności od wielkości używanej kolby na komórki. Na przykład w przypadku kolby T175 przemyć 10 ml 1x PBS.
    2. Usunąć PBS z kolby i odłączyć komórki przez inkubację z kwasem trypsyna-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) 0,05% w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do oderwania komórek od kolby (około 5 min).
      UWAGA: Objętość trypsyny-EDTA 0,05% zależy od wielkości użytej kolby komórkowej. Na przykład w przypadku kolby T175 użyj 2 ml trypsyny-EDTA 0,05%.
    3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej, pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy.
      Uwaga: Objętość podłoża do hodowli różni się w zależności od wielkości użytej kolby komórkowej, a tym samym całkowitej liczby komórek w kolbie. Na przykład w przypadku kolby T175 użyj 8 ml pożywki hodowlanej.
    4. Policz komórki i utwórz zawiesinę komórkową o końcowym stężeniu 1 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej zawierającej 200 μg/ml heparyny.
    5. Płytka: 250 μl zawiesiny komórkowej (2,5 x 104 komórki) na basenik w 96-dołkowej płaskiej płytce do hodowli tkankowej.
    6. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Dzień 1 – Przygotowanie immunokompleksów
    1. Rozmrozić barwnik tau o pH na lodzie.
    2. Przygotować 65 μl na warunek 500 nM roztworu agregatów barwnikowo-tau pH w pożywce wolnej od surowicy (SFM) (DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 200 μg/ml heparyny).
    3. Przygotować rozcieńczenia przeciwciał w 65 μl SFM i w stężeniu dwukrotnie wyższym od końcowego. Wymieszaj agregaty barwnika pH-tau i przeciwciała w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Końcowa objętość na warunek wynosi teraz 130 μl, a stężenie zagregowane barwnika i tau pH wynosi 250 nM. Uszczelnić płytkę rozcieńczającą i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Dzień 2 – Wychwyt immunokompleksów
    1. Usuń pożywkę hodowlaną z komórek BV-2. Umyj komórki raz 100 μl temperatury pokojowej 1x PBS.
    2. Przenieś 125 μl immunokompleksów do komórek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować komórki z immunokompleksami przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Usunąć pożywkę inkubacyjną z komórek i wyrzucić ją. Umyj komórki raz 100 μl temperatury pokojowej 1x PBS.
    4. Usuń 1x PBS i potraktuj komórki 50 μl trypsyny-EDTA 0,25% przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Dodać 200 μl pożywki do hodowli i dobrze zawiesić, pipetując w górę i w dół, aby oddzielić komórki. Przenieś komórki na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U. Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Umieść płytkę na lodzie, usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki, ponownie zawieszając granulki komórek w 150 μl lodowato zimnym 1x PBS. Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Umieść komórki na lodzie, usuń dodany 1x PBS i umyj je, ponownie zawieszając granulki komórek w 150 μL zimnego buforu FACS (1x PBS, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2 mM EDTA). Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Umieść komórki na lodzie, usuń dodany bufor FACS i ponownie zawieś komórki w 200 μl zimnego buforu FACS.
    9. Natychmiast przeanalizuj próbki za pomocą FACS, uzyskując zdarzenia 2 x 104 w bramce żywych komórek (patrz krok 4.1).

4. Analiza FACS

UWAGA: Patrz Rysunek 1, aby zapoznać się ze strategią bramkowania.

  1. Korzystając z wykresu gęstości obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A), przelej bramkę na aktywnych komórkach, wykluczając zdarzenia o niższych poziomach rozproszenia do przodu (tj. szczątki i martwe komórki).
  2. W populacji żywych komórek należy użyć FSC-A w funkcji wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H), aby wykluczyć dublety i agregacje komórek. To jest bramka singletowa.
  3. Korzystając ze zdarzeń w bramce singletowej, wygeneruj histogram pojedynczego parametru barwnika pH.
  4. Określić średnią intensywność fluorescencji. Określ procent komórek dodatnich pod względem pH barwnika tau, wykluczając komórki ujemne, jak określono za pomocą kontroli tylko BV-2.

5. Wychwyt immunokompleksów z odczytem mikroskopowym

  1. Dzień 1 – Zasień komórki
    1. Przygotować komórki BV-2 zgodnie z opisem w krokach 3.1.1, 3.1.2 i 3.1.3.
    2. Policz komórki i ponownie zawieś je w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia10-4 komórek/ml.
    3. Płytka: 150 μl zawiesiny komórek (1,5 x 103) na studzienkę na 96-dołkowej czarnej płytce pokrytej poli-D-lizyną z przezroczystym płaskim dnem.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.
  2. Dzień 3 – Przygotowanie immunokompleksów
    UWAGA: Przeprowadzono łagodną sonikację znakowanych agregatów tau przed inkubacją z przeciwciałem w celu poprawy wyników mikroskopii.
    1. Rozmrozić barwnik pH-tau na lodzie i poddać sonikacji za pomocą sonikatora sondowego, trzymając na lodzie. Użyj amplitudy 15% (moc sonikatora 250 W). Wykonaj 30 impulsów po 2 sekundy i odczekaj 20 s między impulsami.
    2. Przygotować 65 μl na warunek roztworu 500 nM agregatów barwnikowo-tau pH w SFM.
    3. Rozcieńczyć przeciwciała w 65 μl SFM do stężenia dwukrotnie większego niż końcowe. Wymieszaj agregaty barwnika pH-tau i przeciwciała w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Końcowa objętość na warunek wynosi teraz 130 μl, a stężenie zagregowane barwnika i tau pH wynosi 250 nM. Uszczelnić płytkę do rozcieńczania i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Usunąć pożywkę z płytki komórkowej i zastąpić 150 μl pożywki z dodatkiem 200 μg/ml heparyny. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dzień 4 – Wychwyt immunokompleksów
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek BV-2. Przenieś 125 μl immunokompleksów do komórek za pomocą pipety wielokanałowej.
    2. Inkubować komórki z immunokompleksami przez 1 godzinę i 45 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      Wybarwić jądra komórkowe barwnikiem specyficznym dla DNA i kwaśnymi organellami za pomocą sondy, która selektywnie barwi przedziały komórkowe o niskim pH. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Rozcieńczyć barwniki w SFM.
    3. Wykonaj obrazowanie żywych komórek przy użyciu przesiewowego systemu konfokalnego o wysokiej zawartości. Ustaw temperaturę na 37 °C i 5% CO2 . Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy, użyj obiektywu 63X zanurzonego w wodzie i uzyskaj płaszczyzny 0,5 μm (20 na stos Z) na obrazowane pole.

Wyniki

Zaggregowane rekombinowane białko tau zostało kowalencyjnie znakowane pH-czułym zielonym barwnikiem. Barwnik ten wykazuje znaczny wzrost fluorescencji po internalizacji do organelli o niskim pH, co umożliwia ilościowe oznaczenie wewnątrzkomórkowe. Znakowane agregaty tau inkubowano z monoklonalnymi przeciwciałami anty-tau. W szczególności zastosowano chimeryczną wersję (region Fc mysiego IgG1) przeciwciała CBTAU-28.1. To ludzkie przeciwciało wiąże się z regionem wstawkowym N-końca białka tau i jest zdolne do wiązania włókien tau generowanych in vitro13. W tym teście sprawdzono również wersję CBTAU-28.1 o zwiększonym powinowactwie – dmCBTAU-28.1. Jako kontrole wykorzystano fragmenty Fab CBTAU-28.1, w formacie rodzicielskim oraz w formie mutanta o wysokim powinowactwie, a także mysi izotyp kontrolny IgG1.

Komórki BV-2 inkubowano przez dwie godziny z uprzednio utworzonymi kompleksami immunologicznymi lub samymi agregatami tau w obecności heparyny, aby zablokować niezależny od przeciwciał pobór tau. Po inkubacji komórki poddano trypsynizacji w celu usunięcia tau związanej z błoną zewnętrzną, a następnie przeanalizowano pobór tau za pomocą cytometrii przepływowej. Jak opisaliśmy niedawno13, zaobserwowaliśmy, że warianty CBTAU-28.1 promowały pobór tau do komórek BV-2 w sposób zależny od dawki. Pobór ten był zależny od fragmentu Fc, ponieważ fragmenty Fab CBTAU-28.1 nie zwiększyły podstawowego poboru tau (Rysunek 2). Co więcej, przeciwciało dmCBTAU-28.1 o wysokim powinowactwie pośredniczyło w pobieraniu tau do komórek BV-2 w większym stopniu niż przeciwciało typu dzikiego (Rysunek 2).

Przeciwciałowy pobór białka tau oraz lokalizacja agregatów tau w przedziale endolizosomalnym zostały potwierdzone za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rycina 3), w której kwaśny przedział komórkowy zabarwiono za pomocą sondy selektywnej dla organelli o niskim pH. Wewnątrz komórek inkubowanych z CBTAU-28.1 zaobserwowano wewnątrzkomórkowe punkty zielonego barwnika pH znakujące agregaty tau. Co więcej, wewnątrzkomórkowe agregaty tau często kolokalizowały z czerwonym barwnikiem selektywnym dla przedziałów o niskim pH, co sugeruje obecność agregatów tau w kwaśnych organellach. Fragmenty Fab CBTAU-28.1 nie zwiększyły poboru tau, co ponownie wskazuje na mechanizm internalizacji zależny od receptorów Fc (Rycina 3).

Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej, bramkowanie komórek BV-2, histogram FITC-A, kwantyfikacja komórek rTau+, analiza.
Rycina 1: Strategia bramkowania zastosowana w analizie cytometrii przepływowej w celu wykrycia internalizacji białka tau przez komórki BV-2. Przedstawiono przykładowe dane dla kontroli z samymi komórkami BV-2 (A-C), kontroli izotypowej (D-F) oraz dmCBTAU-28.1 (G-I). Populację komórek BV-2 wyznaczono na wykresie gęstości FSC-A vs SSC-A, wykluczając resztki komórkowe i martwe komórki (A, D, G). Następnie komórki BV-2 poddano dalszemu bramkowaniu na wykresie gęstości FSC-A vs FSC-H, aby wykluczyć dublety i agregaty komórkowe (B, E, H). Bramkę dla pojedynczych komórek wykorzystano do wygenerowania histogramu jednego parametru dla barwnika pH (FITC w tych reprezentatywnych wynikach) (C, F, I) i wyznaczenia geometrycznej średniej intensywności fluorescencji. Alternatywnie obliczono procent komórek pozytywnych pod kątem barwnika pH-tau, wykluczając komórki negatywne określone na podstawie kontroli z samymi komórkami BV-2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres fluorescencji i stężenia komórek rTau, analiza wiązania białek, wykres danych eksperymentalnych.
Rysunek 2: CBTAU-28.1 pośredniczy w pobieraniu agregatów tau przez mikroglejowe komórki BV-2. Agregowane rekombinowane tau zostało kowalencyjnie znakowane zielonym fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na pH i inkubowane z mysią chimeryczną wersją ludzkiego przeciwciała anty-tau CBTAU-28.1, jego formatem o zwiększonym powinowactwie dmCBTAU-28.1, odpowiadającymi fragmentami Fab, mysim przeciwciałem kontrolnym izotypu IgG1 lub bez przeciwciała (same agregaty tau). Immunokompleksy inkubowano następnie z komórkami BV-2 przez dwie godziny w obecności heparyny, aby zablokować niezależne od przeciwciał pobieranie tau. Pobieranie immunokompleksów oceniano metodą cytometrii przepływowej i wyrażono jako średnią geometryczną (GM) intensywności fluorescencji (A) lub procent komórek dodatnich pod kątem tau (tau+) (B). Słupki błędów na wykresie (A) wskazują odchylenie standardowe z dwóch niezależnych eksperymentów, natomiast (B) przedstawia pojedynczy eksperyment. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Immunofluorescencja agregatów białka Tau, barwienie Lysotracker i Hoechst, wyniki badań komórkowych.
Rycina 3: Agregaty białka Tau są internalizowane przez komórki BV-2 i lokalizują się w kwasowych organellach komórkowych. Wcześniej utworzone immunokompleksy przeciwciał przeciwko białku tau inkubowano z komórkami BV-2 przez dwie godziny w obecności heparyny, aby zablokować pobieranie niezależne od przeciwciał. Po inkubacji jądra barwiono specyficznym dla DNA niebieskim barwnikiem, a kwasowy przedział komórkowy czerwonym barwnikiem selektywnym dla przedziałów o niskim pH. Obrazowanie żywych komórek wykazało wewnątrzkomórkowe punkty znakowanych agregatów tau (zielone) w komórkach inkubowanych z CBTAU-28.1 i dmCBTAU-28.1, lecz nie w kontroli izotypowej. Co więcej, wewnątrzkomórkowe agregaty tau często kolokalizowały z czerwonym barwnikiem (żółte), co sugeruje obecność agregatów tau w kwasowym przedziale komórkowym. Fragmenty Fab CBTAU-28.1 nie zwiększały pobierania tau, co wskazuje na mechanizm internalizacji zależny od receptorów Fc. Obrazy przedstawiają projekcje maksymalnej intensywności stosu Z złożonego z 20 płaszczyzn (płaszczyzny 0,5 µm), wykonanego przy użyciu obiektywu imersyjnego z wodą 63X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, zostały niedawno zidentyfikowane jako ważni gracze w podejściach terapeutycznych opartych na przeciwciałach w tauopatiach10,11. Klirens tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej, wraz z blokowaniem wychwytu neuronalnego9, hamowaniem lub destabilizacją tworzenia włókienek13,14 i usuwaniem włókienek wewnątrzneuronalnych przez szlak lizosomalny15, mogą przyczyniać się do skuteczności przeciwciał anty-tau obserwowanej w mysim modelu tauopatii 5,6,7,8,9.

Opisaliśmy tutaj test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Ten test, zaadaptowany z Funk i wsp.11, wykorzystuje komórki BV-2, które są nieśmiertelnymi mysimi komórkami mikrogleju. Chociaż nie można ich w pełni porównać z pierwotnymi komórkami mikrogleju, mają wiele cech pierwotnego mikrogleju, w tym zdolność do silnej fagocytozy zarówno włókienek Aβ, jak i tau 11,16,17,18,19. Co więcej, wykazały się powtarzalnym zachowaniem in vitro, co sprawiło, że doskonale nadają się do opracowywania testów i badań ilościowych, które wymagają minimalnej zmienności eksperymentalnej. Poza tym unieśmiertelnione linie komórkowe pozwalają na większą przepustowość testów i eliminują potrzebę składania ofiar ze zwierząt w porównaniu z zastosowaniem pierwotnego mikrogleju.

Agregaty tau, których użyliśmy w tym teście, zostały uzyskane przy użyciu wysoce powtarzalnej procedury agregacji in vitro , którą niedawno opisaliśmy13, i wykazują podobną morfologię do sparowanych włókien spiralnych (PHF) wyizolowanych z mózgów pacjentów z AD. Chociaż nie zaobserwowaliśmy żadnych nieoczekiwanych wyników, które mogłyby być spowodowane przyleganiem agregatów tau do powierzchni z tworzyw sztucznych lub szkła, zastosowanie stabilnych i dobrze scharakteryzowanych agregatów tau odegrało kluczową rolę w odtwarzalności tego testu.

Innym aspektem, który znacząco przyczynił się do odtwarzalności testu, była gęstość komórek. Liczba komórek w studzience opisana w protokole reprezentuje optymalną gęstość komórek w opisanych warunkach.

Inaczej niż to, co Funk i wsp.11 opisanych, oznaczyliśmy agregaty tau barwnikiem wrażliwym na pH, który znacznie zwiększa jego fluorescencję po internalizacji w organellach kwaśnych, umożliwiając w ten sposób ilościową ocenę wewnątrzkomórkową. To, wraz z trawieniem trypsyny przez immunokompleksy związane z powierzchnią i/lub tau, gwarantuje, że sygnał fluorescencyjny mierzony za pomocą cytometrii przepływowej jest wynikiem wychwytu tau, a nie wiązania się z powierzchnią komórki. Co więcej, zastosowanie barwnika wrażliwego na pH ułatwia wykrywanie zinternalizowanych agregatów tau w eksperymentach mikroskopowych bez konieczności trawienia immunokompleksów związanych z powierzchnią/agregatów tau, co wymagałoby ponownego posiewu i regeneracji komórek.

Zoptymalizowaliśmy również odczyt mikroskopowy naszego testu, w porównaniu z tym, co zostało wcześniej opisane11, stosując wysoce selektywny barwnik dla organelli kwaśnych w naszych eksperymentach mikroskopowych, co pozwoliło nam nie tylko potwierdzić wychwyt tau za pośrednictwem przeciwciał, ale także lokalizację agregatów tau w kompartmencie endolizosomalnym.

Opracowany przez nas test ma optymalną specyficzność, co skutkuje dobrym oknem eksperymentalnym pozwalającym na silną separację próbek dodatnich i ujemnych. Co ciekawe, test pośrednio wykrywa różnice w powinowactwie przeciwciał, stanowiąc w ten sposób potężne narzędzie do badania funkcji efektorów przeciwciał anty-tau.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Alberto Carpinteiro Soaresowi za jego cenną pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki BV-2ICLC Interlab Cell Line CollectionATL03001
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x)Gibco10010-015
Trypsyna-EDTA 0,05%Gibco25300-054
DMEM 4,5 g / dl glukozyGibco41966-029
Surowica bydlęca płoduGibco10091-148
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140122
L-Glutamina 200 mMLonza17-605E
EasYFlaskNunc156499 / 159910
pHrodo Green STP esterLife TechnologiesP35369 
Wodorowęglan sodu pH 8,5 100 mM
DMSOSigmaD2650-100ml
Kolumny PD10GE Healthcare17-0851-01
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Fisher Scientific23225
Greiner CELLSTAR  wielodołkowe płytkihodowlane Greiner665180
Falcon 96-dołkowe płytki testoweFalcon353910
HeparinSigma H3393-50KU
Trypsyna-EDTA 0,25%SigmaT4049-100ml
BSASigmaA7030-100G
EDTA 0,5 M, pH8
FACS Canto IIBD
Hoechst 33342 Roztwór (20 mM)Thermo Fisher Scientific62249
LysoTracker Deep RedThermo Fisher ScientificL12492
Opera PhenixPerkin HelmerHH14000000

Bibliografia

  1. Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
  2. Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
  3. Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
  4. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  5. Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
  6. Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
  7. Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
  8. Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
  9. Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
  10. Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161(2015).
  11. Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
  12. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
  13. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43(2018).
  14. Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
  15. Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
  16. Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
  17. Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
  18. Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
  19. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wch anianie zale ne od przeciwciakom rki mikroglejuagregaty bia ka taucytometria przep ywowamikroskopia konfokalnakom rki BV 2przedzia endolizosomalnychoroba Alzheimera
Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.