Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia opartą na Fidżi, przyjazną dla użytkownika metodologię wraz z prostymi instrukcjami wyjaśniającymi, jak niezawodnie analizować zachowanie aktomiozyny w pojedynczych komórkach i zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Do korzystania z samouczka nie są wymagane żadne umiejętności programowania; wszystkie kroki są wykonywane w sposób półinteraktywny przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika Fiji i powiązanych wtyczek.

Streszczenie

Niedojrzałe jaja Drosophila nazywane są komorami jajowymi, a ich struktura przypomina prymitywne organy, które podczas rozwoju przechodzą zmiany morfologiczne z okrągłego na elipsoidalny. Ten proces rozwojowy nazywa się oogenezą i ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia funkcjonalnych dojrzałych jaj, aby zabezpieczyć następne pokolenie much. Z tych powodów komory jajowe posłużyły jako idealny i odpowiedni model do zrozumienia rozwoju narządów zwierzęcych.

Opracowano kilka protokołów hodowli in vitro, ale te protokoły mają kilka wad. Jedna z nich polega na zastosowaniu różnych pokryw, które wywierają sztuczny nacisk na obrazowane komory jajowe w celu ich unieruchomienia i zwiększenia obrazowanej płaszczyzny akwizycji powierzchni obwodowej analizowanych komór jajowych. Takie podejście może negatywnie wpłynąć na zachowanie cienkiej maszynerii aktomiozyny, która generuje moc do obracania komór jajowych wokół ich dłuższej osi.

Dlatego, aby przezwyciężyć to ograniczenie, hodujemy komory jajowe Drosophila swobodnie w pożywce, aby niezawodnie analizować maszynerię aktomiozyny wzdłuż obwodu komór jajowych. W pierwszej części protokołu udostępniamy podręcznik szczegółowo opisujący, jak analizować maszynerię aktomiozyny w ograniczonej płaszczyźnie akwizycji w lokalnej skali komórkowej (do 15 komórek). W drugiej części protokołu udostępniamy użytkownikom nową wtyczkę opartą na Fidżi, która umożliwia proste wydobycie zdefiniowanej cienkiej warstwy obwodowej powierzchni komór jajowych. Poniższy protokół opisuje następnie, jak analizować sygnały aktomiozyny w skali tkankowej (>50 komórek). Na koniec wskazujemy ograniczenia tych podejść zarówno w lokalnej skali komórkowej, jak i tkankowej oraz omawiamy ich potencjalny przyszły rozwój i możliwe zastosowania.

Wprowadzenie

Ciągły rozwój nowatorskich technologii obrazowania i oprogramowania mających zastosowanie w naukach przyrodniczych miał ogromny wpływ na zrozumienie podstawowych zasad życia. Jednym z głównych wyzwań jest wiarygodna wizualizacja procesów rozwojowych w połączeniu z ich obrazowaniem na żywo w różnych tkankach. Tkanki są częściami narządów i ciał i jako takie większość z nich nie jest łatwo dostępna do obrazowania. Dlatego opracowano protokoły, które umożliwiają ich sekcję i hodowlę in vitro, w celu wizualizacji zdarzeń biologicznych, które w wystarczającym stopniu odzwierciedlają sytuację in vivo w żywym organizmie.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, hodowla i obrazowanie na żywo komór jajowych Drosophila, struktur podobnych do acinarów przypominających prymitywne organy, przyczyniło się ogromnie do zrozumienia podstawowych zasad rozwoju prymitywnych organów^1,2,3. Obecnie dostępnych jest kilka protokołów hodowli, a ich użycie zależy od czasu akwizycji, typu komórki, która ma być zobrazowana, oraz ich dostępności (np. wewnętrzna linia zarodkowa vs. zewnętrzna linia somatyczna)⁴.

Wspólną cechą wszystkich tych protokołów hodowlanych jest konieczność unieruchomienia analizowanych komór jajowych, które wykazują wysoką aktywność kurczliwą w płynnych podłożach. Aktywność skurczowa komór jajowych jest spowodowana głównie przez arkusz mięśniowy, który pokrywa długi ciąg połączonych komór jajowych^5,6,7. Dlatego, aby osiągnąć prawidłowe unieruchomienie komór młodych jaj, opracowano różne podejścia, polegające na pokryciu komór jajowych szkiełkami nakrywkowymi^6,8,9 lub elastycznych^4,10 lub osadzaniu ich w agarozie o niskiej temperaturze topnienia^3,11. Podejścia te są popularne, ponieważ pozwalają również na obrazowanie większej płaszczyzny wizualnej ze względu na subtelne spłaszczenie powierzchni obwodowej komór jajowych.

Jednak ostatnio wykazano, że komory młodych jaj (etap 1-8) obracają się wokół swojej osi przednio-tylnej⁶ i że ten ruch tkanki jest napędzany przez delikatną sieć aktomiozyny blisko obwodowej powierzchni tych młodych komór jajowych¹². Dlatego sztuczna zmiana powierzchni komórkowej spowodowana subtelnym spłaszczeniem tej tkanki może mieć negatywny wpływ na zachowanie maszynerii aktomiozyny generującej siłę. Przeciwieństwem jest to, że jeśli tkanka komory jajowej nie jest spłaszczona, mikroskopowe obrazowanie białek na obwodowej powierzchni komór jajowych staje się jeszcze bardziej ograniczone przez zmniejszony rozmiar płaszczyzny akwizycji.

Dlatego połączyliśmy protokoły z Prasad et al.⁹ i laboratorium Celeste Berg^4,10 i dalej je zmodyfikowaliśmy, aby w opracowanej metodzie nie stosowano szkiełek nakrywkowych/elastycznych/agarozy. Komory jajowe Drosophila są swobodnie hodowane w pożywkach, a przedstawiony tutaj protokół dotyczy tylko mikroskopii odwróconej. Protokół składa się z dwóch części. Pierwsza część skupia się na analizie sygnałów aktomiozyny w lokalnej skali komórkowej (do 15 komórek) w komorach jajowych. W drugiej części skupimy się na pokonaniu ograniczeń związanych z małą płaszczyzną akwizycji spowodowaną swobodną hodowlą komór jajowych. W związku z tym opracowaliśmy nowatorską metodę obliczeniową opartą na Fidżi z półinteraktywnym graficznym interfejsem użytkownika, który selektywnie wyodrębnia i rozwija określone warstwy obwodowej powierzchni tkanki. Następnie stosuje się protokół, który opisuje, jak analizować aktomiozynę w skali tkankowej (tj. >50 komórek). Ponieważ selektywna ekstrakcja zdefiniowanej cienkiej warstwy zakrzywionych tkanek nabłonkowych nie była łatwa do zrealizowania przy użyciu klasycznej projekcji z-stack (Rysunek 1), ta łatwa w użyciu metoda służy jako ważny warunek wstępny do kompleksowego zrozumienia zachowania cienkiej (<1 μm) sieci aktomiozyny w skali tkankowej w komorach jajowych Drosophila.

Ponadto, aby ułatwić protokół, udostępniamy przykładowe filmy poklatkowe (TLM) oraz przykładowe pliki fluorescencyjnie oznaczonego konwencjonalnego zachowania Myosin II bez mięśni (zobacz Plik uzupełniający 3). Miozyna II jest białkiem motorycznym i reprezentuje aktywną kurczliwą część maszynerii aktomiozyny. Aby zobrazować Miozynę II, używamy linii transgenicznych Drosophila, które zawierają zmodyfikowany regulatorowy łańcuch świetlny Myosin II o nazwie MRLC::GFP (szczegóły w Tabeli Materiałów)^12,13. W celu wizualizacji błon komórkowych protokół opiera się na dostępnych w handlu barwnikach (patrz tabela materiałów). Protokół ten jest odpowiedni nie tylko do analizy małych subkomórkowych sygnałów MRLC::GFP¹², ale także do wszelkich cząstek subkomórkowych o podobnej wielkości około ±300 μM, takich jak te obserwowane za pomocą Life-Act::GFP^12,14.

Chociaż oba te protokoły są prezentowane za pomocą komór jajowych Drosophila hodowanych in vitro, akwizycja sygnałów aktomiozyny może być również przeprowadzana przy użyciu innych tkanek po optymalizacji pożywki hodowlanej i w zależności od dostępności albo fluorescencyjnie znakowanych białek z odpowiednimi barwnikami komercyjnymi, albo, na przykład, mikroiniekcji mRNA w celu uzyskania przejściowych profili ekspresji genów. Podobnie, oparty na Fidżi protokół ekstrakcji cienkiej warstwy z powierzchni obwodowej może być stosowany bardziej ogólnie do tkanek elipsoidalnych i narządowych.

Protokół

UWAGA: Poniższy protokół zawiera instrukcje, jak analizować aktomiozynę na lokalnej skali komórkowej i tkankowej w komorach jajowych Drosophila. Podejście w skali lokalnej pozwala użytkownikom na szczegółową analizę zachowania aktomiozyny w maksymalnie 15 komórkach na komorę jajową i wymaga akwizycji TLM przez krótki okres czasu (5–10 minut) przy użyciu szybkiego obrazowania i odwróconego mikroskopu konfokalnego. W przeciwieństwie do tego, skala tkankowa dostarcza użytkownikom informacji o aktomiozynie w 50-100 komórkach i wymaga akwizycji TLM przez długi okres czasu (≥30 min) przy użyciu obrazowania o niskiej prędkości i mikroskopu z odwróconym wirującym dyskiem (patrz Rysunek 2 i zalecane parametry dla każdej skali w Tabeli 1). Decyzja o tym, w jakiej skali analizować sygnały aktomiozyny, całkowicie zależy od pytania naukowego użytkownika. Testy TLM z testem towarzyszącym powinny pomóc w podjęciu tej decyzji.

1. Lokalna skala komórkowa (LCS)

UWAGA: Aby przeprowadzić sekcję i zobrazować in vitro komory jajowe Drosophila, postępuj zgodnie z protokołem opisanym w Pliku Uzupełniającym 1. Aby przeanalizować uzyskane TLM, kontynuuj korzystanie z następującego protokołu. Linki do towarzyszących plików testowych TLM znajdują się w pliku uzupełniającym 3.

1. Przetwarzanie danych TLM w lokalnej skali komórkowej (LCS)
   1. Korekcja wybielacza TLM w celu skompensowania zaniku intensywności etykiet fluorescencyjnych
      1. Upewnij się, że na używanym komputerze jest zainstalowana aktualna aplikacja Fiji, postępując zgodnie z poniższymi instrukcjami: Fiji > Otwórz TLM (np. TestMovie1.tif z pliku uzupełniającego 3).
      2. Podziel kanały kolorów, klikając Obraz > Kolor > Podziel kanały.
      3. Wykonaj korekcję wybielania na obu kanałach za pomocą opcji Image > Adjust > Bleach Correction > Simple Ratio > Background Intensity 0.0.
         >nuta: Jeśli uzyskasz niezadowalające wyniki, sprawdź, które metody korekcji w tej wtyczce najlepiej pasują (np. użyj dopasowania histogramu zamiast prostego współczynnika).
   2. Segmentacja komórek w celu wygenerowania maski komórki dla TLM
      1. Jeśli Fidżi nie jest jeszcze otwarty, otwórz go ponownie (i upewnij się, że jest aktualny), postępując zgodnie z instrukcjami Pomoc > Aktualizacja > Zastosuj zmiany > OK.
      2. Jeśli nie zostało to jeszcze zrobione, pobierz makro TissueCellSegmentMovie.ijm (z http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Przeciągnij i upuść ten skrypt na Fidżi.
      3. Otwórz plik TLM .tiff z korekcją wybielacza (patrz sekcja 1.1.1). Podziel kanały pliku z korekcją wybielania za pomocą opcji Obraz > Kolor > Podziel kanały.
      4. Uruchom przesłany skrypt na aktywnym kanale błony komórkowej wybranego TLM, naciskając ikonę Uruchom w otwartym skrypcie. Ustaw rozmycie gaussowskie na 2,500, a czułość wykrywania komórek na -1, a następnie kliknij przycisk OK. Aby uzyskać ładną maskę komórkową, nie zmieniaj powyższych parametrów. Ustaw szacowaną tolerancję szumów w zakresie 10–20 dla TLM zarejestrowanych za pomocą obiektywu 63x i kliknij przycisk OK.
         nuta: W przypadku innych celów mogą być wymagane inne parametry. Im czystsze tło w TLM, tym niższa szacowana tolerancja hałasu jest wymagana.
      5. Wygenerowana maska komórki pojawia się w analizowanym TLM, a także w nowym oknie o nazwie ParticleStack (G), a dodatkowo pojawia się małe okno o nazwie Action Required. Z maski komórki w TLM skup się tylko na komórkach w środku TLM i wybierz te, które mogą zapewnić pełne i dobrze zdefiniowane kontury w całym TLM.
      6. Jeśli zaznaczone komórki zawierają sztuczne/dodatkowe kontury komórek, użyj okna narzędzia scalania o nazwie Wymagane działanie w TLM. W tym drugim przypadku postępuj zgodnie z instrukcjami w oknie.
         nuta: Upewnij się, że kontury komórek są dobrze zdefiniowane i odpowiadają rzeczywistym błonom komórkowym w TLM, ponieważ wszelkie niedokładności mogą mieć wpływ na kolejne analizy. Dodatkowe poprawki i zmiany, takie jak usuwanie niechcianych komórek, można wykonać później za pomocą narzędzia Menedżer powierzchni (opisanego w sekcji 1.1.3).
      7. Gdy wybrane komórki w środku ładnie odpowiadają prawdziwym błonom komórkowym, zapisz ParticleStack jako plik .tiff po File > Save As > Tiff.
   3. Wczytywanie wygenerowanej maski komórki do narzędzia Surface Manager
      1. Zainstaluj wtyczkę Surface Manager Plugin¹⁵ w używanej konfiguracji Fiji. Postępuj zgodnie z instrukcjami Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Otwórz aplikację Surface Manager za pomocą wtyczek > segmentacji > Menedżera powierzchni (3D).
         nuta: W oknie Menedżer powierzchni po prawej stronie jest wyświetlanych kilka przycisków akcji, a po lewej puste okno. Aby zobaczyć wszystkie przyciski akcji, może być konieczne rozciągnięcie okna na wysokość/szerokość. Zwróć uwagę, że przedziały czasowe będą wyświetlane jako wycinki z .
      3. Otwórz odpowiedni plik ParticleStack .tiff w Menedżerze powierzchni, klikając Plik > Otwórz i wybierz obraz, który chcesz otworzyć (np. ParticlesStack1.tif).
      4. W programie Surface Manager kliknij przycisk Odczytaj obraz konturu i ustaw indeks żakardu na 60%.
         nuta: Wczytywanie pliku ParticlesStack1.tif może potrwać do kilku minut, w zależności od mocy obliczeniowej komputera.
      5. Po załadowaniu każda komórka zostanie przypisana do numeru S i pojawi się w lewej części okna Menedżer powierzchni.
         nuta: Aby wyświetlić kontury i nazwy komórek dla wszystkich komórek, zaznacz pola wyboru Pokaż wszystko i Pokaż etykiety u dołu okna Menedżer powierzchni. Zaleca się korzystanie z tej funkcji po sprawdzeniu numerów komórek pod kątem ich poprawności.
      6. Kliknij pierwszą liczbę S; zaimportowany kontur komórki z ParticlesStack1.tif pojawi się w TLM. Sprawdź każdą zaimportowaną liczbę S pod kątem jakości konturów komórek w całym TLM i usuń niechciane komórki, które wyświetlają nieprawidłowe kontury komórek. Aby to zrobić, zaznacz kontur komórki i kliknij przycisk Usuń.
         nuta: Możliwe jest również korygowanie nieprecyzyjnych konturów komórek i dodawanie nowych konturów komórek. Jest to opisane w sekcji dyskusji.
      7. Zapisz wszystkie poprawione komórki jako plik RoiSet.zip, naciskając przycisk Zapisz na dysku.
         nuta: Jeśli sesja musi zostać przerwana, możliwe jest późniejsze załadowanie pliku RoiSet do Surface Manager: otwórz TLM na Fidżi (File > Open) i wybierz TLM. Otwórz Menedżera powierzchni za pomocą wtyczek > segmentacji > Menedżera powierzchni (3D). Załaduj odpowiedni plik RoiSet.zip, klikając przycisk Załaduj z dysku i wybierając odpowiedni plik RoiSet.zip. Dokładnie sprawdź, czy załadowane maski komórek odpowiadają załadowanemu TLM.
   4. Korekcja dryfu tkankowego w TLMs
      nuta: W czasie akwizycji TLM można zaobserwować efekty dryfu spowodowane rotacją nabłonka lub niepożądanym ruchem. W obu przypadkach zalecamy skorygowanie ewentualnego dryftu, aby uprościć późniejszą ręczną analizę aktomiozyny. Korekcja dryftu jest wymagana tylko w przypadku ręcznej analizy aktomiozyny. Ten samouczek wymaga aktualnego oprogramowania Fiji z zainstalowaną wtyczką MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg).
      1. Otwórz TLM z korektą wybielacza na Fidżi za pomocą > Plik Otwórz i wybierz plik poprawiony wybielaczem utworzony za pomocą wspomnianego powyżej samouczka.
      2. Podziel kanały i wybierz ten, który identyfikuje błony komórkowe za pomocą Image > Color > Split Channels.
      3. Jeśli kontury komórek nie są widocznie gładkie, należy użyć następującego protokołu: Filtry > procesowe > Rozmycie gaussowskie. Ustaw ją na ~1–2 dla obiektywu 63x i kliknij OK, a następnie Tak. Kliknij opcję Process > Binary > Convert to Mask (Konwertuj na maskę) przy użyciu ustawień domyślnych; następnie kliknij przycisk OK.
      4. Załaduj wtyczkę MultiStackReg zgodnie z > Rejestracja wtyczek > MultiStackReg.
      5. Upewnij się, że Stos 1 jest ustawiony na kanał błony komórkowej, Akcja 1 jest ustawiona na Wyrównaj, a Transformacja jest ustawiona na Translacja. Zaznacz pole wyboru Zapisz plik transformacji, a następnie kliknij przycisk OK.
      6. Otwórz ponownie wybrany TLM, wtyczkę MultiStackReg i zapisany plik transformacji za pomocą opcji Plik > Otwórz i wybierz TLM. Podziel kanały kolorów za pomocą opcji Obraz > Kolor > Podziel kanały.
      7. Załaduj wtyczkę MultiStackReg, klikając Wtyczki > Rejestracja > MultiStackReg. Wybierz opcję Załaduj plik transformacji jako Akcję 1.
      8. Pozostaw Przekształcenie jako Ciało sztywne i kliknij przycisk OK. Wybierz poprzednio zapisany plik transformacji i ponownie kliknij przycisk OK.
      9. Scal kanały obrazu i zapisz zarejestrowany TLM jako plik .tiff po wyświetleniu opcji Image > Color > Merge channels. Zapisz plik, klikając Plik > Zapisz jako > Tiff.
         >nuta: Istnieją alternatywne sposoby korygowania dryfu tkanki na Fidżi, a mianowicie za pomocą wtyczek > rejestracji > StackReg/Correct 3D drift.
2. Analiza impulsów aktomiozyny w menedżerze powierzchni w LCS
   nuta: Ten etap protokołu pozwala naukowcom określić, czy impulsy aktomiozyny są obecne w analizowanej tkance i zrozumieć szczegółowe zachowanie, a także kierunkowość sygnałów aktomiozyny.
   1. Otwórz Fidżi i upewnij się, że TLM i odpowiadająca mu maska komórki są otwarte w programie Surface Manager.
      nuta: Upewnij się, że oprogramowanie Fiji jest zainstalowane i aktualne, a wtyczka Surface Manager jest zainstalowana (krok 1.1.3.1).
   2. Otwórz TLM za pomocą opcji Otwórz plik > i wybierz TLM do otwarcia (np. TestMovie1_bleach.tif). Załaduj wtyczkę Surface Manager za pomocą opcji Plugins > Segmentation > Surface Manager (3D). Załaduj zapisaną maskę komórki utworzoną w samouczku tutaj (np. ParticlesStack1.tif) za pomocą Plik > Otwórz i wybierz maskę komórki (np. ParticlesStack1.tif). Załaduj odpowiedni obszar zainteresowania (ROI, np. TestMovie1_RoiSet.zip). Zobacz Rysunek 3A.
   3. Przełącz się na interesujący Cię kanał w wybranym TLM.
      nuta: Aby rozróżnić kanały, postępuj zgodnie z kodem kolorystycznym wskazanym wokół TLM.
   4. W Menedżerze powierzchni kliknij przycisk Statystyki, aby wyświetlić okno o nazwie Średnia wartość szarości plasterek po plasterku (Rysunek 3B). Należy zauważyć, że wyświetlane będą średnie/mediany wartości intensywności sygnałów aktomiozyny w danym analizowanym kanale w ramach zdefiniowanych konturów komórek w czasie, a także inne parametry związane z obszarem komórki i kształtem komórki.
      nuta: Wartości intensywności są podane w jednostkach arbitralnych (A.U.); Obszar komórki jest wyrażony w pikselach i należy go przeliczyć na mikrometry kwadratowe.
   5. Uzyskane wartości zapisujemy jako plik arkusza kalkulacyjnego. Kliknij okno Statystyki, Plik > Zapisz jako.
      >nuta: Uzyskane wartości statystyczne można później zweryfikować w następujący sposób: otwórz TLM skorygowany o wybielacz na Fidżi i otwórz Menedżer powierzchni. Załaduj odpowiedni RoiSet.zip do TLM, naciskając przycisk Załaduj z dysku i otwórz plik. Zapisana maska z konturami komórek zostanie przesłana, a nazwy komórek pojawią się w lewym oknie Menedżera powierzchni. Kliknij przycisk Statystyki, aby wyświetlić wartości statystyk.
3. Ręczna analiza indywidualnych subkomórkowych sygnałów aktomiozyny w LCS
   nuta: Protokół ten wymaga największej koncentracji i jest czasochłonny. Ogólnie rzecz biorąc, jeden nabyty TLM można wygodnie przeanalizować w ciągu 1 dnia. Nie obejmuje to czasu na przygotowanie much przed ich preparacją, samą sekcję i pozyskiwanie obrazu.
   1. Otwórz wybrany, skorygowany wybielaczem i zarejestrowany (skorygowany o dryft) TLM w aktualnej aplikacji Fidżi. Jako przykład testowy użyj TLM z korekcją wybielacza i dryftu (np. TestMovie1_bleach_reg.tif).
   2. Dostosuj jasność i kontrast, aby zobaczyć poszczególne sygnały aktomiozyny za pomocą opcji Image > Adjust > Brightness/Contrast.
   3. Wyrównaj TLM w tym samym kierunku względem osi tkanka/ciało. W przypadku komór jajowych przed analizą należy zawsze wyrównać przednią stronę komór jajowych na lewo od obrazu/podfilmu/TLM.
   4. Podziel wybrany film na krótkie 30-sekundowe podfilmy i rzutuj każdy z nich w czasie. Zapisywanie filmów podrzędnych nierzutowanych w czasie i projekcji czasowych o odpowiadających im nazwach. Zachowaj oryginalne źródło.
      nuta: Podfilmy można tworzyć z oryginalnych TLM, usuwając najpierw niechciane klatki za pomocą Image > Stacks > Slice Remover. Zdefiniuj plasterki, które mają zostać usunięte, i ustaw Przyrost. Przekształć w RGB przed użyciem narzędzia do usuwania plasterków, gdy Przyrost = 1. Aby wyświetlić w czasie 30-sekundowy film podrzędny, kliknij opcję Image > Stacks (Stosy obrazów) > Z-project > Max Intensity (Maksymalna intensywność) dla zdefiniowanych klatek (plasterków), a następnie kliknij przycisk OK. Pomiń co drugi podfilm 30 s, aby uniknąć liczenia sygnałów aktomiozyny 2x w dwóch kolejnych 30-sekundowych filmach podrzędnych.
   5. Umieść obraz rzutowany w czasie obok odpowiedniego filmu podrzędnego trwającego 30 s (Rysunek 4A,B). Zidentyfikuj linię sygnału w filmie podrzędnym wyświetlanym w czasie. Określ kierunek ruchu sygnału aktomiozyny (0°–360°) wzdłuż tej linii w oryginalnym filmie podrzędnym, odtwarzając go ręcznie. Użyj narzędzia Kąt (na pasku Fidżi), aby ręcznie zmierzyć kierunek ruchu sygnału względem zdefiniowanej osi tkanki lub podobnego dostępnego narzędzia.
      nuta: Fidżi działa tylko w skali 0°–180° (Rysunek 4C) i wymagane jest przeliczenie uzyskanych wartości na skalę 0°–360°. Linia sygnałowa odpowiada trajektorii ruchu jednego sygnału aktomiozyny w czasie.
   6. Aby uniknąć duplikacji w analizie sygnałów aktomiozyny, należy zaznaczyć analizowane linie sygnałowe w komórkach w podfilmie projekcji czasowej (Figura 4B, D).
   7. Przeanalizuj wszystkie zaznaczone komórki w podfilmie 30 s i zapisz uzyskane kąty.
      nuta: Analizuj tylko subkomórkowe cytoplazmatyczne sygnały aktomiozyny w komórkach z dobrze zdefiniowanymi konturami komórek w całym TLM. Wyklucz pojedyncze komórki z mniej niż 15–20 wykrytymi sygnałami w całym TLM. Ignoruj sygnały aktomiozyny, które przemieszczają się między komórkami z powodu ich nieznanego pochodzenia. Przykład zliczania sygnałów dla jednej analizowanej komórki w podfilmie 30 s jest pokazany w Rysunek 4D.
   8. Kontynuuj, aż wszystkie 30 podfilmów o długości 3 s jednego TLM zostaną przeanalizowane i zapisz wszystkie zmierzone kąty sygnałów aktomiozyny jednego TLM w pliku arkusza kalkulacyjnego.
   9. Zsumuj wszystkie zmierzone kąty w odpowiedniej liczbie TLM (w zależności od eksperymentu). Wykreśl procentowy kierunek analizowanych sygnałów aktomiozyny, na przykład jako diagram róży z zakresem od 0° do 360° za pomocą preferowanego oprogramowania.
      nuta: Aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, zaleca się analizę od pięciu do dziesięciu niezależnych komór jajowych na dowolnym etapie komory jajowej.

2. Skala tkankowa

UWAGA: Aby przeprowadzić analizę i zobrazować in vitro komory jajowe Drosophila, postępuj zgodnie z protokołem w pliku uzupełniającym 2. Aby przeanalizować uzyskane TLM, postępuj zgodnie z poniższym protokołem. Dołączone pliki testowe TLM są umieszczone w pliku uzupełniającym 3.

1. Selektywna ekstrakcja powierzchniowa zakrzywionych tkanek nabłonkowych
   nuta: Protokół ten pozwala użytkownikom na selektywne wyodrębnianie cienkiej warstwy aktomiozyny w zakrzywionej tkance nabłonkowej w czasie. Ten krok protokołu jest przyjazny dla użytkownika i oparty na intuicyjnym interfejsie graficznym. Możliwe jest wygodne przeanalizowanie (wyodrębnienie powierzchni) kilku TLM. Użyj TestMovie2.czi (z pliku uzupełniającego 3) jako przykładu testowego TLM.
   1. Otwórz aktualną aplikację Fidżi (Fiji > Help > Update > Apply Changes > OK).
   2. Upewnij się, że zainstalowano wtyczkę Ellipsoid Surface Projection Plugin¹⁵. Śledź Viktorinova i wsp. ¹⁶.
   3. Otwórz TLM i wyeksportuj go jako plik XML/HDF5, klikając Wtyczki > BigDataViewer > Eksportuj bieżący obraz jako plik XML/HDF5.
      >nuta: Wymagane jest zdefiniowanie ścieżki eksportu. Samo zapisywanie może zająć kilka minut i zależy od długości TLM.
   4. Otwórz wyeksportowany plik w programie Ellipsoid Surface Projection, klikając Plugins > BigDataViewer > Ellipsoid Surface Projection > Wybierz plik XML.
      >nuta: Pojawi się nowe okno z strzałkowymi widokami komory jajowej oraz oknem dialogowym prowadzącym użytkownika przez proces. Szczegółowe informacje na temat nawigacji w widoku plasterków można znaleźć na stronie https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. Okno dialogowe o nazwie Projekcja jajników ma kilka zakładek. W pierwszej karcie dialogowej o nazwie Bounding box zdefiniuj krawędzie x i y komory jajowej w TLM wraz z szerokością z obwiedni (tj. głębokość komory z-stack/egg) i naciśnij set (Rysunek 5A).
   6. Aby zdefiniować obramowania, przeciągnij przyciski obok x, y i z lub zdefiniuj współrzędne liczbowe w polach x, y i z. Upewnij się, że brzegi są wystarczająco szerokie, aby część komory jajowej będąca przedmiotem zainteresowania znalazła się w ekstrakcji powierzchniowej. Wybrane części komory na jajka są podświetlone na różowo.
   7. Przejdź do zakładki o nazwie Znajdź obiekty blob w oknie Projekcja jajników. Zdefiniuj sigma i minimalną wartość szczytu; następnie naciśnij przycisk compute, aby zidentyfikować sygnały aktomiozyny (Rysunek 5B), które pojawią się jako zielone plamy. Ponów ten krok z różnymi parametrami, aż zostanie znaleziona wystarczająca liczba miejsc (około 100).
      nuta: Sigma 1\u20123 z minimalną wartością piku 20\u2012100 najlepiej sprawdza się w identyfikacji sygnałów aktomiozyny komór jajowych w stadium od 6 do -8. Identyfikacja sygnałów aktomiozyny jest kluczowym krokiem i zależy od jakości sygnału i jego wielkości. Ważne jest, aby potwierdzić poprawny rozmiar istniejących obiektów blob. Brak widocznych zielonych punktów/plam na obrazie oznacza, że następny krok nie zadziała. Przeglądaj wybrane płaszczyzny z, aby wyświetlić obiekty blob.
   8. Aby zaprojektować elipsoidę, przejdź do zakładki o nazwie Dopasuj elipsoidę. Ustaw Losowe próbki na 10 000, Odległość graniczna zewnętrzna/wewnętrzna na 1\u201210, a następnie kliknij Compute (Rysunek 5C).
      nuta: Im mniejsza odległość graniczna, tym dokładniejsza będzie pożądana elipsoida. Następnie automatycznie otworzy się zakładka o nazwie Projekcja, która umożliwia zdefiniowanie ekstrakcji powierzchni. Ustawienia należy zoptymalizować.
   9. Kontynuuj dalej z zakładką o nazwie Projekcja ( Rysunek 5D). Ustaw minimalną i maksymalną odległość rzutowania (tj. szerokość żądanej elipsoidy). Wymagane jest ustawienie minimalnej i maksymalnej odległości projekcji tak, aby różowy zdefiniowany obszar elipsoidalny obejmował całą zewnętrzną warstwę komory jajowej. Określ odległość przekroju (zalecana jest wartość 1).
      nuta: Przykłady nieprawidłowego i optymalnego dopasowania elipsoidalnego skutkującego nieprawidłowymi i optymalnymi parametrami rzutowania przedstawiono na rysunku 6A,C. Cienka warstwa obwodowa zainteresowania może być zdefiniowana później. Upewnij się, że różowy obszar elipsoidy o zdefiniowanej szerokości w komorze jaj jest widoczny przed naciśnięciem przycisku obliczeń. Ważne jest, aby pożądana elipsoida (różowa pojedyncza linia) ładnie pasowała do elipsoidalnej powierzchni komory jajowej, aby uzyskać najlepsze wyniki. Jeśli dopasowanie elipsoidy nie jest dobre, ustaw różne ustawienia, aż do uzyskania żądanego wyodrębnienia powierzchni.
      1. Ustaw szerokość wyjściową (≥800) i wysokość (≥400) elipsoidy. Ustaw, od którego punktu czasowego ma zostać utworzona ekstrakcja powierzchniowa (tj. określ długość ekstrakcji TLM). Wybierz rzut sferyczny lub cylindryczny. W razie potrzeby odwróć Z i wyrównaj Y.
      2. Naciśnij przycisk compute, aby uzyskać ekstrakcję powierzchni dla obu kanałów w nowych oknach o nazwie Obraz. Dostosuj jasność i kontrast uzyskanych okien obrazu, aby móc zobaczyć wyświetlane sygnały aktomiozyny, klikając Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast.
         nuta: Przykładowe porównanie rzutu wynikającego z nieprawidłowego i optymalnego dopasowania elipsoidy przedstawiono na rysunku 6B,D.
   10. Jeśli wyodrębnianie powierzchni wygląda dobrze, zapisz obrazy (oba kanały osobno) jako .tiff. Dodatkowo zapisz plik okna dziennika, aby w przyszłości móc dowiedzieć się, w jaki sposób powierzchnia tej konkretnej komory jajowej została wydobyta.
       nuta: Jest to szczególnie ważna informacja, jeśli wydobyta cienka warstwa ma zostać przywrócona do pierwotnego rozwiniętego kształtu (tylko dla programistów).
   11. Scal kanały z preferowanym kodem koloru w Fiji.
       nuta: W razie potrzeby rzutuj wybrane warstwy stosu z sygnałami aktomiozyny. Projekcja wybranych warstw z-stack jest wymagana, gdy ostrość akwizycji nieznacznie zmienia się w czasie w TLM. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wyświetlaj co najwyżej jedną do dwóch warstw z-stack.
   12. Zapisz wyniki jako .tiff files.
       nuta: Reprezentatywne przykłady cienkich warstw (selektywna powierzchnia podstawowa i wierzchołkowa), które reprezentują sygnał Myosin II (MRLC::GFP) z nabłonka pęcherzyków komory jajowej z mutacją kontrolną i tłuszczową2, można znaleźć w Rysunek 8.
2. Przetwarzanie danych z selektywnie ekstrahowanej powierzchni tkanki
   1. Skoryguj wybielacz TLM, aby skompensować zanik intensywności etykiet fluorescencyjnych.
      1. Otwórz Fidżi. Otwórz TLM (np. TestMovie2_extraction.tif z pliku uzupełniającego 3) za pomocą opcji File > Open. Wybierz obraz, aby go otworzyć.
      2. Podziel kanały kolorów i przekonwertuj je na obrazy 16-bitowe, jeśli to konieczne, klikając Obraz > Kolor > Podziel kanały. Przekonwertuj kanały na obrazy 16-bitowe (z obrazów 32-bitowych) za pomocą opcji Typ > Obraz > 16-bitowy.
      3. Wykonaj korekcję wybielania na obu kanałach za pomocą opcji Image > Dostosuj > Korekcja wybielania > Proste proporcje > intensywności tła 0,0,<br /> nuta: Jeśli uzyskane zostaną niezadowalające wyniki, konieczne jest sprawdzenie, które metody korekcji w tej wtyczce najlepiej pasują (np. użyj dopasowania histogramu zamiast prostego współczynnika).
      4. Scal kanały z dwóch obrazów z korekcją wybielania, klikając Obraz > Kolor > Scal kanały. Zapisz scalony obraz jako plik .tiff, klikając Plik > Zapisz jako > Tiff.
         >nuta: W razie potrzeby dostosuj kontrast i jasność kanałów.
   2. Segmentacja komórek w celu wygenerowania maski komórki dla TLM
      1. Jeśli Fidżi nie jest jeszcze otwarty, otwórz go ponownie (i upewnij się, że jest aktualny, klikając Pomoc > Aktualizuj > Zastosuj zmiany > OK).
      2. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, pobierz makro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Przeciągnij i upuść ten skrypt na Fidżi. Otwórz plik z korektą wybielacza (np. TestMovie2_bleach.tif z pliku uzupełniającego 3, patrz także 2.2.1).
      4. Podziel kanały pliku z korektą wybielania, klikając Obraz > Kolor > Podziel kanały. Dostosuj kanał membrany, aby zapewnić wyraźne kontury komórek, klikając Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast.
      5. Uruchom przesłany skrypt na aktywnym kanale błony komórkowej wybranego TLM, naciskając ikonę Uruchom w otwartym skrypcie. Ustaw rozmycie gaussowskie na 1.500. Ustaw czułość wykrywania komórek na -1 i kliknij przycisk OK. Ustaw Szacowana tolerancja szumów na ~8 dla TLM zarejestrowanych za pomocą obiektywu 40x i kliknij OK.
         nuta: Aby uzyskać ładną maskę komórkową, nie zmieniaj powyższych parametrów. W przypadku innych celów mogą być wymagane inne parametry. Im czystsze tło w TLM, tym niższa szacowana tolerancja hałasu jest wymagana.
      6. Wygenerowana maska komórki pojawia się w analizowanym TLM, a także w nowym oknie o nazwie ParticleStack (G). Dodatkowo pojawia się małe okno o nazwie Wymagana akcja. Z maski komórki w TLM skup się tylko na komórkach w środku TLM i wybierz te, które mogą zapewnić pełne i dobrze zdefiniowane kontury w całym TLM.
      7. Jeśli zaznaczone komórki zawierają sztuczne/dodatkowe kontury komórek, użyj okna narzędzia scalania o nazwie Wymagane działanie w TLM. W tym drugim przypadku postępuj zgodnie z instrukcjami w oknie.
         nuta: Upewnij się, że kontury komórek są dobrze zdefiniowane i odpowiadają rzeczywistym błonom komórkowym w TLM, ponieważ wszelkie niedokładności mogą mieć wpływ na kolejne analizy. Dodatkowe poprawki i zmiany, takie jak usuwanie niechcianych komórek, można wykonać później za pomocą narzędzia Menedżer powierzchni (opisanego w poniższym samouczku).
      8. Gdy wybrane komórki w środku ładnie odpowiadają prawdziwym błonom komórkowym, zapisz ParticleStack jako plik .tiff po File > Zapisz jako > Tiff. Kontynuuj ładowanie wygenerowanej maski komórkowej i analizę aktomiozyny w programie Surface Manager, tak jak poprzednio wykonano to w sekcjach 1.1.3 i 1.2 (opisano również szczegółowo w sekcjach 2.2.3 i 2.3).
   3. Wczytywanie wygenerowanej maski komórki do narzędzia Surface Manager
      1. Jeśli wtyczka Surface Manager jest już zainstalowana w używanej konfiguracji Fidżi, przejdź do kroku 2. Jeśli nie, postępuj zgodnie z Viktorinova i ^wsp.16. Dla programistów dostępny jest również sam kod źródłowy¹⁵.
      2. Otwórz Menedżera powierzchni, klikając Wtyczki > Segmentacja > Menedżer powierzchni (3D).
         >nuta: W oknie Menedżer powierzchni po prawej stronie jest wyświetlanych kilka przycisków akcji, a po lewej puste okno. Aby zobaczyć wszystkie przyciski akcji, może być konieczne rozciągnięcie okna na wysokość/szerokość. Zwróć uwagę, że przedziały czasowe będą wyświetlane jako wycinki z .
      3. Otwórz odpowiedni plik ParticleStack.tif w programie Surface Manager za pomocą opcji Plik > Otwórz i wybierz obraz do otwarcia (np. ParticleStack2.tif z pliku uzupełniającego 3).
      4. W programie Surface Manager kliknij przycisk Odczytaj obraz konturu i ustaw indeks żakardu na 60%.
         nuta: Wczytywanie pliku ParticleStack.tif może potrwać do kilku minut, w zależności od mocy komputera.
      5. Po załadowaniu każda komórka zostanie przypisana z numerem S i pojawi się w lewej części okna menedżera powierzchni (Rysunek 7A).
         nuta: Aby wyświetlić kontury i nazwy komórek dla wszystkich komórek, zaznacz pola wyboru Pokaż wszystko i Pokaż etykiety u dołu okna Menedżer powierzchni. Zaleca się korzystanie z tej funkcji po sprawdzeniu numerów komórek pod kątem ich poprawności.
      6. Kliknij pierwszą liczbę S; zaimportowany kontur komórki z ParticleStack.tif pojawi się w TLM. Sprawdź każdą zaimportowaną liczbę S pod kątem jakości konturów komórek w całym TLM i usuń niechciane komórki, które wyświetlają nieprawidłowe kontury komórek. Aby to zrobić, zaznacz kontur komórki i kliknij przycisk Usuń.
         nuta: Możliwe jest również korygowanie nieprecyzyjnych konturów komórek i dodawanie nowych konturów komórek. Jest to opisane w sekcji dyskusji.
      7. Zapisz wszystkie poprawione komórki jako plik RoiSet.zip, naciskając przycisk Zapisz na dysku.
         nuta: Jeśli sesja musi zostać przerwana, możliwe jest późniejsze załadowanie pliku RoiSet.zip do programu Surface Manager: otwórz TLM na Fidżi za pomocą opcji File > Open i wybierz TLM. Otwórz Menedżera powierzchni w następujący sposób: Wtyczki > Segmentacja > Menedżer powierzchni (3D). Załaduj odpowiedni RoiSet.zip, klikając przycisk Załaduj z dysku i wybierając odpowiedni plik RoiSet.zip (np. TestMovie2_RoiSet.zip). Dokładnie sprawdź, czy załadowane maski komórek odpowiadają załadowanemu TLM.
3. Analiza impulsów aktomiozyny w Surface manager
   nuta: Otwórz Fidżi i upewnij się, że TLM i odpowiadająca mu maska komórki są otwarte w Menedżerze powierzchni. Upewnij się, że oprogramowanie Fiji jest zainstalowane i aktualne, a wtyczka Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) jest zainstalowana.
   1. Otwórz TLM za pomocą opcji Otwórz plik > i wybierz TLM do otwarcia (np. TestMovie2_bleach.tif). Załaduj wtyczkę Surface Manager za pomocą opcji Plugins > Segmentation > Surface Manager (3D). Załaduj zapisaną maskę komórki utworzoną w samouczku tutaj (np. ParticlesStack2.tif) za pomocą Plik > Otwórz i wybierz maskę komórki (np. ParticlesStack2.tif). Załaduj odpowiedni zwrot z inwestycji (np. TestMovie2_RoiSet.zip).
   2. Przełącz się na interesujący Cię kanał w wybranym TLM.
      nuta: Aby rozróżnić kanały, postępuj zgodnie z kodem kolorystycznym wskazanym wokół TLM.
   3. W Menedżerze powierzchni kliknij przycisk Statystyki, aby wyświetlić okno o nazwie Średnia wartość szarości plasterek po plasterku (Rysunek 7B). Należy zauważyć, że wyświetlane będą średnie/mediany wartości intensywności sygnałów aktomiozyny w danym analizowanym kanale w ramach zdefiniowanych konturów komórek w czasie, a także inne parametry związane z obszarem komórki i kształtem komórki.
      nuta: Wartości intensywności podane są w A.U.; Obszar komórki jest wyrażony w pikselach i należy go przeliczyć na mikrometry kwadratowe.
   4. Zapisz uzyskane wartości jako plik arkusza kalkulacyjnego: kliknij w okno Statystyki, Plik > Zapisz jako.
      >nuta: Uzyskane wartości statystyczne można później zweryfikować w następujący sposób. Otwórz TLM z korekcją wybielacza na Fidżi. Otwórz Menedżera powierzchni. Załaduj odpowiedni RoiSet.zip do TLM, naciskając przycisk Załaduj z dysku i otwórz plik. Zapisana maska z konturami komórek zostanie przesłana, a nazwy komórek pojawią się w lewym oknie Menedżera powierzchni. Kliknij przycisk Statystyki, aby wyświetlić wartości statystyczne.
      nuta: Jeśli chodzi o ręczną analizę poszczególnych subkomórkowych sygnałów aktomiozyny, nie jest możliwe przeprowadzenie ręcznej analizy subkomórkowych sygnałów aktomiozyny w skali tkankowej. Optymalizacja jest wymagana do analizy poszczególnych sygnałów aktomiozyny w skali półtkankowej, jak podkreślono w sekcji dyskusji.

Wyniki

Ten protokół umożliwia naukowcom badanie zachowania sieci aktomiozyny w tkankach nabłonkowych. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy szczegółowa analiza zachowania aktomiozyny w lokalnej skali komórkowej (kilka komórek) jest połączona z podobną analizą w skali tkankowej (wiele komórek). Jednak tkanki nabłonkowe są często zakrzywione, a ekstrakcja cienkiej warstwy tych tkanek nie była wcześniej łatwo możliwa, jak pokazano w komorach jajowych Drosophila (Ryc. 1). Prz...

Dyskusja

Krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów związanych z sekcją i hodowlą komór jajowych

Jeśli zbyt wiele much zostanie umieszczonych w małej fiolce, pokarm dla much może stać się błotnisty po 2-3 dniach z powodu dużej ilości żerujących larw i dorosłych much uwięzionych w pokarmie much. W takim przypadku przerzuć resztę tych much do nowej fiolki ze świeżym pokarmem i zmniejsz ich liczbę. W szczególności wyklucz samice, które utknęły w jedzeniu.

Miesza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamina
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 jednostek/ml penicyliny [+] 10.000 &mikro; g/mL Streptomycyna
Płodowa surowica bydlęca	Sigma	F135	Inaktywowany termicznie
roztwór insuliny Human	Sigma	I9278
50 ml probówki Falcon	Eppendorf		sterylny
filtr Millex-GV	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Naczynia Microwell ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm szalka Petriego, 14 mm Microwell, nr 1,5 szklana osłona
Kleszcze	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (barwnik błony komórkowej)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (barwnik błony komórkowej)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Szkiełko preparacyjne depresji	Fisher Scientific	12-560B
Aparatura mikroskopowa
Steromikroskop	np. Zeiss		Stemi SV 6
Odwrócony mikroskop konfokalny	np. Zeiss/Olympus
Mikroskop z wirującym dyskiem	np. Zeiss/Andor
Szkło mikroskopowe/szkło nakrywkowe	np. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit uchwyt	na igłęHammacher	9160020
Grzbiet kaktusa	Echinocactus grusonii/beczkowy kaktus
Drosophila użyte w manuskrypcie
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Rauzi i wsp.: Planarna spolaryzowana aktomiozyna kurczliwa przepływy kontrolujące przebudowę połączenia nabłonkowego. Nature 2010, tom 468, str. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Viktorinova et al.: Rotacja nabłonka jest poprzedzona złamaniem symetrii płaskiej aktomiozyny i chroni tkankę nabłonkową przed deformacjami komórek. PLoS Genetics 2017, tom 13, wydanie 11, str. e1007107.