Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58582

⸱

1 grudnia 2018

 , 
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Streszczenie

Różnorodność procesów biologicznych obejmuje interakcje komórka-komórka, zazwyczaj pośredniczone przez białka, które oddziałują na granicy między sąsiednimi komórkami. Co ciekawe, tylko nieliczne testy są w stanie dokładnie zbadać takie interakcje bezpośrednio w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiamy test do pomiaru wiązania białek ulegających ekspresji na powierzchniach sąsiednich komórek, na styku komórka-komórka. Test ten składa się z dwóch etapów: mieszania komórek wyrażających interesujące białka połączonych z różnymi białkami fluorescencyjnymi, a następnie pomiarów spektroskopii fluktuacji fluorescencji na styku komórka-komórka przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Pokazujemy wykonalność tego testu w biologicznie istotnym kontekście, mierząc interakcje białka podobnego do prekursora amyloidu 1 (APLP1) w połączeniach komórka-komórka. Zapewniamy szczegółowe protokoły pozyskiwania danych przy użyciu technik opartych na fluorescencji (spektroskopia fluorescencji skaningowej, spektroskopia korelacji krzyżowej, analiza liczby korelacji krzyżowych i jasności) oraz wymagane kalibracje przyrządów. Ponadto omawiamy krytyczne etapy analizy danych oraz sposoby identyfikowania i korygowania zewnętrznych, fałszywych zmian sygnału, takich jak te spowodowane fotowybielaniem lub ruchem komórek.

Ogólnie rzecz biorąc, prezentowany test ma zastosowanie do każdej homo- lub heterotypowej interakcji białko-białko na styku komórka-komórka, między komórkami tego samego lub różnych typów i może być zaimplementowany na komercyjnym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Ważnym wymogiem jest stabilność systemu, która musi być wystarczająca do zbadania dynamiki dyfuzyjnej badanych białek w ciągu kilku minut.

Wprowadzenie

Wiele procesów biologicznych zachodzi w miejscach oddziaływań międzykomórkowych, np. adhezji komórkowej1,2,3, fuzji komórkowej4 oraz rozpoznawania komórkowego5. Zdarzenia te są szczególnie istotne podczas rozwoju organizmów wielokomórkowych oraz dla komunikacji międzykomórkowej, np. podczas odpowiedzi immunologicznych. Procesy te są zazwyczaj mediowane przez białka zlokalizowane na powierzchni, tzn. w błonie plazmatycznej (PM) sąsiadujących komórek, i ulegają specyficznym oddziaływaniom w punkcie kontaktu międzykomórkowego, które są precyzyjnie regulowane w przestrzeni i czasie. W wielu przypadkach oddziaływania te są bezpośrednimi homotypowymi lub heterotypowymi oddziaływaniami białko-białko typu trans, ale mogą również angażować jony lub ligandy działające jako łączniki zewnątrzkomórkowe1. Mimo ich fundamentalnego znaczenia, brakuje testów pozwalających na bezpośrednie badanie tych specyficznych oddziaływań białko-białko w naturalnym środowisku żywych komórek. Wiele metod wymaga albo rozbicia komórek (np. testy biochemiczne, takie jak koimmunoprecypitacja6), fiksacji (np. niektóre techniki optycznej mikroskopii superrozdzielczej oraz mikroskopia elektronowa kontaktów międzykomórkowych7), albo są niespecyficzne, np. testy agregacji/adhezji8,9. Aby rozwiązać ten problem, wdrożono techniki fluorescencyjne oparte na fluorescencyjnym transferze energii (FRET)10 lub komplementacji fluorescencyjnej11. Jednakże, aby osiągnąć wystarczająco małe odległości między fluoroforami, metody te wymagają znakowania białek fluoroforami po stronie zewnątrzkomórkowej10, co potencjalnie może zakłócać oddziaływania trans.

W niniejszej pracy przedstawiamy alternatywną metodę analizy opartą na fluorescencji do badania oddziaływań białko-białko w miejscach kontaktów międzykomórkowych. Podejście to łączy metody korelacji fluorescencji (skaningową spektroskopię korelacyjną fluorescencji (sFCCS), korelacyjną analizę liczby i jasności (ccN&B)) z mieszaniem komórek wykazujących ekspresję konstruktu fuzyjnego badanego białka, np. receptora adhezyjnego. Badane receptory w dwóch oddziałujących komórkach są znakowane dwoma spektralnie rozdzielonymi białkami fluorescencyjnymi (FPs) od strony wewnątrzkomórkowej (patrz Rysunek 1A).

Zastosowane metody opierają się na analizie statystycznej fluktuacji fluorescencji indukowanych dyfuzyjnym ruchem fluorescencyjnych białek fuzyjnych przez objętość ogniskową konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Bardziej szczegółowo, test bada współdyfuzję analizowanych białek w obu sąsiednich błonach plazmatycznych w miejscach kontaktów międzykomórkowych. Jeśli białka ulegają Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. oddziaływania, te Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. kompleksy będą zawierać białka fluorescencyjne emitujące w obu kanałach widmowych, co spowoduje skorelowane fluktuacje fluorescencji obu emitterów. Z drugiej strony, w przypadku braku wiązania, fluktuacje liczby białek w przeciwległych błonach plazmatycznych (PM) będą niezależne, co nie wywoła skorelowanych fluktuacji. Akwizycję można przeprowadzić na dwa sposoby: 1) sFCCS opiera się na skanowaniu w linii w poprzek kontaktu międzykomórkowego i efektywnie bada oddziaływania w obszarze zlokalizowanym w strefie kontaktu. Dzięki analizie czasowej fluktuacji fluorescencji, sFCCS dostarcza również informacji o dynamice, t. j. współczynniki dyfuzji kompleksów białkowych; 2) ccN&Metoda B opiera się na analizie pikselowej sekwencji obrazów zarejestrowanych w obszarach kontaktu międzykomórkowego. Umożliwia ona badanie i mapowanie oddziaływań wzdłuż całego regionu kontaktu (w jednej płaszczyźnie ogniskowej), lecz nie dostarcza informacji na temat dynamiki. Obie metody można połączyć z analizą jasności molekularnej, t. j. średni sygnał fluorescencji emitowany w jednostce czasu przez pojedyncze dyfundujące kompleksy białkowe, co pozwala na oszacowanie stechiometrii kompleksów białkowych w kontaktach międzykomórkowych.

W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania próbek, kalibracji instrumentu, akwizycji i analizy danych w celu przeprowadzenia zaprezentowanego testu na komercyjnym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym. Eksperymenty można przeprowadzić na każdym urządzeniu wyposażonym w detektory analogowe lub zliczające fotony oraz obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej. Następnie omawiamy krytyczne etapy protokołu i przedstawiamy schematy korekcji dla kilku procesów powodujących artefakty w postaci fluktuacji sygnału, np. szumu detektora, fotobleachingu lub ruchu komórek. Test, opracowany pierwotnie do badania oddziaływań między komórkami adherentnymi, można zmodyfikować dla komórek w zawiesinie lub zaadaptować do modelowych systemów błonowych, np. gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUVs) lub gigantycznych pęcherzyków błony plazmatycznej (GPMVs), co pozwala na kwantyfikację oddziaływań w różnych środowiskach lipidowych lub w przypadku braku zorganizowanego cytoszkieletu12,13.

Skanująca spektroskopia korelacji wzajemnej fluorescencji jest zmodyfikowaną wersją spektroskopii korelacji wzajemnej fluorescencji14, zaprojektowaną specjalnie do badania powolnej dynamiki dyfuzyjnej w błonach lipidowych15. Opiera się ona na akwizycji skanu liniowego prostopadłego do błony plazmatycznej (PM) zawierającej badane białka fluorescencyjne. Aby zbadać interakcje dwóch różnych gatunków białek znakowanych w różny sposób, akwizycję przeprowadza się w dwóch kanałach spektralnych, wykorzystując dwie linie laserowe i dwa okna detekcji dla fluoroforów rozdzielonych spektralnie. Ze względu na powolną dynamikę dyfuzyjną białek w PM (D≤~1 µm2/s), pomiar wolny od przesłuchów (cross-talk) można przeprowadzić poprzez naprzemienne stosowanie schematu wzbudzenia z linii na linię15. Analiza rozpoczyna się od: 1) algorytmu wyrównania korygującego boczny ruch komórki na podstawie uśredniania blokowego około 1000 linii, 2) wyznaczenia pozycji z maksymalnym sygnałem fluorescencji, tj. pozycji PM, w każdym bloku oraz 3) przesunięcia wszystkich bloków do wspólnego początku układu współrzędnych12,15, oddzielnie dla każdego kanału. Następnie przeprowadza się automatyczny wybór pikseli odpowiadających PM, wybierając region centralny z dopasowania gaussowskiego sumy wszystkich wyrównanych linii (tj. centrum ± 2,5σ). Całkowanie sygnału w każdej linii daje szeregi czasowe fluorescencji błony F(t) w każdym kanale (g = kanał zielony, r = kanał czerwony). Należy pamiętać, że rozmiar piksela musi być wystarczająco mały, np. <200 nm, aby zrekonstruować kształt funkcji rozproszenia punktowego (PSF) i znaleźć jej centrum, odpowiadające pozycji PM. W przypadku wystąpienia znacznego fotoblaknięcia, szeregi czasowe fluorescencji w każdym kanale mogą być modelowane za pomocą funkcji podwójnie wykładniczej, a następnie skorygowane zgodnie z następującą formułą:16

Równanie funkcjonalne do modelowania matematycznego; wyświetlanie wzoru; analiza równania..    (1)

Ważne jest, aby zauważyć, że wzór ten skutecznie koryguje zarówno amplitudy, jak i czasy dyfuzji uzyskane z analizy korelacyjnej F(t)c, w porównaniu do szacunków parametrów, które uzyskano by z niepoprawionego F(t). Następnie oblicza się funkcje autokorelacji i korelacji wzajemnej (ACF/CCF) sygnałów fluorescencji:

Wzór funkcji autokorelacji, G_auto(τ), w analizie spektroskopii fluktuacji fluorescencji., (2)

Równanie funkcji korelacji wzajemnej, G_cross(τ), stosowane w analizie fluktuacji, w kontekście mikroskopii., (3)

gdzie δFi = Fi(t) - Równanie chromatografii ΣFx=0 diagram; bilans masy w procesie rozdzielania chemicznego.Fi(t)Równowaga statyczna; diagram z ΣFx=0; ilustracja równowagi mechanicznej; edukacyjny koncept fizyczny. oraz i = g,r.

Następnie do wszystkich funkcji korelacyjnych (CF) dopasowano dwuwymiarowy model dyfuzji:

Równanie do analizy spektroskopii korelacyjnej fluorescencji, reprezentacja wzoru \( G(\tau) \)..   (4)

Tutaj N oznacza liczbę białek fluorescencyjnych w objętości obserwacyjnej, a τd czas dyfuzji dla każdego kanału. Model ten uwzględnia, że w opisanym układzie eksperymentalnym dyfuzja białek w PM zachodzi w płaszczyźnie x-z, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanej konfiguracji eksperymentów spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS) na błonach, w których badana jest dyfuzja w płaszczyźnie x-y objętości konfokalnej17. Przewężenie w0 oraz czynnik strukturalny S, opisujący wydłużenie wz objętości ogniskowej w osi z, S = wz/w0, są wyznaczane z pomiaru kalibracyjnego punktowego FCS wykonanego z użyciem spektralnie podobnych barwników i tych samych ustawień optycznych, korzystając z dostępnych wartości współczynnika dyfuzji Ddye:

"Równanie w₀=√(4τd,dyeDdye); analiza dyfuzji molekularnej; formuła, badania",    (5)

gdzie τd,dye to zmierzony średni czas dyfuzji cząsteczek barwnika, uzyskany z dopasowania modelu dyfuzji trójwymiarowej do danych, z uwzględnieniem przejść frakcji T wszystkich N cząsteczek do stanu tripletowego ze stałą czasową ττ:

Równanie spektroskopii korelacji fluorescencji; analizuje dynamikę molekularną, formuła zależna od τ..   (6)

Na koniec obliczane są współczynniki dyfuzji (D), wartości jasności cząsteczkowej (ε) oraz względna korelacja wzajemna danych sFCCS (rel.cc.) zgodnie z poniższymi wzorami:

Wzór na współczynnik tłumienia, D=ω₀²/4τd, przedstawiający równanie analizy stabilności dynamicznej.,    (7)

Równanie równowagi statycznej, ε=⟨F(t)⟩/N, wzór, badania edukacyjne, zwięzły opis. ,   (8)

Równowaga statyczna, wzór: rel.cc=max{C_cross(0)/C_g_auto(0),C_cross(0)/C_r_auto(0)}.,   (9)

gdzie Gcross(0) jest amplitudą funkcji korelacji wzajemnej, a Statyczna równowaga; ΣFx=0, ΣFy=0; diagram; równania dla analizy stabilności mechanicznej. jest amplitudą funkcji autokorelacji w i-tym kanale.

Ta definicja względnej korelacji wzajemnej, t.j. użycie max zamiast mean w równaniu 9, uwzględnia fakt, że maksymalna liczba kompleksów dwóch gatunków białek występujących w różnych stężeniach jest ograniczona przez gatunek występujący w mniejszej liczbie.

Liczba i jasność korelacji wzajemnej opierają się na analizie momentów intensywności fluorescencji dla każdego piksela stosu obrazów zarejestrowanych w czasie w stałej pozycji w próbce, zazwyczaj składającego się z ~100-200 klatek, z dwoma kanałami spektralnymi (g = kanał zielony, r = kanał czerwony). Na podstawie średniej czasowej Diagram równania chromatograficznego ΣFx=0; bilans masy w procesie rozdzielania chemicznego.IRównowaga statyczna; diagram z ΣFx=0; ilustracja równowagi mechanicznej; edukacyjny koncept fizyczny.i i wariancji równowaga statyczna; formuła Σσ²ᵢ; równanie fizyczne; diagram edukacyjny, jasność molekularna εi oraz liczba ni są obliczane dla każdego piksela i kanału spektralnego (i = g, r)18:

Równanie stanu statycznej równowagi: εᵢ = (σᵢ²/⟨Ι⟩ᵢ) - 1, ilustracja wzoru matematycznego.,   (10)

Równanie statystycznej analizy danych, wzór przedstawiający metodę obliczania średniej ważonej. (11)

Ważne jest, aby zauważyć, że podane równania dotyczą przypadku idealnego detektora z prawdziwym zliczaniem fotonów. W przypadku analogowych systemów detekcji mają zastosowanie następujące równania19,20:

Równanie równowagi statycznej; symbol εi dla analizy odkształcenia; wzór matematyczny do oceny naprężeń materiału.,   (12)

Wzór statystyczny dla analizy procesu; równanie obejmuje obliczenie przesunięcia i składniki wariancji..   (13)

W tym przypadku S jest współczynnikiem konwersji między wykrytymi fotonami a zarejestrowanymi zliczeniami cyfrowymi, Wzór na równowagę statyczną σ₀²; obraz równania. oznacza szum odczytu, a offset odnosi się do przesunięcia intensywności detektora. Zazwyczaj wartości te, dla każdego typu detektora, powinny być kalibrowane na podstawie pomiaru wariancji detektora jako funkcji intensywności przy stałym oświetleniu19, np. dla odblaskowej powierzchni metalowej lub wysuszonego roztworu barwnika. Wartość offset można wyznaczyć, mierząc szybkość zliczań dla próbki bez światła wzbudzenia. Poprzez wykonanie regresji liniowej wykresu wariancji związanej z detektorem równowaga statyczna; równanie ΣFx=0; schemat; edukacja, koncepcja fizyczna, analiza sił w funkcji intensywności (I), można wyznaczyć S oraz Wzór na równowagę statyczną σ₀²; obraz równania.19:

Wzór na równowagę statyczną σ²d = S(l) - S ⋅ offset + σ²₀. Schemat równania matematycznego..   (14)

Na koniec obliczana jest jasność korelacji wzajemnej w każdym pikselu, którą definiuje się ogólnie jako21

Wzór BCC na spektroskopowy współczynnik korelacji; równanie; kluczowe terminy badawcze i analityczne.,   (15)

gdzie Symbol statystyczny σ² w kontekście matematycznym, używany do obliczania wariancji. jest wariancją krzyżową Wzór na kowariancję krzyżową σ²_cc w analizie przetwarzania sygnałów; równanie matematyczne..

Aby odfiltrować długotrwałe fluktuacje, wszystkie ccN&Obliczenia B są wykonywane po zastosowaniu filtrowania prostokątnego, niezależnie dla każdego piksela.22W skrócie, ni, εi (i = g, r) i Bcc oblicza się w przesuwnych segmentach o np. 8–15 klatek. Uzyskane w ten sposób wartości można następnie uśrednić, aby otrzymać ostateczną liczbę pikseli oraz wartości jasności.

Analiza stechiometrii
Aby oszacować stechiometrię kompleksów białkowych w kontaktach międzykomórkowych, jasność molekularną można analizować oddzielnie w każdym kanale widmowym dla danych sFCCS lub ccN&B. W sFCCS dla każdego pomiaru w każdym kanale uzyskuje się jedną wartość jasności. W ccN&B uzyskuje się histogram jasności wszystkich pikseli odpowiadających kontaktowi międzykomórkowemu, a wartość średnią (lub medianę) można przyjąć jako reprezentatywną jasność pomiaru. Poprzez przeprowadzenie analogicznej analizy na referencji monomerowej, wszystkie wartości jasności można znormalizować, aby bezpośrednio wyznaczyć średni stan oligomeryczny wykrytych kompleksów białkowych. Na tym etapie ważne jest skorygowanie wyników o obecność niefluorescencyjnych białek fluorescencyjnych (FP), co mogłoby prowadzić do niedoszacowania stanu oligomerycznego. Zazwyczaj wykonuje się to poprzez pomiar jasności homo-dimerycznego białka referencyjnego23,24 przy użyciu jednobarwnego sFCS lub analizy liczby i jasności (N&B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbek: test mieszania komórek

UWAGA: Poniższy protokół opisuje procedurę mieszania dla komórek adherentnych. Może on zostać zmodyfikowany dla komórek hodowanych w zawiesinie.

  1. Dzień przed transfekcją wysiać odpowiednią liczbę komórek na płytkę 6-dołkową, np. 800 000 komórek HEK 293T (odliczonych za pomocą komory Neubauera). Liczbę tę można modyfikować w zależności od czasu między wysianiem a transfekcją oraz dostosować do innych typów komórek. Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment (t.j. białka zainteresowania i kontrolę negatywną), przygotować co najmniej 4 dołki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (10%) i L-glutaminę (1%).
  2. Przeprowadzić transfekcję komórek zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    1. Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment, przetransfekować w oddzielnych dołkach plazmidy dla białka zainteresowania połączonego z „zielonym” (np. monomericznym ulepszonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (mEGFP) lub żółtym białkiem fluorescencyjnym (mEYFP)) lub „czerwonym” (np. mCherry lub mCardinal) białkiem fluorescencyjnym.
      UWAGA: W niniejszym protokole skupiamy się na APLP1-mEYFP i APLP1-mCardinal12 oraz odpowiadającej im kontroli negatywnej, np. myryloilo-palmitylo-mEYFP (myr-palm-mEYFP) i -mCardinal (myr-palm-mCardinal)12. Zazwyczaj wystarczające jest 200 ng – 1 µg DNA plazmidowego. Wysoka wydajność transfekcji zwiększa szansę na znalezienie komórek „czerwonych” i „zielonych” w kontakcie. Zmodyfikować ilość plazmidu i odczynnika do transfekcji, aby zoptymalizować wydajność transfekcji. Krytyczne: Konfluencja komórek podczas transfekcji powinna wynosić około 70%. Jeśli komórki będą zbyt konfluentne, wydajność transfekcji spadnie. Jeśli komórki nie będą wystarczająco konfluentne, transfekcja i mieszanie mogą wywołać stres i uniemożliwić wielu komórkom prawidłowe przytwierdzenie po zmieszaniu.
  3. Przeprowadzić mieszanie komórek ~4 ± 2 h po transfekcji.
    1. Usunąć pożywkę wzrostową i ostrożnie przemyć każdy dołek 1 mL PBS uzupełnionego o Mg2+ i Ca2+. Następnie usunąć PBS. (Krytyczne) Nalać PBS po ściance dołka, aby zapobiec odrywaniu się komórek podczas płukania.
    2. Do każdego dołka dodawać kroplami ~50 µL roztworu trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby ułatwić odrywanie komórek. Inkubować w 37 °C przez 2 min. Następnie powoli potrząsać płytką 6-dołkową w kierunku bocznym, aby odspoić komórki.
      UWAGA: Dla niektórych typów komórek może być wymagany dłuższy czas inkubacji.
    3. Do każdego dołka dodać 950 µL pożywki wzrostowej i resuspenderować komórki, pipetując kilka razy w górę i w dół, aby oderwać wszystkie komórki od dna dołka. (Krytyczne) Upewnić się, że komórki są prawidłowo resuspenderowane i oddzielone od siebie, sprawdzając wizualnie brak dużych agregatów komórkowych po resuspensji. W przeciwnym razie po zmieszaniu powstanie wiele kontaktów typu „czerwony”-„czerwony” lub „zielony”-„zielony”.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową z jednego dołka (białko zainteresowania lub kontrola negatywna) do odpowiadającego mu dołka, t.j. z komórek „czerwonych” (np. przetransfekowanych APLP1-mCardinal) do „zielonych” (np. przetransfekowanych APLP1-mEYFP). Zmieszać, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Następnie wysiać zmieszane komórki na szklane naczynia 35-mm (1 mL zmieszanej zawiesiny komórkowej na naczynie oraz 1 mL pożywki wzrostowej) i hodować wysiane komórki przez kolejny dzień w 37 °C i 5% CO2.

Schemat analizy białka APLP1; spektroskopia korelacyjna fluorescencji, analiza danych, wykres korelacyjny.
Rysunek 1. Schemat przepływu pracy eksperymentalnej oraz reprezentacja skanującej spektroskopii korelacyjnej fluorescencji oraz analizy liczby i jasności korelacji krzyżowej w kontaktach międzykomórkowych. (A) Schemat przygotowania próbek: dwie populacje komórek przetransfekowane białkiem zainteresowania (np. APLP1) połączonym z dwoma spektralnie odmiennymi białkami fluorescencyjnymi (np. mEYFP i mCardinal) są mieszane po transfekcji. W badaniach mikroskopowych wybierane są kontakty między komórkami przetransfekowanymi w różny sposób. Aby uniknąć interferencji z pozakomórkowymi domenami wiążącymi, białko fluorescencyjne powinno być połączone z wewnątrzkomórkowym końcem białka zainteresowania. (B) Pomiary skanującej FCCS (sFCCS) są wykonywane prostopadle do kontaktu międzykomórkowego w dwóch kanałach spektralnych (kanał 1, zielony i kanał 2, czerwony). Linie skanowania (przedstawione jako kymografy) są wyrównywane, a piksele błony sumowane. Następnie z przebiegów intensywności Fi(t) oblicza się ACF i CCF. ACF przedstawiono w kolorze czerwonym i zielonym. CCF przedstawiono w kolorze niebieskim. (C) Pozyskiwanie danych ccN&B (cross-correlation N&B) skutkuje uzyskaniem trójwymiarowego (x-y-czas) stosu obrazów. W obszarze kontaktu międzykomórkowego wybierany jest obszar ROI. Następnie dla każdego piksela kontaktu międzykomórkowego obliczane są wartości jasności kanałów i jasności korelacji krzyżowej (ε1, ε2 oraz Bcc). Wyniki są następnie wizualizowane w formie histogramów, agregując wszystkie wybrane piksele. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie próbek: kontrola pozytywna dla eksperymentów korelacji wzajemnej oraz konstrukt homo-dimeru do analizy jasności

  1. Na jeden dzień przed transfekcją wysiać 600 000 komórek HEK 293T, odliczonych za pomocą komory licznikowej, na szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 w pełnej pożywce DMEM (patrz krok 1.1) przez kolejną dobę.
  2. Przeprowadzić transfekcję komórek przy użyciu ~250 ng plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Jako pozytywną kontrolę korelacji wzajemnej zastosować plazmid kodujący zakotwiczone w błonie fluorescencyjne białko heterodimeryczne, np. myr-palm-mCherry-mEGFP lub myr-palm-mCardinal-mEYFP12, odpowiadające białkom FP badanego białka. Do kalibracji jasności zastosować plazmidy kodujące zarówno monomer, jak i homodimer FP zakotwiczonego w błonie, odpowiadające białkom FP połączonym z badanym białkiem, np. myr-palm-mEYFP oraz myr-palm-mEYFP-mEYFP w celu skalibrowania analizy jasności APLP1-mEYFP12.
  3. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 w pełnej pożywce DMEM (patrz krok 1.1) przez kolejną dobę.

3. Konfokalna mikroskopia skaningowa: Konfiguracja i kalibracja objętości ogniskowej

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany dla eksperymentów przeprowadzanych z użyciem mEGFP/mEYFP oraz mCherry/mCardinal na konfokalnym mikroskopie skaningowym używanym w niniejszym badaniu. Układ optyczny, ustawienia oprogramowania (linie laserowe, lustra dichroiczne, filtry) oraz dobór barwników kalibracyjnych mogą zostać zmodyfikowane dla innych białek fluorescencyjnych (FP) i konfiguracji mikroskopów.

  1. Włącz mikroskop i lasery co najmniej godzinę przed eksperymentem, aby zapewnić stabilność lasera i wyrównanie temperatury.
  2. Przygotuj 100-200 µL odpowiednich wodnych roztworów barwników fluorescencyjnych (przykłady znajdują się w Tabeli materiałów) w wodzie lub PBS do kalibracji objętości ogniskowania, w zakresie stężeń 10-50 nM.
  3. Umieść roztwory barwników w czystej szalce z szklanym dnem 35 mm nr 1,5, t.j. o grubości 0,16-0,19 mm.
    UWAGA: Idealnie należy stosować szalki z wysokiej jakości szkłem powierzchniowym o niskiej tolerancji grubości, np. 0,170 ± 0,005 mm, co pozwala na optymalną korekcję pierścieniem korekcyjnym (krok 3.6). Ważne jest, aby używać tego samego typu szalki, która zostanie wykorzystana później w kolejnych eksperymentach.
  4. Umieść szalkę zawierającą roztwór barwnika bezpośrednio na obiektywie (preferowany obiektyw imersyjny wodny z NA 1,2), aby zapewnić ogniskowanie w roztworze. Alternatywnie, umieść szalkę w uchwycie na próbkę i ustaw ostrość w próbce (np. 10-20 µm nad dnem szalki).
    UWAGA: Nie zalecamy stosowania obiektywów olejowych ze względu na słaby sygnał uzyskiwany przy ogniskowaniu głęboko w próbkach wodnych.
  5. Skonfiguruj ścieżkę wzbudzenia i emisji, np. wybierz laser 488 nm, lustro dichroiczne 488/561 nm, okno detekcji 499-552 nm i rozmiar pinhole wynoszący 1 jednostkę Airy (AU). Upewnij się, że rozmiar pinhole jest taki sam, jak ten, który będzie używany w pomiarach korelacji wzajemnej.
  6. Wyreguluj pozycję pinhole (regulacja pinhole) oraz pierścień korekcyjny obiektywu, aby zmaksymalizować szybkość zliczania. W tym celu obracaj pierścieniem korekcyjnym, aż zostanie wykryta maksymalna szybkość zliczania.
    UWAGA: Korekcja pierścieniem korekcyjnym uwzględnia konkretną grubość zastosowanego szkła powierzchniowego. Maksymalizacja szybkości zliczania, t.j. zbieranie jak największej liczby fotonów na cząsteczkę, jest kluczowa dla maksymalizacji stosunku sygnału do szumu (SNR) pomiarów.
  7. Wykonaj serię pomiarów punktowych FCS (np. 6 pomiarów w różnych miejscach, z których każdy składa się z 15 powtórzeń trwających 10 s, t.j. łącznie 2,5 min, z czasem przebywaniadwell time 1 µs lub krótszym) przy tej samej mocy lasera, która zostanie użyta w pomiarach korelacji wzajemnej (zazwyczaj ~1%, t.j. ~1-2 µW).
  8. Dopasuj do danych trójwymiarowy model dyfuzji z uwzględnieniem wkładu tripletowego (Równanie 6).
    UWAGA: Typowe uzyskane czasy dyfuzji wynoszą około 30 µs, a czynnik strukturalny około 4-8.
  9. Oblicz promień wnęki w0 z pomierzonego średniego czasu dyfuzji i opublikowanych wartości współczynnika dyfuzji zastosowanego barwnika w temperaturze pokojowej25 zgodnie z Równaniem 5. Typowe wartości to 200-250 nm.
  10. Powtórz procedurę kalibracji (kroki 3.4-3.9) z innym barwnikiem fluorescencyjnym dla drugiego kanału detekcji, jeśli jest to konieczne (np. wzbudzenie 561 nm i detekcja między 570 nm a 695 nm). Zachowaj pozycję i rozmiar pinhole ustawione dla pierwszego kanału detekcji.
  11. Oblicz jasność cząsteczkową (Równanie 8) z pomiarów kalibracyjnych i zapisz uzyskane wartości.
    UWAGA: Typowe wartości dla zastosowanej konfiguracji wynoszą ~8-10 kHz/cząsteczkę (MOL) dla mocy wzbudzenia 1,8 µW przy 488 nm. Wartości niższe niż zwykle mogą wskazywać na zabrudzenie obiektywu, rozregulowanie układu lub zmniejszoną moc wyjściową lasera. Regularnie sprawdzaj i zapisuj moce wyjściowe lasera na obiektywie za pomocą miernika mocy. W celu porównania różnych konfiguracji, najbardziej znaczącym parametrem do oceny wydajności mikroskopu jest jasność cząsteczkowa znormalizowana przez moc lasera wzbudzającego.

4. Skanująca spektroskopia korelacji wzajemnej fluorescencji: Akwizycja

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany dla eksperymentów przeprowadzanych z użyciem białek mEGFP/mEYFP („zielonych”) oraz mCherry/mCardinal („czerwonych”) na konfokalnym mikroskopie skaningowym wykorzystanym w niniejszym badaniu. Układ optyczny oraz ustawienia oprogramowania (linie laserowe, lustra dichroiczne, filtry) mogą się różnić w przypadku innych białek fluorescencyjnych lub innych konfiguracji mikroskopów.

  1. Skonfiguruj tor optyczny, np. wzbudzenie 488 nm i 561 nm oraz lustro dichroiczne 488/561 nm, otwór pinhole ustawiony na 1 AU dla wzbudzenia 488 nm. Aby uniknąć przesłuchów spektralnych (cross-talk), wybierz dwa osobne tory w celu sekwencyjnego wzbudzania i detekcji mEGFP/mEYFP (wzbudzenie 488 nm, kanał zielony) oraz mCherry/mCardinal (wzbudzenie 561 nm, kanał czerwony) i wybierz opcję switch tracks every line (zmiana torów co linię). Do detekcji użyj odpowiednich filtrów dla obu kanałów, np. 499-552 nm w kanale zielonym i 570-695 nm w kanale czerwonym.
  2. Jeśli naprzemienne wzbudzanie nie jest możliwe, zastosuj odpowiednie ustawienia filtrów dla kanału czerwonego, aby zminimalizować przesłuchy spektralne (tzn. detekcja fluorescencji mCherry/mCardinal powyżej 600 nm). Może to zmniejszyć liczbę fotonów detekowanych w kanale czerwonym, a tym samym obniżyć SNR.
  3. Umieść szalkę zawierającą zmieszane komórki na uchwycie do próbek. Odczekaj co najmniej 10 min, aby zapewnić wyrównanie temperatury i zredukować dryft ostrości.
  4. Ustaw ostrość na komórkach, korzystając ze światła transmitowanego w menu Locate.
  5. Wyszukaj parę komórki „czerwonej” i „zielonej” stykających się ze sobą. W przypadku pozytywnej korelacji wzajemnej lub kontroli jasności homo-dimeru (patrz sekcja 2), wyszukaj izolowaną komórkę emitującą fluorescencję w obu kanałach lub odpowiedni sygnał homo-dimeru w błonie plazmatycznej (PM).
    UWAGA: (Krytyczne) Zminimalizuj czas ekspozycji próbki podczas poszukiwania komórek, aby uniknąć przedwczesnego blaknięcia (pre-bleaching), co może zmniejszyć korelację wzajemną26. W związku z tym skanuj z maksymalną prędkością i przy niskiej mocy lasera. Aby uniknąć nasycenia detektora podczas obrazowania komórek o silnej ekspresji, wyszukuj w trybie integration mode. Jednak w celu zminimalizowania ekspozycji, skanowanie przy niższych mocach lasera jest możliwe w trybie photon counting.
  6. Wybierz ścieżkę skanowania prostopadłą do kontaktu międzykomórkowego (lub do PM pojedynczej komórki dla pozytywnej korelacji wzajemnej lub kontroli jasności homo-dimeru), korzystając z przycisku Crop, jak przedstawiono na Rysunkach 1B i 2A.
    UWAGA: Niektóre starsze mikroskopy nie pozwalają na dowolne kierunki skanowania. W takim przypadku należy zlokalizować kontakty międzykomórkowe o orientacji prostopadłej do kierunku skanowania.
  7. Użyj funkcji Zoom, aby uzyskać rozmiar piksela od 50-200 nm, i wybierz Line w Scan Mode. Ustaw Frame Size na 128 × 1 pikseli.
    UWAGA: Typowy rozmiar piksela to 160 nm, co odpowiada długości skanu około 20 µm.
  8. Ustaw Scan speed na maksymalną dopuszczalną wartość, np. 472,73 µs na linię.
    UWAGA: Dla schematu wzbudzania naprzemiennego odpowiada to czasowi skanowania 954,45 µs, tzn. ~1000 skanów/s na użytej konfiguracji. Prędkość skanowania można dostosować w zależności od współczynnika dyfuzji badanego białka. Dla białek zakotwiczonych w błonie typowe czasy dyfuzji wynoszą około 10-20 ms. Czas skanowania powinien być co najmniej dziesięciokrotnie krótszy niż czasy dyfuzji. Niższe prędkości skanowania mogą powodować silniejsze fotoblaknięcie i wymagać niższych mocy oświetlenia. Alternatywnie, w przypadku kompleksów dyfundujących bardzo powoli, można wprowadzić pauzę, np. 5 ms, między każdym skanem, korzystając z opcji Interval w podmenu Time Series.
  9. Wybierz odpowiednie moce lasera, np. ~1-2 µW dla wzbudzenia 488 nm i ~5-10 µW dla 561 nm.
    UWAGA: Wyższe moce lasera poprawiają SNR, ale zwiększają fotoblaknięcie. Dlatego moce lasera powinny być dobrane tak, aby fotoblaknięcie stanowiło mniej niż 50% początkowej szybkości zliczania.
  10. Ustaw Cycles na 100 000-500 000.
    UWAGA: Liczba skanów, tzn. czas trwania pomiaru, może być różna: dłuższy czas pomiaru poprawi SNR i może być bardziej odpowiedni dla cząsteczek dyfundujących powoli, jednak ruch komórek i fotoblaknięcie ograniczają maksymalny czas pomiaru. Dane przedstawione tutaj były rutynowo pozyskiwane przez ~3-6 min, tzn. 200 000-400 000 skanów liniowych.
  11. Ustaw detektory w trybie Photon counting. Naciśnij Start Experiment, aby rozpocząć akwizycję. Powtórz kroki 4.5-4.11, aby zmierzyć kolejną komórkę.
    UWAGA: Zaleca się pomiar 10-15 komórek na próbkę przy różnych poziomach ekspresji. (Krytyczne) Unikaj nasycenia detektora przy wysokich poziomach ekspresji. Maksymalna szybkość zliczania nie powinna przekraczać ~1 MHz.
  12. Jeśli przeprowadzana jest analiza jasności w celu określenia stanów oligomerycznych, wykonaj pomiary kalibracyjne jasności homo-dimerów zgodnie z zmodyfikowanymi krokami 4.1-4.11: zmierz każdy homo-dimer białka fluorescencyjnego oddzielnie (w izolowanych komórkach, przygotowanych zgodnie z sekcją 2 protokołu) i wykonuj pomiary tylko w jednym kanale spektralnym.

5. Skanująca spektroskopia korelacyjna fluorescencji: analiza danych

UWAGA: Poniższy protokół stanowi implementację procedury analitycznej opisanej szczegółowo w poprzednich artykułach12,15. Kod oprogramowania jest dostępny na prośbę do autorów.

  1. Wyeksportuj pliki z surowymi danymi (np. CZI) do obrazu RGB TIFF w formacie surowych danych. Plik ten będzie zawierał kymograf z danymi z kanału zielonego i czerwonego, odpowiednio w kanałach G i R obrazu.
  2. Zaimportuj plik TIFF do odpowiedniego oprogramowania analitycznego i przystąp do analizy.
    UWAGA: Następujące kroki (kroki 5.3-5.7) są stosowane oddzielnie dla każdego kanału:
  3. Wyrównaj linie, wykonując uśrednianie czasowe segmentowe lub kroczące z blokami od 500 do 1000 linii. Wyznacz pozycję błony, t.j. pozycję piksela o maksymalnej szybkości zliczeń w każdym bloku. Przesuń wszystkie bloki do tej samej pozycji bocznej. Procedura ta koryguje boczne przesunięcie kontaktu międzykomórkowego, np. spowodowane ruchem komórek.
  4. Zsumuj wszystkie wyrównane linie wzdłuż osi czasu i dopasuj średni profil intensywności za pomocą funkcji Gaussa. W przypadku wystąpienia znacznego tła wewnątrzkomórkowego użyj funkcji Gaussa i funkcji sigmoidalnej. Zdefiniuj piksele odpowiadające błonie jako wszystkie piksele w zakresie ±2,5σ od pozycji błony i zsumuj intensywność tych pikseli w każdej linii, uzyskując pojedynczą wartość sygnału fluorescencji dla każdego punktu czasowego (t.j. dla każdego skanu liniowego).
  5. W razie potrzeby (np. tło >10% sygnału z błony), zastosuj korekcję tła poprzez odjęcie od fluorescencji błony średniej intensywności pikseli w cytoplazmie pomnożonej przez 2,5σ (w jednostkach pikseli), w blokach po 1000 linii. Podczas wyboru pikseli tła unikaj jasnych pęcherzyków wewnątrzkomórkowych.
  6. Jeśli zaobserwowano fotowyblakanie, zastosuj korekcję wyblakania. W tym celu dopasuj szeregi czasowe fluorescencji błony za pomocą funkcji podwójnie wykładniczej i zastosuj odpowiedni wzór korekcyjny, Równanie 116.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować schematy korekcji oparte na widmie Fouriera27. (Kluczowe) Jeśli fotowyblakanie występuje, ale nie zostanie skorygowane, funkcje korelacji (CF) mogą być silnie zniekształcone, a oceny parametrów mogą być obciążone (np. patrz Rycina 5E).
  7. Oblicz funkcje autokorelacji (ACF) i korelacji wzajemnej (CCF) zgodnie z Równaniami 2 i 3, stosując np. algorytm multiple-tau28. Aby zwiększyć niezawodność analizy i uniknąć artefaktów, wykonaj obliczenia dla 10-20 równych segmentów całego pomiaru. Przeanalizuj szeregi czasowe fluorescencji i funkcje CF w każdym segmencie i usuń segmenty wyraźnie zniekształcone (patrz przykłady na Rycini 4A- 4D). Wyciągnij średnią ze wszystkich niezniekształconych segmentów.
    UWAGA: Procedurę tę można zautomatyzować, aby uniknąć subiektywnego błędu w danych29. W przypadku bardzo niestabilnych pomiarów pomocne może być zastosowanie wielu krótkich segmentów. Niemniej jednak długość segmentu powinna być co najmniej o trzy rzędy wielkości większa od czasu dyfuzji, aby uniknąć błędów statystycznego niedopróbkowania29,30,17.
  8. Dopasuj dwuwymiarowy model dyfuzji, Równanie 4, do uzyskanych funkcji CF. W związku z tym ustal czynnik strukturalny na wartość uzyskaną w pomiarze kalibracyjnym (Sekcja 3 Protokołu). Dokładność dopasowania można poprawić, wykonując dopasowanie ważone przy użyciu wag statystycznych każdego punktu danych uzyskanych z algorytmu multiple tau.
  9. Oblicz współczynnik dyfuzji, korzystając z skalibrowanego promienia wiązki (waist) zgodnie z Równaniem 7.
  10. Oblicz jasność cząsteczkową, dzieląc średnią intensywność fluorescencji w każdym kanale przez odpowiadającą jej liczbę cząsteczek, Równanie 8. Znormalizuj wyznaczoną wartość jasności w każdym kanale przez średnią jasność odpowiedniego referencyjnego monomeru, aby uzyskać stan oligomeryczny, uwzględniając niefluorescencyjne białka fluorescencyjne (FP)23. W tym celu wyznacz średnie wartości jasności homo-dimerów z analizy jednobarwnej, aby obliczyć frakcję niefluorescencyjnych FP23.
  11. Oblicz względną korelację wzajemną zgodnie z Równaniem 9.

6. Liczba korelacji wzajemnej i jasność: Kalibracja detektora

UWAGA: Poniższy protokół stanowi ogólną wytyczną dotyczącą kalibracji systemu detekcji. Procedura ta jest obowiązkowa w przypadku analogowych systemów detekcji, natomiast nie jest ściśle wymagana przy użyciu detektorów z rzeczywistym liczeniem fotonów.

  1. Wysuszyć odpowiednie wodne roztwory barwników (patrz Tabela materiałów (np.) w naczyniu z szklanym dnem o średnicy 35 mm. Odpowiednio ustaw tor optyczny, tj. wzbudzenie przy 488 lub 561 nm i detekcja odpowiednio w zakresie 499–552 nm lub 570–695 nm.
    UWAGA: Alternatywnie, zamiast wysuszonych roztworów barwnika, można zastosować refleksyjną powierzchnię metalową, umieszczając element metalowy bezpośrednio na obiektywie.
  2. Wykonaj jednobarwne N&pomiary B w obszarach o różnych stężeniach barwnika lub przy różnych mocach lasera. W związku z tym należy zastosować Powiększenie aby uzyskać rozmiar piksela wynoszący 300 nm, Prędkość skanowania aby ustawić odpowiedni czas przebywania wiązki na pikselu, np. 25 µs i zestaw Cykle do 100–200 klatek.
  3. Ustaw detektory na liczenie fotonów (lub tryb analogowy (jeśli pomiary są wykonywane z detekcją analogową) i naciśnij Rozpocznij eksperyment aby rozpocząć akwizycję. Należy przeprowadzić pomiar przy zerowej mocy wzbudzenia w celu wyznaczenia przesunięcia intensywności.
  4. Narysuj wykres wariancji pikseli w funkcji intensywności pikseli dla wszystkich zmierzonych pikseli i wykonaj dopasowanie liniowe tych danych. Wyznacz wartość S jako nachylenie dopasowania liniowego. Oblicz szum odczytu z punktu przecięcia z osią y, wykorzystując S oraz wyznaczony offset intensywności zgodnie z równaniem 14.

7. Liczba korelacji wzajemnej i jasność: Akwizycja

  1. Należy postępować zgodnie z krokami 4.1–4.4 protokołu akwizycji sFCCS.
  2. Zastosowanie Kadrowanie aby wybrać obszar o wymiarach 512 × 128 pikseli wokół kontaktu międzykomórkowego (lub odizolowanej błony plazmatycznej w celu kontroli jasności homo-dimerów) i Powiększenie aby uzyskać rozmiar piksela wynoszący 50–100 nm.
  3. Zastosowanie Prędkość skanowania aby ustawić odpowiedni czas przebywania wiązki na pikselu, np. 6.3 µs.
    UWAGA: W N&B, czas przebywania piksela powinien być znacznie krótszy niż czas dyfuzji analizowanego białka. W przypadku wyboru innego schematu wzbudzenia, np. zmieniając ścieżkę w każdej linii, czas między dwiema ścieżkami powinien być krótszy niż czas dyfuzji badanego białka. W przeciwnym razie wykrywalna korelacja wzajemna ulega zmniejszeniu.
  4. Zestaw Cykle do 100–200 klatek.
    UWAGA: Większa liczba klatek poprawi stosunek sygnału do szumu (SNR), jednak ruch komórek może ograniczyć całkowity czas pomiaru. Czas skanowania jednej klatki powinien być znacznie dłuższy niż czas dyfuzji badanego białka. W przeciwnym razie jasność pozorna ulega zmniejszeniu. tj. cząsteczki wydają się być nieruchome. W przypadku kompleksów dyfundujących bardzo powoli należy zastosować pauzę, np. 2 s, pomiędzy klatkami przy użyciu Przedział w Szeregi czasowe podmenu
  5. Ustaw moc laserów na odpowiednie wartości (typowe wartości wynoszą ~1-2 µW dla 488 nm i ~5-10 µW (dla wzbudzenia 561 nm).
    UWAGA: Wyższa moc lasera prowadzi do większej jasności i poprawy stosunku sygnału do szumu (SNR), ale także do nasilenia fotowybielania. Moc lasera powinna być wystarczająco wysoka, aby uzyskać wykrytą jasność na poziomie co najmniej ~1 kHz/MOL, lecz jednocześnie na tyle niska, aby uniknąć fotowybielania przekraczającego 10-20%. W przypadku mEGFP/mEYFP lub mCherry/mCardinal zazwyczaj uzyskuje się fotowybielanie na poziomie poniżej 10%.
  6. Ustaw detektory na liczenie fotonów (lub tryb analogowy (jeśli pomiary są wykonywane z detekcją analogową). Naciśnij Rozpocznij eksperyment aby rozpocząć akwizycję.
  7. Oceń szybkość zliczania fotonów. Jeśli szybkość zliczania w pikselach kontaktu międzykomórkowego przekracza 1 MHz, należy zmniejszyć moc lasera lub wybrać komórki o niższym poziomie ekspresji. Powtórz kroki 7.2–7.7, aby zmierzyć kolejną parę komórek. Zaleca się zmierzenie 10–15 komórek na eksperyment przy różnych poziomach ekspresji.
  8. Jeśli analiza jasności jest przeprowadzana w celu ilościowego oznaczenia oligomeryzacji, należy wykonać pomiary kalibracyjne jasności homo-dimerów zgodnie ze zmodyfikowanymi krokami 7.1–7.7: każdy homo-dimer białka fluorescencyjnego należy mierzyć oddzielnie (w izolowanych komórkach, przygotowanych zgodnie z sekcją 2 protokołu), wykonując pomiary tylko w jednym kanale widmowym.

8. Liczba i jasność korelacji wzajemnej: analiza danych

UWAGA: Poniższy protokół opiera się na wcześniej opisanej procedurze analitycznej12,31. Kod oprogramowania jest dostępny u autorów na zapytanie.

  1. Zaimportuj surowe dane (np. pliki CZI można zaimportować za pomocą pakietu Bioformats32). Wyciągnij średnią ze wszystkich klatek i zaznacz obszar zainteresowania (ROI) wokół kontaktu międzykomórkowego.
  2. Przeprowadź algorytm wyrównywania obrazów33, np. poprzez maksymalizację korelacji przestrzennej między obszarami ROI w kolejnych klatkach dla dowolnych przesunięć bocznych, uśredniając wyniki dla obu kanałów. Procedura ta skoryguje boczny ruch komórek.
  3. Zastosuj filtr boxcar22, aby zredukować zbędne długotrwałe fluktuacje wynikające np. z resztkowego ruchu komórek lub wybielania tła. Alternatywnie można zastosować metodę detrendingu w celu korekcji fotowybielania34.
    UWAGA: Jeśli nie zostanie zastosowana analiza segmentowa ani detrending, pozorna jasność może być znacznie zawyżona.
    1. Zdefiniuj przesuwne segmenty obejmujące np. od 8 do 15 klatek (np. klatki 1-8, 2-9 i tak dalej) i oblicz wartości jasności kanałów oraz korelacji wzajemnej zgodnie z równaniami 10, 11 i 15 dla każdego piksela w każdym segmencie. Jeśli detektory nie są prawdziwymi detektorami zliczającymi fotony, przy obliczaniu jasności należy uwzględnić skalibrowane parametry detektora, tzn. zastosować równania 12 i 13.
      UWAGA: Obliczanie wartości jasności w segmentach od 8 do 15 klatek prowadzi do niedoszacowania absolutnej jasności o 10-20% i przeszacowania liczby cząsteczek o 10-20%. Niemniej jednak stosunki jasności (np. jasność dimeru do monomeru) nie ulegają zmianie, pod warunkiem że długość segmentu pozostaje stała przez całą analizę (dane nie zostały przedstawione). Błąd statystyczny dla danej długości segmentu można określić za pomocą symulacji, a następnie go skorygować.
    2. Wyciągnij średnią z uzyskanych wartości jasności dla każdego piksela we wszystkich segmentach. Na tym etapie można usunąć z obliczeń średniej najwyższe i najniższe 5% wartości jasności segmentów lub wykluczyć segmenty wykazujące wyraźne zniekształcenie intensywności, spowodowane np. przejściową obecnością wewnątrzkomórkowego pęcherzyka lub agregatu w tych pikselach.
  4. Przedstaw wartości jasności pikseli jako funkcję intensywności pikseli i wybierz populację pikseli odpowiadającą kontaktowi międzykomórkowemu. Piksele tła będą miały bardzo niskie wartości intensywności. W tym momencie ponownie oceń maksymalną szybkość zliczeń. Wyklucz piksele z szybkością zliczeń powyżej 1 MHz, aby zapobiec efektom spiętrzenia (pile-up).
  5. Utwórz histogramy jasności kanałów i korelacji wzajemnej dla wybranych pikseli kontaktu międzykomórkowego i uzyskaj wartości jasności uśrednione dla ROI. Znormalizuj średnią wartość jasności kanału przez średnią jasność odpowiadającego referencyjnego monomeru, aby określić stan oligomeryczny, uwzględniając niefluorescencyjne białka FP23. W związku z tym wyznacz średnie wartości jasności homodimerów z analizy jednobarwnej, aby obliczyć frakcję niefluorescencyjnych białek FP23.
  6. W celu ilustracji przedstaw mapy jasności kanałów i korelacji wzajemnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwszy test analizy oddziaływań białko-białko, t.j. mieszanie komórek wykazujących ekspresję spektralnie odmiennych białek fluorescencyjnych, a następnie pomiary sFCCS/ccN&B (Rysunek 1), należy przeprowadzić na białkach, których nie spodziewamy się, że będą oddziaływać w punkcie kontaktu międzykomórkowego (t.j. kontrola negatywna). W związku z tym zmieszano komórki HEK 293T wykazujące ekspresję myristoylowano-palmitylowanego-mEYFP (myr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tu procedura doświadczalna pozwala na badanie oddziaływań białko-białko trans na styku komórka-komórka, z wykorzystaniem technik spektroskopii fluktuacji fluorescencji, a mianowicie sFCCS i ccN&B. Metody te obejmują analizę statystyczną fluktuacji fluorescencji emitowanych przez dwa spektralnie oddzielone FP połączone z białkiem (białkami) będącym przedmiotem zainteresowania na styku dwóch sąsiednich komórek, z których każda wykazuje ekspresję jednego lub drugiego białka fuzyjnego. Obecność kompleksó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez 254850309 grantowe Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Autorzy dziękują Madlenowi Lucknerowi za krytyczną lekturę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka DMEMPAN-BiotechP04-01548
DPBS w: Ca2+ i Mg2+PAN-BiotechP04-36500
DPBS w: Ca2+ i Mg2+PAN-BiotechP04-35500
Trypsyna EDTAPAN-BiotechP10-023100
Odczynnik do transfekcji TurboFectThermo Fisher ScientificR0531
HEK Komórki 293TDSMZACC 635
Alexa Fluor 488 NHS EsterThermo Fisher ScientificA20000
Rhodamine BSigma-Alderich83689-1G
Plasmid DNAAddgeneNAPatrz odniesienie 12 (Dunsing i wsp., MBoC 2017), aby uzyskać szczegółowy opis wszystkich plazmidów
6-dołkowa płytkaStarlabCC7672-7506
35- mm szklane płytkidolne CellVisD35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 konfokalneCarl ZeissNA
MATLAB pakiet oprogramowaniaMathWorks  2015b 
Komora zliczania komórek NeubauerMarienfeld640110

Bibliografia

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273(2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634(2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494(2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073(2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487(2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412(2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545(2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Skanuj ca spektroskopia korelacji wzajemnej fluorescencjianaliza liczby korelacji wzajemnej i jasno cikonfokalny mikroskop skanuj cybia ko podobne do bia ka prekursorowego amyloidu 1heterodimer zakotwiczony w b oniefuzja z bia kiem fluorescencyjnymobrazowanie ywych kom rek
Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.