Artykuł metodologiczny

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/58619

⸱

2 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki wyczuwają i reagują na fizyczne sygnały w swoim otoczeniu, przekształcając bodźce mechaniczne w biochemicznie wykrywalne sygnały w procesie zwanym mechanotransdukcją. Kluczowym krokiem w mechanotransdukcji jest przenoszenie sił między środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym. Aby przenosić siły, musi istnieć trwałe, nieprzerwane połączenie fizyczne utworzone przez szereg oddziaływań białko-białko. Dla danej interakcji białko-białko obciążenie mechaniczne może albo nie mieć wpływu na oddziaływanie, albo prowadzić do szybszej dysocjacji oddziaływania, albo nawet stabilizować oddziaływanie. Zrozumienie, w jaki sposób obciążenie molekularne wpływa na obrót białek w żywych komórkach, może dostarczyć cennych informacji na temat stanu mechanicznego białka, co z kolei wyjaśni jego rolę w mechanotransdukcji. Istniejące techniki pomiaru dynamiki białek wrażliwych na siłę albo nie mają bezpośrednich pomiarów obciążenia białkami, albo opierają się na pomiarach wykonanych poza kontekstem komórkowym. W tym miejscu opisujemy protokół techniki rezonansowego transferu energii i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRET-FRAP), który umożliwia pomiar wrażliwej na siłę dynamiki białek w żywych komórkach. Technika ta jest potencjalnie możliwa do zastosowania w każdym czujniku napięcia opartym na FRET, ułatwiając badanie dynamiki białek wrażliwych na siłę w różnych strukturach subkomórkowych i w różnych typach komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Środowisko zewnątrzkomórkowe jest bogatym źródłem zarówno biochemicznych, jak i fizycznych wskazówek, które dyktują zachowanie komórki. W szczególności fizyczna natura mikrośrodowiska może pośredniczyć w kluczowych funkcjach komórkowych, w tym we wzroście, migracji i różnicowaniu komórek1,2,3,4. Rozregulowanie mechaniki mikrośrodowiska jest krytycznym elementem wielu chorób, które nie mają jeszcze odpowiedniego leczenia, takich jak cancer5, atherosclerosis6 i fibrosis7. Pełne zrozumienie, w jaki sposób komórki przekształcają bodźce fizyczne w biochemicznie wykrywalne sygnały, proces określany jako mechanotransdukcja, wymaga wyjaśnienia mechanizmów molekularnych pośredniczących w przenoszeniu siły, zarówno do komórek, jak i z nich oraz w obrębie wielu struktur subkomórkowych.

Wewnątrz struktur subkomórkowych białka nieustannie się przewracają; wiążą się i rozwiązują w zależności od siły ich interakcji z partnerami wiążącymi8. Aby siły mogły być skutecznie przenoszone na odległość fizyczną, musi istnieć nieprzerwany łańcuch interakcji białko-białko, co oznacza, że obrót białka musi być wystarczająco wolny, aby utrzymać i przekazać siłę swojemu partnerowi wiążącemu9. Podczas gdy interakcje białko-białko na ogół składają się z kilku niekowalencyjnych wiązań między domenami białkowymi, interakcja jest często konceptualizowana jako stan związany, który może przejść do stanu niezwiązanego w różnych warunkach10,11. Dla danej interakcji białko-białko możliwe jest, że siła może nie mieć wpływu na czas życia interakcji, znany jako "wiązanie idealne", skracający czas trwania interakcji, znany jako "wiązanie poślizgowe", lub zwiększający czas życia interakcji, znany jako "wiązanie chwytliwe"10. Tak więc istnieje skomplikowany związek między obciążeniem białkami a dynamiką białka, który nazywamy dynamiką wrażliwą na siłę.

Aby zrozumieć wpływ obciążenia na dynamikę wiązań, przeprowadzono szereg bardzo pouczających eksperymentów na poziomie pojedynczej cząsteczki. Wykorzystując izolowane białka lub fragmenty białek i techniki manipulacji, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i mikroskopia sił atomowych, badania te wykazały wrażliwe na siłę interakcje białko-białko dla kilku istotnych białek11,12. Zarówno integryny13, jak i cadherins14, które są białkami transbłonowymi ważnymi dla tworzenia odpowiednio interakcji komórka-macierz i komórka-komórka, wykazały zmiany w dynamice spowodowane obciążeniem. W komórce winkulina jest rekrutowana zarówno do talin15, jak i α-catenina16 w sposób zależny od siły i może tworzyć wiązanie chwytliwe z actin17, co wskazuje na kluczową rolę winkuliny zarówno w zrostach ogniskowych (FA), jak i połączeniach adherens (AJ) pod obciążeniem. Badania pojedynczych cząsteczek pozwalają na wyizolowanie określonych oddziaływań białko-białko i dają jednoznaczne wyniki, ale nie uwzględniają złożoności środowiska komórkowego.

Przełomowe eksperymenty wykazały, że kilka struktur subkomórkowych, w tym FA i AJ, są mechanowrażliwe i wykazują zwiększoną składanie w odpowiedzi na obciążenia generowane wewnętrznie lub zewnętrznie18,19,20,21,22. Ponadto kilka modeli teoretycznych sugeruje, że mechanoczuły montaż może być napędzany przez dynamikę białek wrażliwych na siłę23,24,25. Aby zbadać tę wrażliwą na siłę dynamikę w żywych komórkach, podjęto kilka pośrednich podejść. FRAP i pokrewne techniki zapewniają stosunkowo prostą metodologię pomiaru dynamiki białek w komórkach26,27,28,29. Jednak pomiar obciążenia białkami był bardziej ograniczony. Typowym podejściem jest porównanie dynamiki białek w komórkach z ekspozycją na inhibitor cytoszkieletu stosowany w celu zmniejszenia ogólnej kurczliwości komórek i bez niego8,30,31. Koncepcyjnie jest to porównanie stanu wysokiego i niskiego obciążenia. Jednak nie ma kwantyfikacji obciążenia białka w żadnym z tych stanów i mogą wystąpić niezamierzone efekty biochemiczne inhibitora, takie jak utrata kluczowych miejsc wiązania wzdłuż filamentu F-aktyny. Inne podejście, specyficzne dla FA, polegało na zmierzeniu całkowitej siły wywieranej na podłoże przez FA za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych w celu przybliżenia obciążenia molekularnego i zbadania związku z dynamiką pojedynczego białka w klasie FA32. Chociaż podejście to pozwala na ilościowe określenie całkowitej siły, nie dostarcza informacji specyficznych molekularnie. FA składają się z ponad 200 różnych białek, z których wiele może wytrzymać load33. W związku z tym pomiar całkowitej siły wyjściowej FA potencjalnie zaciemnia możliwość wielu ścieżek przenoszenia siły i nie zapewnia wiarygodnego pomiaru obciążenia określonego białka.

W przeciwieństwie do poprzednich podejść w mechanobiologii, pojawienie się czujników napięcia opartych na FRET umożliwia bezpośredni pomiar obciążeń doświadczanych przez określone białka wewnątrz żywych komórek34,35,36. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który łączy czujniki napięcia oparte na FRET z pomiarem dynamiki białek opartym na FRAP. Technikę tę nazywamy FRET-FRAP. Takie podejście umożliwia jednoczesny pomiar obciążenia białkami i dynamiki białek, umożliwiając w ten sposób ocenę wrażliwej na siłę dynamiki białek w żywych komórkach (ryc. 1). Technika FRET-FRAP została już zastosowana do badania wrażliwej na siłę dynamiki mechanicznego białka łącznikowego vinculin37. Czujniki napięcia zostały opracowane dla wielu białek, które są istotne w różnych strukturach subkomórkowych. Na przykład czujniki zostały opracowane dla vinculin34 i talin38,39 w FA, kadherynach i kateninach w AJs40,41,42, nesprin w jądrowym kompleksie LINC43, α-aktynina44 i filamin36 w cytoszkielecie, oraz MUC-1 w Glycocalyx45, między innymi46. Podobnie, FRAP jest powszechnie stosowaną techniką stosowaną na białkach wrażliwych mechanicznie w obrębie zrostów ogniskowych8,31, adherens junctions47, actin cortex26, and nucleus48. Idąc dalej, technika FRET-FRAP powinna mieć szerokie zastosowanie do każdego z tych istniejących czujników lub nowo opracowanych czujników, umożliwiając pomiary dynamiki wrażliwej na siłę w wielu różnych strukturach i kontekstach subkomórkowych. W tym celu udostępniamy szczegółowy, uogólniony protokół implementacji techniki FRET-FRAP mającej zastosowanie w tych różnych systemach. Miejmy nadzieję, że umożliwi to przeprowadzenie szerokiej gamy eksperymentów wyjaśniających rolę różnych białek wrażliwych na mechanoterapię w regulacji przenoszenia siły i pośredniczeniu w zachowaniu komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generuj próbki do obrazowania

  1. Stabilnie wyrażona konstrukcja czujnika napięcia w żądanym typie ogniwa.
    1. Sklonuj konstrukt czujnika napięcia w wektor pRRL lub inny plazmid ekspresji wirusa.
      UWAGA: Aby osiągnąć ten krok, dostępnych jest kilka różnych narzędzi do klonowania molekularnego, w tym użycie enzymów restrykcyjnych, rozszerzanie nakładania się i Gibson Assembly35. Wektor pRRL jest stosowany w transdukcji wirusa lenti i umożliwia znaczny stopień produkcji białka dzięki zastosowaniu promotora ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV). W określonym kontekście mogą być potrzebne różne wektory. Na przykład promotor CMV jest wyciszony w niektórych typach komórek49. Ponadto do tworzenia stabilnych linii komórkowych można używać tylko czujników opartych na FRET, zawierających białka fluorescencyjne, które nie mają silnej homologii sekwencji, takich jak mTFP1 i Venus A206K. Czujniki zawierające cyjanowe białko fluorescencyjne i żółte białko fluorescencyjne prawdopodobnie będą podlegać rekombinacji homologicznej50.
    2. Wygeneruj lentiwirusa w ludzkich komórkach embrionalnych nerek (HEK) 293T przy użyciu plazmidów pakujących psPax2 i pMD2.G przy użyciu standardowych metod produkcji wirusów51.
      UWAGA: Lentiwirus powinien być obsługiwany wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel w środowisku laboratoryjnym o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
      UWAGA: Ta kombinacja komórek i plazmidów pakujących jest odpowiednia do stosowania z pRRL. W przypadku innych wektorów mogą być wymagane inne systemy.
    3. Transdukuj żądane komórki wirusem za pomocą standardowych protokołów transdukcji52 i użyj cytometrii przepływowej do sortowania komórek53, wybierając jednorodną populację wyrażającą każdy konstrukt na poziomie w przybliżeniu endogennym37. Po wybraniu komórek eksperymenty można przeprowadzić natychmiast lub komórki można zamrozić kriogenicznie do późniejszego wykorzystania. Nie należy przekraczać 2 cykli zamrażania i rozmrażania dla danej stabilnej linii komórkowej.
      UWAGA: Użycie linii komórkowych z niedoborem badanego białka (np. winkuliny -/- MEF do stosowania z czujnikiem napięcia winkuliny) zwiększy stosunek sygnału do szumu w eksperymentach FRET, a także ograniczy artefakty nadmiernej ekspresji. Takie stabilne linie fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) mogą być używane przez około 15 pasaży, zanim pojawi się znaczna utrata ekspresji lub degradacja czujników. Jeśli metody oparte na wirusach nie są pożądane, można użyć wielu komercyjnych odczynników zgodnie z protokołem producenta do przejściowej transfekcji różnych typów komórek za pomocą czujników napięcia w odpowiednim plazmidzie, takim jak pcDNA3.1. Optymalna ekspresja to 24-48 godzin po transfekcji.
  2. Przygotuj podłoża do wysiewu komórek.
    1. Zdobądź 4 naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
    2. Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, w kanonicznej probówce o pojemności 15 ml, przygotuj 4 ml fibronektyny 10 μg/ml fibronektyny w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), używając sterylnego PBS w kapturze do hodowli komórkowej. Delikatnie odwróć probówkę raz, aby wymieszać i pozostaw roztwór na 5 minut w kapturze do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Stężenie lub rodzaj białka ECM może wymagać dostosowania do innych typów komórek. Podane warunki są odpowiednie dla MEF.
    3. Odpipetować 1 ml roztworu fibronektyny na każde naczynie ze szklanym dnem.
    4. Pozostawić roztwór fibronektyny na szalkach na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać roztwór fibronektyny, spłukać raz PBS i dodać 1 ml PBS.
  3. Wysiewaj komórki na przygotowanych podłożach.
    1. Zacznij od interesujących komórek o procentowym współczynniku konfluencji odpowiednim do poduprawy w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.
      UWAGA: Różne typy komórek będą wymagały różnych warunków hodowli komórkowej i protokołów subhodowli. Ta sekcja zawiera wskazówki odpowiednie dla MEF. Zazwyczaj MEF-y są uprawiane do 85% konfluencji przed subuprawą.
    2. Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, przepłucz komórki raz 3 ml PBS. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 3 ml kompletnej pożywki do 6-centymetrowej pożywki, zebrać komórki i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Skład dla kompletnych pożywek będzie zależał od typu używanego ogniwa. W przypadku MEF kompletna pożywka jest często definiowana jako zmodyfikowana pożywka Eagle Medium firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% antybiotykiem przeciwgrzybiczym (zawierającym amfoterycynę B, penicylinę i streptomycynę) oraz 1% roztworem aminokwasów endogennych (NEAA).
    4. Wiruj komórki w temperaturze 1000 x g przez 5 minut.
    5. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki.
    6. Usuń PBS ze szklanych naczyń pokrytych fibronektyną. Policz komórki i zasiej 30 000 komórek na każdym szklanym naczyniu pokrytym fibronektyną z odpowiednią kompletną pożywką, aby uzyskać końcową objętość 1,5 ml.
      UWAGA: Ta gęstość komórek jest odpowiednia dla MEF i doprowadzi do powstania populacji komórek, które nie stykają się, ale nie są nadmiernie rzadkie. Dokładna liczba komórek może wymagać dostosowania do innych typów komórek lub innej komory obrazowania.
    7. Pozwól komórkom rozprzestrzenić się przez 4 godziny po wysianiu. Po 2 godzinach rozprowadzania odessać pożywkę wzrostową i spłukać raz pożywką do obrazowania, pozostawiając 1,5 ml pożywki do obrazowania.
      UWAGA: Ten czas rozprowadzania jest odpowiedni dla MEF, ale może być konieczna zmiana dla innych komórek. Jednak okresy inkubacji dłuższe niż 6-8 godzin doprowadzą do znacznego odkładania się białka ECM z surowicy w kompletnej pożywce. Podłoża obrazowe powinny zawierać te same dodatki, co pożywki kompletne, ale powinny być optycznie przezroczyste i nie powinny zawierać żadnych związków, które fluoryzują w kanałach obrazowania, takich jak flawiny, lub fluorescencji wygaszającej, takich jak czerwień fenolowa. Ogólnie użytecznym nośnikiem obrazowania jest nośnik DMEM-gfp Live Cell Visualization uzupełniony o 10% roztwór FBS i 1% NEAA. Jeśli autofluorescencja tła jest niedopuszczalnie wysoka, ilość surowicy można zmniejszyć. Jeśli zmiana pożywki nie jest możliwa po początkowym posiewie, komórki można bezpośrednio zawiesić w pożywce obrazowej uzupełnionej inhibitorem trypsyny.

2. Konfiguracja mikroskopu do obrazowania

  1. Włącz mikroskop.
    1. Najpierw włącz lampę łukową.
      UWAGA: Lampa łukowa wyzwoli impuls elektromagnetyczny, który może uszkodzić inne urządzenia, które są już włączone.
    2. Włącz kontroler koła filtrów, automatyczny kontroler stage, interfejs mikroskop-komputer i kamerę.
    3. Włącz laser FRAP i kontrolery położenia lasera.
      UWAGA: Lasery o dużej mocy mogą być szkodliwe dla oczu, jeśli są oglądane bezpośrednio. Zaleca się skonfigurowanie systemu mikroskopu w taki sposób, aby blokował wzbudzenie lasera przed skierowaniem na okulary, co można osiągnąć, przesuwając lustro na ścieżkę wiązki FRAP podczas wybielania, aby odbić laser w kierunku próbki i zapobiec transmisji do okularu.
    4. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem.
    5. Odczekaj 15 minut, aż lampa łukowa i laser FRAP się rozgrzeją.
  2. Skalibruj laser FRAP.
    1. Otwórz okno konfiguracji lasera. Ustaw ustawienie oświetlenia (podczas impulsu) na odpowiednie ustawienia oświetlenia FRAP dla ekspozycji lasera na próbkę. Ustaw ustawienie oświetlenia (podczas obrazowania) na ustawienia oświetlenia odpowiednie dla obrazowania tylko fluoroforu akceptora.
    2. Wybierz obiektyw do kalibracji w obszarze Ustawienia układu współrzędnych. Usuń zaznaczenie opcji Ręcznie kliknij punkty kalibracji i zaznacz opcję Wyświetlaj obrazy podczas kalibracji.
    3. Ustaw czas przebywania na 10 000 μs, a liczbę impulsów na 100.
    4. Umieść szkiełko kalibracyjne, wykonane z bromku etydyny uszczelnionego między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, w adapterze stage szkiełkiem nakrywkowym do dołu.
      UWAGA: Bromek etydyny jest substancją mutagenną i należy obchodzić się z nim w rękawiczkach. Jeśli zjeżdżalnia jest zagrożona, należy ją zutylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
    5. Użyj ustawień oświetlenia akceptora, aby ustawić ostrość na powierzchni slajdu, rozpoznawalnej jako płaszczyzna ogniskowa o najjaśniejszym sygnale. Drobne defekty w powłoce będą widoczne, aby pomóc w ustawieniu ostrości.
    6. Przesuń slajd do obszaru o jednolitej fluorescencji w poprzek płaszczyzny obrazowania.
    7. Kliknij Utwórz ustawienie. Oprogramowanie zainicjuje proces kalibracji, automatycznie wybielając i wykrywając położenie bielonego punktu.
    8. Upewnij się, że kalibracja przebiega pomyślnie, oceniając ostateczny obraz, który będzie siatką 3 x 3 wybielonych punktów, które powinny być równomiernie rozłożone i ostre. Zapisz obraz kalibracyjny do wykorzystania w przyszłości.
    9. Wyjmij szkiełko kalibracyjne i bezpiecznie przechowuj. Kalibrację należy przeprowadzić przed rozpoczęciem każdego eksperymentu, ale nie trzeba jej wykonywać między próbkami.

3. Wybierz parametry dla obrazowania FRET

  1. Utrwal jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia za pomocą 4% paraformaldehydu przez 10 minut. Roztwór paraformaldehydu powinien być wolny od metanolu, często określany jako EM, aby zapobiec denaturacji białek fluorescencyjnych. Umieścić w PBS po utrwaleniu.
    UWAGA: Roztwory paraformaldehydu są toksyczne. Ten etap powinien być wykonywany w dygestorium, a roztwór powinien być utylizowany zgodnie z zasadami instytucji.
    UWAGA: Ta optymalizacja nie zależy od dynamiki białka, a stała próbka pozwala na maksymalny czas obrazowania bez obaw o zdrowie komórki.
  2. Przepłukać próbkę trzykrotnie PBS i pozostawić w PBS.
    UWAGA: Użycie większości dostępnych na rynku nośników montażowych wpłynie na właściwości fluoroforu, co sprawi, że próbka nie będzie odpowiednia do obrazowania FRET54. Idealnie byłoby, gdyby komórki zostały zobrazowane natychmiast, ale można je pozostawić na noc w temperaturze 4 °C. Dłuższy czas oczekiwania spowoduje pogorszenie jakości próbki.
  3. Umieść próbkę w uchwycie stolika mikroskopu w celu obrazowania.
  4. Otwórz narzędzie Akwizycja wielowymiarowa (MDA). Ustanów sekwencyjne obrazowanie trzech kanałów: wzbudzenie i emisja tylko akceptora (kanał akceptorowy), wzbudzenie i emisja akceptora dawcy (kanał FRET) oraz wzbudzenie i emisja tylko donora (kanał donorowy).
    UWAGA: Istnieje wiele sposobów obrazowania próbek FRET. Trzykanałowa lub "trójsześcienna" metoda obrazowania w połączeniu ze sposobem kalibracji systemu do pomiaru wydajności FRET jest zalecana dla czujników napięcia opartych na FRET55,56. Podejście to jest szybkie, proste, nieniszczące, wymaga jedynie standardowego mikroskopu do obrazowania fluorescencyjnego i umożliwia porównanie eksperymentów w różnych dniach i konfiguracjach obrazowania.
  5. Zeskanuj próbkę, używając czasu naświetlania 500 ms i filtra o neutralnej gęstości (ND) 10%. Znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze.
  6. Wybierz czas naświetlania 500 ms lub żądaną długość dla każdego kanału obrazowania oraz filtr ND 100% i uzyskaj sekwencję obrazów FRET.
  7. Oszacuj średnią intensywność czujnika w interesujących strukturach subkomórkowych w każdym kanale obrazowania. Słabe sygnały mogą prowadzić do niedokładnych wyników z powodu nieprawidłowych oszacowań korekcyjnych, nieliniowości detektorów lub znacznego udziału sygnałów tła. Przybliżoną wskazówką jest dążenie do intensywności powyżej 10% zakresu dynamiki kamery (tj. w przypadku kamery 16-bitowej intensywność powinna wynosić powyżej 6,000).
    UWAGA: Identyczne ustawienia optyczne (czasy ekspozycji, filtry, obiektywy i inne zmienne, takie jak wzmocnienie kamery lub binning) muszą być używane we wszystkich eksperymentach FRET, które będą porównywane. Zmiana któregokolwiek z tych ustawień doprowadzi do zmiany ilości FRET generowanej i/lub wykrywanej w zestawie mikroskopowym. Pomiary wydajności FRET są niezależne od tych ustawień, ale współczynniki kalibracji używane do określania wydajności FRET nie są. Teoretycznie można użyć różnych zestawów współczynników kalibracyjnych do generowania wydajności FRET przy różnych ustawieniach optycznych, ale nie jest to zalecane. Wybielanie lub fototoksyczność mogą się różnić w zależności od ustawienia, co powoduje fałszywe wyniki.
  8. Uzyskaj drugą sekwencję obrazów FRET o tym samym polu widzenia. Oszacuj fotowybielanie między klatkami, porównując średnią intensywność matrycy w każdym kanale obrazowania. Fotowybielanie powinno być ograniczone do minimum, najlepiej mniej niż 1-5% utraty sygnału.
  9. Dostosuj parametry obrazowania, aby zmaksymalizować intensywność, jednocześnie minimalizując fotowybielanie. W przypadku regulacji zgrubnych należy wymienić filtr ND używany podczas akwizycji. Aby uzyskać dokładniejsze regulacje, zmieniaj czas ekspozycji w krokach co 250 ms.
  10. Powtarzaj kroki 3.5 – 3.8, aż będzie można uzyskać odpowiedni sygnał, jednocześnie minimalizując fotowybielanie.
    UWAGA: Zazwyczaj ustawienia czujnika napięcia winkuliny w winkulinie -/- MEF wynoszą 1,500 ms, 1,500 ms i 1,000 ms odpowiednio dla kanałów donorowych, fret i akceptorowych. Optymalne wartości będą się różnić w zależności od rodzaju systemu oświetlenia, obiektywu, zestawów filtrów i poziomu ekspresji czujnika.

4. Wybierz parametry dla obrazowania FRAP

  1. Zoptymalizuj ustawienia lasera, aby zapewnić całkowite wybielenie obszaru zainteresowania (ROI) bez wybielania otoczenia lub powodowania fotouszkodzeń.
    1. Utrwalić jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia za pomocą 4% paraformaldehydu przez 10 min.
      UWAGA: Ta optymalizacja nie zależy od dynamiki białka, a stała próbka pozwala na maksymalny czas obrazowania bez obaw o zdrowie komórki. Zapobiegnie to również odzyskiwaniu bielenia przez białka ruchome, umożliwiając wyizolowanie efektu wybielania, unikając wszelkich skutków szybkiego, dyfuzyjnego odzyskiwania fluorescencji, które występuje między występowaniem wybielania a wykonaniem pierwszego zdjęcia po wybielaniu.
      UWAGA: Roztwory paraformaldehydu są toksyczne. Ten etap powinien być wykonywany w dygestorium, a roztwór powinien być zutylizowany zgodnie z polityką instytucji.
    2. Przepłukać próbkę 3 razy PBS i pozostawić w PBS.
      UWAGA: Użycie większości dostępnych na rynku nośników montażowych wpłynie na właściwości fluoroforu, co sprawi, że próbka nie będzie nadawała się do obrazowania FRAP54. Idealnie byłoby, gdyby komórki zostały zobrazowane natychmiast, ale można je pozostawić na noc w temperaturze 4 °C. Dłuższy czas oczekiwania spowoduje pogorszenie jakości próbki.
    3. Umieść próbkę w uchwycie stolika mikroskopu w celu obrazowania.
    4. Otwórz okno konfiguracji lasera. Zacznij od ustawienia czasu przebywania lasera na 1 000 μs i 10 impulsów, co oznacza, że każdy punkt w skanie w poprzek ROI otrzyma 10 000 μs lasera o pełnej mocy
      UWAGA: Do wybielania użyto lasera o mocy 500 mW, 515 nm. Został on wybrany do selektywnego wybielania Venus A206K, akceptora w czujniku napięcia winkuliny, z maksymalną wydajnością. Jeśli stosowane są czujniki napięcia oparte na fret z innymi białkami fluorescencyjnymi, może być konieczne zastosowanie innego rodzaju lasera.
    5. Znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze i uzyskaj obraz.
    6. Narysuj prostokątny obszar zwrotu z inwestycji wyznaczający obszar do wybielenia i zapisz lokalizację zwrotu z inwestycji. Impuls lasera. Przyciąganie kolejnego obrazu sample.
      UWAGA: Rozmiar pudełka powinien być w przybliżeniu równy rozmiarowi całego FA. Należy uważać, aby rozmiar pudełka nie różnił się drastycznie w różnych eksperymentach. Wybielony obszar musi być dokładnie monitorowany w białkach, na których dynamikę wpływa dyfuzja. Jest to potencjalny problem w przypadku białek transbłonowych, takich jak kadheryny47, lub białek, które dyfundują powoli27,57.
    7. Sprawdź jakość fotowybielania, sprawdzając, czy cały zwrot z inwestycji jest wybielony tak, aby intensywność była zbliżona do poziomów tła. Dodatkowo upewnij się, że nie ma wybielania poza ROI.
    8. Dostosuj ustawienia lasera zgodnie z potrzebami, aby uzyskać znaczną ilość wybielania w ramach ROI bez wywoływania znacznego wybielania poza ROI. W przypadku regulacji zgrubnych należy zwiększać i zmniejszać czas przebywania w krokach co 100 μs, a w przypadku regulacji precyzyjnych zwiększać i zmniejszać liczbę impulsów w krokach co 5 impulsów.
    9. Powtarzaj kroki 4.1.5 – 4.1.8, aż do osiągnięcia minimalnych ustawień, przy których zwrot z inwestycji jest w pełni wybielony bez fotowybielania poza celem.
      UWAGA: Osiągnięcie znacznej początkowej wartości bielenia bez wywoływania fototoksyczności jest kluczowym aspektem analizy FRAP. Użyj ustawień lasera, które powodują całkowite wybielenie utrwalonych próbek. Ogólnie rzecz biorąc, do osiągnięcia pożądanego poziomu bielenia należy użyć minimalnej liczby fotonów. Ponadto, protokół wybielania powinien być względnie spójny podczas eksperymentów, ponieważ zmiany mogą wpływać na pomiary dynamiki białek58.
  2. Zoptymalizuj parametry poklatkowe, aby w pełni uchwycić dynamikę interesującego białka, jednocześnie minimalizując fotowybielanie.
    1. Przygotuj zestaw mikroskopowy do obrazowania żywych komórek, najlepiej z podgrzewanym stolikiem i obiektywem, a także kontrolą CO2 . Pozostawić do wyrównania przez 20 min.
      UWAGA: Aby utrzymać zdrowie obrazowanych komórek, w naczyniu do obrazowania musi być utrzymywana temperatura i pH. Różne podgrzewane stopnie i grzejniki obiektywowe mogą z łatwością utrzymać temperaturę ogniwa na poziomie 37 °C. Kontrolę pH dla wielu rodzajów pożywek można przeprowadzić za pomocą pompy perystaltycznej do przepuszczania nawilżonego 5% CO2 przez próbkę z prędkością 15 ml/min. Alternatywnie, jeśli kontrola CO2 jest niedostępna, należy użyć nośników do obrazowania na żywo zawierających HEPES, aby zapobiec dużym zmianom pH.
    2. Umieść jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia w uchwycie stolika mikroskopu w celu obrazowania. Pozostawić do zrównoważenia na 10 minut.
    3. Korzystając z narzędzia MDA, ustaw film poklatkowy, aby uzyskać 3-5 zdjęć przed wybielaniem, wybielić zwrot z inwestycji i kontynuować robienie 10-60 zdjęć.
      UWAGA: W przypadku winkuliny w FA obrazowanie co 5 s przez 5 minut po wybielaniu jest wystarczające, aby obserwować dynamikę bez wprowadzania nadmiernego wybielania31. Przydatne punkty wyjścia do badania szybkości i czasu trwania obrazowania dla wielu innych białek można znaleźć w literaturze47,48,59,60.
    4. Użyj ustawień obrazowania akceptora, które minimalizują ekspozycję próbki na światło, zachowując jednocześnie wystarczający stosunek sygnału do szumu, aby zobrazować strukturę będącą przedmiotem zainteresowania. Dobrym punktem wyjścia jest połowa filtra ND i czas naświetlania niezbędny do obrazowania akceptora podczas FRET.
    5. Znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze i zrób zdjęcie.
    6. Narysuj prostokątny obszar robót, aby wskazać, gdzie należy wybielić i zapisać lokalizację zwrotu z inwestycji. Zainicjuj film poklatkowy.
    7. Sprawdź wynikowy zestaw obrazów pod kątem potencjalnych problemów.
      1. Jeśli występują znaczne skoki (większe niż 10% początkowej intensywności) w odzyskiwaniu fluorescencji między klatkami, zmniejsz odstęp czasu między klatkami.
      2. Jeśli w czasie następuje znaczna globalna utrata fluorescencji (większa niż 5-10% początkowej intensywności), zmniejsz liczbę zdjęć wykonanych po wybielaniu i/lub zmień ustawienia obrazowania, aby zmniejszyć ekspozycję próbki na światło.
      3. Jeśli odzyskiwanie fluorescencji nie ustabilizowało się do końca filmu poklatkowego, zwiększ całkowitą długość filmu poklatkowego.
    8. Dostosuj odpowiednio parametry filmu poklatkowego i powtarzaj kroki 4.2.5 – 4.2.7, aż odzysk fluorescencji zostanie odpowiednio uchwycony bez globalnego fotouszkodzenia próbki.

5. Pobieranie danych FRET-FRAP

  1. Przygotuj zestaw mikroskopowy do obrazowania żywych komórek, najlepiej z podgrzewanym stolikiem i obiektywem, a także kontrolą CO2 . Pozostawić do zrównoważenia na 20 minut.
    1. Aby zapewnić zdrowie obrazowanych komórek, należy utrzymywać temperaturę 37 °C w komorze obrazowania. Użyj pompy perystaltycznej, aby przepuścić nawilżone 5% CO2 przez próbkę z prędkością 15 ml/min, aby utrzymać pH.
    2. Alternatywnie, jeśli kontrola CO2 jest niedostępna, należy użyć nośników do obrazowania na żywo zawierających HEPES, aby zapobiec dużym zmianom pH.
  2. Otwórz narzędzie MDA i skonfiguruj parametry obrazowania FRET, w tym różne zestawy filtrów.
  3. Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRET_Date.
  4. Skonfiguruj inny MDA z parametrami obrazowania FRAP, w tym różnymi zestawami filtrów, ustawieniami poklatkowymi i dziennikiem, aby impulsować laser po akwizycji przed wybielaczem.
  5. Zapisz ten MDA w folderze eksperymentalnym o nazwie MDA_FRAP_Date. Zamknij okno MDA.
  6. Na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik | Rozpocznij nagrywanie.
  7. Otwórz okno MDA, załaduj stan MDA_FRET_Date i naciśnij Pobierz. Następnie załaduj stan MDA_FRAP_Date i naciśnij Pobierz.
  8. Na końcu pozyskiwania na pasku narzędzi u góry ekranu wybierz pozycję Dziennik | Zatrzymaj nagrywanie.
  9. Zapisz ten dziennik w folderze eksperymentalnym o nazwie FRETFRAP_Date i dodaj go do paska narzędzi, aby mieć do niego łatwy dostęp. Zamknij okno MDA.
  10. Umieść jedną z wygenerowanych próbek komórek wyrażających czujnik napięcia w uchwycie mikroskopu w celu obrazowania. Pozostawić do zrównoważenia na 10 minut.
  11. Nawigowanie po przykładzie przy użyciu pobierania obrazu w obszarze Pobieranie | Pobieraj przy minimalnym czasie ekspozycji i filtrze ND, aby zidentyfikować interesujące komórki.
  12. Ustaw ciągły autofokus, przechodząc do Urządzenia | Ostrość. Ręcznie ustaw ostrość na próbce, aż osiągniesz właściwą płaszczyznę obrazowania.
  13. Kliknij opcję Set Continuous Focus (Ustaw ciągłe ustawianie ostrości), poczekaj, aż system się dostosuje, a następnie kliknij przycisk Start Continuous Focusing.
    UWAGA: Nie jest to wymagane, ale znacznie poprawia jakość krzywych odzysku FRAP, ponieważ zapobiega dryfowaniu próbki w nieostrości.
  14. Znajdź komórkę wyrażającą czujnik napięcia z wyraźną lokalizacją w interesującej Cię strukturze i zrób zdjęcie.
  15. Narysuj prostokątny zwrot z inwestycji, aby zaznaczyć miejsce, w którym chcesz wybielić. Przechowuj lokalizację ROI.
  16. Zainicjuj dziennik FRETFRAP_Date, który rozpocznie pobieranie obrazów FRET, a następnie inicjalizację filmu poklatkowego FRAP.
  17. Powtarzaj kroki 5.14-5.16, aż zostanie pobranych 10-15 zestawów obrazów.
    UWAGA: Pomiaru nie można powtórzyć w tej samej komórce. Gdy dojdzie do fotowybielania, dane FRET są niewiarygodne.

6. Analiza danych FRET-FRAP

  1. Analizuj obrazy FRET za pomocą wybranego oprogramowania.
    UWAGA: Istnieje kilka sposobów obrazowania i ilościowego określania FRET61, w tym ratiometryczne FRET62 i FRET index34,35. Jednak zdecydowanie zaleca się korzystanie z szacunków wydajności FRET55,63 do interpretacji danych FRET-FRAP. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na ten temat. Do uczulania emisji i obliczania wydajności FRET dostępne jest niestandardowe oprogramowanie w laboratorium Hoffman pod adresem https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Określ ilościowo odpowiednie parametry dla każdej struktury subkomórkowej, która została wybielona. Powinno to obejmować średni indeks/wydajność FRET i średnią początkową intensywność akceptora (proporcjonalną do stężenia), ale może również obejmować parametry fizyczne, takie jak wielkość ROI.
  3. Analizuj obrazy FRAP za pomocą wybranego oprogramowania.
    UWAGA: Istnieje kilka sposobów ilościowego oznaczania FRAP26,27,28,29. Kluczowe problemy eksperymentalne obejmują uwzględnianie wybielania podczas obrazowania po wybielaniu, zmiany intensywności tła i translokację wysoce dynamicznych struktur subkomórkowych, takich jak zrosty ogniskowe. Korekcje wybielania i zmiany w oświetleniu tła można uzyskać poprzez analizę niebielonych i niefluorescencyjnych obszarów obrazów. Wysoce dynamiczne struktury subkomórkowe, szczególnie te wykazujące nadmierną dynamikę wzrostu lub demontażu, są niezgodne ze standardowymi analizami FRAP i nie powinny być analizowane. Ponadto istnieje wiele sposobów normalizacji danych. Podane wytyczne służą do najprostszej analizy.
  4. Popraw dane regeneracji dla efektów wybielania, a następnie znormalizuj do intensywności przed wybielaniem. Określ ilościowo okres połowicznego zaniku regeneracji i frakcję ruchomą zgodnie z następującym równaniem28,34:
    MF - (MF - Ro)e-kt
    gdzie MF jest frakcją ruchomą, Ro jest początkowym odzyskiem, a k jest współczynnikiem odzysku. Okres połowy rekonwalescencji jest określany przez:
    τ1/2 = ln 2/k.
    UWAGA: Istnieje wiele publicznie dostępnych pakietów oprogramowania do wykonywania tych analiz64, a także różne wtyczki ImageJ. Oprogramowanie na zamówienie jest dostępne w Hoffman Lab pod adresem https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Należy przeprowadzić więcej analiz w sytuacjach, w których dyfuzja wpływa na dynamikę białka będącego przedmiotem zainteresowania, w procesie odzysku widocznych jest wiele skal czasowych lub stosuje się niestandardowe geometrie bielenia.

7. Interpretacja danych FRET-FRAP

  1. Skompiluj odpowiednie informacje dla każdego zwrotu z inwestycji, w tym: indeks/wydajność FRET, intensywność akceptora, czas połowicznego zaniku FRAP, frakcja ruchoma FRAP.
    UWAGA: Wskaźnik FRET lub wydajność służy do określenia średniego obciążenia białka w ramach ROI. Intensywność akceptora mierzy lokalne stężenie białka. Okres połowicznego okresu regeneracji jest miarą dynamiki białek. Krótsza połowa meczu oznacza szybszą rotację. Frakcja ruchoma FRAP mierzy ilość białka w ROI, które aktywnie się obraca. Większa frakcja ruchoma wskazuje, że większy procent białka w ROI przewraca się.
  2. Aby zbadać wpływ lokalnego stężenia na szybkość i ilość obrotu białka, należy wykreślić czas połowicznego zaniku FRAP i frakcję ruchomą w stosunku do początkowej intensywności akceptora.
  3. Aby zbadać wpływ obciążenia białkiem na szybkość i ilość obrotu białka, należy wykreślić czas połowicznego zaniku FRAP i frakcję ruchomą w stosunku do indeksu/wydajności FRET.
    UWAGA: W zależności od białka lub struktury, interesujące może być również zbadanie wpływu parametrów fizycznych, takich jak wielkość struktury lub mimośród, na obciążenie białkiem lub obrót.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET-FRAP składa się z połączenia dwóch technik fluorescencyjnych, FRET i FRAP. Skupiając się na skutkach obciążenia białkiem, użyliśmy czujników napięcia opartych na FRET34,46. Czujniki te są często oparte na module czujnika napięcia składającym się z dwóch białek fluorescencyjnych, takich jak mTFP1 i VenusA206K, połączonych łącznikiem w kształcie wici (Rysunek 1A). Gdy moduł zostanie umieszczony między domeną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda FRET-FRAP pozwala na bezpośredni pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę, właściwości, która była trudna do bezpośredniego zbadania w żywych komórkach. Wrażliwość dynamiki białka na obciążenie molekularne ma kluczowe znaczenie dla funkcji białka jako przekaźnika lub przetwornika siły. Obciążenie jest wymagane do przenoszenia zarówno sił generowanych wewnętrznie, jak i zewnętrznie, zwanych mechanotranskałgencją, oraz do przekształcania tych sił w sygnały wykrywalne biochemicznie, co nazywa się mechanotransdukcją....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257), a także granty od American Heart Association (16GRNT30930019) i National Institutes of Health (R01GM121739-01) przyznane dr Brentonowi Hoffmanowi oraz stypendium National Science Foundation Graduate Research Fellowship przyznane Katheryn Rothenberg. Za treść odpowiedzialni są wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy NSF lub NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTAThermo Fisher25300062
16% paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Nauki30525-89-4
60x Obiektyw NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)Gibco15240-062
Etap zautomatyzowanyWcześniejszyH117EIX3
Niestandardowe lustro dichroiczneChroma Technology CorpT450 / 514rpc
Niestandardowy filtr emisji mTFP1Chroma Technology CorpET485 / 20m
Niestandardowy filtr wzbudzenia mTFP1Chroma Technology CorpET450/30x
Niestandardowy filtr wzbudzenia VenusChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Medium do wizualizacji komórek na żywoSapphireMC102
Zmodyfikowany Środek Orła firmy Dulbecco Sigma AldrichD5796z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu
Hyklon płodowej surowicy bydlęcejSH30396.03
Fibronektyna, HumanCorning47743-654
Szkiełko kalibracyjne FRAPPAAndordostarczany wraz z jednostką FRAPPA
System FRAPPA z laserem 515 nmior
Naczynia fluorowe ze szklanym dnemWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
Bromek heksadimetryny, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
Wysoki poziom glukozy Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's MediumSigma AldrichD6429
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX83
JMP Pro OprogramowanieSAS
Lambda 10-3 Zmotoryzowane koła filtracyjneSutter InstrumentsLB10-NW
Lampa łukowa LambdaLS z bezozonową żarówką ksenonową 300 WSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-027
Oprogramowanie MATLABMathworks
MEM Aminokwasy endogenneThermo Fisher11140050
MetaMorph dla OlympusSystem
Bioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Sorter komórekBeckman CoulterB25982
Podgrzewacz obiektywu MediumBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma AldrichD8537
pMD2.G Plazmid kopertowyAddgene12259
pRRL Wektorprezent od dr Kam Leonga (Columbia University)
psPax2 Opakowanie PlazmidAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 KameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Wirówka Sorvall Legend XT/XFThermo Fisher 75004505
Stajnia Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Filtr emisyjny VenusSemrockFF01-571/72
naukowy mikronawilżania Olympus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101(2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283(2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586(2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549(2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491(2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika FRET FRAPmechanotransdukcjaoddzia ywania bia ko bia koadhezja ogniskowaczujnik napi cia winkulinyobrazowanie FRAPobrazowanie FRET

Powiązane artykuły