Oznaczanie liczby nefronów w całej nerce metodą maceracji kwasowej

Podsumowanie

Szacunki liczby nefronów w całej nerce są ważne klinicznie i eksperymentalnie, ponieważ istnieje odwrotny związek między liczbą nefronów a zwiększonym ryzykiem chorób nerek i układu krążenia. W niniejszej pracy przedstawiono zastosowanie metody maceracji kwasowej, która zapewnia szybkie i wiarygodne oszacowanie liczby nefronów w całej nerce.

Streszczenie

Wyposażenie nefronu odnosi się do całkowitej liczby nefronów, z którymi dana osoba się rodzi, ponieważ nefrosteneza u ludzi kończy się po 36 tygodniach ciąży i po urodzeniu nie powstają żadne nowe nefrony. Liczba nefronów odnosi się do całkowitej liczby nefronów zmierzonej w dowolnym momencie po urodzeniu. Zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe wpływają zarówno na wyposażenie, jak i liczbę nefronów. Zrozumienie, w jaki sposób określone geny lub czynniki wpływają na proces nefrogenezy oraz utraty lub zaniku nefronów, jest ważne, ponieważ uważa się, że osoby z niższym wyposażeniem lub liczbą nefronów są bardziej narażone na rozwój chorób nerek lub układu krążenia. Zrozumienie, w jaki sposób narażenie środowiskowe w ciągu życia danej osoby wpływa na liczbę nefronów, będzie również miało kluczowe znaczenie dla określenia przyszłego ryzyka choroby. W związku z tym zdolność do szybkiej i wiarygodnej oceny liczby nefronów w całej nerce jest podstawowym wymogiem eksperymentalnym pozwalającym lepiej zrozumieć mechanizmy, które przyczyniają się do lub promują nefrogenezę lub utratę nefronów. W tym miejscu opisujemy metodę maceracji kwasowej do szacowania liczby nefronów w całej nerce w oparciu o procedurę opisaną przez Damadiana, Shawayriego i Brickera, z niewielkimi modyfikacjami. Metoda maceracji kwasowej zapewnia szybkie i wiarygodne oszacowanie liczby nefronów (ocenianej przez zliczanie kłębuszków nerkowych), która mieści się w granicach 5% liczby oznaczonej przy użyciu bardziej zaawansowanych, choć kosztownych metod, takich jak rezonans magnetyczny. Co więcej, metoda maceracji kwasowej jest doskonałą metodą wysokoprzepustową do oceny liczby nefronów w dużej liczbie próbek lub warunkach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Nefron jest zarówno podstawową strukturą, jak i funkcjonalną jednostką klasy nerki1. Strukturalnie nefron składa się z kłębuszków nerkowych (naczyń włosowatych i podocytów) znajdujących się w torebce Bowmana i kanalika nerkowego, składającego się z kanalika proksymalnego, pętli Henlego i kanalika dystalnego, który kończy się w przewodzie zbiorczym. Funkcjonalnie rolą nefronu jest filtracja i reabsorpcja wody i elektrolitów oraz wydzielanie odpadów. Ogólnie rzecz biorąc, nefrosteneza kończy się w 36 tygodniu ciąży u ludzi i wkrótce po urodzeniu u kilku gatunków, takich jak myszy i szczury². Wyposażenie nefronu odnosi się do całkowitej liczby nefronów, z którymi dana osoba się rodzi, podczas gdy liczba nefronów to całkowita liczba nefronów zmierzona w dowolnym momencie po urodzeniu³. Terminy liczba nefronowa i liczba kłębuszkowa są często używane zamiennie. Ponieważ na nefron przypada tylko jeden kłębuszek nerkowych, ocena liczby kłębuszków nerkowych jest ważnym substytutem szacowania liczby nefronów.

Ocena wyposażenia nefronów i liczby nefronów jest interesująca klinicznie, ponieważ badania wykazały związek między wyposażeniem nefronów a zmniejszoną liczbą nefronów ze zwiększoną częstością występowania chorób sercowo-naczyniowych4^,5^{,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Opierając się na wynikach badań nerek podczas autopsji, Brenner zaobserwował, że osoby z nadciśnieniem tętniczym wykazywały niższą całkowitą liczbę nefronów niż osoby z prawidłowym ciśnieniem¹⁶. W związku z tym Brenner wysunął hipotezę, że istnieje odwrotna zależność między liczbą nefronów a ryzykiem rozwoju nadciśnienia w późniejszym życiu. Brenner wysunął również hipotezę, że zmniejszenie liczby nefronów zostało zrekompensowane przez nefrony, które pozostały. W celu utrzymania prawidłowego współczynnika filtracji w nerce, szczątkowe nefrony kompensują to poprzez zwiększenie powierzchni kłębuszków nerkowych (przerost kłębuszków nerkowych), działając w ten sposób nad złagodzeniem niekorzystnego wpływu utraty nefronów na czynność nerek^4,16.

Podczas gdy ochrona w krótkim okresie, przerost kłębuszków nerkowych, w dłuższej perspektywie, prowadzi do zwiększonej retencji sodu i płynów, zwiększonej objętości płynu zewnątrzkomórkowego i wzrostu ciśnienia tętniczego krwi, prowadząc do błędnego koła dalszego wzrostu ciśnienia w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych, przebarwienia kłębuszków nerkowych oraz bliznowacenia nefronów (stwardnienia) i urazów^4,16.

Uzyskanie szacunków lub obliczeń liczby nefronów oferuje kilka eksperymentalnych korzyści: 1) dostarcza informacji dotyczących procesu nefrogenezy, który następnie może być powiązany z określonymi genami lub czynnikami w środowisku zarodkowym lub matczyno-płodowym, oraz 2) istnieje związek liczby nefronów z chorobami sercowo-naczyniowymi, a zatem istnieje możliwość, że szacunki liczby nefronów mogą być wykorzystane do przewidywania przyszłego ryzyka sercowo-naczyniowego^{2,17,18,19,20,21,22}. Oprócz środowiska matczyno-płodowego, kilka chorób bezpośrednio wpływa na liczbę nefronów i czynność nerek, w tym miażdżyca, cukrzyca, nadciśnienie, a nawet normalne starzenie się^{2,9,10,11,12,22,23}. Dlatego ocena liczby nefronów w całej nerce jest ważna, aby zrozumieć zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, które wpływają na nefrogenezę (tj. wyposażenie nefronów) i liczbę nefronów w ciągu życia danej osoby i wynikający z tego wpływ na czynność nerek i zdrowie układu sercowo-naczyniowego.

Obecnie dostępnych jest kilka metod określania i ilościowego określania liczby nefronów, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia^{24,25,26,27,28,29,30}. Zaawansowane metody określania liczby nefronów w całej nerce obejmują metody stereologiczne, takie jak metoda dyssektory/frakcjonowania oraz obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego^25,26. Metoda dyssektoryzacji/frakcjonowania, często uważana za złoty standard w określaniu liczby nefronów w całej nerce, jest zarówno kosztowna, jak i czasochłonna. Ostatnie postępy i ulepszenia w obrazowaniu i przetwarzaniu rezonansu magnetycznego dostarczyły narzędzi do indywidualnego liczenia każdego nefronu. Jednak rezonans magnetyczny jest nie tylko czasochłonny, ale także niezwykle kosztowny. Ponadto zarówno metoda dyssektorycyjna/frakcjonująca, jak i rezonans magnetyczny wymagają zaawansowanej wiedzy technicznej, co ogranicza stosowanie tego typu metod w większości laboratoriów badawczych.

Większość metod określania liczby nefronów dokonuje obliczeń lub szacunków na podstawie identyfikacji kłębuszków nerkowych, ponieważ są one łatwo identyfikowalne strukturalnie. W artykule opisano i zademonstrowano metodę maceracji kwasowej do szacowania liczby nefronów w całej nerce²⁷. Metoda maceracji kwasowej jest szybka, niezawodna i znacznie tańsza niż inne metody, takie jak metoda dyssektorycji/frakcjonowania i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego. Co więcej, metoda maceracji kwasowej zapewnia wysoce powtarzalne oszacowania liczby nefronów, które według doniesień mieszczą się w zakresie określonym za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego²⁶.

Protokół

Materiały eksploatacyjne i odczynniki wymienione poniżej służą do oznaczania całkowitej liczby nefronów nerkowych u jednej myszy, czyli dwóch nerek. Modyfikacje dotyczące stosowania metody maceracji kwasowej u szczurów są oznaczone gwiazdkami. Wszystkie protokoły eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w Centrum Medycznym Uniwersytetu Mississippi.

1. Procedura izolacji nerki

1. Zważ mysz (lub inny gatunek) i poddaj ją eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu (5% - 8%) lub pentobarbitalu (150 mg/kg wstrzyknięcia dootrzewnowego).
2. Po uśpieniu myszy otwórz jej jamę brzuszną za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wzdłuż linii środkowej.
3. Ostrożnie unieś jelita i tkankę tłuszczową rozrodczą na prawą stronę jamy brzusznej. Przez grube rozwarstwienie odizolować lewą nerkę. Za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych przeciąć lewą tętnicę nerkową i żyłę i ostrożnie usunąć lewą nerkę, umieszczając nerkę w odpowiednio oznakowanej (numer / identyfikator myszy) łodzi wagowej zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforem (PBS).
4. Powtórz procedurę dla prawej nerki.
5. Wyjmij każdą nerkę z odpowiedniej łodzi wagowej i umieść ją na gazie chirurgicznej wstępnie zwilżonej PBS.
6. Pozostawiając nerkę na gazie chirurgicznej, należy szybko usunąć wszelkie przylegające tkanki nienerkowe (takie jak tkanka tłuszczowa okołonerkowa lub nadnercza), a następnie usunąć torebkę nerkową. Zważyć każdą nerkę indywidualnie, zapisując masę lewej i prawej nerki oddzielnie w zeszycie laboratoryjnym.

2. Procedury homogenizacji, inkubacji i odcedzania

1. Po zważeniu każdej nerki opróżnij każdą łódź wagową z PBS i umieść nerki z powrotem w odpowiednio oznakowanej łodzi do ważenia. Za pomocą czystej żyletki przetnij nerkę na pół, wzdłuż. Ułóż każdą połówkę nerki skierowaną w dół i pokrój każdą połówkę na 2 mm lub mniejsze kawałki.
2. Używając tej samej żyletki, ostrożnie zbierz i umieść posiekane kawałki nerki w oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml (numer/identyfikator myszy; lewa i prawa nerka).
3. Powtórz procedurę dla przeciwnej nerki, używając nowej żyletki. Umieść posiekaną nerkę w oddzielnie oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
4. W dobrze wentylowanym dygestorium dodaj 5 ml 6 M kwasu solnego (HCl) do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
5. Załóż nasadkę na rurkę stożkową, delikatnie wymieszaj mieszaninę nerek/HCl i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 90 minut (*120 minut dla nerek szczurów).
6. Krótko mieszać każdą probówkę o pojemności 15 ml co 15 minut podczas inkubacji, aby upewnić się, że cała tkanka jest wystawiona na działanie kwasu HCl.
7. Wprowadzić igłę 18 G do strzykawki o pojemności 5 ml (*strzykawka 10 ml dla szczurów) i ostrożnie wyjąć tłok strzykawki. Umieścić strzykawkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (probówka #1) w dygestorium.
8. Usunąć roztwór nerki/HCl z łaźni wodnej i wlać roztwór tkankowy do otwartego końca strzykawki, a następnie odłożyć stożkową probówkę o pojemności 15 ml na bok w stojaku na probówki. Ostrożnie wymienić tłok i powoli wciskać tłok tak, aby wytłoczyć roztwór przez igłę do rurki #1.
9. Umyj stożkową probówkę o pojemności 15 ml 5 ml roztworu PBS. Zakręć PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby rozpuścić pozostałą tkankę nerkową.
10. Ponownie ostrożnie wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej igłę 18 G i wlać zawartość stożkowej probówki o pojemności 15 ml do otwartego końca strzykawki. Ostrożnie wymienić tłok i przepłukać strzykawkę, delikatnie naciskając tłok do rurki #1. Powtórz ten proces 2x (w sumie wykonane 3x).
11. Wprowadzić igłę 21 G do nowej strzykawki o pojemności 5 ml (*strzykawka 10 ml dla szczurów) i ostrożnie wyjąć tłok strzykawki. Umieścić strzykawkę z dołączoną igłą 21-G w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml (probówka #2).
12. Wlać zawartość z probówki #1 do otwartego końca strzykawki zawierającej igłę 21-G. Ostrożnie włożyć tłok i przepłukać strzykawkę, delikatnie naciskając tłok strzykawki i umieszczając wyciśnięty roztwór w probówce #2.
13. Przemyć probówkę #1 5 ml roztworu PBS. Zakręć PBS w probówce #1, aby rozpuścić pozostałą tkankę nerkową.
14. Ponownie ostrożnie wyjąć tłok z 5 ml strzykawki zawierającej igłę 18 G i wlać zawartość z probówki #1 do otwartego końca strzykawki. Ostrożnie wymienić tłok i przepłukać strzykawkę, delikatnie naciskając na tłok, wytłaczając roztwór do probówki #2. Powtórz ten proces 2x (w sumie wykonane 3x).
15. Zwiększ całkowitą objętość probówki #2 do 50 ml, dodając dodatkowy PBS, aż do linii 50 ml na probówce #2.
16. Inkubować probówkę #2 zawierającą roztwór tkanki nerkowej w stojaku na probówki na płytce kołyskowej w lodówce nastawionej na 4 °C przez noc (minimum 8 - 10 godzin).

3. Liczenie kłębuszków nerkowych i ekstrapolacja liczby nefronów

1. Wyjmij probówkę #2 z lodówki i ponownie zawieś granulowaną chusteczkę, delikatnie obracając probówkę kilka razy, aby uzyskać jednorodny roztwór. Zalecamy liczenie kłębuszków nerkowych w ciągu 5 dni po przetworzeniu.
2. Ostrożnie podzielić 500 μl roztworu nerkowego do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce. Powtórz to 2 razy, umieszczając każdą podwielokrotność w oddzielnym studzince, tak aby na nerkę przypadały trzy studzienki roztworu nerkowego do analizy w trzech egzemplarzach.
3. Dodać 500 μl PBS do każdej z trzech studzienek zawierających roztwór nerkowy, w celu rozcieńczenia w stosunku 1:1.
4. Za pomocą odwróconego mikroskopu policz liczbę kłębuszków nerkowych na studzienkę. Liczenie jest wspomagane przez użycie siatki 16 oddzielnych sekcji umieszczonych na dnie każdej studzienki. Policz liczbę kłębuszków nerkowych na każdą sekcję z siatką, a następnie zsumuj liczbę kłębuszków na siatkę, aby uzyskać całkowitą liczbę kłębuszków na studzienkę. Kłębuszki nerkowe są łatwe do zidentyfikowania po ich kulistej budowie. Dodatkowe identyfikatory obejmowały czerwonawy odcień spowodowany naczyniami włosowatymi wypełnionymi krwią, a także tętniczki przed- lub po-tętniczki, które pozostają przyczepione do ciała poszczególnych kłębuszków nerkowych (Ryc. 1).
5. Dodać całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych zliczonych na każdą z trzech studzienek, a następnie podzielić je przez trzy, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych na 500 μl roztworu nerkowego. Jeśli odchylenie w średniej liczbie kłębuszków nerkowych na studzienkę jest większe niż 10%, powtórz procedurę liczenia nefronów, zwracając szczególną uwagę na jednorodny charakter roztworu nerkowego. Pomnóż liczbę kłębuszków nerkowych liczonych na studzienkę razy 100, aby uzyskać średnią liczbę kłębuszków nerkowych. Całkowita liczba nefronów może być wyrażona na nerkę lub, na podstawie masy nerki, na mg lub g tkanki.

Wyniki

Poniżej znajdują się reprezentatywne szacunki liczby nefronów w całej nerce z ustalonego mysiego modelu nadciśnienia oraz genetycznego szczurzego modelu przewlekłej choroby nerek związanej z wiekiem. Kluczowe cechy identyfikujące kłębuszki nerkowe, takie jak kulista struktura z dołączonymi strukturami przed- lub pozatętniczymi lub rurkowymi lub bez nich, są wyróżnione dla osób, które dopiero zaczynają stosować metodę maceracji kwasowej (Rysunek 1).

Dyskusja

Przy dobrej technice eksperymentalnej metoda maceracji kwasowej jest idealna do szacowania liczby nefronów w całej nerce. Chociaż nerka jest rozpuszczona w kwasie, kłębuszki pozostają w dużej mierze nienaruszone i są łatwe do zidentyfikowania, co sprawia, że liczenie poszczególnych kłębuszków nerkowych jest stosunkowo łatwe i proste. Technika maceracji kwasowej jest szczególnie korzystna z kilku powodów. Po pierwsze, metoda maceracji kwasowej jest szybką i wygodną metodą, która wymaga stosunkowo niewielkich nakładów fina...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Znieczulenie izofluranem	Laboratories	05260-05
System parownika izofluranu i przepływomierz	Braintree Scientific	VP I	Obejmuje zaopatrzenie w tlen klasy medycznej
Mikroskop odwrócony Leica LED DMIL Microsystems		DMIL LED	Dowolna marka również odpowiednia
Cyfrowa kąpiel wodna	Fisher Scientific	2239	Dowolna marka również odpowiednie
nożyczki chirurgiczne ToughCut Fine	Fine Fine Science Tools	14058-11	Krawędź tnąca 25 mm, długość 11,5 cm; Końcówki: ostre-ostre; Kształt końcówki: proste
Mikro kleszcze preparacyjne 4 1/4 cala.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Zakrzywiona końcówka
Płyta z pleksiglasu 5 cali x 7 cali.	dowolne źródło odpowiednie	nie dotyczy	Dowolna marka nadaje się również
Sześciokątne naczynie wagowe z polistyrenu	Fisher Scientific	02-2002-100	Dowolna marka również
odpowiednia Żyletki	Fisher Scientific	12-640	Jednokrawędziowa stal węglowa 0,009
Gąbki z gazy 4 x 4 cale 8-warstwowe	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x koncentrat soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Rozcieńczony do 1x
6 N Roztwór kwasu hydrocholowego	Sigma Aldrich	3750-32
15 ml stożkowa probówka wirówkowa	Fisher Scientific	14-959-70C	Dowolna marka nadaje się również 50
ml stożkowa probówka wirówkowa	Fisher Scientific	14-959-49A	Dowolna marka również odpowiednia
Jednorazowa strzykawka 5 ml	Cole Palmer	EW-07944-06	Dowolna marka nadaje się również
do jednorazowego użytku 18G1.5 igła	Fisher Scientific	14-826-5D	Dowolna marka nadaje się również
do jednorazowej igły 21G1.5	Fisher Scientific	14-826-5B	Dowolna marka nadaje się również
12-dołkowe wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych z pokrywką	Cole Palmer	#FW-01959-06	Dowolna marka również odpowiednia
Modułowy stojak na probówki z polipropylenu	Cole Palmer	#EW-06733-00	Możliwość umieszczenia probówek stożkowych o pojemności 15 i 50 ml; dowolna marka również odpowiednia