Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Rośnie zainteresowanie płynną biopsją w diagnostyce raka, prognozowaniu i monitorowaniu terapeutycznym, co stwarza zapotrzebowanie na wiarygodne i użyteczne biomarkery dla praktyki klinicznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekstrakcji, odwrotnej transkrypcji i oceny poziomów ekspresji krążących miRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC). mikroRNA (miRNA) to klasa niekodujących RNA o długości 18-25 nukleotydów, które regulują ekspresję docelowych genów na poziomie translacyjnym i odgrywają ważną rolę, w tym funkcję pro- i antyangiogenną, w fizjopatologii różnych narządów. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Ekstrakcję krążącego miRNA przeprowadzono przy użyciu szybkiej i skutecznej metody, która obejmuje zarówno metodologie organiczne, jak i kolumnowe. W przypadku retrotranskrypcji miRNA zastosowaliśmy wieloetapową procedurę, która uwzględnia poliadenylację w 3' i ligację adaptera w 5' dojrzałych miRNA, a następnie losową wstępną amplifikację miRNA. Wybraliśmy niestandardowy panel 24 miRNA do przetestowania za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i zauważyliśmy sondy miRNA na niestandardowych płytkach macierzy. Przeprowadziliśmy przebiegi na płytkach qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym. MiRNA do normalizacji wybrano za pomocą oprogramowania GeNorm (v. 3.2). Dane analizowano za pomocą oprogramowania Expression suite (v 1.1) i przeprowadzono analizy statystyczne. Metoda okazała się wiarygodna i solidna pod względem technicznym oraz może być przydatna do oceny poziomów biomarkerów w próbkach płynnych, takich jak osocze i/lub surowica.

Wprowadzenie

CRC stanowi trzecią najczęściej diagnozowaną złośliwość i czwartą przyczynę zgonów związanych z rakiem na świecie. Do tej pory bewacyzumab (B), przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz cetuksymab (C) lub panitumumab (P), przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), zostały zatwierdzone do leczenia pierwszego rzutu w skojarzeniu z chemioterapią (CT).

Mutacje w genach K-RAS i N-RAS są jedynymi klinicznie użytecznymi biomarkerami zdolnymi do identyfikacji pacjentów, którzy mają najmniejsze szanse na skorzystanie z tomografii komputerowej opartej na anty-EGFR. Chociaż przeprowadzono kilka badań w celu poszukiwania biomarkerów, które są predykcyjne w odpowiedzi na tomografię komputerową opartą na B, nadal istnieje znaczny brak wiarygodnych i skutecznych leków do stosowania w praktyce klinicznej¹.

miRNA to małe RNA (o długości 18-25 nukleotydów), które regulują translację docelowych genów i odgrywają kluczową rolę w licznych procesach fizjopatologicznych, w tym embriogenezie i kancerogenezie. Cząsteczki te są wysoce stabilne w płynach biologicznych, takich jak osocze/surowica, mocz i plwocina, co czyni je solidnymi biomarkerami do wykorzystania w nieinwazyjnym pobieraniu próbek². Korzystając z panelu miRNA zaangażowanych w szlak angiogenny, naszym celem było zidentyfikowanie nowych krążących biomarkerów zdolnych do przewidywania wyniku klinicznego u pacjentów z przerzutowym CRC (mCRC) leczonych schematem CT opartym na B.

Przeanalizowaliśmy serię 52 pacjentów z mCRC leczonych za pomocą tomografii komputerowej opartej na B w ramach prospektywnego wieloośrodkowego randomizowanego badania III fazy "Włoskie badanie w zaawansowanym raku jelita grubego" (ITACa). Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyki (Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr 674) w dniu 19 września 2007^r. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę przed pobraniem próbki krwi. Dla każdego pacjenta próbki krwi żylnej pobrano przed leczeniem i podczas pierwszej oceny klinicznej (po 8 tygodniach) w celu oceny wyjściowej ekspresji miRNA i jej modulacji podczas leczenia w odniesieniu do wyniku pacjenta.

Przeszukując literaturę, wybraliśmy 21 miRNA skorelowanych z procesem angiogennym, o których wiadomo, że są wykrywalne w ludzkim osoczu: has-miR-107, has-miR-126-3p, has-miR-145-5p, has-miR-194-5p, has-miR-199a-5p, has-miR-200b-3p, has-miR-20b-5p, has-miR-21-5p p, has-miR-210-3p, has-miR-221-3p, has-miR-24-3p, has-miR-27a-3p, has-miR-29b-3p, has-miR-335-5p, has-miR-424-5p, has-miR-497-5p, has-miR-520d-3p, has-miR-92a-3p, has-miR-17-5p i has-miR-155-5p. Wybraliśmy również has-miR-223-3p i has-mir-484 do normalizacji endogennej^3,4,5,6, oraz cel-miR-39 oczyszczony z C. elegans jako impuls do egzogennej normalizacji. Wszystkie normalizacje danych przeprowadzono metodą 2 ̂ ̄(ΔΔCt).

Wykrywanie krążących miRNA stwarza pewne trudności techniczne, ponieważ cząsteczki są obecne na bardzo niskich poziomach w osoczu, a ich wzmocnienie jest chemicznie trudne, biorąc pod uwagę ich krótką sekwencję. Z tych powodów wybraliśmy procedurę, która uwzględnia zarówno ekstrakcję organiczną za pomocą fenolu, jak i metodologię opartą na kolumnie z włókna szklanego. Ekstrakcja miRNA w krążeniu jest gorącym tematem w dziedzinie płynnej biopsji, a my wybraliśmy komercyjny zestaw, który okazał się jednym z najbardziej niezawodnych pod względem ilości i jakości odzyskanych plonów^7,8. Wybraliśmy protokół odwrotnej transkrypcji miRNA poprzez dodanie adaptera w 5' i ogona poli(A) do 3' dojrzałego miRNA, aby zwiększyć selektywność i swoistość reakcji.

Biorąc pod uwagę solidność metody, zaprojektowaliśmy niestandardowe płytki z wstępnie narysowanymi sondami do RT-PCR do oceny każdej próbki w dwóch egzemplarzach i przeanalizowaliśmy 2 pacjentów na każdej płytce, jak pokazano na rysunku 1.

Protokół

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki pod wysterylizowanym dygestoriami zgodnie z Dobrą Praktyką Laboratoryjną (GLP).

1. Pobieranie i przechowywanie osocza

1. Zebrać 3 ml próbki krwi obwodowej w probówce K3E EDTA.
2. Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej o stężeniu 1,880 x g przez 15 minut.
3. Odzyskać osocze sklarowane nad osadem w podwielokrotnościach 450 μl.
4. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
   nuta: Probówkę z krwią obwodową należy przetworzyć w ciągu 2 godzin od pobrania. Podczas pobierania osocza z probówki nie należy naruszać warstwy limfocytów.

2. Ekstrakcja krążących miRNA z próbek osocza (tabela materiałów)

1. Przygotuj wszystkie wymagane roztwory i rozmroź próbki do etapów ekstrakcji.
   1. Dodaj 375 μl 2-merkaptoetanolu do 2x roztworu denaturującego i dobrze wymieszaj.
   2. Dodaj 21 ml 100% etanolu klasy ACS do roztworu do płukania miRNA I i dobrze wymieszaj.
   3. Dodaj 40 ml 100% etanolu klasy ACS do roztworu myjącego 2/3 i dobrze wymieszaj.
   4. Pozostawić podwielokrotność osocza do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, a następnie rozpocząć etapy ekstrakcji.
2. Ekstrakcja organiczna
   1. Przenieść 400 μl próbki osocza do probówki o pojemności 2 ml wolnej od RNaz.
   2. Dodać 400 μL 2x roztworu denaturującego, wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.
   3. Dodać 4 μl 1 nM nakłucia, wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.
   4. Dodać 800 μl kwaśnego chloroformu fenolowego.
   5. Wirować przez 60 s i wirować z maksymalną prędkością (≥10 000 x g) przez 15 min.
   6. Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki. Nie zakłócaj interfazy. Zanotować odzyskaną objętość i wyrzucić probówkę zawierającą fazę niewodną.
      nuta: 2x roztwór denaturujący jest przechowywany w temperaturze 4 °C i w tej temperaturze może zastygać. Przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 37 °C, mieszając od czasu do czasu przez 10-15 minut. Należy uważać, aby pobrać dolną fazę zawierającą kwaśny fenol-chloroform, a nie bufor wodny, który znajduje się na wierzchu mieszaniny. Podgrzej roztwór elucyjny lub wodę wolną od nukleaz do temperatury 95 °C. Należy uważać, aby podgrzać odpowiednią objętość roztworu (100 μl na próbkę + 10% nadmiaru).
3. Wzbogacanie małego RNA
   1. Dodać 1/3 objętości etanolu 100% do fazy wodnej z kroku 2.2.6 i dokładnie wymieszać.
   2. Umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej dla każdej próbki.
   3. Przenieść do 700 μl lizatu z kroku 2.3.1 i etanolu do wkładu filtracyjnego i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s.
   4. Jeżeli pozostało >700 μl mieszaniny, umieścić filtrat w świeżej probówce i powtórzyć krok 2.3.3; powtarzać, aż cała mieszanina przejdzie przez wkład filtracyjny.
   5. Zmierzyć całkowitą objętość przepływu.
   6. Dodaj 2/3 objętości etanolu 100% do filtracji i dokładnie wymieszaj.
   7. Umieść drugi wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej.
   8. Przenieść do 700 μl objętości próbki do wkładu i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
   9. Powtarzać krok 2.3.8, aż cała mieszanina przejdzie przez wkład filtra.
   10. Nałożyć 700 μl roztworu do płukania miRNA 1 do wkładu filtrującego i odwirować wkład filtra z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ. Umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
   11. Nanieść 500 μl roztworu płuczącego 2/3 do wkładu filtracyjnego i odwirować wkład filtra z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ. Umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej.
   12. Umieścić wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej i powtórzyć krok 2.3.11 z 500 μl roztworu płuczącego 2/3. Wyrzuć przepływ i przenieś wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej.
   13. Odwirować probówki z wkładami filtracyjnymi o sile 10 000 x g przez 1 min.
   14. Przenieść wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl podgrzanego (95 °C) roztworu elucyjnego lub wody wolnej od nukleaz.
   15. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w celu odzyskania miRNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.
       UWAGA: W roztworze płuczącym 2/3 może tworzyć się biały osad. Jest to nadmiar EDTA uwalniany z roztworu. Należy unikać pobierania tych kryształów na etapie pipetowania.

3. Wykonaj odwrotną transkrypcję i wstępną amplifikację miRNA (Tabela materiałów)

1. Przeprowadź reakcję poliadenylacji
   1. Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, a następnie krótko zwirować i odwirować, aby odwirować zawartość. Dodatkowo rozmrozić 50% PEG 8000, pozwalając mu osiągnąć temperaturę pokojową.
   2. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml, uzyskując końcową objętość 3 μl koktajlu reakcyjnego na każdą próbkę. Użyj następujących objętości plus 10% nadmiaru objętości dla każdego odczynnika.
   3. Dodaj 1,7 μl wody wolnej od RNaz, 0,5 μl 10x buforu poli(A), 0,5 μl 10 mM ATP, a na koniec 0,3 μl 5 U/μL enzymu PolyA.
   4. Krótko zmieszaj i odwiruj mieszankę koktajlową, aby odwirować zawartość.
   5. Przenieść 2 μl próbki do każdego dołka płytki reakcyjnej lub probówki reakcyjnej i dodać 3 μl koktajlu reakcyjnego. Krótko zwirować i odwirować, aby odwirować zawartość.
   6. Umieść płytkę/rurki w termocyklerze i wykonaj następujące czynności.
   7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut (etap poliadenylacji).
   8. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut (reakcja zatrzymana), a następnie trzymać w temperaturze 4 °C.
2. Przeprowadź reakcję podwiązania.
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o następujących objętościach dla każdej próbki i 10% objętości w nadmiarze.
   2. Dodaj 0,4 μl wody wolnej od RNaz, 3 μl 5x buforu ligazy DNA, 0,6 μL 25x adaptera ligacyjnego, 4,5 μl 50% PEG 8000 i na koniec 1,5 μl ligazy RNA.
   3. Krótko zwiruj i odwiruj mieszankę koktajli, aby odwirować zawartość.
   4. Dodać 10 μl mieszaniny do każdej studzienki/probówki reakcyjnej zawierającej produkt przeróbczy z poli(A). Mieszać za pomocą wytrząsarki płytkowej z prędkością 1 900 obr./min przez 1 minutę lub przez krótkie wirowanie i odwirować zawartość.
   5. Umieścić płytkę/probówki reakcyjne w termocyklerze z następującymi ustawieniami: inkubacja w temperaturze 60 °C przez 60 minut, a następnie zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: 50% PEG 8000 ma wysoką lepkość. Stosować w temperaturze pokojowej, powoli zasysając i dozując. Po każdym etapie zasysania i dozowania przytrzymaj zatyczkę przez 10 sekund, aby odczynnik mógł płynąć w górę iw dół.
3. Wykonaj reakcję odwrotnej transkrypcji.
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej, z następującymi objętościami dla każdej próbki i 10% objętości w nadmiarze.
   2. Dodaj 3,3 μl wody wolnej od RNaz, 6 μl 5x buforu RT, 1,2 μl mieszanki dNTP (po 25 mM), 1,5 μl 20x uniwersalnych starterów RT i na koniec 3 μl 10x mieszanki enzymów RT.
   3. Krótko zmieszaj i odwiruj mieszankę koktajlową, aby odwirować zawartość.
   4. Dodać 15 μl mieszaniny do każdej studzienki/probówki reakcyjnej zawierającej produkt ligacji. Mieszać za pomocą wytrząsarki płytkowej z prędkością 1 900 obr./min przez 1 minutę lub przez krótkie wirowanie i odwirować zawartość.
   5. Umieść płytkę/probówki reakcyjne w termocyklerze z następującymi ustawieniami.
   6. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 15 minut (odwrotna transkrypcja).
   7. Inkubować w temperaturze 85 °C przez 5 minut (zatrzymanie reakcji), a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
      nuta: Produkt RT może być teraz przechowywany w temperaturze -20 °C i pozostaje stabilny przez okres do 2 miesięcy.
4. Przeprowadź reakcję miR-Amp (Tabela materiałów).
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o następujących objętościach dla każdej próbki i 10% objętości w nadmiarze.
   2. Dodaj 17,5 μl wody wolnej od RNaz, 25 μl 2x miR-Amp master mix i 2,5 μl 20x miR-Amp primer mix.
   3. Krótko zmieszaj i odwiruj mieszankę koktajlową, aby odwirować zawartość.
   4. Dla każdej próbki przenieść 45 μl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka nowej płytki reakcyjnej lub probówki reakcyjnej. Dodać 5 μl produktu RT do każdej studzienki lub probówki reakcyjnej. Mieszać za pomocą wytrząsarki płytkowej z prędkością 1 900 obr./min przez 1 minutę lub przez krótkie wirowanie i odwirować zawartość.
   5. Umieścić płytkę/probówki reakcyjne w termocyklerze i uruchomić zgodnie z ilustracją w tabeli 1.

4. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym

1. Rozcieńczyć każdą próbkę cDNA w stosunku 1:10 w buforze 0,1x TE.
2. Obliczyć liczbę studzienek/kontrprób dla każdej próbki. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o następujących objętościach dla każdej próbki, dodając w nadmiarze 10% objętości.
3. Dodaj 4 μl wody wolnej od RNaz, 10 μl 2x szybkiej zaawansowanej mieszanki głównej (tabela materiałów), a na koniec 5 μl rozcieńczonego cDNA.
4. Wymieszaj przez wirowanie i krótko odwiruj, aby odwirować zawartość.
5. Przenieść 19 μl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka, uszczelnić płytkę i krótko odwirować.
6. Wykonaj protokół termiczny (Tabela 2) w systemie RT-PCR.

Wyniki

Przeanalizowaliśmy panel krążących miRNA związanych z angiogenezą w odniesieniu do przeżycia wolnego od progresji choroby (PFS), całkowitego przeżycia (OS) i wskaźnika obiektywnej odpowiedzi (ORR) u 52 pacjentów z mCRC leczonych za pomocą tomografii komputerowej opartej na B. Ocena takich biomarkerów w próbkach osocza jest trudna ze względu na trudności techniczne. Zastosowaliśmy sprawdzone metody ekstrakcji miRNA z próbek osocza pacjenta, odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji. P...

Dyskusja

miRNA to małe niekodujące RNA (o długości 18-25 nukleotydów) zdolne do wiązania regionu 3' UTR docelowego informacyjnego RNA i hamowania go i/lub degradacji. Można je zatem uznać za regulatory ekspresji genów na poziomie translacyjnym. W ciągu ostatniej dekady kilka miRNA zostało skorelowanych z inicjacją i rozwojem raka, co czyni je użytecznymi biomarkerami klinicznymi w diagnostyce, prognozowaniu i terapii. Chronione przez RNazy, miRNA są obecne w stabilnej postaci w płynach biologicznych, takich jak krew, osocze, suro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki Safe-lock 1,5 ml bez rnazy	Eppendorf	0030 123.328
Probówki Safe-lock 2 mL bez rnazy	Eppendorf	0030 123.344
rnazy 20 µ L końcówki	Starlab	S1123-1810
Bez rnazy 200 i mikro; L końcówki	Starlab	S1120-8810
Bez rnazy 1,000 &mikro; L końcówki	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS Zestaw do oczyszczania RNA i białka natywnego	Thermo Fisher	AM1556
Zaawansowany zestaw do syntezy cDNA miRNA TaqMan	Thermo Fisher	A28007
100% etanol anidronowy klasy ACS	Odczynniki 414605
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Zaawansowane testy miRNA	Thermo Fisher	A25576
7500 System PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	4406984
0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 i mikro; L pipety laboratoryjne
Mikrowirówka
Vortex
Stacjonarny blok
Dygestoria
			0,2 ml probówki do PCR