Artykuł metodologiczny

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58592

⸱

20 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Streszczenie

Jak aktywność sieci korowej przetwarza informacje, ma znaczenie dla dużej liczby podstawowych i klinicznych pytań naukowych. Opisany tutaj protokół identyfikuje podstawowe elementy składowe tego obwodu. Dogłębne badania regionów kory mózgowej ostatecznie dostarczą innym naukowcom komponentów obwodów potrzebnych do zrozumienia, w jaki sposób mózg pozyskuje, przetwarza i przechowuje informacje oraz co idzie nie tak w chorobie, podczas gdy dane elektrofizjologiczne i morfologiczne są szeroko wykorzystywane przez neurobiologów obliczeniowych do budowy sieci modelowych, które badają przetwarzanie informacji. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób komórki wypełnione biocytyną zapisane w regionie CA2 hipokampa są odzyskiwane, a następnie rekonstruowane w 3D. Dodatkowo w protokole opisano wykazanie zawartości białka wiążącego wapń lub peptydu w zarejestrowanych interneuronach.

Wprowadzenie

Kora i hipokamp są strukturami o takiej złożoności, że klasyfikacja podtypów neuronalnych1,2,3,4, mapy połączeń między nimi5,6,7,8,9,10,11 i jak ten obwód wspiera funkcje poznawcze12,13,14,15 są nadal przedmiotem intensywnych badań i są przedmiotem ciągłej debaty. Na przykład, aby zrozumieć szczegóły i złożoność obwodów oraz skoordynować dane uzyskane z wielu różnych badań, niezwykle pomocna jest umiejętność zdefiniowania i opisania komponentów, ale pozostaje kwestią dyskusyjną, ile istnieje różnych klas neuronów, a nawet czy możliwe jest zdefiniowanie wszystkich neuronów jako należących do określonej klasy. Opracowywane są narzędzia obliczeniowe, które mogą budować i testować obwody o różnym stopniu złożoności16,17,18, ale kluczowe dla tych przedsięwzięć jest potrzeba szczegółowych badań typów komórek i właściwości połączeń między nimi. Duża ilość informacji na temat lokalnych obwodów kory nowej dorosłych szczurów została już zebrana przy użyciu opisanego tutaj protokołu10,19,20,21,22. Chociaż "schemat połączeń" jest daleki od kompletności, pojawiły się pewne wyraźne wzorce lub zasady. Co więcej, chociaż niektóre szczegóły się różnią, zasady te są wspólne dla dwóch gatunków ssaków (szczura i kota) i w kilku regionach kory nowej, co pozwala na rozwój podstawowych elementów budulcowych, które prawdopodobnie będą miały równie duże zastosowanie w ludzkiej korze nowej. Opisana tutaj technika służy do poszerzenia naszej wiedzy na temat funkcjonalnej mapy obwodów korowych poprzez identyfikację neuronów presynaptycznych i postsynaptycznych zaangażowanych w połączenia w regionach, które nie były wcześniej szczegółowo badane, przy użyciu protokołu, który pozwala na doskonałe zachowanie tkanek i niezwykłe odzyskiwanie barwienia w tkance mózgowej dorosłej osoby. Dane dotyczące obwodów lokalnych w CA2 i właściwości neuronalnych w tej subdziedzinie zostały zebrane tą metodą poprzez połączenie wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologicznych (sparowane zapisy z ostrymi mikroelektrodami) z wypełnieniem biocytyną, immunofluorescencją, procedurami histologicznymi i bardzo szczegółowymi rekonstrukcjami neuronów, co pozwala na bezpośrednie porównanie z sąsiednimi regionami CA23,24,25.

Technika opisana w tym artykule została opracowana na przestrzeni lat w celu uzyskania szczegółowej anatomii neuronów, co pozwala na prawidłową klasyfikację komórek oraz wysokiej jakości i dokładne rekonstrukcje zarówno ich dendrytycznych jak i aksonalnych altan, danych, które można skorelować z danymi elektrofizjologicznymi zebranymi z sparowanych nagrań za pomocą ostrych elektrod. Protokół histologiczny został zoptymalizowany w celu zachowania ultrastruktury neuronów i uzyskania doskonałej regeneracji zarówno altan dendrytycznych (w tym kolców), jak i aksonalnych. Na przykład, zasada techniki podwójnej fiksacji, polegająca po pierwsze zanurzeniu w roztworze utrwalającym, a następnie po utrwaleniu w tetratlenku osmu, daje dobry kontrast dla mikroskopii świetlnej26. Niewielka ilość aldehydu glutarowego i roztworu kwasu pikrynowego jest dodawana do roztworu utrwalającego, aby zwiększyć penetrację przeciwciał i zachować ultrastrukturę komórek, jak sugerowano w poprzednim badaniu27. Przepuszczalność wycinków mózgu przy użyciu metody zamrażania i rozmrażania w połączeniu z krioochroną sacharozą, a nie tradycyjnym detergentem, zapewnia również optymalną konserwację tkanek do szczegółowej analizy morfologicznej zarejestrowanych komórek. Ponadto wizualizacja, szczególnie bardzo drobnych struktur, jest poprawiona dzięki zmniejszeniu barwienia tła, z inkubacją z nadtlenkiem wodoru (H2O2) i borowodorkiem sodu (NaBH 4). Dodanie chlorku niklu (NiCl2) do reakcji peroksydazy chrzanowej (HRP) w celu uzyskania produktu reakcji czarnego pigmentu również zwiększa kontrast.

Poniższy protokół opisuje procedury stosowane w celu zapewnienia doskonałego zachowania tkanek i bardzo szczegółowych neuronalnych rekonstrukcji 3D po wewnątrzkomórkowych zapisach in vitro. Opis przygotowania plastrów, wewnątrzkomórkowych sparowanych zapisów z użyciem ostrych elektrod oraz późniejszych procedur histologicznych stosowanych w naszym laboratorium został już wcześniej opisany28. Chociaż protokół ma zastosowanie do komórek wypełnionych wewnątrzkomórkowo biocytyną w warstwach o grubości 450–500 μm, ten sam protokół można zastosować po zapisach całych komórek. Jednak użycie cieńszych plastrów spowoduje mniej kompletną rekonstrukcję komórek.

Protokół

Wszystkie procedury użyte w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z regulacjami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w odniesieniu do Ustawy o Procedurach Naukowych dla Zwierząt z 1986 roku.

1. Oznaczanie białka wiążącego wapń lub zawartości białka w interneuronach oraz wizualizacja biocytyny na podstawie zapisów elektrofizjologicznych i wypełnienia biocytyną

Uwaga: Na końcu zapisów elektrofizjologicznych, plastry zawierające komórki wypełnione biocytyną są utrwalane przez noc przed procedurami histologicznymi. Roztwór utrwalający zostanie zastąpiony jednorazową zmianą 0,1 M buforu fosforanowego następnego ranka, jeśli reszta procedury zostanie przeprowadzona innego dnia, w celu zapobieżenia uszkodzeniu tkanek. Aby uzyskać najlepsze wyniki, roztwór utrwalający (4% paraformaldehydu, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB)) musi być przygotowany w dniu zapisów.

  1. Pod koniec zapisu elektrofizjologicznego ostrożnie podnieś pędzlem plasterek zawierający nagraną komórkę (komórki) i umieść go w doniczce zawierającej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF).
    UWAGA: Szczegóły protokołu używanego do przygotowania warstw i zapisów wewnątrzkomórkowych przy użyciu ostrych elektrod zostały opisane wcześniej28.
  2. W dygestorium ostrożnie podnieś plasterek mózgu pędzlem i zwiń go na mały kawałek dobrej jakości bibuły filtracyjnej. Umieść kolejny kawałek zwilżonej bibuły filtracyjnej na plasterku i umieść dwa kawałki mokrej bibuły filtracyjnej w małym plastikowym garnku zawierającym 5-10 ml roztworu utrwalającego i przechowuj w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj roztwór żelatyny w wodzie destylowanej. Umieścić 20 ml wody destylowanej w zlewce na płycie grzejnej i podgrzać do 60 °C. Stopniowo dodawać 2,4 g żelatyny do wody, poczekać, aż się rozpuści i pozostawić do ostygnięcia do 35–40 °C przed użyciem, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek.
  4. Zastąp roztwór utrwalający 2 ml 0,1 M PB. Umieść plasterek na szalce Petriego i odetnij nadmiar tkanki ostrzem skalpela. Przyciętą tkankę umieścić na szalce Petriego (średnica 9 cm, wysokość 1,4 cm), upewniając się, że leży płasko bez fałd i zagnieceń, a nadmiar buforu usunąć suchym pędzlem.
  5. Przykryj tkankę ciepłym roztworem żelatyny i umieść szalkę Petriego na zamrożonym bloku, aby szybko schłodzić roztwór.
  6. Używając lampy kątowej, aby zapewnić kontrast, spójrz przez bok naczynia i trzymaj plasterek płasko, lekko naciskając cienkim pędzlem, aż żelatyna zacznie twardnieć.
    UWAGA: Żelatynę można ponownie stopić, jeśli tkanka nie leży płasko. Wszelkie niedoskonałości na powierzchni żelatyny powstałe w wyniku usuwania pędzla w miarę jej krzepnięcia można usunąć poprzez delikatne stopienie warstwy wierzchniej, przesuwając bańkę lampy blisko powierzchni na kilka sekund.
  7. Naczynie z żelatyną do wiązania przenieść do lodówki i odstawić w temperaturze 4°C na 30-60 min.
  8. W dygestorium wyciąć mały blok (~ 1 x 1 cm) zawierający tkankę naczynia zatopioną w żelatynie za pomocą ostrza skalpela, podnieść blok za pomocą małej szpatułki i ostrożnie umieścić go w tym samym, ale świeżym roztworze utrwalającym, który służy do utrwalania plastrów przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Umyj blok żelatyny w 5 ml 0,1 M PB trzy razy, osusz go kawałkiem papierowej chusteczki i przyklej blok stroną do góry (tj. z chusteczką u góry) na wibratomie za pomocą superglue.
  10. Usuń nadmiar kleju kawałkiem bibuły filtracyjnej i za pomocą ostrza skalpela odetnij rogi bloku, pozostawiając kształt rombu.
  11. Plasterek o grubości 50 μm należy podzielić na części za pomocą wibratomu i ostrożnie umieścić każdy fragment w szklanej fiolce zawierającej 10% sacharozy.
  12. Ostrożnie pobrać fragment z fiolki i umieścić go płasko w pokrywce szalki Petriego. Używając mikroskopu preparacyjnego i świeżego ostrza skalpela, usuń żelatynę z okolic skrawka i umieść wycinek z powrotem w fiolce zawierającej 2 ml świeżej 10% sacharozy
    UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby usunąć jak najwięcej żelatyny, aby zmniejszyć kurczenie się tkanek na etapie odwodnienia (krok 1.37).
  13. Kriozabezpiecz skrawki w 0,1 M roztworze sacharozy i glicerolu na bazie PB w temperaturze pokojowej, inkubując je przez 10 minut w 10% roztworze sacharozy, 20 minut w 20% roztworze sacharozy i 6% glicerolu dwa razy i na koniec 30 minut w 30% roztworze sacharozy-12% glicerolu dwukrotnie pod stałym mieszaniem.
  14. Ułóż sekcje płasko na małym prostokącie z folii aluminiowej za pomocą pędzla. Usuń nadmiar płynu z sekcji i ostrożnie złóż folię aluminiową do paczki.
  15. Trzymaj paczkę blisko powierzchni ciekłego azotu, nie dotykając powierzchni przez 30 s, a następnie pozwól sekcjom całkowicie się rozmrozić przez około 30 sekund. Powtórz zamrażanie-rozmrażanie jeszcze dwa razy.
  16. Usunąć wszystkie skrawki pędzlem i umieścić je w szklanej fiolce zawierającej 2 ml 0,1 M PB pod ciągłym mieszaniem w celu zmycia nadmiaru sacharozy.
  17. Wyjąć PB pipetą Pasteura i inkubować skrawki w 2 ml 1% wodnego roztworuH2O2przez 30 min. Przemyć skrawki w 2 ml 0,1 M PB 3x 5 min.
  18. Usunąć 0,1 M PB za pomocą pipety Pasteura i dodać 1 % borowodorku sodu (NaBH4) do 0,1 M PB.
    UWAGA: Nie należy zakręcać fiolki, ponieważ roztwór NaBH4 wydziela wodór.
  19. Usunąć borowodorek sodu pipetą Pasteura i dokładnie umyć skrawki w 2 ml 0,1 M PB 5x 5 min.
  20. Zastąp 0,1 M PB 10% normalną surowicą kozią (NGS) w 0,1 M PB na 30 min.
  21. Usunąć surowicę kozią i inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C w mieszaninie mysich przeciwciał monoklonalnych i króliczych przeciwciał poliklonalnych sporządzonych w roztworze ABC.
    UWAGA: Lista pierwszorzędowych przeciwciał stosowanych w poprzednich badaniach znajduje się w tabeli 1 w Botcher et al. (2014)29.
  22. Inkubować skrawki przez 2 godziny w ciemności w mieszaninie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych (tabela materiałów).
  23. Zamontuj sekcje na prowadnicach w podłożu montażowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
  24. Zrób zdjęcia znakowania fluorescencyjnego przy 40-krotnym powiększeniu (Rysunek 1Bb).
  25. Po wykonaniu obrazowania fluorescencyjnego umieścić szkiełko podstawowe w szklanej szalce Petriego zawierającej PBS i ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie zmyj skrawki szkiełka delikatnymi impulsami PBS z pipety Pasteura. Umieścić skrawki w czystej szklanej fiolce zawierającej PBS.
  26. Przeprowadzić reakcję awidyna-HRP, najpierw inkubując skrawki w ABC przez co najmniej 2 godziny w celu amplifikacji produktu reakcji HRP.
  27. Przygotować roztwór 3,5-diaminobenzydyny (DAB), dodając jedną tabletkę do 5 ml wody destylowanej.
  28. Przemyć sekcje PBS trzy razy przez 10 minut, a następnie dwukrotnie buforem Tris przez 10 minut. Po ostatnim myciu usunąć bufor Tris.
  29. Szybko dodać jedną kroplę 8% roztworu NiCl2 do roztworu DAB, odpipetować roztwór do mieszania i szybko dodać 1 ml tego roztworu na poszczególne sekcje. Inkubować skrawki w roztworze DAB/NiCl2 przez 15 minut.
  30. Dodać 10 μl 1% H2O2 do roztworu DAB. Pozostawić reakcję zachodzącą w ciemności pod ciągłym mieszaniem przez około 1 do 2 minut i monitorować znakowanie wypełnionych komórek za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
  31. Zatrzymać reakcję, usuwając roztwór DAB/NiCl2/H2O2 i przemyć sekcje buforem Tris dwukrotnie przez 5 minut.
  32. W dygestorium umieścić mały okrąg bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i zwilżyć go 0,1 M PB. Podnieś skrawki pojedynczo ze szklanej fiolki za pomocą pędzla i ostrożnie umieść je płasko na papierze.
  33. Przykryj skrawki kolejnym zwilżonym okręgiem bibuły filtracyjnej i usuń nadmiar buforu, delikatnie dotykając bibułą o powierzchnię.
  34. Nanieś 8–9 kropli 1% tetratlenku osmu w 0,1 M PB na górny papier, przykryj naczynie i trzymaj w dygestoriach przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę.
  35. Otwórz szalkę Petriego i podnieś górną bibułę filtracyjną. Ostrożnie podnieś kawałki pojedynczo za pomocą pędzla, umieść je w szklanej fiolce i dwukrotnie opłucz w wodzie destylowanej.
  36. Odpady tetratlenku osmu należy utylizować w odpowiedni sposób. Wypłucz cały jednorazowy sprzęt i umieść go w odpowiednich pojemnikach.
  37. Umieść każdą sekcję płasko na szkiełku podstawowym i nakryj sekcje. Przenieść szkiełko na szalkę Petriego, umieścić pustą szklaną fiolkę na szkiełku nakrywkowym, aby utrzymać je na miejscu i zalać 50% alkoholem. Po 15 minutach wyjąć szkiełko z roztworu i usunąć fragmenty z szkiełka. Umieść sekcje z powrotem na szkiełku, a następnie umieść szkiełko w 70% alkoholu na 15 minut. Powtórz ten sam proces z 95% i na końcu 100% roztworem alkoholu.
  38. Po etapie odwadniania przenieść skrawki do szklanej fiolki zawierającej 100% alkoholu na shakerze w dygestorium. Zastąp roztwór alkoholu tlenkiem propylenu (C, 3,H6O) i myj trzykrotnie przez 5 minut. Po ostatnim przemyciu trzymaj ~2 ml tlenku propylenu w fiolce i dodaj żywicę (w stosunku 1:1). Upewnij się, że żywica jest rozpuszczona i utrzymuj sekcje w ciągłym mieszaniu przez 30 minut.
  39. Umieść każdą sekcję w aluminiowej planszecie zawierającej żywicę epoksydową za pomocą drewnianego patyczka i inkubuj przez noc.
    UWAGA: Nie pozostawiaj sekcji w żywicy dłużej niż 24 godziny, aby uniknąć ryzyka uszkodzenia sekcji.
  40. Umieść planszetkę na płycie grzejnej na około 10 minut. Podnieś każdą sekcję drewnianym patyczkiem i umieść ją na czystym szkiełku. Utrzymuj spójną orientację każdej sekcji za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach. Umieścić szkiełko w piekarniku na 48 godzin w temperaturze 56 °C w celu utwardzenia.

2. 3D Rekonstrukcje neuronów

UWAGA: Używane jest oprogramowanie Neurolucida. Poniższe instrukcje dotyczą tylko konkretnego systemu rekonstrukcji neuronów (Tabela Materiałów). Skrawki uzyskane z cięcia są dopasowywane przed rekonstrukcjami za pomocą mikroskopu.

  1. Umieść szkiełko na scenie i zabezpiecz klipsem scenicznym i otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji neuronów. Kliknij zakładkę Acquire i wybierz Live image.
  2. Zmierz grubość każdej sekcji za pomocą soczewki obiektywu olejowego 100X. Zanotuj wartość na mierniku z u góry i na dole każdej sekcji i oblicz grubość przekroju jako różnicę dwóch wartości.
  3. Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby ustawić ostrość na sekcji Ekran główny zawierającej ciało komórki. Następnie użyj obiektywu 100x, skup się na ciele komórki i kliknij pośrodku, aby zaznaczyć punkt odniesienia.
  4. Na karcie Trace (Śledzenie) wybierz opcję Serial Section Manager (Menedżer sekcji szeregowej). Następnie wybierz Utwórz nową sekcję (ikona +) w oknie Menedżer sekcji szeregowej. Wprowadź liczbę sekcji. Nazwij każdą sekcję w odpowiedniej kolejności Z i wprowadź grubość cięcia zmierzoną w kroku 2.2.
  5. Aby śledzić somę w 3D za pomocą obiektywu 100X, wybierz Kontur z zakładki Śledzenie i wybierz kontur ciała komórki. Użyj joysticka, aby przesunąć ostrość na samą górę korpusu komórki. Umieść punkty, klikając wokół obwodu części, która jest aktualnie aktywna. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Zamknij kontur, aby zakończyć ten pierwszy kontur. Powtarzaj ten proces w różnych pozycjach z, aż dojdziesz do dolnej części ciała komórki (Rysunek 2).
    UWAGA: Wybierz opcję Wizualizacja 3D na karcie Śledzenie, aby wyświetlić treść komórki w 3D.
  6. Aby śledzić ciało komórki w 2D za pomocą obiektywu 100X, wybierz Ciało komórki z menu Neuron w zakładce Śledzenie. Skoncentruj się na środku ciała komórki. Umieść punkty, klikając na obwodzie korpusu komórki. Aby ukończyć treść komórki, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Zakończ zawartość komórki.
  7. Aby prześledzić altanę dendrytyczną, wybierz Dendryt lub Dendryt wierzchołkowy w menu Neuron. Najpierw narysuj krótki, początkowy segment dla każdego dendrytu za pomocą kółka przewijania myszy, aby dostosować średnicę kursora do średnicy dendrytu. Śledź wzdłuż każdego dendrytu za pomocą joysticka, aby poruszać się po sekcji i kółka myszy, aby dostosować średnicę śledzenia.
  8. Sprawdź wyrównanie obrysu z obrazem mikroskopu na żywo i wyreguluj w razie potrzeby, zwłaszcza po poruszaniu się za pomocą joysticka. Na karcie Śledzenie wybierz opcję Wyrównaj śledzenie, kliknij śledzenie, a następnie kliknij właściwą lokalizację.
  9. Po osiągnięciu węzła w drzewie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz z menu rozwijanego opcję Węzeł bifurkacyjny lub Węzeł trójpodziałowy.
  10. Po osiągnięciu końca gałęzi wybierz zakończenie z menu rozwijanego w menu Neuron. Wybierz odpowiedni typ zakończenia, tj. Wysokie zakończenie, normalne zakończenie lubzakończenie lewe, aby ułatwić dopasowanie między sekcjami.
  11. Zmniejsz powiększenie mikroskopu Po prześledzeniu wszystkich dendrytów w bieżącej sekcji, wybierz zakładkę Joy Free i przejdź do sekcji, która pasuje bezpośrednio powyżej lub poniżej ukończonej sekcji.
  12. Aby zidentyfikować pasujące punkty między dendrytami w sekcji, która pasuje do ukończonej sekcji, kliknij kartę Przenieś i wybierz Dopasuj punkty. Wybierz liczbę punktów potrzebnych do dopasowania (preferowane są trzy lub więcej punktów), a następnie naciśnij przycisk OK. Kliknij zakończenie ukończonej gałęzi, a następnie kliknij gałąź. Powtórz to dla każdego punktu meczowego. Powtórz ten proces przy 100-krotnym powiększeniu, aby zapewnić dokładne dopasowanie.
  13. Dodaj pasujące gałęzie do poprzedniej sekcji bezpośrednio, klikając prawym przyciskiem myszy zakończenie. Wybierz pozycję Dodaj do zakończenia, gdy gałąź jest wyrównana z ukończoną śledzoną gałęzią i śledź zgodnie z wcześniejszym opisem.
  14. Po prześledzeniu wszystkich dendrytów każdej sekcji, prześledź akson przy użyciu tego samego procesu, wybierając Axon z menu Neuron.
  15. Przejdź do sekcji Strona główna, ponownie wyrównaj rekonstrukcję z obrazem mikroskopu na żywo i wybierz Kontury z zakładki Obrys. Wybierz wstępnie zdefiniowany kontur/obramowanie warstwy/obramowanie regionu i kliknij, aby obrysować kontur. Wybierz opcję Zakończ otwarty kontur. Obrysuj wszystkie żądane warstwy i kontury regionów.
  16. Użyj wizualizacji 3D w zakładce Śledzenie, aby zobrazować rekonstrukcje w 3D.
  17. Aby nagrać filmy z rekonstrukcjami 3D (Wideo 1), otwórz rekonstrukcję 3D i otwórz Utwórz filmy. Ustaw miejsce docelowe pliku i żądaną prędkość obrotową. Zaleca się ustawienie obrotu na 270°. Wybierz opcję Rozpocznij nagrywanie, nagrywaj przez kilka sekund, a następnie kliknij przycisk Obracaj automatycznie. Wybierz opcję Zatrzymaj nagrywanie, gdy jest to wymagane. Edytuj wideo za pomocą oprogramowania do edycji wideo (Spis materiałów).
  18. Aby wyeksportować pliki do plików TIFF lub JPEG, wybierz Plik | Eksport | Eksportuj obrys jako obraz. Wybierz współczynnik μm/piksel i wybierz opcję Dopasuj. Wybierz kolor tła i wybierz Plik. Nazwij plik, wybierz Tiff lub JPEG i naciśnij Zapisz. Aby wyeksportować pliki do plików wektorowych, wybierz punkt menu Plik | Eksport | Eksportowanie obrysów jako plików wektorowych.
  19. Użyj oprogramowania do analizy rekonstrukcji neuronów, aby wykonać analizy morfometryczne.
    1. Aby przeanalizować drzewa dendrytyczne i uzyskać dendrogram, otwórz plik w Neurolucida Explorer. Wybierz pozycję Analizuj | Struktura i wybierz Dendrogram z menu rozwijanego (Rysunek 3).
    2. Aby przeprowadzić kompleksową analizę morfometryczną rekonstrukcji 3D (złożoność rozgałęzień, objętości gałęzi i somy, pole powierzchni), otwórz plik w oprogramowaniu. Na karcie Widok kliknij przycisk Zaznacz wszystko. Wybierz kartę Analizowanie. Następnie wybierz opcję Analiza struktury i struktury gałęzi.

3. Rozwiązywanie problemów

  1. Zmień ustawienia aparatu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, ustaw czas ekspozycji na mniej niż 100 ms, a wzmocnienie i przesunięcie jak najbliższe 0.
  2. Jeśli oprogramowanie do rekonstrukcji neuronów nie wyświetla automatycznie śledzonych konturów jako ciała komórki 3D w wizualizacji 3D w zakładce Śledzenie, wybierz Wybierz obiekty w zakładce Śledzenie, przytrzymaj Ctrl na klawiaturze i kliknij wszystkie narysowane kontury, kliknij prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierz Ustaw treść komórki z menu rozwijanego.
  3. Aby dostosować parametry z pojedynczej gałęzi, wybierz drzewo (Wybierz obiekty na karcie Śledzenie) i ustaw korektę z wszystkich punktów za pomocą menu rozwijanego po kliknięciu prawym przyciskiem myszy. Wybierz opcję Modyfikuj pozycję z, a następnie wybierz opcję Shift z value i wprowadź wymaganą wartość.
  4. Wyrównaj rekonstrukcje za pomocą opcji "Idź do" w zakładce "Przesuń", gdy konieczne jest przemieszczenie się na dużą odległość nad obrysem.
  5. Dodaj dodatkowe węzły w dowolnym momencie procesu przebudowy. Wybierz gałąź, w której ma zostać umieszczony węzeł (Wybierz obiekt w zakładce Śledzenie i kliknij gałąź), kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wstaw węzeł do wybranego drzewa. Następnie kliknij odpowiednie miejsce na gałęzi.
  6. Podczas rekonstrukcji złożonego neuronu należy śledzić pasujące gałęzie pojedynczo, a następnie łączyć je w celu łatwiejszej identyfikacji gałęzi. Śledź gałęzie w nowej sekcji pojedynczo, a następnie dołącz te gałęzie do pasujących gałęzi w poprzedniej sekcji, najeżdżając kursorem na zakończenie gałęzi, która ma zostać połączona, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Łącz, a następnie najedź kursorem na zakończenie, z którym ma zostać połączona gałąź i kliknij.
  7. Jeśli gałąź jest śledzona pod niewłaściwym typem drzewa, wybierz drzewo, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Zmień typ drzewa, a następnie wybierz właściwy typ drzewa.
  8. Jeśli punkt jest umieszczony niepoprawnie, naciśnij Ctrl + Z lub kliknij przycisk Cofnij w menu Śledzenie, aby usunąć ostatni punkt. Jednak ta procedura nie zadziała, jeśli joystick zostanie użyty do poruszania się po sekcji przed próbą usunięcia punktu. W takim przypadku punkt może zostać usunięty po zakończeniu odgałęzienia. Zaznacz gałąź (naciśnij Wybierz obiekt i kliknij gałąź), najedź kursorem na punkt, który chcesz usunąć, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz usuń punkt.
  9. Jeśli nie masz pewności, czy dwie gałęzie są dopasowane, 1) użyj karty Wizualizacja 3D na trasie, aby sprawdzić, czy gałęzie pasują do siebie w płaszczyźnie z, lub 2) użyj funkcji Pokaż flankowanie w Menedżerze sekcji szeregowych, aby wyświetlić sekcje bezpośrednio powyżej i poniżej bieżącej sekcji w kolorze szarym.
  10. Jeśli sekcja jest odwrócona, przejdź do Narzędzia na karcie Śledzenie. Wybierz Dostosuj skalowanie XY i zmień oś X na -1. Następnie wybierz opcję Popraw skurcz Z i zmień oś Z na -1. Następnie śledź gałęzie jak zwykle. Pamiętaj, aby cofnąć te zmiany podczas przechodzenia do sekcji, która miała pierwotną orientację. Zmiana osi x i z nie spowoduje zmiany etykiet końcówek rozgałęzień, dlatego podczas łączenia należy upewnić się, że używane są prawidłowe zakończenia.
  11. Prawidłowy skurcz Z można skorygować, jeśli występuje znaczna różnica między grubością ciętego przekroju a zmierzoną grubością zamontowanego. Na karcie Śledzenie wybierz Narzędzia, a następnie Popraw skurcz Z i wprowadź współczynnik skurczu dla osi Z jako dziesiętną reprezentację grubości cięcia podzielonej przez grubość zamontowanego.

Wyniki

Neurony w obszarze CA2 hipokampa wypełniono biocytyną po dokonaniu rejestracji elektrofizjologicznych (Ryciny 1Ac, Ad oraz 1Bc, Bd). Przezcięcia utrwalono przez noc po zakończeniu rejestracji, a charakterystykę neurochemiczną i morfologiczną neuronów przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym opracowaniu.

Zawartość białek wiążących wapń lub ogólną zawartość białek w wypełnionych interneuronach określono poprzez inkubację skrawków najpierw z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi. Wybór użytych przeciwciał pierwszorzędowych zależał od charakterystyki wyładowań interneuronów podczas rejestracji. Do wizualizacji wypełnionego biocytyną interneuronu zastosowano Avidin-AMCA, natomiast do charakterystyki neurochemii interneuronów wykorzystano przeciwciała przeciwko mysi znakowane fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) oraz kozie przeciwciała przeciwko królicze znakowane Texas Red (TR) (Rysunek 1Bb).

Po wizualizacji fluorescencyjnej zastosowano protokół HRP w celu uwidocznienia biocytyny (Rysunek 1Ab). Następnie, przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji neuronów, wykonano trójwymiarowy rysunek szczegółowej anatomii interneuronów CA2 (Rysunek 2 oraz Rysunek 3a). W Filmie przedstawiono rekonstrukcję 3D komórki koszyczkowej zarejestrowanej i wypełnionej w obszarze CA2. Rekonstrukcje neuronalne uznano za kompletne, jeśli zarówno drzewo dendrytyczne, jak i aksonalne mieściły się w obrębie skrawka o grubości 450-50 μm. Słabe barwienie drzewa aksonalnego oceniano na podstawie obecności uciętych gałęzi z otwartymi końcami na górnej lub dolnej krawędzi skrawka lub w przypadku barwienia ograniczonego do początkowego segmentu aksonu i bardzo proksymalnych gałęzi. Rysunek 4 przedstawia przykłady prawidłowego i słabego barwienia HRP po wizualizacji biocytyny.

Analizę morfometryczną rekonstrukcji 3D (Rycina 3>) można przeprowadzić w celu wykazania złożoności rozgałęzień, powierzchni soma oraz powierzchni i objętości drzew dendrytycznych i aksonalnych.

Morfologia i elektrofizjologia neuronów, komórki koszykowe obszaru CA2, schematy, dane o aktywności, analiza synaptyczna.
Rycina 1: Rekonstrukcje neuronalne dwóch typów komórek koszyczkowych zarejestrowanych i wypełnionych w obszarze CA2 hipokampa oraz skorelowane dane elektrofizjologiczne uzyskane po rejestracjach wewnątrzkomórkowych in vitroRysunek ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniejszych badań23,24SO warstwa orientacyjna, SP warstwa piramidalna, SR warstwa promienista, SLM warstwa lakunarnie molekularna. (A) Aa: Rekonstrukcja komórki koszykowej CA2 z ograniczonym drzewem dendrytycznym i aksonalnym, wykonana za pomocą rurki rysunkowej (10X). Dendryty zaznaczono kolorem czarnym, a akson kolorem czerwonym. Ab: Obraz komórki koszykowej wypełnionej biocytyną po zastosowaniu opisanego tutaj protokołu z użyciem awidyny-HRP. Ac: Reprezentatywny zapis odpowiedzi napięciowych na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego i depolaryzującego w komórce koszykowej CA2 z ograniczonym drzewem dendrytycznym i aksonalnym. Ad: Przykład połączeń między komórką piramidalną CA2 a komórką koszykową o wąskim drzewie, zarejestrowany przy użyciu elektrod ostrych. Średnie złożone potencjały postsynaptyczne pobudzające (EPSP) wykazują krótkotrwałą depresję serii, widoczną podczas odpowiedzi na serie trzech impulsów. (B) Ba: Rekonstrukcja 2D komórki koszykowej obszaru CA2 o rozległych drzewach dendrytycznych i aksonalnych wykonana za pomocą rurki rysunkowej (10X). Drzewo dendrytyczne tej komórki koszykowej (kolor czarny) rozciągało się promieniście przez wszystkie warstwy obszaru CA2 oraz poziomo w warstwach SO i SP obszarów CA2 i CA3. Jeden dendryt poziomy sięgał również obszaru CA1. Akson (kolor czerwony) rozciągał się do obszarów CA3 i CA1. Bb: Wypełniona biocytyną (barwienie AMCA) komórka koszykowa była immunoreaktywna wobec PV (barwienie FITC) i immunonegatywna wobec CB (barwienie Texas-Red). Bc: Reprezentatywny zapis odpowiedzi napięciowych na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego i depolaryzującego w komórce koszykowej obszaru CA2 o rozległym drzewie dendrytycznym i aksonalnym. Bd: Średnie wartości kompozytowe EPSP wykazują krótkotrwałe ułatwienie widoczne podczas odpowiedzi na serie trzech impulsów. Przykłady innych typów interneuronów zarejestrowanych w obszarze CA2 można znaleźć w poprzednich badaniach.25,30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Żółte modelowanie struktury 3D; schematy (A: wykres konturowy, B: powierzchnia, C: analiza sieci neuronowej).
Rycina 2: Trójwymiarowa rekonstrukcja ciała komórki. (A) Trójwymiarowe śledzenie konturów ciała komórki. Widok różnych konturów odrysowanych na różnych poziomach osi z podczas ogniskowania na ciele komórki. (B) Widok 3D różnych konturów. (C) Widok 3D ciała komórki pod innym kątem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat mapowania neuronalnego, wykres rozgałęzień dendrytycznych, histogram analizy rozkładu rozgałęzień.
Rysunek 3: Analizy morfometryczne trójwymiarowych rekonstrukcji neuronów. (ARekonstrukcja 3D wąskiej komórki koszykowej obszaru CA2. Każda gałąź dendrytyczna jest reprezentowana innym kolorem (zielonym, niebieskim, czerwonym i różowym), a akson zaznaczono kolorem jasnoniebieskim.B) Dendrogram komórki koszykowej przedstawiający liczbę rozgałęzień dendrytycznych i długość każdego segmentu znajdującego się w obrębie sfer koncentrycznych względem somy i w 100 μm odległości od somy. Kolory na dendrogramie odpowiadają kolorom dendrytów w punkcie A. (C) Przykład analizy morfometrycznej przeprowadzonej na komórkach piramidalnych obszaru CA2 (zaadaptowano z wcześniejszego badania23). Liczbę odgałęzień dendrytycznych nanieścono na wykres w funkcji odległości od somy komórek piramidalnych obszaru CA2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy porównujący struktury neuronalne z oznakowanymi obszarami; analiza wizualna szczegółów komórkowych.
Rycina 4: Przykłady prawidłowego (A) i nieprawidłowego (B) barwienia HRP. (AOdzyskanie biocytyny ujawniło bardzo dobrze wypełniony interneuron w obszarze CA2. Ciało komórkowe (CB) jest ciemno barwione i ma wyraźne kontury. Dendryty mają strukturę paciorkowatą i wykazują obecność kolców (oznaczonych czerwonymi gwiazdkami). Drzewo aksonalne (A) jest gęste i wykazuje obecność małych zakończeń presynaptycznych (boutons).B) Przykład słabego barwienia dendrytów i aksonów dwóch komórek piramidowych w obszarze CA2. Barwienie ciał komórkowych (CB) jest blade i nie posiada wyraźnego obrysu. Słabe barwienie często wiąże się z krótszymi rejestracjami elektrofizjologicznymi, co skutkuje obecnością bardzo niewielkiej liczby wypełnionych biocytyną gałęzi. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1: Rekonstrukcja 3D neuronu typu komórki koszykowej obszaru CA2 z ograniczonym drzewem dendrytycznym (nazywanej również komórką koszykową CA2 o wąskim drzewie) z somą w stratum pyramidale, dendrytami obejmującymi wszystkie warstwy oraz aksonem w stratum pyramidale obszaru CA2 oraz sąsiednich warstwach stratum oriens i radiatum. Bardzo niewielka liczba odgałęzień dotarła do proksymalnego stratum oriens oraz stratum pyramidale obszaru CA3. Komórka ta została wypełniona biocytyną po rejestracjach elektrofizjologicznych, a przekroje przetworzono z użyciem awidyny-HRP zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym opracowaniu. Ze względu na przecinanie, odzyskano jedynie fragment aksonu w obrębie głębokości skrawka, natomiast dendryty pozostały nienaruszone. Dendryty są koloru ciemnoróżowego, a akson białego. Granice warstw i regionów zostały dodane na początku filmu. Rekonstrukcja 3D: Georgia Economides – wideo 3D: Svenja Falk. Film został nagrany za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji neuronów, zgodnie z opisem w kroku 2.17, i zmontowany w programie do edycji wideo. Link do filmu:30. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Stosowane roztwory Skład/Instrukcje
Roztwór utrwalający4% paraformaldehyd, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB)
Bufor fosforanowy 0,1 M pH 7,6Dodać 10 ml 1 M buforu fosforanowego (roztwór zapasowy) do 90 ml wody destylowanej 
Bufor fosforanowy (PBS) pH 7,4/7,5Do 90 ml wody destylowanej dodać 10 ml 0,1 M buforu fosforanowego, 0,2 g KCl oraz 8,76 g NaCl.
bufor TRIS pH 7,5Rozpuścić 5,72 g chlorowodorku Trisu oraz 1,6 g zasady Trisu w 50 ml wody destylowanej. Następnie uzupełnić objętość wody destylowanej do 1 l.
Buforowy roztwór utrwalający z glutaraldehydem i paraformaldehydem4% paraformaldehydu, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym. 
roztwór ABC Roztwór należy przygotować co najmniej 30 minut przed użyciem z zestawu ABC. Do 2,5 ml PBS dodać 1 kroplę roztworu A i 1 kroplę roztworu B.
żywicą epoksydowa Durcupan: Aby przygotować 20 doniczek: 20 g komponentu A, 20 g komponentu B, 0,6 g komponentu C i 0,4 g komponentu D- 
Aby chronić wagę przed rozlaniem substancji, należy przykryć talerzyk kółkiem z papieru filtracyjnego. Odważ starannie odczynniki do zlewki z dzióbkiem w proporcjach określonych powyżej. Wymieszaj dokładnie, energicznie mieszając dwoma drewnianymi pręcikami przez co najmniej 5 min. Mieszanina powinna przybrać ciemnobrązowy kolor i jednolitą gęstość. Umieść zlewkę w piecu w temperaturze ~50 °C przez maksymalnie 10 min, aby usunąć jak najwięcej pęcherzyków powietrza. UWAGA: Jeśli zlew zostanie pozostawiony w piekarniku na dłużej niż 10 min, żywica zacznie polimeryzować. Przelej żywicę do plastikowych pojemników lub strzykawek o pojemności 5 ml, opisz je datą i przechowuj w -20 °C zamrażarka gotowa do użycia.

Tabela 1: Tabela roztworów. 

Dyskusja

Zapisy elektrofizjologiczne in vitro (ryc. 1 Ac,d i Bc,d) w połączeniu z procedurami histochemicznymi i immunohistochemicznymi umożliwiają ujawnienie szczegółowej morfologii, zawartości białka wiążącego wapń i tożsamości zarejestrowanych dorosłych interneuronów korowych. W regionie CA2 technika ta pozwoliła po raz pierwszy na zbadanie obwodów lokalnych i ujawniła podklasy interneuronów, które nie zostały wcześniej opisane w CA1 lub CA3: szerokie komórki koszykowe dendrytyczne i aksonalne (ryc. 1B), komórki dwuwarstwowe i interneurony SP-SR.

Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany w celu zachowania ultrastruktury neuronów i uzyskania doskonałej regeneracji zarówno altan dendrytycznych (w tym kolców), jak i aksonalnych. Kluczowe kroki obejmują zastosowanie techniki podwójnej fiksacji w celu zwiększenia kontrastu w mikroskopii świetlnej26 oraz dodanie aldehydu glutarowego i roztworu kwasu pikrynowego do roztworu utrwalającego w celu zwiększenia penetracji przeciwciał i zachowania ultrastruktury neuronalnej27. Delikatna przepuszczalność zamrażania i rozmrażania zapewnia lepsze zachowanie drobnej struktury, a osmyfikacja i osadzanie żywicy zmniejszają skurcz w płaszczyźnie Z28. Ponadto wizualizacja bardzo drobnych struktur (na przykład drobnych aksonów z małymi bulionami) jest ulepszona poprzez inkubację skrawków zH2O2i NaBH4 w celu zmniejszenia barwienia tła. Kontrast można również zwiększyć poprzez dodanie NiCl2 do reakcji HRP.

Opisana tutaj procedura histologiczna zapewnia doskonałe wyniki pod względem odtwarzalności i wiarygodności. Jednak czas trwania zapisów elektrofizjologicznych określi jakość barwienia biocytyną/fluorescencyjną, przy czym krótsze zapisy zwykle wiążą się ze słabym barwieniem aksonów. Wybór protokołów zapisu (zapisy wewnątrzkomórkowe z użyciem ostrych elektrod vs. zaciskanie plam na całych komórkach) może również wpływać na zatrzymywanie biocytyny i zachowanie dokładnej anatomii.

Chociaż doceniane są opisane tutaj trudności w zachowaniu drobnej struktury podczas przetwarzania histologicznego oraz czas potrzebny na rekonstrukcję przy 100-krotnym powiększeniu (1-4 tygodnie w zależności od złożoności aksonu), metoda ta daje dokładne odwzorowanie średnic dendrytycznych i aksonalnych. Stosowanie mniej wymagających protokołów w celu ujawnienia znakowania biocytyną jest zrozumiałe, jednak często uniemożliwiają one wyraźną wizualizację drobnych gałęzi aksonalnych. Detergenty, które ułatwiają wnikanie Avidin-HRP w celu ujawnienia biocytyny i przeciwciał, są często konieczne w grubych odcinkach, ale mogą zakłócić drobną strukturę. Neurobiolodzy nieustannie poszukują półautomatycznych metod rekonstrukcji, ale na razie i szczególnie w przypadku aksonów biocytyna-HRP z ręczną rekonstrukcją pozostaje złotym standardem31.

Bardzo szczegółowe rekonstrukcje neuronów, zwłaszcza dokładne rysunki bulionów i węzłów aksonalnych, obecność lub brak mieliny, a bardziej ogólnie rysunek kompletnej altany aksonalnej, z odwzorowaniem dokładnych zmian średnicy aksonu na całej jego długości, dostarczają dalszych informacji do dokładnej identyfikacji odrębnego typu interneuronu. Chociaż wiele interneuronów może nie pasować dokładnie do określonej klasy, opisana powyżej technika dostarcza skorelowanych danych na temat właściwości elektrofizjologicznych neuronów, krótkotrwałej plastyczności związanej z określonym typem połączenia i szczegółowych rekonstrukcji neuronów, co pozwala na szczegółowe zbadanie schematu połączeń, na przykład w regionie CA2.

Drobna, szczegółowa struktura jest często upraszczana w modelach obliczeniowych. Chociaż jest to zrozumiałe, powoduje to utratę informacji, które mogą okazać się krytyczne w przyszłości. Analiza szczegółowych rekonstrukcji 3D z równoległymi danymi synaptycznymi pozwoli na dodanie kolejnych kryteriów klasyfikacji międzyneuronalnej. Dane mogą być deponowane w repozytoriach publicznych i wykorzystywane przez osoby zajmujące się modelowaniem do obliczeniowego badania wpływu sporadycznych zmian średnicy aksonów i mielinizacji na propagację potencjału czynnościowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie otrzymało finansowanie od Novartis Pharma (Bazylea) i Rady Badań Medycznych przyznane Prof. Alexowi Thomsonowi, Radzie Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC- BB/G008639/1), Towarzystwu Fizjologicznemu, Programowi Ramowemu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na mocy Szczegółowej Umowy o Grant nr 720270 (Projekt Ludzki Mózg SGA1) oraz na podstawie Szczegółowej Umowy o Grant nr 785907 (Projekt Ludzki Mózg SGA2). Jesteśmy niezmiernie wdzięczni prof. Alex Thomson za ustanowienie protokołu w innych regionach kory mózgowej, zapewnienie finansowania i za jej ciągłe wsparcie dla tego projektu. Wkład wniesiony przez członków laboratorium, którzy pomogli zoptymalizować protokół odzyskiwania i zrekonstruować neurony CA2, jest wdzięczny: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało przeciwko kwasowi awidyno-7-amino-4-metylokomaryno-3-octowemu (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/ml Laboratoria wektoroweA2008
Biocytyna  ≥ 98% (TLC)SigmaB4261
3,5 diaminobenzydyna (DAB) tabletka, Aby przygotować 5 mlSigmaD4293
Żywica epoksydowa Durcupan ASigma44611
Żywica epoksydowa Durcupan BSigma44612
Żywica epoksydowa Durcupan CSigma44613
Żywica epoksydowa Durcupan DSigma44614
Etanol, puriss. p.a., absolutny, ≥ 99,8%Sigma32221
ŻelatynaSigma48723
Roztwór aldehydu glutarowego, klasa I, 25 % w H2OSigmaG5882
Glicerol, ≥ 99% SigmaG5516
Kozia surowicaSigmaG9023
Kozia anty-mysia izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - 14,3 mg / mlSigmaF2653
Koza anty-królik Texas Red (TR) - 3,3 mg / mlInvitrogenT2767
Nadtlenek wodoru, 30% roztwórSigmaH-1009
Olejek immersyjny, lepkość 1.250 cSt (lit.)SigmaI0890
Chlorek niklu (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
Tetratlenek osmu, do mikroskopii elektronowej, 4% w H2O Sigma75632
Paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystaliczny SigmaP6148
Kwas pikrynowy, zwilżony wodą, ≥ 98%Sigma197378
Bufor fosforanowy 1 MSigmaP3619
Tlenek propylenu (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
Tetrawodoroboran soduVWR27885.134
SacharozaFisher scientificS/8600/53
Chlorowodorek trizma, ≥ 99.0%SigmaT5941
Baza Trizma, ≥ 99,9%SigmaT6066
Vectashield Antifade Medium montażowe, , współczynnik załamania światła 1,45 Laboratoria VectorH-1000
Vectastain Elite ABC HRP kitLaboratoria VectorPK6100
Zastosowany sprzęt 
VibratomeAgar Scientific
C4A Miseczki aluminiowe GA-MA & WSPÓLNICY, INC.
Mikroskop Leica DMR Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  fluorescencyjne źródło światła Technologie Excelitas 
Cyfrowy aparat mikroskopowy Leica DFC450 Mikrosystemy Leica 
Rapidograph rysik techniczny 0,18mm Londyńskie centrum
0,18 mm Końcówka do rapidografuLondyńskie centrum
Rapidograph pióro do rysowania technicznego 0,25 mm Londyńskie centrum
Końcówka rapidografu 0,25 mmLondyńskie centrum
System Neurolucida wraz ze stacją roboczą PC, sceną, kamerą i joystic do sterowania sceną XYZMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida wersja oprogramowania 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW graphics Suite X5Corel
Oprogramowanie do edycji wideo Adobe Premiere Pro
Szklane fiolki 14 mlFisher scientific 
graficznegraficznegraficznegraficzne

Bibliografia

  1. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
  4. Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
  5. Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
  6. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  7. Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
  8. Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
  9. Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
  10. Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
  11. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  12. Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
  13. Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
  14. Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
  15. Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621(2017).
  16. Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
  17. Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).
  18. Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
  19. Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
  20. Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
  21. West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
  22. Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
  23. Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
  24. Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
  25. Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
  26. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
  27. Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
  28. Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
  29. Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).
  30. Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).
  31. Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekonstrukcja 3Dmorfologia interneuron wrejestracja elektrofizjologicznasekcjonowanie w wibratomiereakcja awidyny z HRPbarwienie czwartotlenkiem osmubia ko wi ce wapobrazowanie fluorescencyjne
Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.