Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

23.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58595

⸱

20 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inovio Pharmaceuticals, Inc, 2Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Streszczenie

Świnka morska odegrała kluczową rolę jako istotny model małego zwierzęcia w rozwoju szczepionek na choroby zakaźne, takie jak gruźlica, grypa, błonica i wirusowe gorączki krwotoczne. Wykazaliśmy, że podanie szczepionki plazmid-DNA (pDNA) do skóry wywołuje silne reakcje humoralne u świnki morskiej. Jednak wykorzystanie tego zwierzęcia do modelowania odpowiedzi immunologicznych było w przeszłości nieco ograniczone ze względu na brak dostępnych odczynników i protokołów do badania odpowiedzi limfocytów T. Limfocyty T odgrywają kluczową rolę zarówno w mechanizmach immunoprofilaktycznych, jak i immunoterapeutycznych. Zrozumienie odpowiedzi limfocytów T ma kluczowe znaczenie dla opracowania szczepionek przeciwko chorobom zakaźnym i onkologicznym oraz odpowiednich urządzeń do ich dostarczania. Tutaj opisujemy test immunopunktowy sprzężony z interferonem gamma (IFN-γ) (ELISpot) dla komórek jednojądrzastych krwi obwodowej świnki morskiej (PBMC). Test umożliwia naukowcom scharakteryzowanie specyficznych dla szczepionki odpowiedzi limfocytów T w tym ważnym modelu gryzoni. Możliwość oznaczania komórek wyizolowanych z krwi obwodowej daje możliwość śledzenia immunogenności u poszczególnych zwierząt.

Wprowadzenie

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu umożliwia wykrywanie komórek wydzielających interferon gamma (IFN-γ) po rewakcynacji antygenowej w populacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) pobranych od świni morskich rasy Hartley. Zastosowaliśmy ten test do charakterystyki kinetyki i wielkości odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu po zastosowaniu schematu szczepień przeciwko grypie u świnek morskich. Wierzymy, że protokół ten znacząco przyspieszy przedkliniczny rozwój programów szczepień w tym wysoce istotnym modelu zwierzęcym.

Limfocyty T indukowane przez szczepionki odgrywają istotną rolę w ochronie przed czynnikami zakaźnymi oraz w immunoterapeutycznych ścieżkach leczenia innych chorób. Znaczenie limfocytów T zostało podkreślone w wielu badaniach nad szczepionkami. Immunizacja fretka i myszy plazmidowym DNA (pDNA) kodującym hemaglutyninę H5 i neuraminidazę N1 zapewniła ochronę przed zachorowalnością i śmiertelnością podczas ekspozycji na wirusa grypy w przypadku braku przeciwciał neutralizujących, co wskazuje na istotną rolę odporności komórkowej zależnej od limfocytów T1. Oprócz silnej neutralizującej odpowiedzi humoralnej, limfocyty T pełnią kluczową rolę nie tylko w eliminacji wirusa2, ale także w ochronie przed zakażeniem wirusem RSV (RSV) u myszy3. U ludzi obecność limfocytów T CD8+ była powiązana ze zmniejszoną ciężkością przebiegu choroby podczas pandemii H1N1 w 2009 roku4. Liczba limfocytów T CD4+ wraz z określonymi stężeniami cytokin w osoczu korelują z ciężkością choroby u dzieci zakażonych RSV5.

Świnia morska zyskała znaczenie jako model laboratoryjny w badaniach i opracowaniach w różnych obszarach medycyny, takich jak uczulenie skóry, badania żywieniowe, badania układu słuchowego oraz, co najistotniejsze dla niniejszej pracy, choroby zakaźne. Była ona kluczowa dla odkrycia szczepionek przeciwko gruźlicy i błonicy. W ostatnim czasie świnia morska jest wykorzystywana jako model grypy6 oraz wirusa Ebola7. Ponadto, dzięki podobieństwu fizjologicznemu do ludzkiej skóry8, świnia morska stanowi dostępny model małego zwierzęcia do badania metod podawania leków przez skórę. W przeciwieństwie do jej znaczenia jako modelu laboratoryjnego, dostępność specyficznych dla świni morskiej testów i sond do charakteryzacji odpowiedzi immunologicznych pozostaje ograniczona9. Niedostępne były podstawowe testy komórkowe, takie jak test immunospot (ELISpot) dla IFN-γ, który jest rutynowo stosowany w badaniach przedklinicznych i klinicznych do wyliczania odpowiedzi limfocytów T.

Pierwsze testy immunospot w fazie stałej (ELISpot) zostały wykorzystane do określenia liczby specyficznych komórek wydzielających przeciwciała w zróżnicowanej populacji limfocytów B10,11. Metoda ta została rozwinięta w celu wykrywania komórek wydzielających cytokiny, w tym IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alpha, TNF-beta, granzym B oraz IFN-γ. Test ELISpot charakteryzuje się wysoką czułością; potencjalnie można wykryć każdą komórkę produkującą cytokiny. Przekazano, że granica wykrywalności dla testów ELISpot jest niższa niż 10 plamek na 100 000 PBMC12. Niedawno udostępniono parę przeciwciał specyficznych dla IFN-γ świnki morskiej13, co otworzyło możliwość uzupełnienia tego braku w danej dziedzinie.

IFN-γ jest uważany za ważną cząsteczkę efektorową w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej; może być produkowany i wydzielany przez limfocyty T CD4 oraz CD8 po ich aktywacji. IFN-γ pełni szeroki zakres funkcji biologicznych w kontekście odpowiedzi immunologicznej na infekcję wirusową, takich jak aktywacja makrofagów oraz zwiększenie ekspresji głównego układu zgodności tkankowej (MHC) I i MHCII. Promuje on również różnicowanie limfocytów B, hamuje wzrost limfocytów T pomocniczych typu 2 oraz aktywuje komórki natural killer. IFN-γ blokuje replikację wirusa w zainfekowanych komórkach somatycznych i zwiększa ekspresję cząsteczek MHC. Zatem produkcja IFN-γ jest bardzo ważnym wskaźnikiem jakości odpowiedzi limfocytów T na szczepionkę lub patogen.

Ważnym aspektem przedstawionego tutaj testu IFN-γ ELISpot jest zastosowanie PBMC zamiast splenocytów13. PBMC można uzyskać poprzez przetworzenie próbki krwi pobranej w sposób nieterminalny, podczas gdy pozyskanie splenocytów wymaga uśmiercenia zwierzęcia przed pobraniem śledziony. Wykorzystanie PBMC umożliwia monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na IFN-γ w określonym czasie oraz ocenę efektów wpływających na odpowiedzi limfocytów T, takich jak schematy szczepień typu prime-boost14.

Dla badaczy obecnie wykorzystujących świnki morskie jako model zwierzęcy, metoda IFN-γ ELISpot rozszerzy zakres możliwych do uzyskania danych naukowych. Jej dostępność może obecnie ograniczyć konieczność prowadzenia badań na mniej odpowiednich modelach zwierzęcych dla danej choroby, które wcześniej wybierano ze względu na dostępność odczynników do badania odpowiedzi komórkowych. Wykorzystanie PBMC zamiast śledziony lub węzłów chłonnych umożliwia przeprowadzanie eksperymentów nieterminalnych oraz ciągłe monitorowanie poszczególnych zwierząt.

Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis kroków zaangażowanych w wykrywanie komórkowej odpowiedzi IFN-γ u świni pomorszych na szczepionkę pDNA. Opisujemy naszą konkretną procedurę podawania oraz przedstawiamy ogólną analizę ELISpot, obejmującą pobieranie krwi, przetwarzanie krwi, izolację PBMC, procedurę analizy oraz analizę danych. Schemat analizy ELISpot przedstawiono na Rysunku 1.

figure-introduction-1
Rycina 1: Schematyczny przegląd protokołu ELISpot dla świnki morskiej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) Acculab.

UWAGA: Protokół wymaga użycia potencjalnie niebezpiecznych materiałów. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki producenta i noszenie odpowiedniego sprzętu osobistego (PPE) przez cały czas trwania procedury.

1. Przygotowanie miejsca szczepienia świnki morskiej, śródskórne wstrzyknięcie Mantoux i zabieg CELLECTRA-3P-EP

  1. Przygotowanie miejsca zabiegowego na śwince morskiej.
    1. Umieścić świnkę morską w komorze indukcyjnej i znieczulić 5% parą izofluranu.
    2. Wyjmij zwierzę z komory i umieść stożek nosowy na miejscu, dostarczając 2% pary izofluranu, aby utrzymać znieczulenie przez cały zabieg.
    3. Obszar golenia około 4cm2 na boku brzucha.
    4. Zdezynfekuj ogolony obszar wacikiem na bazie etanolu.
  2. Iniekcja preparatu pDNA i procedura elektroporacji.
    1. Użyj strzykawki insulinowej, aby wstrzyknąć 100 μl preparatu do skóry właściwej techniką Mantoux. Igła jest wprowadzana pod kątem 10 stopni do ciała zwierzęcia.
    2. Wyjąć igłę i natychmiast wprowadzić matrycę elektrod CELLECTRA-3P® w poprzek bąbla iniekcyjnego i przyłożyć pole elektryczne.
    3. Usuń zwierzę ze znieczulenia i monitoruj jego powrót do zdrowia.

2. Krwawienie niekońcowe

  1. Pobranie krwi z żyły szyjnej znieczulonej świnki morskiej.
    1. Umieścić świnkę morską w komorze indukcyjnej i znieczulić zwierzę zgodnie z opisem w ppkt 1.1.1
    2. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27G 1/2 cala należy naciąć żyłę szyjną znieczulonego zwierzęcia i pobrać 3 ml krwi.
    3. Natychmiast przenieś krew do probówki do pobierania krwi K2EDTA, kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać krew z antykoagulantem i umieść na lodzie.
      UWAGA: Unikanie krzepnięcia krwi ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przetwarzania próbki krwi w dalszej części procesu.
    4. Monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia.

3. Przetwarzanie próbek krwi

  1. Oddzielanie PBMC od krwi pełnej przez wirowanie w gradiacji gęstości
    1. Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, wszystkie prace od tego momentu powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z zastosowaniem techniki aseptycznej.
    2. Rozcieńczoną krew należy stopniowo rozcieńczać na 4,5 ml Ficoll-Paque Plus w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Unikaj zakłóceń interfejsu. UWAGA: Aby zapewnić prawidłową separację, Ficoll-Paque musi mieć temperaturę pokojową.
    3. Probówki wirówkowe przy 800 rcf przez 30 min z wyłączonym hamulcem.
      UWAGA: Alternatywnie do separacji PBMC można zastosować probówki SepMate™ (STEMCELL Technologies). Rozcieńczoną HBSS krew dodaje się do 15 ml probówki SepMate wypełnionej 3,5 ml Ficoll-Paque Plus, a następnie odwirowuje w temperaturze 1200 rcf przez 10 minut (hamulec włączony). Ta oszczędzająca czas technika wirowania gradientowego zapewnia równą żywotność, wydajność komórek i tworzenie plamek.
    4. Zebrać warstwę Buffy-Coat i rozcieńczyć w pożywce R10 (10% (v/v) aktywowany termicznie FBS i 1% (v/v) Pen/Strep w RPMI1640 podłożu) do całkowitej objętości 15 ml.
    5. Komórki peletowe przez odwirowanie w temperaturze 450 rcf przez 5 min.
    6. Umyj komórki dwukrotnie pożywką R10.
    7. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml R10 i przepuścić zawiesinę komórek przez sitko komórkowe 70 μm do nowej probówki.
    8. Policz komórki i określ liczbę żywych komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
    9. Rozcieńczyć komórki pożywką R10 do stężenia 1x10^6 żywych komórek na ml.

4. Przygotowanie płytek ELIS i stymulacja komórkowa

  1. Pokryj i zablokuj dołki 96-dołkowej płytki ELISpot z membraną PVDF przed wysiewem PBMC.
    1. Płytki należy poddawać wstępnej obróbce przez 60 sekund. Wstępna obróbka etanolem spowoduje mniej niespecyficznych powstawania plam i plam o lepszej definicji.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby cała membrana miała kontakt z 15 μl 35% etanolu.
    2. Po 60 sekundach dodaj 150 μl 1x PBS na studzienkę, a następnie opróżnij studzienki, odwracając płytki.
      UWAGA: Wstępna obróbka etanolem jest bardzo wrażliwa na czas. Nie inkubować błony studzienki dłużej niż 60 sekund. Membrany nie mogą wysychać podczas kolejnych etapów zabiegu.
    3. Umyć płytki trzykrotnie 250 μl 1x PBS na studzienkę.
    4. Pokryć 100 μl/basenik 5 μg/ml przeciwciałem przeciwko śwince morskiej IFN-γ V-E4 w PBS.
    5. Inkubować płytki przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 4 °C.
    6. Umyć płytki, dodając trzykrotnie 250 μl/studzienkę PBS.
    7. Dodać 200 μl/basenik buforowy blokujący (10% (w/v) sacharozy i 2% (w/v) BSA w PBS) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    8. Umyć płytki trzykrotnie 250 μl/studzienkę PBS.
  2. Płytki PBMC z peptydami specyficznymi dla antygenu, kontrolami pozytywnymi i negatywnymi.
    1. Rozcieńczyć pulę białkowo-peptydową w R10 do pożądanego końcowego stężenia peptydu.
    2. Oznaczyć próbkę PBMC w trzech powtórzeniach.
      UWAGA: Najpierw dodaj pożywkę ze stymulantami do płytek ELISpot, a następnie dodaj zawiesinę PBMC.
    3. Do wskazanych studzienek dodać 50 μl pożywki peptydowej R10.
    4. W celu kontroli ujemnej dodać 50 μl pustego preparatu peptydowego w R10 do wskazanych studzienek.
    5. W celu kontroli pozytywnej dodać 5 μg/ml konkanawaliny A (ConA) w pożywce R10 do wskazanych studzienek.
    6. Dodać 100 μl zawiesiny komórek PBMC do wszystkich studzienek
    7. Inkubować płytki w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 ° Celsjusza przez 18 godzin.
      UWAGA: Umieść płytki ELISpot na równej powierzchni/stojaku w inkubatorze i unikaj jakichkolwiek zakłóceń płytek w czasie inkubacji.

5. Wykrywanie punktów dodatnich pod względem interferonu gamma

  1. Inkubacja z detekcją Rozwój przeciwciał i płytki.
    UWAGA: W przypadku wszystkich kroków opisanych w tej sekcji nie jest wymagana żadna technika aseptyczna.
    1. Ostrożnie wyjmij płytki z inkubatora i bezpiecznie opróżnij studzienki. Umyj płytki, dodając trzykrotnie 250 μl/studzienkę PBS.
    2. Dodać 100 μl/basenik 2 μg/ml biotynylowanego przeciwciała przeciwko IFN-γ przeciwko śwince morskiej N-G3 rozcieńczonego w buforze blokującym.
      UWAGA: Przefiltruj (22 μm) roztwór przeciwciała, aby zredukować tło.
    3. Inkubować z przeciwciałem wykrywającym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Odrzucić sklarowany osad i przepłukać płytki, dodając trzykrotnie 250 μl/basenik PBS.
    5. Dodać 100 μl/basenik streptawidyny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną (ALP) rozcieńczonej w buforze blokującym.
      UWAGA: Roztwór filtrujący (22 μm) w celu zmniejszenia tła.
    6. Inkubować ze sprzężonym ALP-Streptawidyną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Wyrzucić roztwór ALP-streptawidyny i umyć płytki, dodając dwukrotnie 250 μl/studzienkę PBS, a następnie usunąć nadmiar PBS, odwracając płytkę i osuszając ją na czystym ręczniku papierowym.
    8. Umyj talerze, dodając jednorazowo 250 μl/studzienkę wody UltraPure DI i usuń nadmiar wody, odwracając płytkę i osuszając ją czystym ręcznikiem papierowym.
    9. Dodać 100 μl roztworu substratu BCIP/NBT (UWAGA) do każdej studzienki. Ostrzeżenie: BCIP/NBT jest wysoce łatwopalny i toksyczny w przypadku połknięcia, kontaktu ze skórą lub wdychania. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki.
    10. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
    11. Opłucz płytkę 4 razy wodą dejonizowaną. Odwróć płytkę i kran, aby usunąć nadmiar wody.
    12. Usuń plastikowy drenaż ze spodu płytek ELISpot i pozostaw płytki do wyschnięcia.
    13. Ilościowe określanie plamek należy dokonywać ręcznie lub za pomocą automatycznego czytnika ELISpot, na przykład czytnika płytek CTL-Immunospot S6.

Wyniki

Przedstawione tutaj wyniki służą jako punkt odniesienia dla oczekiwanych rezultatów po zastosowaniu niniejszego protokołu, podkreślając znaczenie kluczowych etapów i potwierdzając korzyści z opisanych optymalizacji.

Po wirowaniu w gradiencie gęstości, opisanym w kroku 3.1 protokołu, czerwona lepka ciecz na dnie probówki będzie zawierać większość erytrocytów. Jak pokazano na Ryc. 2A, nad erytrocytami znajduje się warstwa medium gradientowego. Pomiędzy warstwą przejrzystej lub żółtej plazmy na górze a medium gradientowym znajduje się biała lub jasnobrązowa warstwa tzw. buffy coat, która zawiera większość leukocytów i płytek krwi. Niepełne rozdzielenie objawiłoby się obecnością erytrocytów nad medium gradientowym. Czerwone zabarwienie plazmy na Ryc. 2A wynika najprawdopodobniej z hemolizy, ponieważ próbka krwi była przechowywana w probówce do pobierania przez 1,5 h przed przetworzeniem. Ryc. 2B przedstawia gradient przed (lewo) i po (prawo) wirowaniu w urządzeniu do izolacji PBMC. Próbka krwi na Ryc. 2B została przetworzona z minimalną zwłoką po pobraniu krwi, a plazma ma żółte zabarwienie.

Wpływ wcześniejszego zwilżenia membran etanolem (patrz krok 4.1 protokołu) na wywoływanie plamek przedstawiono na Rysunku 3. Plamki w studzienkach poddanych wstępnej obróbce wykazują lepszą definicję, a w studzienkach kontrolnych negatywnych z medium/DMSO zaobserwowano zmniejszenie liczby plamek (Rysunek 3A). Typowa żywotność przetworzonych PBMC świnki morskiej wynosi około 90% i jest zbliżona zarówno dla zwykłych probówek 15 mL, jak i urządzeń do izolacji PBMC (Rysunek 3B). Wydajność żywych komórek z 3 mL próbki krwi zazwyczaj mieści się w zakresie od 3 x 106 do 5 x 106.

Zwierzęta zaszczepiono plazmidowym DNA kodującym nukleoproteinę (NP) szczepu A/PuertoRico8 wirusa grypy H1N1. Rysunek 4 przedstawia liczbę odpowiedzi limfocytów T na IFN-γ, wyrażoną w jednostkach tworzących plamki (SFU), wygenerowanych w trakcie schematu szczepień. Test ELISpot z użyciem PBMC pobranych od zwierząt nieimmunizowanych wykazał pomijalną liczbę plamek (no tx). Czternaście dni po pierwszej immunizacji (prime), po stymulacji immunogennej odnotowano średnio 970 plamek IFN-γ na milion PBMC. Siedem dni po drugiej immunizacji (boost) odpowiedzi limfocytów T przeciwko wszystkim trzem pulom uległy zwiększeniu, osiągając średnio 5020 IFN-γ SFUs/106 PBMC. Czterdzieści sześć dni po drugiej immunizacji (memory), we krwi obwodowej odnotowano średnio łącznie 6310 IFN-γ SFUs/106 PBMC.

OPISY RYSUNKÓW:

figure-results-1
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy warstw po wirowaniu w gradiencie gęstości. (A) Próbka krwi przed (lewo) i po (prawo) wirowaniu w zwykłych probówkach. (B) Próbka krwi przed (lewo) i po (prawo) wirowaniu w urządzeniach do izolacji PBMC. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 3: Optymalizacja protokołu. (A) Typowy wygląd plamek pozytywnych dla IFN-γ w dołku płytki do testu ELISpot wykonanego zgodnie z protokołem. Przedstawiono przykładowe dołki w trzech powtórzeniach po wstępnej obróbce etanolem (po prawej) lub bez wstępnej obróbki (po lewej). Komórki inkubowano przez noc z DMSO (góra) jako kontrola bez stymulacji, peptydami dopasowanymi do antygenu (środek) lub mitogenem ConA (dół). PBMC pochodziły od tego samego osobnika zwierzęcia. Obrazy dołków wykonano za pomocą automatycznego skanera płytek. (B) Porównanie różnych probówek do gradientu gęstości zastosowanych do przetwarzania komórek. Pobrano 3 mL próbek krwi od 3 poszczególnych świni pomorskich. 1,5 mL każdej próbki przetworzono, używając albo zwykłych probówek (medium do gradientu gęstości), albo urządzeń do izolacji PBMC. Żywotność (lewa, % ± SEM) oraz liczba żywych komórek (prawa, x 106 ± SEM) zostały określone przy użyciu automatycznego systemu liczenia komórek i testu wykluczania błękitu trypanowego. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-3
Rysunek 4: Wykrycie silnych odpowiedzi odporności komórkowej w trakcie schematu szczepień. W 1. i 15. dniu podano do skóry brzucha świni mórszczyzn Hartley 30 µg pDNA kodującego nukleoproteinę (NP) grypy A, a następnie niezwłocznie wykonano elektroporację skóry. Odpowiedź w teście IFN-γ ELISpot mierzono 14 dni po pierwszej immunizacji (pierwotnej), oraz 7 dni (przypominającej) i 46 dni (pamięci) po drugiej immunizacji. Wykreślono średnią liczbę SFU + SEM dla 5 szczepionych świni mórszczyzn oraz 2 kontrolnych świni mórszczyzn (brak leczenia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Świnka morska jest cennym modelem zwierzęcym dla przedklinicznego rozwoju szczepionek i strategii podawania śródskórnego. Powyższy protokół opisuje metodologię pomiaru odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w tym wysoce istotnym modelu. Test zapewnia jasne wyliczenie obwodowych limfocytów T wytwarzających interferon-gamma po stymulacji peptydami specyficznymi dla antygenu. Kinetykę odpowiedzi immunologicznej można monitorować za pomocą nieterminalnego pobierania próbek krwi.

Zoptymalizowaliśmy protokół i zidentyfikowaliśmy krytyczne aspekty, aby uzyskać optymalne wyniki przy użyciu tego testu. Na przykład tworzenie się skrzepów krwi w probówce zbiorczej spowoduje nieoptymalną regenerację i żywotność PBMC. Świnka morska bardzo szybko krzepnie krew18. Bardzo ważne jest, aby szybko pobrać krew. Au-Birck i wsp. dostarczają obszernego przewodnika po technikach krwawienia w modelu świnki morskiej16. Ze względu na to, że pobranie krwi wymaga znieczulenia ogólnego, zaleca się zapoznanie się z obowiązującymi standardowymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi tego aspektu procedury19. Niedostatecznie znieczulone świnki morskie będą reagować poruszaniem nogami lub wokalizacją po krótkim uszczypnięciu tkanki między palcami u nóg paznokciami lub wzdrygnięciem uszu i przesunięciem wąsów do przodu po uszczypnięciu w ucho. Natychmiastowe przeniesienie krwi do probówki z antykoagulantem i dokładne wymieszanie poprzez kilkukrotne zwinięcie lub odwrócenie probówki jest niezbędnym krokiem w tym protokole. Do opisanego tu protokołu użyto probówek EDTA i nie badano żadnych innych antykoagulantów. Należy pamiętać, że EDTA jest hipertoniczny, w idealnym przypadku probówki powinny być wypełnione więcej niż do połowy, dlatego należy użyć probówki o odpowiednim rozmiarze do objętości próbki.

Przy prawidłowym przeprowadzeniu wirowanie w gradieniu gęstości konsekwentnie prowadzi do czystego przygotowania PBMC. Pożywka o gradiencie gęstości musi mieć temperaturę pokojową podczas nakładania warstw gradientu przed wirowaniem, a hamulce nie powinny być używane do zatrzymywania wirówki w przypadku korzystania ze zwykłych probówek. Znaczącą poprawą pod względem praktyczności przetwarzania PBMC było połączenie wirowania w gradionym gradimencie gęstości z urządzeniami do izolacji PBMC. Pozwala to na skrócenie czasu wirowania. Wirowanie w gradiacji gęstości w urządzeniach izolujących PBMC i zwykłych probówkach skutkuje podobną żywotnością, liczbą żywych komórek przetworzonych PBMC i tworzeniem plam. Niezależnie od rodzaju rurki użytej do separacji, zbiór kożuchy powinien nastąpić natychmiast. W dłuższym okresie czasu kontakt z podłożem o gradiencie gęstości jest cytotoksyczny dla PBMC.

Dokładne liczenie żywotnych PBMC jest ważne dla wysiewu konsekwentnie równej liczby komórek do dołków na płytce testowej. Należy zastosować jakąś metodę rozróżniania żywych i martwych. W naszym laboratorium używamy testu wykluczania trypan-niebieski i automatycznego licznika komórek.

Jakość plamki, definiowana jako plamki o ostrych krawędziach i wysokim kontraście, skutkuje poprawą dokładności i spójnym zliczaniem punktów, zwłaszcza w przypadku korzystania z automatycznego systemu liczenia. Zgodnie z zaleceniami producenta, zaobserwowaliśmy, że wstępna obróbka płytek ELISpot za etanol jest kluczowym krokiem w kierunku zmniejszenia liczby plam tła i poprawy ich definicji. Zdecydowanie zaleca się użycie czytnika płytek do obrazowania płytek testowych ELISpot na końcu protokołu. Oryginalne zdjęcia każdej studni można łatwo i efektywnie uzyskać i przechowywać. Za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, obrazy cyfrowe pozwalają również na obiektywną analizę i liczenie punktowe w porównaniu z ręcznym liczeniem przez poszczególnych operatorów.

Absolutną koniecznością dla opracowania opisywanego tutaj testu było wygenerowanie odpowiedniej pary przeciwciał interferon-gamma przeciwko śwince morskiej. Mysie przeciwciała monoklonalne V-E4 i N-G3 opracowano techniką hybrydoma z klonami komórek B od myszy, które zostały immunizowane rekombinowanym interferonem gamma20 świnki morskiej. Zgłoszono, że V-E4, który jest izotypem IgG1, i N-G3, który jest IgG2a, wiążą się zarówno z rekombinowanym, jak i natywnym antygenem. Przypisanie V-E4 jako przeciwciała wychwytującego i biotynylowanego N-G3 jako przeciwciała detekcji skutkowało wysoką czułością zarówno dla białka rekombinowanego, jak i natywnego, przy jednoczesnym zachowaniu niskiego sygnału tła w formacie sandwich-ELISA. Oba przeciwciała są dostępne dla społeczności naukowej w ramach umowy produkcyjnej prowadzonej przez laboratorium dr Huberta Schaefera, który jest współautorem tej publikacji. Zamówienia będą odbierane przez laboratorium dr Schaefera, a następnie produkowane przez partnera komercyjnego.

Doniesiono, że interferon-gamma jest niestabilny w zwykłych lub pożywkach21. Schaefer i wsp.20 stwierdzili jedynie umiarkowany spadek wskaźnika odzysku przy użyciu zdegradowanego IFN-y, który utracił funkcjonalność biologiczną, w formacie ELISA przy użyciu przeciwciał V-E4 i N-G3. Jednak wydłużenie czasu inkubacji stymulacji peptydowej PBMC powyżej 18 godzin powinno być dokładnie przetestowane.

Omówiono zalety stosowania PBMC. Jednak opisany tutaj test odzwierciedla tylko specyficzne dla antygenu odpowiedzi krążących limfocytów T na obrzeżach. Limfocyty T naciekające tkanki lub komórki wyizolowane z narządów limfatycznych, takich jak śledziona i węzły chłonne, mogą wykazywać różne właściwości 22,23,24. Nie zaobserwowano istotnych różnic w odpowiedziach komórkowych po porównaniu plamek interferonu-gamma z PBMC i splenocytów świnek morskich, które zostały zaszczepione tą samą szczepionką przeciw grypie pNP14.

W tym protokole opisaliśmy procedurę szczepienia śródskórnego. Głównym uzasadnieniem dla szczepień ID jest ukierunkowanie na dużą gęstość komórek dendrytycznych obecnych w skórze25. My i inni wykazaliśmy, że komórki te mogą być specyficznie ukierunkowane poprzez dostosowanie metody dostarczania26, preparatu27 lub projektu leku28. Aktywowane profesjonalne komórki prezentujące antygen mogą migrować do drenującego węzła chłonnego i aktywować adaptacyjny układ odpornościowy 29,30,31,32. Komórki dendrytyczne są niezbędnym typem komórek prezentujących antygen do pobudzania produktywnych komórkowych odpowiedzi immunologicznych.

W tym badaniu zwierzęta zostały uodpornione plazmidowym DNA kodującym nukleoproteinę grypy H1N1 szczep A/PuertoRico/8. Wykazano, że podawanie tej szczepionki pDNA (pNP) w połączeniu z elektroporacją wywołuje specyficzne dla antygenu odpowiedzi humoralne u świnek morskich33, fretek i naczelnych (NHP)1,34. Ponadto szczepionka ta wywołała silną odpowiedź limfocytów T u myszy po dostarczeniu do naskórka35, co można przypisać limfocytom T CD4 i CD8 poprzez stymulację peptydami reprezentującymi określone epitopy dla tych populacji komórek. Szczepionka pNP była również immunogenna po dostarczeniu błony śluzowej, jak wykazano w generowaniu odpowiedzi humoralnej u królików i świnek morskich, a także odpowiedzi komórkowych i humoralnych u myszy36. Ostatnio nasza grupa była w stanie zademonstrować generowanie odpowiedzi komórek IFN-γT u królika po podaniu domięśniowym (dane niepublikowane).

Obecnie obserwowane plamki interferonu gamma w teście ELISpot świnki morskiej nie mogą być przypisane do podzbioru limfocytów T CD4 + lub CD8 +. Szczególnie dla projektowania i rozwoju terapii immunologicznych ukierunkowanych na skórę bardzo przydatne byłoby ustalenie, czy obserwowane częstości plamek interferon-gamma są spowodowane ekspansją jednego konkretnego podzbioru, czy zrównoważoną odpowiedzią obu, w celu oceny skuteczności szczepionki w wywoływaniu prezentacji krzyżowej. To ograniczenie można przezwyciężyć poprzez ujemne sortowanie komórek dla CD4 lub CD8 przed wysiewem komórek na płytce lub przez identyfikację epitopów ograniczonych MHC klasy II (dla odpowiedzi CD4) lub MHC klasy I (dla odpowiedzi CD8).

Opisany tutaj test ELISpot interferonu-gamma z wykorzystaniem PBMC świnki morskiej odpowiada na potrzebę oceny przebiegu odpowiedzi komórkowych w modelu laboratoryjnym świnki morskiej. Pozwoli to na udoskonalenie opracowywania szczepionek i protokołów podawania szczepionek na skórę. Uważamy, że pozwala to na wykorzystanie tego odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania chorób z ważnymi składnikami komórek T, takich jak TB37, Ebola38, HSV39 i inne. Ograniczy to wykorzystanie mniej istotnych modeli zwierzęcych.

Oświadczenia

Autorzy: Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick i Trevor R.F. Smith są pracownikami Inovio Pharmaceuticals i w związku z tym otrzymują od firmy wynagrodzenie i świadczenia, w tym prawo własności akcji i opcji na akcje.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom działu badawczo-rozwojowego Inovio Pharmaceuticals za pomoc techniczną oraz personelowi Acculab za świadczenie doskonałych usług hodowlanych. W szczególności chcielibyśmy podziękować Alysha Vu i Joe Agnes za korektę rękopisu. Praca ta nie została sfinansowana z żadnej konkretnej dotacji od agencji finansujących w sektorze publicznym, komercyjnym lub non-profit.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cellectra-3PInovio PharmaceuticalsID-Electroporatio urządzenie / niekomercyjne, R&
Probówka do pobierania krwi K2EDTABD367844
Hank' s Zrównoważony roztwór soliGibco 14175-079
Ficoll-Paque PlusGE Healthacre 17144003medium gradientu gęstości
Rurka SepMateSTEMCELL Technologies85415Urządzenie izolujące PBMC
RPMI Thermo Fisher11875-135
dezaktywowany termicznie FBS VWR97068-085
Pióro/Paciorkowiec Gibco 15140-122
  β-MerkaptoetanolGibco 21985-023
96-dołkowa membrana PVDF ELISpot Płytka testowa Millipore MSIPS4W10 ELISpot
Etanol Sigma459844-1L
UPDIInvitrogen10977-015Ultra-czysta woda DI
Sacharoza SigmaS7903
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
10x PBSHyCloneSH30378.03
Concanavalin A (ConA) SigmaC5275-5MG
streptawidyna sprzężona z fosfatazą alkaliczną (ALP) R& D Systems Inc. SEL002
BCIP/NBT R& D Systems Inc. SEL002
wychwytuje przeciwciało anty-świnki morskiej IFN-γ V-E4GenScriptZamówienie #:U5472CE080-3LOT # A217071153
biotynylowane wykrywanie anty-świnki morskiej IFN-γ przeciwciało N-G3 Zamówienie GenScript#:U5472CE080-1LOT # A21700598
CTL S6 Micro AnalyzerImmunoSpot#S6MIC12automatyczny czytnik płytek ELISpot
Vi-CELL XRBeckman-Coulter731050Automatyczny licznik komórek
ImmunoSpot 5.1Oprogramowanie do analizy testówImmunoSpot
ESCO Class II Type A2ESCOBiosafety
Sitko do komórek FalconCorning, Inc.VWR cat# 21008-952
Strzykawka insulinowa Exel Comfort PointMedLab Supply 26028
Wirówka Rotanta 460RHettich
Zestaw odczynników Vi-CELL XR Quad Pak BeckmanCoulter383722
Incu BezpiecznyinkubatorPanasonic-Healthcare
22 µ m FiltrThermoScientific Ustawa VWR # 597-452022 &mikro; m Filtr
KimWipesKimberly-Clark Professional VWR kat# 21903-005 ręczniki papierowe

Bibliografia

  1. Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517(2008).
  2. Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
  3. Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
  4. Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
  5. Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
  6. Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
  7. St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
  8. Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33(2017).
  9. Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
  10. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
  11. Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
  12. Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
  13. Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
  14. Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
  15. Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
  16. Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982(2014).
  17. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
  18. Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
  19. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
  20. Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
  21. Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
  22. Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
  23. Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210(2015).
  24. Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33(2017).
  25. Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123(2013).
  26. Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
  27. Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
  28. Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
  29. Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
  30. Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
  31. Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054(2014).
  32. Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
  33. Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
  34. Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
  35. Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
  36. Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
  37. Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
  38. Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
  39. Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mononuklearne kom rki krwi obwodowejswoiste dla szczepionki odpowiedzi limfocyt w Twirowanie w gradiencie g sto ciinkubacja z przeciwcia em wychwytuj cymbiotynilowane przeciwcia o detekcyjnestreptawidyna sprz ona z ALProztw r substratu BCIP NBT

Powiązane artykuły