Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

28.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58596

⸱

10 listopada 2018

 ,  , 
1Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty, University of Bern, 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Streszczenie

Celem tej metody jest ułatwienie szybkiego, czułego i specyficznego wykrywania wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii. Protokół ten może być stosowany w ramach programów nadzoru, środków bezpieczeństwa biologicznego oraz w podstawowych laboratoriach badawczych TiLV. Złoty standard diagnostyki wirusów zazwyczaj obejmuje izolację wirusa, a następnie techniki uzupełniające, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w celu dalszej weryfikacji. Może to być kłopotliwe, czasochłonne i zazwyczaj wymaga próbek tkanek silnie zainfekowanych wirusem. Zastosowanie RT-ilościowego (q)PCR w wykrywaniu wirusów jest korzystne ze względu na jego ilościowy charakter, wysoką czułość, swoistość, skalowalność i szybki czas oczekiwania na wynik. W tym miejscu opisano całą metodę podejść do wykrywania TiLV opartych na PCR, od przekroju narządów tilapii, ekstrakcji całkowitego kwasu rybonukleinowego (RNA) przy użyciu roztworu tiocyjanianu guanidu, fenolu i chloroformu, kwantyfikacji RNA, a następnie dwuetapowego protokołu PCR obejmującego komplementarną syntezę kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA) i wykrywanie TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub identyfikacji ilościowej za pomocą qPCR przy użyciu barwnika SYBR green I. Konwencjonalny PCR wymaga kroków po PCR i po prostu informuje o obecności wirusa. To ostatnie podejście pozwoli na bezwzględne określenie ilościowe TiLV do zaledwie 2 kopii, a zatem jest wyjątkowo przydatne w diagnostyce TiLV w przypadkach subklinicznych. Szczegółowy opis dwóch podejść PCR, reprezentatywne wyniki z dwóch laboratoriów oraz dokładne omówienie krytycznych parametrów obu zostały dołączone, aby zapewnić, że badacze i diagności znajdą najbardziej odpowiednią i możliwą do zastosowania metodę wykrywania TiLV.

Wprowadzenie

Globalna podaż ryb capita osiągnęła nowy rekord 20 kg w 2014 roku, co było spowodowane dynamicznym wzrostem w akwakulturze. Akwakultura pozostaje jednym z najszybciej rozwijających się sektorów produkcji żywności dla zwierząt na świecie i jest jedynym sektorem produkcji żywności dla zwierząt, który rozwija się szybciej niż populacja ludzka1. Tilapiine cichilds to druga najważniejsza ryba słodkowodna hodowana na świecie, o całkowitej globalnej produkcji 6,4 miliona ton (MT) i szacowanej wartości 9,8 miliarda dolarów amerykańskich w 2015 roku2. Dziesięciu największych producentów tilapii to Chiny (1,78 MT), Indonezja (1,12 MT) i Egipt (0,88 MT), a następnie Bangladesz, Wietnam, Filipiny, Brazylia, Tajlandia, Kolumbia i Uganda2. Oczekuje się, że do 2030 r. światowa produkcja tilapii wyniesie około 7,3 MT3. Tilapia stały się tak ważnym globalnym źródłem pożywienia nie tylko dlatego, że są niedrogim źródłem białka4, ale także dlatego, że są łatwe do rozmnażania w szerokim zakresie warunków wodnych i klimatycznych5,6. Jeszcze kilkadziesiąt lat temu uważano, że istnieje niewiele istotnych z handlowego punktu widzenia chorób zagrażających uprawie tilapii, ale to już nie jest prawda. Pojawiająca się choroba wirusowa zwana chorobą wirusa jeziora tilapii (TiLVD) jest pierwszą w historii krytyczną epidemią choroby stwierdzoną w tilapii, a cała branża jest zagrożona. Choroba ta ma poważne konsekwencje społeczno-ekonomiczne i stanowi bezpośrednie zagrożenie dla bezpieczeństwa żywnościowego milionów ludzi w Afryce7, Azji i Ameryce Południowej. Na początku 2018 roku Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt (OIE) poinformowała, że czynnik etiologiczny tej choroby, TiLV, został oficjalnie wykryty na trzech kontynentach obejmujących osiem krajów8, a od czasu aktualizacji tej karty informacji o patogenach pojawiło się więcej doniesień o TiLV w Tanzanii, Ugandzie9, Indonezji10, Tajwan11 i Peru12. TiLV jest nowym jednoniciowym wirusem RNA, opisanym jako wirus podobny do ortomykso, ponieważ zawiera różnorodne cechy przypominające inne ortomyoksowirusy, takie jak wirus grypy lub zakaźnej anemii łososia (ISAV)13. Po raz pierwszy został zidentyfikowany w następstwie ogromnych strat dzikich i hodowlanych tilapii w Jeziorze Galilejskim, Izrael14. Następnie podobne ogniska choroby określane jako śmiertelność letnia i zespół jednomiesięcznej śmiertelności związany z zakażeniem TiLV odnotowano odpowiednio w tilapii nilowej (Oreochromis niloticus) w Egipcie15 oraz tilapii nilowej i czerwonej hybrydowej (Oreochromis spp.) w Tajlandii16. Historycznie rzecz biorąc, wykrywanie wirusów zwierząt wodnych odbywa się poprzez wzrost i izolację wirusów w hodowli komórkowej. Różne linie komórkowe zostały przetestowane pod kątem rozmnażania i izolacji TiLV, w tym komórki E-11 pochodzące z ryby wężogłowej (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB i TmB pochodzące z Oreochromis mossambicus18 oraz OnlB i OnlL pochodzące z tilapii nilowej (O. niloticus)19. O ile hodowla wirusa ma tę zaletę, że dostarcza materiału do dalszych eksperymentów, o tyle wadą jest to, że potrzebuje co najmniej 4-7 dni, aby zaobserwować powstawanie efektów cytopatycznych (CPE), a co najważniejsze, różne wirusy ryb, które są bardziej przystosowane do replikacji, mogą się rozmnażać i wytwarzać podobne CPE.

W ciągu ostatnich kilku dekad nastąpiło odejście od tradycyjnych, często czasochłonnych metod diagnostycznych, takich jak hodowla komórkowa, serologia i wykrywanie antygenów oraz zastępowanie ich szybszymi i bardziej czułymi testami wykrywania opartymi na kwasach nukleinowych20,21. Świadczy o tym fakt, że wiele testów qPCR zostało opracowanych jako ważne metody diagnostyczne dla wielu chorób wirusowych zwierząt wodnych, takich jak ISAV22,23, wirusowy wirus posocznicy krwotocznej (VHSV)24,25, betanodavirus26,27 alfawirus łososiowa28, irydowirus ryb29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, oraz wirus choroby limfocysty (LCDV)31. Pilnie potrzebne są solidne metody diagnozowania i nadzoru nad patogenami w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się TiLV. Takie metody powinny umożliwiać wczesne wykrycie zakażenia przed wystąpieniem objawów klinicznych oraz wykrycie niskiego miana wirusa. Do tej pory do wykrywania TiLV w tkankach ryb opracowano różne protokoły PCR, w tym RT-PCRxref">14,32, zagnieżdżone RT-PCR18, częściowo zagnieżdżone RT-PCR i RT-qPCR32,34. Porównanie izolacji RT-qPCR i wirusa w podatnych liniach komórkowych do wykrywania TiLV wykazało, że RT-qPCR był 1000 razy bardziej czuły niż izolacja wirusa32. Chociaż każdy opublikowany protokół PCR zgłaszał różne czułości wykrywania TiLV, większość testów jest bardzo czuła, a granice wykrywalności kopii wirusa wynoszą 7,5 kopii33, 7 kopii18 lub 2 kopie32 na reakcję.

Celem tego artykułu o metodach jest szczegółowe wyjaśnienie, jak przeprowadzać testy wykrywania TiLV, zaczynając od pobrania tkanki tilapii, poprzez ekstrakcję całkowitego RNA, syntezę cDNA, a następnie testy PCR specyficzne dla TiLV. W szczególności opisano kompleksowe protokoły zarówno konwencjonalnego RT-PCR, jak i zielonego RT-qPCR opartego na SYBR, aby spodobać się szerokiemu gronu naukowców dążących do wykrycia TiLV. Ta pierwsza jest mniej czuła, ale jest zazwyczaj tańszą opcją wykrywania. Ten ostatni wymaga bardziej skomplikowanej infrastruktury, takiej jak ilościowa maszyna do PCR i droższe odczynniki, ale ma zalety tego, że jest ilościowy, szybki i bardzo czuły, co oznacza, że może być stosowany do wykrywania TiLV u subklinicznie zakażonych ryb. Protokoły RT-PCR i RT-qPCR przeprowadzono w dwóch różnych laboratoriach z różnymi izolatami geograficznymi TiLV, a zawarte wyniki podkreślają czułość i odtwarzalność opisanych tutaj testów.

Protokół

Protokół wykorzystania zwierząt w tym badaniu został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Kasetsart pod numerem zezwolenia ACKU 59-VET-016.

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat odczynników i sprzętu sugerowanego dla tego protokołu.

1. Pobieranie próbek tkanek

  1. Rybę należy poddać eutanazji za pomocą przedawkowania olejku goździkowego (objętość zależy od wielkości ryby i stężenia produktów, zwykle ponad 3 ml / l). Zanurz jedną czwartą kleszczy i nożyczek majonezowych w 95% (v/v) etanolu, a następnie spal sprzęt za pomocą palnika alkoholowego w celu sterylizacji sprzętu.
    UWAGA: Metanosulfonian trikainy (MS-222) może być stosowany zamiast olejku goździkowego.
  2. Znajdź wątrobę i odetnij mały kawałek (około 20-100 mg) lub zbierz 200 μl śluzu za pomocą szkła nakrywkowego lub ostrza chirurgicznego, aby usunąć śluz z przodu do tyłu ryby tilapii i umieść próbki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  3. Próbki należy natychmiast przetworzyć, przechowywać w roztworze stabilizującym RNA lub przenieść do temperatury -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Największym zadaniem w pracy z RNA jest przygotowanie nienaruszonych cząsteczek RNA i utrzymanie ich w stanie nieuszkodzonym przez kolejne obchodzenie się z nimi. Szkielet RNA jest z natury bardziej wrażliwy na uszkodzenia niż DNA. Ekstrakcja i izolacja całkowitego RNA z komórek tkankowych wymaga starannej techniki laboratoryjnej; Należy podjąć wszelkie środki w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu RNazą, nosząc rękawice, używając wody wolnej od RNazy, odczynników, sprzętu, wyrobów z tworzyw sztucznych, szkła, przestrzeni roboczej oraz używając końcówek filtrujących do pipetowania.

2. Tiocyjanian guanidu - Ekstrakcja fenolu - chloroformu RNA

  1. Dodać 1 ml jednofazowego roztworu zawierającego fenol i izotiocyjanian guanidyny do probówki zawierającej próbkę tkanki z sekcji 1.
    UWAGA: Ten roztwór jest bardzo toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie w kapturze z przepływem laminarnym z wyposażeniem ochronnym oraz nosząc odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice ochronne.
  2. Zmielić próbkę tkanki za pomocą homogenizatora do tkanek do uzyskania jednorodnej konsystencji.
    UWAGA: Próbki można również homogenizować za pomocą homogenizatora mocy połączonego z kulkami ceramicznymi. Upewnij się, że próbka tkanki jest całkowicie zhomogenizowana przed przejściem do następnego kroku lub zatrzymaj protokół w tym miejscu i przechowuj w pełni zhomogenizowane próbki w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
  3. Dodać 200 μl chloroformu do separacji faz.
    UWAGA Chloroform jest potencjalnym narkotykiem i jest niezwykle niebezpieczny. Należy obchodzić się z nim ostrożnie w okapie z przepływem laminarnym z wyposażeniem ochronnym, a także nosząc odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice ochronne. Jako mniej toksyczną alternatywę można również stosować 1-bromo-3-chloropropan.
    UWAGA: W razie potrzeby zwiększaj lub zmniejszaj głośność. Na przykład, jeśli użyto tylko 500 μl jednofazowego roztworu zawierającego fenol i izotiocyjanian guanidyny, to na tym etapie dodaj tylko 100 μl chloroformu.
    1. Dobrze mieszaj próbki przez inwersję przez 15 sekund.
    2. Próbki inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g i temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Powinno nastąpić wyraźne rozdzielenie na dolną fazę organiczną, białą interfazę i górną fazę wodną zawierającą RNA. Ta górna faza jest zwykle bezbarwna, ale w zależności od rodzaju i ilości homogenizowanej tkanki może mieć jasnoróżowy wygląd.
  5. Przenieść górną warstwę wodną (około 500 μl) do świeżej probówki mikrowirówkowej bez naruszania interfazy.
    UWAGA: nie próbuj przenosić całej fazy wodnej, pozostaw niewielką ilość, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu fazy wodnej RNA fazą organiczną lub interfazową.
  6. Dodaj 1 objętość 100% izopropanolu, aby wytrącić RNA.
    1. Opcjonalnie, jeśli użyto bardzo małych ilości tkanki, dodaj 1 μl (5-10 μg) glikogenu wolnego od RNaz do każdej próbki, aby zapewnić efektywne wytrącanie RNA. Pomoże to w identyfikacji osadu RNA w kroku 2.8.
      UWAGA: Glikogen działa jako nośnik RNA i zapobiega przywieraniu niewielkich ilości RNA do boku probówki.
    2. Dobrze wymieszaj probówki przez odwrócenie kilka razy.
    3. Próbki należy przechowywać przez 2 godziny do nocy w temperaturze -20 °C.
  7. Odwirowywać próbki przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C.
  8. Wyrzucić supernatant, uważając, aby nie przesunąć osadu RNA na dnie probówki do mikrowirówki.
  9. Dodać 1 ml 75% etanolu (v/v) i wymieszać próbki RNA, kilkakrotnie odwracając probówkę.
  10. Wirować przez 15 minut przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można zatrzymać, a próbki zawierające osad RNA w 75% etanolu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  11. Odrzucić supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu RNA z dna probówki do mikrowirówki.
    1. Opcjonalnie powtórz kroki 2.9 - 2.11 przy użyciu 70% etanolu (v/v). Dokładne mycie osadu RNA zminimalizuje przenoszenie soli lub zanieczyszczeń, które mogą zakłócać wrażliwe aplikacje końcowe.
  12. Wyciągnij pozostały etanol za pomocą pipety, a następnie wysusz granulkę RNA na powietrzu w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5 do 10 minut.
    UWAGA: przesuszone granulki będą trudne do ponownego zawieszenia.
  13. Dodać 30-60 μl wody wolnej od RNaz, wstępnie podgrzanej do 55-60 °C, aby rozpuścić osad RNA.
  14. Umieścić RNA na lodzie do natychmiastowego użycia lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Ilościowe określanie stężenia RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego

  1. Zmień ustawienia spektrofotometru na RNA.
  2. Użyj 1-2 μl wody wolnej od RNaz jako ślepego próby.
  3. Użyj 1-2 μl każdej próbki RNA, aby ocenić ilość RNA.
  4. Zapisać odczyty przy 230 nm, 260 nm i 280 nm dla każdej próbki.
  5. Rozcieńczyć RNA do 200 ng/μl za pomocą wody wolnej od RNaz.

4. Synteza komplementarnego DNA (cDNA) z wykorzystaniem całkowitego RNA

  1. Wymieszać 1 μg całkowitego RNA z protokołu 2, mieszaniny 2 μM oligo (dT), 0,5 mM dNTP i doprowadzić końcową objętość do 10 μl wodą wolną od nukleaz. W tym celu należy przygotować RT-master-mix w zależności od liczby próbek i kontroli, które mają być badane.
    UWAGA: Kontrole to próbka z ujemną odwrotną transkryptazą (-RT), w której enzym RT jest zastępowany wodą wolną od nukleaz (patrz krok 4.3) oraz kontrola bez matrycy (NTC), w której woda wolna od nukleaz jest dodawana do mieszanki głównej zamiast matrycy RNA.
    1. Próbki dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie krótkie odwirowanie.
  2. Próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.
    1. Krótko odwirować próbki, aby zebrać całą ciecz na dnie probówek.
  3. Dodaj 1x bufor odwrotnej transkryptazy, 100 U odwrotnej transkryptazy i doprowadź końcową objętość każdej próbki do 20 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
    1. Próbki dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie krótkie odwirowanie.
  4. Próbki inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
  5. Rozcieńczyć zsyntetyzowane cDNA do pożądanego stężenia, dodając odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz i umieścić cDNA na lodzie do natychmiastowego użycia lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

5. Konwencjonalny PCR TiLV

  1. Użyć cDNA, próbek i kontroli wygenerowanych w sekcji 4 protokołu jako matryc do reakcji PCR przy użyciu dowolnej z ustalonych par starterów wyszczególnionych w Tabeli 1, wraz z wybraną polimerazą DNA.
    UWAGA: W tym miejscu należy uwzględnić dodatkową kontrolę bez matrycy (NTC) poprzez zastąpienie cDNA wodą wolną od nukleaz w reakcji PCR. Należy również uwzględnić kontrolę dodatnią, jeżeli jest dostępna, obejmującą wcześniej zweryfikowane próbki dodatnie TiLV lub odpowiedni fragment cDNA TiLV sklonowany do plazmidu.
  2. Przygotować wzorcową mieszaninę PCR zgodnie z wytycznymi stosowanego systemu polimerazy DNA oraz liczbą próbek i kontroli, które mają być badane. Mieszanina ta powinna zawierać starter do przodu, starter odwrotny, dNTP, MgCl2 i wybraną polimerazę DNA wraz z jej buforem.
  3. Zgodnie z wytycznymi wybranej polimerazy DNA, należy połączyć wyznaczoną objętość mieszanki głównej z sugerowaną ilością próbek cDNA i próbek kontrolnych.
    UWAGA: Przygotowanie 0,5-krotnego nadmiaru reakcyjnego jest często korzystne, ponieważ część mieszanki wzorcowej jest tracona podczas pipetowania.
  4. Wykonać warunki cykliczne PCR zgodnie z wytycznymi zastosowanego systemu polimerazy DNA i stosując odpowiednią temperaturę wyżarzania dla używanych starterów (Tabela 1). Zazwyczaj taki program obejmuje wstępną denaturację w temperaturze 95 °C przez 2-5 minut, następnie 30-40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w zalecanej temperaturze przez 30 s i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s, a następnie końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 5-10 min.
  5. Załaduj 5-15 μl każdej reakcji PCR i odpowiednią drabinkę DNA do studzienek z 1-2% żelem agarozowym, w zależności od oczekiwanej wielkości produktu PCR. Oddzielić amplifikowane DNA za pomocą elektroforezy żelowej i wybarwić żel bromkiem etydyny (EthBr), aby ułatwić wizualizację prążków DNA o oczekiwanej wielkości (Tabela 1) w maszynie do dokumentacji żelu przy użyciu światła UV.
    UWAGA: EtBr jest toksyczny; Należy obchodzić się z nim ostrożnie, nosząc odpowiednią odzież ochronną i rękawice ochronne.
Rozdział szt. TGLI TGLI TGLI szt. TGL szt. Rozdział TGLI TGLI TGL Rozdział szt. Rozdział TGLI szt. TGLI TGL TGLI szt. TGL TGLI TGLI Rozdział TGL TGLI szt. Rozdział TGL Rozdział TGLI szt. Rozdział TGLI
Docelowy segment genomu TiLVNaprzód primer
5' - 3'		Odwrócony podkład
5' - 3'		Rozmiar produktu PCR (bp)Tm
°C		Oryginalne odniesienie
1CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCACGCAAATATTTCTCTCATTCGCCTRok 164150Surachetpong i wsp., 2017
1CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGTAGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG100062Mugimba i wsp., 2018
cyfra arabskaACTCTCTATTACCAAATACATTTACTTTACCATATATATAGTGAAGGC1445Rozdział 45Surachetpong i wsp., 2017
cyfra arabskaGTCCAGGGCGGTATGTATTGCTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG83462Mugimba i wsp., 2018
3GTTGGGCACAAGGCATCCTATATCACGTGCGTACTCGTTCAGTZ kolei 25056 Rozdział 56Eyngor i wsp., 2014
3TATGCAGTACTTTCCCTGCCTTGCTCTGAGCAAGAGTACCOkręg wyborczy 49157Eyngor i wsp., 2014
3ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTACCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT135250Surachetpong i wsp., 2017
3GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAGGAGCTAAGGGAACGGCTATTG83462Mugimba i wsp., 2018
4AGCAGCAGGAGAAAGAGACCGTCCTGTTTCTGAATGGOkręg wyborczy 35860Nicholson i wsp., 2017
4CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGAGCAAATCTCTCTCCAATTACCGTCT125050Surachetpong i wsp., 2017
4GCCCAATGGTTCCCATATCTGCCCAATGGTTCCCATATCTLokal mieszkalny 52462Mugimba i wsp., 2018
5CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTCCTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATGNumer katalogowy 108757Surachetpong i wsp., 2017
5CAACTCTTAGCCTCCGGAATACCGTTCTGCACTGGGTTACA69662Mugimba i wsp., 2018
6CCAAATTTTACCTCTCGCATTCAAGCACTTAAAACTGTACCNumer katalogowy 1027Rozdział 45Surachetpong i wsp., 2017
6CCCACACGACAGGACATATAGGAGTTGGCTTAGGGTGATAAGAOkręg wyborczy 94862Mugimba i wsp., 2018
7CTCTCTTTGCATTGCATACCGTGACCAATTATCCCTGCTTTCA70457Surachetpong i wsp., 2017
7TCCTTTAGGGATTGGCACTAACTTCCATCGACTGCTCCTAGAOkręg wyborczy 48662Mugimba i wsp., 2018
8ACCTCATCTACACTAACATTTCCATCATCATTACACAAATGGAGTAGCT63750Surachetpong i wsp., 2017
8CTTAAGGGCCATCCTGTCATCTGGCTCAAATCCCAACACTAAOkręg wyborczy 47662Mugimba i wsp., 2018
9TTGGTGATGTCACGATGGATAAGTTCTATCGCCAGCCATGT35160Nicholson i wsp., 2017
9ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGCTCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCAOkręg wyborczy 53050Surachetpong i wsp., 2017
9GATATCCTCCACATGACCCTTCGTACGTCACTTTGTGCCATTACRozdział 26162Mugimba i wsp., 2018
10AACCCTACTAACACCAATATAGCTCTTTCCCTCTGACACCCTGT45050Surachetpong i wsp., 2017
10TCCTCTCTGTCCCTTCTGTTCAGGATGAGTGTGGCAGATTATRozdział 27662Mugimba i wsp., 2018

Tabela 1. Opublikowano pary starterów do amplifikacji cDNA TiLV za pomocą PCR w punkcie końcowym. Zestaw starterów zaznaczony pogrubioną czcionką został użyty do wygenerowania reprezentatywnych wyników pokazanych w Rysunek 3A i 3B.

6. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy TiLV (qPCR)

  1. Używając plazmidu zawierającego jako standard odpowiedni genomowy segment 3 cDNA TiLV, taki jak pTiLV32, przygotuj zduplikowaną lub trzykrotnie potrojoną serię seryjnych rozcieńczeń.
  2. Przygotować wzorcową mieszaninę qPCR dla wszystkich próbek, wzorców i kontroli, biorąc pod uwagę, że reakcje powinny być przeprowadzane w dwóch lub trzech egzemplarzach, przy użyciu 0,4 μl wody wolnej od nukleaz, 0,3 μl startera przedniego, 0,3 μl startera odwrotnego i 5 μl 2x mieszaniny głównej polimerazy SYBR Green DNA na reakcję.
    1. Stosować startery w stężeniu 10 μM, a informacje o starterze i wzorcowy pTiLV w następujący sposób:
      Starter do przodu: TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3')
      Starter odwrotny:TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3')
      Standardowy pTiLV: 10 pg / μL
      UWAGA: Jeżeli łączna liczba próbek i próbek kontrolnych wynosi 10 i zostanie przeprowadzona w trzech powtórzeniach, jest to równoznaczne z mieszanką wzorcową qPCR zawierającą 12 μl wody wolnej od nukleaz, 9 μl startera do przodu, 9 μl startera odwrotnego i 150 μl master-mixu polimerazy SYBR Green. Zakupione w handlu 2x uniwersalne mieszanki główne polimerazy SYBR Green DNA zawierają wszystkie niezbędne składniki do reakcji qPCR, a mianowicie barwnik SYBR Green I, polimerazę Taq DNA na gorąco, dNTPs, MgCl2 i pasywne barwniki referencyjne. Chronić mieszankę wzorcową SYBR Green przed światłem.
  3. Dozować 6 μl master-mixu qPCR do probówek paskowych qPCR lub 96-dołkowej płytki kompatybilnej z używaną maszyną qPCR.
  4. Dodać 4 μl matrycy cDNA, kontroli lub seryjnie rozcieńczanych wzorców TiLV do probówek lub studzienek płytki 96-dołkowej.
  5. Zamknij probówki qPCR lub uszczelnij płytkę 96-dołkową z kompatybilną osłoną płytki dla używanej maszyny do qPCR
    1. Delikatnie przesuń probówki qPCR, aby wymieszać roztwór i odwiruj probówki qPCR lub płytkę 96-dołkową za pomocą wirówki, aby zebrać cały płyn na dnie naczyń.
  6. Umieść rurki lub płytkę w termocyklerze czasu rzeczywistego.
    1. Zaprogramować termocykler qPCR tak, aby przeprowadzał wstępną denaturację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s w celu wyżarzania i wydłużania podkładu, kończąc na kroku krzywej topnienia od 65 °C do 95 °C z przyrostem 0,5 °C/ 5 s.
    2. Wybierz SYBR jako barwnik fluoroforowy, a następnie wybierz nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w polu nazwy próbki.
    3. Otwórz pokrywę maszyny RT-qPCR i umieść pasek qPCR w przypisanych dołkach, a następnie zamknij pokrywę.
  7. Wykonaj test RT-qPCR w wybranych warunkach. Maszyna zacznie działać, gdy pokrywa osiągnie żądaną temperaturę. Pobrać fluorescencję każdej próbki po każdym etapie przedłużania, aby monitorować postęp reakcji.
    UWAGA: Maszyna qPCR i powiązane oprogramowanie automatycznie obliczą wszystkie parametry testu i wyświetlą krzywe amplifikacji w czasie rzeczywistym, podczas gdy krzywa standardowa i krzywa topnienia zostaną wygenerowane pod koniec cyklu qPCR.
  8. Przeprowadzić analizę i akwizycję danych, upewniając się najpierw, że krzywe topnienia dla każdej próbki i wzorca mają jeden jednolity pik w oczekiwanej temperaturze dla amplikonu.
    1. Oceń krzywe amplifikacji próbek i wzorców oraz ustal próg w regionie, w którym szybkość amplifikacji cDNA jest taka sama we wszystkich próbkach. Zwykle jest to wykonywane automatycznie przez oprogramowanie, ale powinno być dokładnie sprawdzone.
    2. Oblicz liczbę kopii TiLV przy użyciu krzywej standardowej.

Wyniki

Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, konające czerwone tilapia hybrydowe wykazujące kliniczne objawy infekcji TiLV (Rycina 1A) zostały uśmiercone poprzez kąpiel w wysokim stężeniu olejku goździkowego, który działa jako środek znieczulający. Opisywane objawy kliniczne są zróżnicowane, lecz do najczęstszych należą letarg, erozja i odbarwienie skóry, egzophthalmus, odwarstwienie łusek, otwarte rany/zmiany oraz nieprawidłowe zachowanie15,16,33,35,36; niektóre z nich są wyraźnie widoczne na Rycini 1A. Ścianę brzuszną usunięto, aby pobrać narządy wewnętrzne, takie jak wątroba, śledziona lub nerka główna (Rycina 1B). Na tym etapie pobrano również próbki śluzu, delikatnie zeskrobując skórę ryby od przodu do tyłu za pomocą szkiełka podstawowego lub skalpela chirurgicznego37.

Analiza anatomiczna sekcji ryby; obrazy przed i po sekcji z odsłoniętymi narządami wewnętrznymi.
Rycina 1. Sekcja tilapia i pobieranie próbek.A. Czerwona tilapia hybrydowa zainfekowana TiLV z owrzodzeniami skóry, zaczerwienieniem wokół pyska i pokrywy skrzelowej, erozją skóry oraz zmętnieniem rogówki. B. Przecięta czerwona tilapia hybrydowa w celu pobrania tkanek z wątroby (w miejscu niebieskiej strzałki), śledziony lub głowowej nerki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Następnie zastosowano protokół szczegółowo opisany w sekcji 2 dotyczący ekstrakcji całkowitego RNA z użyciem tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu, a następnie przeprowadzono kwantyfikację RNA zgodnie z opisem w sekcji 3, aby ocenić czystość próbek poprzez obliczenie współczynników czystości i analizę profili widmowych (Rycina 2). Rycina 2A przedstawia reprezentatywny wynik pomyślnej procedury ekstrakcji całkowitego RNA, podczas gdy Rycina 2B obrazuje niską jakość preparatu RNA. Kwasy nukleinowe wykazują maksima absorbancji przy 260 nm, natomiast białka przy 280 nm. Stosunek pomiarów przy 260 nm i 280 nm wskazuje na czystość każdej próbki, a wartości od 1,9 do 2,1 świadczą o czystości RNA, co ma miejsce w przypadku próbki na Rycynie 2A. Niższe współczynniki A260/280 zaobserwowane na Rycynie 2B wskazują na możliwe zanieczyszczenie białkami lub fenolem pozostałe po procedurze ekstrakcji RNA. Absorbancja przy 230 nm może być wynikiem zanieczyszczenia próbki, dlatego oblicza się również stosunek A260/230 nm. W przypadku czystych preparatów RNA współczynnik ten powinien mieścić się w zakresie 2,0-2,2, co ilustruje wartość 2,03 dla próbki na Rycynie 2A, podczas gdy Rycina 2B wykazuje niski stosunek A260/230 wynoszący 1,07, a profil widmowy pokazuje przesunięcie minimum przy 230 nm w stronę 240 nm, co świadczy o obecności resztkowej guanidyny lub fenolu w próbce. W przypadku próbki przedstawionej na Rycynie 2B, ponowne wytrącanie RNA w celu usunięcia zanieczyszczeń może poprawić czystość preparatu.

Wykres widm absorbancji RNA, absorbancja 10 mm względem długości fali; tabela porównawcza danych, analiza jakości RNA.
Rycina 2. Spektrofotometryczna kwantyfikacja całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanek chorych tilapii. Awskaźniki czystości i profile widmowe z prawidłowo przeprowadzonej preparatyki RNA. BJak w przypadku A, z wyjątkiem próbki reprezentującej niską wydajność procedury ekstrakcji RNA. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Aby wykryć TiLV za pomocą metody RT-PCR, wykorzystuje się czyste próbki, takie jak ta przedstawiona w Rycina 2A poddano odwrotnej transkrypcji (protokół 4) do cDNA, które posłużyło jako matryca w analizie PCR opisanej w sekcji 5; reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 3AStartery zaznaczone pogrubioną czcionką w Tabela 1 wykorzystano do amplifikacji fragmentu o długości 491 bp z segmentu 3 genomu TiLV14Produkty PCR rozdzielono metodą elektroforezy w żelu i zabarwiono EtBr w celu ich wizualizacji. Rysunek 3A przedstawia wyniki dwuetapowej reakcji RT-PCR z wykorzystaniem 4 próbek cDNA (S1-S4), wyizolowanych z wątroby chorych tilapi z Tajlandii; w każdej z próbek widoczny jest wyraźny pojedynczy prążek o wielkości około 500 bp, co oznacza, że próbki 1-4 są dodatnie w kierunku TiLV. Taki sam produkt PCR uzyskano w próbce kontroli dodatniej, zawierającej cDNA segmentu 3 TiLV sklonowane do plazmidu32 podczas gdy kontrola bez matrycy (NTC) nie dała produktów PCR. Analiza w Rycina 3B przeprowadzono przy użyciu tych samych starterów, co w Rysunek 3A lecz w innym laboratorium, stosując metodę jednoetapowej RT-PCR oraz 5 próbek RNA wyizolowanych z tkanek nerki głównej tilapi pochodzących z egipskiej akwakultury15Za pomocą tego testu detekcyjnego ustalono, że próbki 1, 3 i 5 są dodatnie w kierunku TiLV, natomiast próbki 2 i 4 są ujemne w kierunku TiLV, ponieważ nie stwierdzono produktu PCR o prawidłowej wielkości. Kontrole ujemne, w tym dwie kontrole bez odwrotnej transkryptazy oraz dwie kontrole NTC, nie wygenerowały żadnych produktów PCR. Przeprowadzono również jednokrokowy test RT-PCR ukierunkowany na gen ActinB tilapia. We wszystkich próbkach (S1-S5) zgodnie z oczekiwaniami uzyskano amplikon o wielkości 217 bp.38Analiza ta służyła jako kontrola integralności próbek RNA, a także umożliwiła półilościową ocenę próbek dodatnich w kierunku TiLV. Przy założeniu, że ilość uzyskanego produktu ActB Tilapii jest względnie stała, różnice w ilości wygenerowanego specyficznego produktu PCR TiLV można interpretować jako rzeczywiste odzwierciedlenie ilości TiLV w danej próbce tkanki.

Wyniki elektroforezy żelowej; prążki DNA, markery wielkości, próbki S1-S5, kontrole C1-C4.
Rycina 3. RT-PCR TiLV. A. Próbki cDNA otrzymane z tkanek wątroby chorych tilapi zebranych w Tajlandii zostały przebadane pod kątem zakażenia TiLV przy użyciu specyficznych starterów dla segmentu 3 (zaznaczonych pogrubieniem w Tabeli 1) TiLV w dwuetapowym teście RT-PCR. M = marker podany w parach zasad; S1-S4 = próbki 1-4; C1 = kontrola pozytywna z użyciem pTiLV jako matrycy PCR; C2 = kontrola bez matrycy (NTC). B. Jednoetapowy RT-PCR z użyciem tych samych starterów co w A oraz próbek z tkanek głowowej nerki chorych tilapi zebranych w Egipcie15. M = marker podany w parach zasad; S1-S5 = próbki 1-5. Kontrole C1-C2 to kontrole bez odwrotnej transkryptazy, a C3-C4 to kontrole NTC. Dolny panel przedstawia jednoetapowy RT-PCR z użyciem starterów skierowanych przeciwko ActinB tilapi38 (szczegóły w tekście), dający produkt PCR o długości 217 par zasad. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W przeciwieństwie do reakcji PCR końcowopunktowych przedstawionych na Rysunku 3, testy qPCR omówione w protokole 6 mierzą ilość produktu PCR po każdym cyklu PCR. Amplifikację docelowego DNA wykrywa się przy użyciu cząsteczek fluorescencyjnych, które oddziałują z DNA generowanym w każdej rundzie reakcji. W tym przypadku wykorzystano barwnik SYBR Green I, który interpoluje się z dwuniciowym DNA. Sygnał fluorescencyjny jest monitorowany podczas reakcji, a jego intensywność odnosi się do ilości powstałego produktu 39,40,41,42,43. Testy qPCR dla TiLV przeprowadzono zgodnie z opisem w protokole 6 w różnych laboratoriach, stosując różne odczynniki SYBR Green, urządzenia do qPCR oraz próbki z różnych krajów. Wynikowe krzywe amplifikacji przedstawiono na Rysunku 4A i 4B. Można zauważyć, że w każdym teście przebieg eksperymentu składa się z czterech faz: liniowej fazy podstawowej, wczesnej fazy wykładniczej, późnej fazy wykładniczej oraz fazy plateau. Liniowa faza podstawowa występuje podczas wczesnych cykli, w których duplikacja DNA nie może być jeszcze zidentyfikowana ze względu na ilości DNA generujące niewystarczający stosunek sygnału do tła. W tej fazie obliczana jest fluorescencja bazowa. Następnie stężenie docelowego DNA zaczyna się podwajać w każdym cyklu, co powoduje, że sygnał staje się wykrywalny powyżej tła i wzrasta wykładniczo. Wydajność amplifikacji (E) dobrze zoptymalizowanego testu qPCR jest bardzo wysoka (bliska 100%) na początku reakcji i pozostaje stabilna podczas tej wczesnej wykładniczej fazy amplifikacji; to właśnie w tym punkcie, gdy wydajność reakcji jest nadal stała, przeprowadza się kwantyfikację. W późniejszych cyklach sygnał zaczyna osiągać plateau, a intensywność fluorescencji nie jest już skorelowana z początkową liczbą kopii matrycy, ponieważ składniki reakcji ulegają wyczerpaniu44. Nasycenie może również wystąpić w wyniku konkurencji ze strony reakcji ponownego hybrydyzowania, zmieniających się stosunków stężeń składników lub stosunku jednostek enzymu do cząsteczek substratu DNA. Prawdopodobnie takie parametry odpowiadają za różnice między krzywymi amplifikacji dla testów pokazanych na Rysunku 4A i 4B. Dołączone kontrole nie wygenerowały tych charakterystycznych krzywych amplifikacji.

Wykres amplifikacji qPCR przedstawiający RFU w funkcji cykli dla kwantyfikacji DNA; wykres podkreśla wydajność.
Rycina 4. Wykresy amplifikacji przedstawiające akumulację produktu w czasie trwania testu real-time PCR. A. Krzywe amplifikacji próbek dodatnich pod kątem TiLV pochodzących z Tajlandii, NTC oraz dodatniej kontroli plazmidowej z zastosowaniem 2-etapowego testu qPCR z SYBR-Green I. Wykres został wygenerowany poprzez naniesienie względnej fluorescencji (RFU) vs. numeru cyklu. B. Krzywe amplifikacji próbek dodatnich pod kątem TiLV pochodzących z Egiptu, analogicznie jak na Rycini 3B, oraz NTC. Krzywa amplifikacji przedstawia fluorescencję sygnału reporterowego znormalizowaną do fluorescencji pasywnego barwnika ROX zawartego w teście (Rn) versus numer cyklu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Po zakończeniu cykli termicznych qPCR na poszczególnych urządzeniach w każdym z laboratoriów dane zostały pozyskane i przeanalizowane. Rysunek 5A i 5B przedstaw reprezentatywne krzywe topnienia z testów przeprowadzonych w każdym laboratorium. Każdy aparat do qPCR został zaprogramowany tak, aby na koniec przeprowadzić analizę krzywej topnienia. Osiągnięto to poprzez stopniowe zwiększanie temperatury i monitorowanie fluorescencji w funkcji temperatury. Gdy temperatura jest wystarczająco wysoka, aby zdenaturować dsDNA, rejestrowany jest znaczny spadek fluorescencji, ponieważ cząsteczka fluoroforu zostaje uwolniona. Oprogramowanie każdego instrumentu qPCR obliczyło temperaturę topnienia (Tm) z danych krzywej topnienia, wykreślając ujemną pierwszą pochodną w funkcji temperatury (Rysunek 5). Można zauważyć, że w Rycina 5A i 5B że produkty powstałe w różnych zestawach próbek wykazują jednorodną temperaturę topnienia w oczekiwanej temperaturze wynoszącej około 80 °C do analizy. Nie zaobserwowano żadnych innych pików w niższych temperaturach. Ze względu na ich niewielki rozmiar, Tm temperatury topnienia dimerów starterów jest zazwyczaj niższa niż w przypadku docelowej sekwencji DNA. Dlatego ta różnica między Tmpozwala to na łatwą identyfikację potencjalnych dimerów starterów lub innych niespecyficznych produktów amplifikacji. Próby kontrolne nie wygenerowały krzywych topnienia charakterystycznych dla próbek i standardów dodatnich pod kątem TiLV i są widoczne jako niemal pozioma linia u dołu wykresów w Rycina 5A i 5B.

Wykres analizy krzywej topnienia; przedstawia ΔRFU/dT, -Rn w funkcji temperatury dla badania denaturacji DNA.
Rycina 5. Analiza krzywej topnienia w celu zapewnienia specyficzności testu; różne produkty PCR mogą zostać rozróżnione na podstawie ich charakterystyki topnienia. A. Analiza krzywej topnienia próbek dodatnich pod kątem TiLV pochodzących z Tajlandii, kontroli ujemnej oraz dodatniej kontroli plazmidowej. B. Analiza krzywej topnienia próbek dodatnich pod kątem TiLV pochodzących z Egiptu, standardów pTiLV oraz NTC. Wykresy w A i B przedstawiają zmianę fluorescencji podzieloną przez zmianę temperatury w funkcji temperatury, co pozwala na uzyskanie przejrzystego obrazu dynamiki topnienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Większość urządzeń do qPCR jest wyposażona w oprogramowanie ułatwiające dalszą analizę przebiegu qPCR, które dokonuje kwantyfikacji próbek poprzez generowanie krzywej wzorcowej poprzez automatyczne wykreślenie cyklu progowego (Ct) względem logarytmu liczby kopii matrycy standardów pTiLV, co przedstawiono na rysunku 6A oraz 6B dla dwóch niezależnych laboratoriów. W skrócie, Ct jest jednostką stosowaną do oceny wyników qPCR. Wartość Ct oznacza liczbę cykli wymaganych do osiągnięcia ustalonego poziomu sygnału fluorescencji progowej. Im większa ilość matrycy wyjściowej, tym mniej cykli potrzeba do osiągnięcia wykrywalnego poziomu fluorescencji. Rzeczywiście, próbki z wysokim mianem TiLV będą miały niższe wartości Ct niż próbki z niskim mianem TiLV, na przykład u ryb z infekcją subkliniczną. Aby wyznaczyć wartości Ct, z surowych danych najpierw odejmuje się poziomy fluorescencji tła. Następnie oprogramowanie powiązane z urządzeniem do qPCR automatycznie wybierze próg fluorescencji, analizując krzywe danych dla każdej próbki i wyznaczając Ct reprezentujące punkt, w którym próbka przekroczyła próg. Jest to wykonywane oddzielnie dla każdego testu i każdy próg powinien zostać starannie oceniony, aby upewnić się, że został on ustawiony w części logarytmicznej krzywych amplifikacji i w miejscu, w którym wszystkie krzywe są równoległe. Zatem uzyskane konkretne Ct jest wartością względną względem liczby kopii matrycy wyjściowej45, ale jest ono również specyficzne dla użytego urządzenia do qPCR i odczynników, wydajności amplifikacji PCR oraz czułości detekcji. Parametry te wpływają na różnice zaobserwowane przy użyciu tego samego testu na rysunku 6.

Na podstawie krzywych wzorcowych przedstawionych na Rysunku 6 przeprowadzono analizy regresji, w tym obliczenia nachyleń (m) i punktów przecięcia krzywych wzorcowych, wydajności amplifikacji (100 x (101/m -1))46 oraz liniowości reakcji. Analizy krzywych wzorcowych wykorzystano również do potwierdzenia czułości (granicy wykrywalności), powtarzalności i odtwarzalności testu. Teoretycznie ilość DNA podwaja się w każdym cyklu PCR, co oznacza, że wydajność (E) wynosi 100%. Jednak w praktyce tak idealna wydajność jest rzadko osiągana ze względu na suboptymalne warunki PCR, takie jak inhibicja polimerazy DNA, zanieczyszczenia, zbyt duża ilość cDNA oraz błędy pipetowania47. Typowo wydajność amplifikacji E dla dobrych testów mieści się w zakresie 90-110%; na Rysunku 6A obliczono wydajność na poziomie 94,5% przy użyciu 8 seryjnie rozcieńczonych próbek pTiLV, natomiast wydajność testu przedstawionego na Rysunku 6B przy użyciu 7 seryjnie rozcieńczonych próbek pTiLV wyniosła 101,2%. Wydajność powyżej 100% wynika zazwyczaj z obecności inhibitorów PCR w teście. Analiza regresji liniowej wykresu wzorcowego pozwala również na obliczenie liczby kopii TiLV w każdej próbce41,42,45, co można zaobserwować dla trzech próbek TiLV zaznaczonych na czerwono na Rysunku 6B, co jest zgodne z wynikami dla próbek S1, S3 i S5 przedstawionymi na Rysunku 3B.

Wykres progu cyklu PCR; logarytm liczby kopii DNA względem progu cyklu; analiza ilościowa.
Rycina 6. Krzywe wzorcowe RT-qPCR. PCR w czasie rzeczywistym 10-krotnych rozcieńczeń szeregowych pTiLV, wzorca użytego w obu laboratoriach. A. Przebadano 8 próbek pTiLV w rozcieńczeniach szeregowych, wszystkie o znanym stężeniu skorelowanym z liczbą kopii TiLV/reakcję. Krzywą wzorcową wygenerowano poprzez wykreślenie logarytmu liczby kopii vs. próg cyklu (Ct). Nachylenie = -3,462, R2 = 0,9992, a wydajność wynosi 94,47%. B. Analogicznie jak w A, z wyjątkiem faktu, że przebadano 7 próbek pTiLV w rozcieńczeniach szeregowych (kolor zielony), a wykres przedstawia cykl progowy na osi y oraz liczbę kopii TiLV (Ilość) na osi x. Punkt przecięcia z osią y = 32,327, nachylenie = -3,292, R2 = 0,98, a wydajność wynosi 101,2%. W przypadku obu krzywych wzorcowych w A i B wartości nachylenia, punktu przecięcia z osią y oraz współczynnika korelacji (R2) są wykorzystywane do oceny sprawności testu. Co ważne, wartość R2 powinna być bliska 1, ponieważ jest ona miarą liniowości krzywej wzorcowej. Nachylenie służy do pomiaru wydajności PCR, gdzie wydajność 100% odpowiada nachyleniu -3,32; równanie oraz dalsze szczegóły znajdują się w tekście głównym. Dobra reakcja qPCR charakteryzuje się zazwyczaj wydajnością między 90-110%, co odpowiada nachyleniu między -3,58 a -3,10. Krzywa wzorcowa służy do bezwzględnej kwantyfikacji nieznanych próbek dodatnich pod kątem TiLV i pozwala określić dokładną liczbę kopii TiLV/reakcję, co ma miejsce w przypadku trzech próbek dodatnich TiLV zaznaczonych kolorem czerwonym w B.

Dyskusja

TiLV został po raz pierwszy zgłoszony w 2014 roku w Izraelu14 i od tego czasu został zidentyfikowany w wielu krajach, w tym w Egipcie, Kolumbii, Indiach, Malezji, Ugandzie, Tanzanii i Tajlandii 15,16,18,35,48. Światowa świadomość, szczególnie w krajach produkujących tilapię, zwróciła większą uwagę na wirusa i wdrożono różne ograniczenia i środki kontroli ze strony władz rządowych, próbując zapobiec rozprzestrzenianiu się TiLV. W tym miejscu wyjaśniono szczegółowy protokół wykrywania TiLV w tkance tilapii, obejmujący pobieranie próbek, izolację RNA, syntezę cDNA, testy PCR i qPCR. Istnieją różne aspekty tych metod, które wymagają szczegółowej dyskusji. TiLV zidentyfikowano dotychczas u ryb o różnych rozmiarach 9,12,14,15,49 i gatunkach tilapii, w tym tilapii hybrydowej hodowlanej (O. niloticus x O. aureus)11,14, tilapii nilowej (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33,35,36,49,50 i tilapia czerwona (Oreochromis sp.)16,33,48,51, a także w dzikiej tilapii nilowej 9,12, tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus i T. u dzikich karpi (Barbonymus schwanenfeldii) zidentyfikowano simonis intermedia 14, a całkiem niedawno TiLV u dzikich karpi (Barbonymus schwanenfeldii)52. Próbki tkanek z narządów wewnętrznych (skrzela, śledziona, wątroba, serce, głowa, nerka) lub śluzu37 mogą być pobierane zarówno ze zdrowej, jak i umierającej tilapii, niezależnie od wieku, wielkości lub gatunku, i przetwarzane w celu izolacji RNA. Przedstawiony tutaj protokół ekstrakcji całkowitego RNA wykorzystuje jednofazowy roztwór fenolu i tiocyjanianu guanidyny, który jest chaotropowym środkiem denaturującym. Tkanki są bezpośrednio homogenizowane w tym roztworze, a następnie dodawane jest chloroform i odwirowywane w celu uzyskania separacji faz, w której generowany jest przezroczysty RNA zawierający górną fazę wodną, interfazę i dolną fazę organiczną. RNA jest izolowane z fazy wodnej przez wytrącanie izopropanolu, a następnie płukanie odzyskanego RNA w celu pozbycia się zanieczyszczeń. Izolacja RNA za pomocą tej metodologii została zapoczątkowana przez Piotra Chomczyńskiego i Nicolettę Sacchi i została określona jako ekstrakcja tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu53,54. Ten rodzaj odczynnika używanego do ekstrakcji RNA można kupić komercyjnie lub wyprodukować w laboratorium (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów). Protokół ten trwa nieco dłużej niż metody oparte na kolumnach, takie jak oczyszczanie na bazie krzemionki, ale ogólnie rzecz biorąc, jest bardziej opłacalny i daje więcej RNA.

W tym protokole przedstawiono ilościowe określanie RNA przy użyciu wartości A260, przy czym wartości spektrofotometrii mogą wskazywać na jakość RNA (A260/A280 = 1,9 - 2,1). Chociaż metoda ta daje dobre wskazanie czystości próbki, nie może całkowicie informować o jakości wyekstrahowanego RNA. Aby prawidłowo określić, czy RNA jest nienaruszone, czy częściowo zdegradowane, próbki można rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, w której rozmazywanie prążków 18S i 28S rRNA barwionych EtBr wskazuje na degradację RNA. Dalsza weryfikacja jakości RNA może obejmować użycie instrumentu lab-on-a-chip. Ponadto ważne jest również trawienie oczyszczonego RNA za pomocą DNazy I w celu usunięcia zanieczyszczającego genomowego DNA gospodarza, które w zależności od dalszych zastosowań może prowadzić do fałszywych wyników. Jeśli gDNA gospodarza nadal w dużym stopniu zanieczyszcza próbkę RNA, można również przeprowadzić dodatkowe leczenie DNaząI pod koniec procedury ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).

Komplementarna synteza DNA może znacznie wpłynąć na ogólne wyniki qPCR i jest aspektem metody, który może wprowadzać zmienność. Zalecany tutaj protokół cDNA składa się z pojedynczego zestawu komponentów przy użyciu oligo (dT), a zatem transkrybuje tylko mRNA zawierające ogony poliA. Pozwala użytkownikowi dokładnie kontrolować, które składniki mają być użyte w reakcji odwrotnej transkrypcji, a ten tryb syntezy cDNA okazał się skuteczny w wykrywaniu TiLV32. Alternatywą dla tego zestawu jest kupowana na rynku mieszanka wzorcowa zawierająca wszystkie składniki wymagane do reakcji odwrotnej transkrypcji i jest bardzo szybka i prosta bez zwykłego wieloetapowego, Protokół pipetowania i wielotemperaturowy. Jest to korzystne, ponieważ minimalizuje obsługę i zapewnia jednorodność we wszystkich próbkach. Takie mieszanki główne często zawierają zarówno oligo(dT), jak i losowe startery, dzięki czemu mają zastosowanie do różnych matryc RNA i generują reprezentatywne kopie cDNA sekwencji z całej długości RNA w populacji (mRNA gospodarza wirusa i tilapii), a teoretycznie każdy pożądany gatunek RNA można następnie zmierzyć za pomocą konwencjonalnego PCR lub qPCR z takiej próbki. Ta wszechstronność jest główną zaletą 2-etapowego podejścia RT-PCR; Zapewnia długoterminową pulę, którą można wykorzystać do wielu różnych eksperymentów. W uzyskanych wynikach przedstawiono jednoetapowe podejście RT-PCR, w którym zastosowano startery specyficzne dla sekwencji (Tabela 1), a RT i PCR przeprowadzono w jednej probówce (patrz lista materiałów). Ogólnie rzecz biorąc, startery specyficzne dla sekwencji pozwalają na wyższą wydajność RT specyficznego docelowego RNA niż przy użyciu losowego primingu, ale specyficzny docelowy RNA jest jedynym, który można określić ilościowo w takiej próbce cDNA, co może być jedynym celem niektórych laboratoriów (patrz Tabela materiałów dla sugestii produktów syntezy cDNA).

Podczas gdy konwencjonalny RT-PCR wydaje się być powszechnie stosowany do tej pory w diagnostyce TiLV 9,13,14,15,16,17,18,33,35,48,55. Wykazano, że RT-qPCR jest skuteczniejszym narzędziem do wykrywania i oznaczania ilościowego niewielkich ilości TiLV w tkankach ryb lub śluzie32,37. Ogólnie rzecz biorąc, qPCR jest szeroko stosowany w klinicznych laboratoriach diagnostycznych wirusologii ze względu na wysoką czułość, specyficzność, dobrą odtwarzalność, szeroki zakres dynamiki i szybkość21. Chociaż qPCR może być początkowo droższy do wdrożenia niż konwencjonalny RT-PCR, oferuje wiele ważnych zalet w porównaniu z konwencjonalnym PCR; ma szybszy czas realizacji od próbki do wyników i nie wymaga żadnych kroków po PCR. Ten ostatni punkt oznacza, że ryzyko zanieczyszczenia laboratorium jest minimalne i można go łatwiej dostosować do sytuacji o wysokiej przepustowości, takich jak w przypadku ognisk choroby. Ponadto jest z natury bardziej czuły niż konwencjonalny RT-PCR, co ma kluczowe znaczenie dla wykrywania niskiego miana wirusa w infekcjach subklinicznych21. Wymagałoby to zagnieżdżonego podejścia PCR wymagającego odwrotnej transkrypcji, dwóch dalszych reakcji PCR, a następnie analizy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Te wiele kroków zajmuje dużo czasu i zwiększa ryzyko błędów lub zanieczyszczenia. Niemniej jednak, ze względu na wysoką czułość, RT-qPCR wymaga skrupulatnego projektowania eksperymentalnego i dokładnego zrozumienia technik kwantyfikacji w celu uzyskania precyzyjnych wyników56,57.

W protokole tym wykazano obecność fluoroforu wiążącego DNA, SYBR Green I. Jest to niespecyficzny barwnik wiążący DNA dsDNA, a zatem specyficzność testu leży całkowicie w zestawie starterów, które mogą generować wyniki fałszywie dodatnie58. W związku z tym, podczas gdy analiza krzywej topnienia dsDNA wykonywana na końcu każdego PCR jest szczególnie ważną częścią reakcji PCR, ponieważ potwierdza, że wytwarzany jest tylko jeden amplikon PCR o prawidłowymT m (należy to również osiągnąć za pomocą elektroforezy żelowej, gdy wdrażane są nowe testy). Tm fragmentu DNA zależy od wielu cech, takich jak jego długość, skład GC, sekwencja, komplementarność nici, stężenie, a także od składników buforowych i wzmacniaczy PCR. Analizy krzywej topnienia w reprezentatywnych wynikach pokazanych z dwóch laboratoriów nie wykazały obecności dimerów starterów ani innych niepożądanych produktów PCR, ale jeśli zaobserwuje się to w przypadku innych próbek i/lub konfiguracji eksperymentalnych, test powinien zostać ponownie zoptymalizowany. Bardziej zaawansowane technologie qPCR nie wymagają takiego kroku krzywej topnienia i rzeczywiście, od czasu napisania tego artykułu dotyczącego tej metody, TiLV RT-qPCR oparty na TaqMan został opracowany przy użyciu dwóch starterów i sondy, dzięki czemu jest wysoce specyficzny dla TiLV34.

Niewątpliwie startery zaprojektowane do testów RT-qPCR mają fundamentalne znaczenie dla powodzenia testu, a startery zostały zaprojektowane w oparciu o publicznie dostępne dane genomiczne TiLV w tamtym czasie32. Jednak wirusy RNA są dobrze znane z tego, że wykazują wysokie wskaźniki mutacji, a ewentualne szczepy unikną obecnych testów diagnostycznych, jak zaobserwowano w przypadku ISAV59. Takim typom wirusów zawsze będzie trudno wygenerować uniwersalny test pan-TiLV RT-qPCR, a takie testy będą stale ulepszane tylko wtedy, gdy dostępnych będzie więcej danych genomowych TiLV z odległych lokalizacji i okresów.

Wreszcie, konieczne jest przeprowadzenie podwójnych lub, jeśli to możliwe, potrójnych reakcji zarówno w testach wewnątrz, jak i między-qPCR. Jeśli wartości Ct są bardzo wysokie, zastosowanie kontrprób jest szczególnie ważne w celu upewnienia się, że reakcja PCR jest wiarygodna i odtwarzalna. Zasadniczo, jeśli dane z reakcji powtórzonych różnią się o więcej niż 0,5 cyklu, reakcje należy powtórzyć, a jeśli wartości Ct stale zmieniają się > 0,5 cykli w powtórzeniach, test powinien zostać ponownie zoptymalizowany. Zastosowanie zintegrowanego robota pipetującego qPCR ogromnie pomaga w rozwiązaniu tego problemu, ale jest to narzędzie luksusowe. Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu, włączenie odpowiednich i odpowiednich kontroli ma ogromne znaczenie dla opracowania solidnych testów molekularnych, zwłaszcza w laboratoriach diagnostycznych, w których takie testy muszą być akredytowane. Kontrole powinny obejmować dodatnie (dodatnia próbka TiLV, wzorzec plazmidu TiLV) i kontrole ujemne (NTC i -RT), a także wykrywanie endogennych genów porządkowych tilapii. Takie kontrole nie mogą być niedoceniane i powinny być uwzględniane w każdym badaniu, aby właściwie zrozumieć jakość każdego etapu testu i właściwie zinterpretować wyniki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Instytutowi Bakteriologii Weterynaryjnej, Wydziale Vetsuisse, Uniwersytetowi w Bernie za wsparcie. Praca ta została sfinansowana przez Komitet ds. Promocji Akademickiej Naukowców na Wczesnym Etapie Kariery i Równości Płci na Wydziale Vetsuisse Uniwersytetu w Bernie poprzez 120% modelowego finansowania przyznanego PN. WS i PR są wspierane przez Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Tajlandia w ramach Promocji Badań Szkolnictwa Wyższego i Narodowego Projektu Uniwersytetu Badawczego Tajlandii, Biuro Komisji Szkolnictwa Wyższego, Ministerstwo Edukacji, Tajlandia. Chcielibyśmy podziękować dr Kwanrawee Sirikanchana za jej narrację oraz Piyawatcharze Sikarin za montaż filmu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tissue collectionStep 1
Metanosulfonian trikainySigma-AldrichE10521Alternatywa dla olejku goździkowego.
Krok 1.1
Roztwór do stabilizacji RNAlaterThermo Fisher Scientific  AM7020Do przechowywania tkanek, jeśli nie można ich natychmiast przetworzyć
Krok 1.3
< ekstrakcja >RNAKrok 2
TRIodczynnikSigma-Aldrich Krok 2.1
TRIzolThermo Fisher Scientific (Invitrogen)15596026Krok 2.1
GENEzolGeneaidGZR100Krok 2.1
TrisureBiolineBIO-38032Krok 2.1
Domowe rozwiązanie - -94,53 g/L (800 mM) tiocyjanian guanidyny
30,45 g/L  (400 mM) tiocyjanian amonu
8,20 g/L  (100 mM) octan sodu
380 mL/L  (38 % v/v) fenol
50 ml/l (5 % v/v) glicerol
1,0 g/l (0,1 % w/v) 8-chinolinol, pH 5,0
Przechowywać do 2 lat w temperaturze 4oC
Krok 2.1
MagNA Lyser Green BeadsRoche3358941001Alternatywna metoda homogenizacji tkanek stosowana w połączeniu z maszynami do lizy tkanek opisanymi poniżej
Krok 2.2
Lysing Matrix D, probówka 2 mlMP BIOMEDICALS116913050
ChloroformSigma-AldrichC2432Krok 2.3
ChloroformRCI LabscanAR1027E-G2.5LKrok 2.3
1-bromo-3-chloropropanSigma-AldrichB9673Mniej toksyczna alternatywa dla chloroformu
Etap 2.3
Izopropanol (GC) > 99,8 %Sigma-Aldrich59300Krok 2.6
Izopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)Merck KGaA (EMSURE)1.09634.2500Krok 2.6
Glikogen, klasa biologii molekularnej (np. Sigma, nr kat. G1767)Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)R0551Przydatny krok, jeśli materiał wyjściowy tkanki jest mały, aby zmaksymalizować wytrącanie RNA
opcjonalnie
Etanol (czystość (GC) ≥ 99,9Sigma-Aldrich (EMD Millipore)1.00983Krok 2.9
Etanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)Merck (EMSURE)1.00983.2500Krok 2.9
Woda wolna od nukleazPromegaP1193Krok 2.13
Woda wolna od nukleazMulticell809-115-CLKrok 2.13
Zestaw Ambion TURBO bez DNA Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)AM1907Może być wykonywany na końcu protokołu ekstrakcji RNA
opcjonalnie
synteza cDNAKrok 4
Zestaw do syntezy cDNAVivantiscDSK01Krok 4.1 i 4.3
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix z usuwaczem gDNAToyoboA1172KAlternatywna opcja 
zobacz dyskusję
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101Alternatywna opcja 
zobacz dyskusję
AffinityScript Odwrotna transkryptaza wielokrotnej temperatury Agilent Technologies600107Alternatywna opcja 
< silny> PCR< / silny>Krok 5
< silne>systemy polimerazy DNA: < / strong>< / em>Krok 5.2
    - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) 14001012aKrok 5.2
    - GoTaq MastermixPromegaM7122Krok 5.2
Oddzielne składniki mieszaniny PCR:Krok 5.2
10mM dNTP MixVivantisNP2409Krok 5.2
25mM MgCl2Thermo Fisher ScientificR0971Krok 5.2
10X bufor Taq z KClThermo Fisher Scientific00348114Krok 5.2
Polimeraza DNA TaqVivantisPL1202Krok 5.2
    - Verso 1-etapowy RT-PCR ReddyMix z ThermoPrime TaqThermo Fisher Scientific AB1454Jednoetapowy RT-PCR zilustrowany na rysunku 3B
Elektroforeza żelowa: Do wizulacji produktów PCR z etapów 5.1-5.4
Roztwór bromku etydyny (10 mg / ml)Thermo Fisher Scientific17898Krok 5.5
BuforKrok 5.5
    -Tris VivantisPR0612-1KGKrok 5.5
    - Kwas octowy (lodowaty) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)Merck KGaA (EMSURE)1.00063.2500Krok 5.5
    - Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)BIO-RAD161-0729Krok 5.5
AgarozaVivantisPC0701-100GKrok 5.5
Drabinki i markery DNAVivantisNL1405Krok 5.5
Barwnik ładujący żel DNA (6X)Thermo Fisher ScientificR0611Krok 5.5
qPCRKrok 6
PowerUP SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)A25779Zilustrowany na rysunkach 4-6B
Krok 6.2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBIO-RAD1725120zilustrowany na filmie i rysunkach 4-6A
Krok 6.2
Sprzęt  Tłuczek do mielenia tkanek
DounceSigma-AldrichP1110Protokół 2
MagNA Lyser InstrumentRoche3358976001Alternatywna opcja homogenizacji tkanek dla protokołu 2, która jest stosowana w połączeniu z kulkami lizującymi opisanymi powyżej
Krok 2.2
Homogenizator FastPrep-24 5GMP BIOMEDICALS116005500
Mikrowirówka z chłodzeniemEppendorfEppendorf 5427RProtokół 2
Krok  2.4, 2.7 & 2.10
Mikrowirówka z chłodzeniemEppendorfEppendorf 5418R
Skrzynka grzewczaLabnetAccuBlock Cyfrowy protokół suchej kąpieli2
Krok 2.13
Spektrofotometr mikroobjętościowy Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)Protokół Nanodrop 20003
Krok 3.1 - 3.4
Maszyna do PCRProtokół termocyklera BIO-RADT1005
Krok 5.4
ZasilanieProtokół BIO-RADPowerPac HC5
Krok 5.5
Pozioma elektroforeza żelowaProtokół #1704487edu komórek BIO-RADMini ReadySub-Cell GT5
Krok 5.5
Mini mikrowirówkaCorningLSE 6766Przydatna do szybkiego odkręcania probówek reakcyjnych PCR w protokołach 4, 5 i 6
Krok 6.5.1
MikrowirówkaLioFugeLM-60Krok 6.5.1
Maszyna i oprogramowanie qPCRThermo Fisher Scientific7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym z oprogramowaniem 7500 Protokół v2.06
Krok 6.6-6.8
Maszyna qPCR i oprogramowanieBIO-RADCFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym z oprogramowaniem
General Materials  Nożyczki
MayoKrok 1.1-1.2
% Tris/Acetic/EDTA (TAE): CFX ManagerKleszcze Krok 1.1-1.2 Pipeta Rainin Pipet-Lite XLS Końcówki do pipet barierowych dla aerozoli Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344 Probówki do mikrowirówek 1,5 ml bez nukleaz Eppendorf

Bibliografia

  1. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2014. Opportunities and Challenges. , Rome. (2014).
  2. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2016. Contributing to Food Security and Nutrition for all. , Rome. (2016).
  3. WorldBank. FISH TO 2030: Prospects for Fisheries and Aquaculture. Agriculture and Environmental Services Discussion Paper 03. , (2013).
  4. Wing-Keong, N., Nicholas, R. A review of the nutrition and feeding management of farmed tilapia throughout the culture cycle. Reviews in Aquaculture. 5 (4), 220-254 (2013).
  5. Cleasby, N., et al. The socio-economic context for improving food security through land based aquaculture in Solomon Islands: A peri-urban case study. Marine Policy. 45, 89-97 (2014).
  6. Ponzoni Raul, W., et al. Genetic improvement of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with special reference to the work conducted by the WorldFish Center with the GIFT strain. Reviews in Aquaculture. 3 (1), 27-41 (2011).
  7. Hounmanou, Y. M. G., et al. Tilapia lake virus threatens tilapiines farming and food security: Socio-economic challenges and preventive measures in Sub-Saharan Africa. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 493, 123-129 (2018).
  8. OIE. Tilapia Lake Virus (TiLV) - a novel orthomyxo-like virus. OIE technical disease cards. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf (2018).
  9. Mugimba, K. K., et al. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. Journal of Fish Diseases. , (2018).
  10. Koesharyani, I., Gardenia, L., Widowati, Z., Khumaira,, Rustianti, D. D. Studi kasus infeksi tilapia lake virus (tilv) pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur. 13 (1), 85-92 (2018).
  11. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Chinese Taipei. Immediate Notification. , http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=24033 (2017).
  12. OIE. Tilapia Lake Virus Disease (TiLV), Peru. Immediate Notification. , (2018).
  13. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), e00431-e00416 (2016).
  14. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  15. Nicholson, P., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. Journal of Fish Diseases. 40 (12), 1925-1928 (2017).
  16. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  17. Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., Surachetpong, W. Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). Veterinary Microbiology. 207, 170-177 (2017).
  18. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  19. Thangaraj, R. S., et al. Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 492, 206-214 (2018).
  20. Hanson, L. A., Rudis, M. R., Vasquez-Lee, M., Montgomery, R. D. A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virology Journal. 3, 28-28 (2006).
  21. Josko, D. Molecular virology in the clinical laboratory. Clinical Laboratory Science. 23 (4), 231-236 (2010).
  22. Munir, K., Kibenge, F. S. Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 117 (1), 37-47 (2004).
  23. Snow, M., et al. Developement, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo salar). Developments in Biologicals. 126, discussion 325-136 133-145 (2006).
  24. Matejusova, I., McKay, P., McBeath, A. J., Collet, B., Snow, M. Development of a sensitive and controlled real-time RT-PCR assay for viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in marine salmonid aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms. 80 (2), 137-144 (2008).
  25. Garver, K. A., et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. 95 (2), 97-112 (2011).
  26. Dalla Valle, L., et al. Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Veterinary Microbiology. 110 (3-4), 167-179 (2005).
  27. Hodneland, K., Garcia, R., Balbuena, J. A., Zarza, C., Fouz, B. Real-time RT-PCR detection of betanodavirus in naturally and experimentally infected fish from Spain. Journal of Fish Diseases. 34 (3), 189-202 (2011).
  28. Hodneland, K., Endresen, C. Sensitive and specific detection of Salmonid alphavirus using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 131 (2), 184-192 (2006).
  29. Wang, X. W., Ao, J. Q., Li, Q. G., Chen, X. H. Quantitative detection of a marine fish iridovirus isolated from large yellow croaker, Pseudosciaena crocea, using a molecular beacon. Journal of Virological Methods. 133 (1), 76-81 (2006).
  30. van Beurden, S. J., et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of anguillid herpesvirus 1. Journal of Fish Diseases. 39 (1), 95-104 (2016).
  31. Ciulli, S., et al. Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of lymphocystis disease virus. Journal of Virological Methods. 213, 164-173 (2015).
  32. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  33. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 476, 111-118 (2017).
  34. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 497, 184-188 (2018).
  35. Behera, B. K., et al. Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 484, 168-174 (2018).
  36. Ferguson, H. W., et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report. Journal of Fish Diseases. 37 (6), 583-589 (2014).
  37. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 486, 75-80 (2018).
  38. Yang, C. G., et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Gene. 527 (1), 183-192 (2013).
  39. Bustin, S. A. Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (4), 493-498 (2005).
  40. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  41. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  42. Mackay, I. M., Arden, K. E., Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 30 (6), 1292-1305 (2002).
  43. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  44. Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25 (2), 169-193 (2000).
  45. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 6 (10), 986-994 (1996).
  46. Rutledge, R. G., Côté, C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 31 (16), e93-e93 (2003).
  47. Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
  48. Amal, M. N. A., et al. A case of natural co-infection of Tilapia Lake Virus and Aeromonas veronii in a Malaysian red hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus) farm experiencing high mortality. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 485, 12-16 (2018).
  49. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 473, 430-432 (2017).
  50. OIE. Tilapia Lake Virus disease (TiLV), Philippines. Immediate Notification. , (2017).
  51. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Malaysia. Immediate Notification. , https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=24809 (2017).
  52. Abdullah, A., et al. First detection of tilapia lake virus (TiLV) in wild river carp (Barbonymus schwanenfeldii) at Timah Tasoh Lake, Malaysia. Journal of Fish Diseases. 41 (9), 1459-1462 (2018).
  53. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  54. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  55. Del-Pozo, J., et al. Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes. Veterinary Pathology. 54 (1), 164-170 (2017).
  56. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  57. Purcell, M. K., Getchell, R. G., McClure, C. A., Garver, K. A. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of aquatic animal pathogens in a diagnostic laboratory setting. Journal of Aquatic Animal Health. 23 (3), 148-161 (2011).
  58. Simpson, D. A., Feeney, S., Boyle, C., Stitt, A. W. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR. Molecular Vision. 6, 178-183 (2000).
  59. Kibenge, M. J., et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virology Journal. 13, 3(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Detekcja RT PCRqPCR z SYBR Greenekstrakcja RNAsynteza cDNAkwantyfikacja wirusaanaliza krzywej topnieniaPCR w czasie rzeczywistympobieranie pr bek z tkanekkonwencjonalny PCR
Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.