Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58622

⸱

28 listopada 2018

 , 
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Streszczenie

Standardowe spermiogramy opisujące jakość plemników opierają się głównie na parametrach fizjologicznych i wizualnych, takich jak objętość i stężenie ejakulatu, ruchliwość i ruchliwość progresywna oraz morfologia i żywotność plemników. Jednak żadna z tych ocen nie jest wystarczająco dobra, aby przewidzieć jakość nasienia. Biorąc pod uwagę, że utrzymanie żywotności plemników i potencjału zapłodnienia zależy od integralności błony i funkcjonalności wewnątrzkomórkowej, ocena tych parametrów może umożliwić lepsze przewidywanie kompetencji zapłodnienia plemników. W tym miejscu opisujemy trzy możliwe metody oceny jakości nasienia przy użyciu określonych sond fluorescencyjnych w połączeniu z analizami mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. W analizach oceniano integralność błony plazmatycznej przy użyciu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i jodku propidyny (PI), integralność błony akrosomalnej przy użyciu aglutyniny Pisum sativum sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC-PSA) oraz integralność błony mitochondrialnej przy użyciu jodku karbocyjaniny 5,5',6,6'-tetraetylobenzimidazolylu (JC-1). Przedstawiono również kombinacje tych metod. Na przykład zastosowanie aneksyny V w połączeniu z fluorochromami PI umożliwia ocenę apoptozy i obliczenie proporcji apoptotycznych plemników (indeksu apoptotycznego). Uważamy, że te metodologie, które opierają się na badaniu błon plemników, są bardzo przydatne do oceny jakości nasienia.

Wprowadzenie

Integralność i funkcjonalność błon plemników to tylko niektóre z czynników wskazujących na żywotność plemników i potencjał zapłodnienia. Błona plazmatyczna działa jak bariera między przedziałami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi, utrzymując w ten sposób komórkową równowagę osmotyczną1. Każdy stres, który powoduje uszkodzenie integralności błony komórkowej, może upośledzać homeostazę, zmniejszać żywotność i zdolność zapłodnienia oraz zwiększać śmierć komórek. Na przykład kriokonserwacja zmniejsza żywotność plemników z powodu uszkodzenia ich błony plazmatycznej w wyniku zmian temperatury i stresu osmotycznego2. Wcześniej informowaliśmy, że wystawienie nasienia buhaja na działanie niskich stężeń zanieczyszczeń przenoszonych przez żywność, takich jak pestycyd atrazyna, jej główny metabolit diaminochlorotriazyna lub mikotoksyna aflatoksyna B1, zmniejsza żywotność plemników1,3. Ustalono to poprzez znakowanie dwuniciowego DNA DAPI w połączeniu z PI, który wiąże się z DNA komórek z uszkodzoną błoną plazmatyczną.

Reakcja akrosomów (AR) polega na fuzji zewnętrznej błony akrosomowej i leżącej nad nią błony plazmatycznej, co prowadzi do uwolnienia enzymów akrosomalnych4,5. Są to zdarzenia niezbędne do penetracji osłony przejrzystej i dalszego łączenia plemnika z oocytem6. Dlatego ocena integralności błony akrosomalnej stanowi użyteczny parametr do oceny jakości nasienia i płodności samców7,8,9. Do weryfikacji integralności akrosomów nadaje się kilka technik fluorescencyjnych, FITC-PNA lub FITC-PSA8,10. W naszych poprzednich badaniach, korzystając z wzorców barwienia FITC-PSA1,3, przedstawiliśmy dokładne definicje (i) nienaruszonego akrosomu, (ii) uszkodzonej błony akrosomu i (iii) przereagowanego akrosomu. W bieżącym raporcie oceniamy stan akrosomów za pomocą cytometrii przepływowej dedykowanej plemnikom i porównujemy wyniki z wynikami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Mitochondria to wielofunkcyjne organelle zaangażowane między innymi w syntezę ATP, produkcję reaktywnych form tlenu, sygnalizację wapnia i apoptozę. Dysfunkcje fizjologiczne, w tym niepłodność męska i żeńska, są związane ze zmienioną funkcją mitochondriów11. Mitochondria plemników są rozmieszczone w części środkowej i odgrywają kluczową rolę w ruchliwości plemników12. Powszechnie przyjmuje się, że wysoki potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) wiąże się z normalną ruchliwością i wysoką zdolnością do nawożenia13. Natomiast niski ΔΨm wiąże się z podwyższonym poziomem reaktywnych form tlenu i zmniejszoną szybkością nawożenia14. Niemniej jednak różne związki środowiskowe, na przykład substancje zaburzające gospodarkę hormonalną, mogą wywoływać stres komórkowy i prowadzić do przejściowego wzrostu ΔΨm, hiperpolaryzacji1,3, zwiększona produkcja wolnych rodników i ostatecznie apoptoza15. Sonda fluorescencyjna 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraetylobenzimidazolylo-jodku karbocyjaniny (JC-1) umożliwia badanie m.in. wpływu toksyn przenoszonych przez żywność na plemniki ΔΨm1,3.

Standardowe spermiogramy, oparte na parametrach fizjologicznych i morfologicznych, nie są wystarczająco dobre, aby przewidzieć jakość nasienia. Aby zapewnić jakość nasienia, potrzebne są dokładniejsze metody. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwe metody określania jakości nasienia na podstawie oceny błon plemników: jednoczesne poczwórne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych i mikroskopię fluorescencyjną, opisane w naszych badaniach1,3 oraz zaawansowana cytometria przepływowa dedykowana plemnikom, niedawno wykorzystana w naszym laboratorium i już używana przez innych16,17,Rozdział 18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z izraelskimi wytycznymi z 1994 roku dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Nasienie bydlęce zostało dostarczone przez komercyjną firmę izraelską do sztucznego zapłodnienia i hodowli. W tym badaniu oceniano wytryski 11 buhajów.

1. Przygotowanie próbki nasienia

UWAGA: Procedura jest oparta na protokole laboratorium Roth1,3.

  1. Uzyskaj około 1–6 ml nasienia buhaja w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
  2. Do każdego 1 ml nasienia dodać 6 ml wstępnie podgrzanego (w temperaturze 37 °C) buforu NKM (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MOPS [kwas 3-N-morfilino-propanosulfonowy; pH 7,4]) i wirować przez 8 minut przy 600 x g, 1–2 razy, aż supernatant będzie klarowny.
    UWAGA: Jeśli stężenie plemników lub objętość początkowa są bardzo wysokie, podziel je na dwie rurki przy pierwszym praniu.
  3. Natychmiast usunąć i wyrzucić klarowny supernatant oraz pozostawić około 1 cm supernatantu nad osadem.
  4. Ostrożnie pochyl rurki pod kątem 30°, aby zwiększyć powierzchnię, na której plemniki mogą podpłynąć i odczekaj 20–30 minut, aby plemniki mogły podpłynąć w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Widać zmętnienie.
  5. Za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć górny 1 ml supernatantu zawierającego ruchliwe plemniki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Utrzymuj plemniki w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
  7. Oszacuj liczbę plemników za pomocą hemocytometru Neubauera.
    UWAGA: Zamiast tego można użyć innej komory liczącej, ale liczenie jest inne.
    1. Aby zapobiec przemieszczaniu się plemników, rozcieńczyć 100 μl ruchliwych plemników w 10 ml podwójnie destylowanej wody (DDW) (rozcieńczenie 1:100) w probówce o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać.
    2. Załadować po 10 μl próbki z każdej strony hemocytometru i szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że nie tworzysz się pęcherzyków wewnątrz komory, ponieważ może to spowodować niedokładną liczbę plemników.
    3. Obserwuj pod mikroskopem złożonym z obiektywem 20x.
      UWAGA: Pełna siatka na hemocytometrze zawiera 9 dużych kwadratów, każdy o wielkości 1 mm2, a szkło nakrywkowe spoczywa 0,1 mm nad podłogą komory. W ten sposób objętość w centralnym obszarze zliczania wynosi 0,1 mm3 lub 0,1 μl. Centralny obszar hemocytometru zawiera 25 średnich kwadratów, a każdy średni kwadrat ma 16 mniejszych kwadratów z pojedynczymi liniami.
    4. Policz całkowitą liczbę komórek znajdujących się w 4 średnich kwadratach narożnych i kwadracie środkowym. Aby uzyskać większą precyzję, policz dwie komory (obie strony hemocytometru Neubauera) i użyj średniej do obliczenia stężenia komórek.
    5. Obliczyć liczbę plemników, mnożąc otrzymaną średnią liczbę przez 5 (aby uzyskać liczbę komórek na obszarze zliczania) i przez 10 000 (aby uzyskać liczbę komórek na 1 ml rozcieńczonej próbki). Następnie pomnóż otrzymaną liczbę przez współczynnik rozcieńczenia (1:100).
      UWAGA: Na przykład średnia liczba plemników zliczonych w 5 z 25 średnich kwadratów w centralnym obszarze zliczania dwóch komór wynosi 150 ([152+148]/2). Zatem średnia liczba plemników w komorze (lub na 0,1 μl) wynosi 150 x 5 = 750. Pomnóż liczbę 750 przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek na 1 ml rozcieńczonej próbki (7 500 000), a następnie pomnóż przez 100 (współczynnik rozcieńczenia), aby uzyskać 75 x 107 komórek na ml oryginalnej próbki nasienia.

2. Technika #1: Jednoczesna ocena błon plemników za pomocą wielu sond fluorescencyjnych

UWAGA: Błony plemników (plazma, akrosomalne i mitochondrialne) zostały ocenione zgodnie z wcześniejszym opisem Celeghini et al.10, z pewnymi modyfikacjami. Zastosowano mikroskopię epifluorescencyjną, połączoną z kamerą cyfrową o wzbudzeniu przy 450-490 nm i emisji przy 515-565 nm przy użyciu potrójnego filtra.

  1. Przygotować roztwory podstawowe.
    1. Przygotować 0,1 mg/ml roztworu podstawowego DAPI, rozpuszczając 5 mg DAPI w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przygotować 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy PBS w stosunku 1:10 (roztwór roboczy; 10 μg/ml).
    2. Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml FITC-PSA, rozpuszczając 1 mg FITC-PSA w 1 ml PBS. Przygotować 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy PBS w stosunku 1:10 (roztwór roboczy; 100 μg/ml).
    3. Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego JC-1, rozpuszczając 1 mg JC-1 w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przygotować 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy DMSO w stosunku 1:10 (roztwór roboczy; 0,1 mg/ml).
    4. Przygotować roztwór podstawowy PI, rozpuszczając 10 mg PI w 400 μl PBS (co daje 2,5 mg/ml). Przechowywać w temperaturze +4 °C. Rozcieńczyć bulion 1 PBS w stosunku 1:20 (roztwór roboczy; 0,125 mg/ml). Przechowywać w temperaturze +4 °C w postaci roztworu podstawowego.
      Uwaga: PI jest potencjalnym mutagenem i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Barwnik należy zutylizować w sposób bezpieczny i zgodny z obowiązującymi lokalnymi przepisami.
  2. Przenieś 133 μl ruchliwych plemników (krok 1.5) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (25 x 106 plemników/ml).
    UWAGA: Jeżeli stężenie próbki jest wyższe, rozcieńczyć ją w buforze NKM, aby osiągnąć wymagane stężenie; Jeżeli stężenie próbki typu swim up jest niższe, odwirować otrzymany supernatant po wypłynięciu w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut, usunąć 0,5 ml supernatantu i ponownie policzyć plemniki.
  3. Dodać 17 μl DAPI (roztworu roboczego) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Do osadu dodać 100 μL buforu NKM.
  6. Dodać 50 μl FITC-PSA, 2 μl JC-1 i 3 μl PI (roztworów roboczych) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  8. Do osadu dodać 40 μl buforu NKM i ponownie zawiesić przez pipetowanie.
  9. Przenieść 10 μl próbki na szkiełko podstawowe, rozmazać i nakryć szkiełko.
  10. Natychmiastowa wizualizacja za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (użyj obiektywu 40x) z potrójnym filtrem, wyposażonym w kamerę cyfrową i uchwyć obraz osobno dla każdego filtra.
    UWAGA: Nie ma znaczenia kolejność wizualizowanych filtrów.
    1. Wizualizacja pod kanałem DAPI ze wzbudzeniem przy 358 nm i emisją przy 461 nm.
    2. Wizualizacja w kanale FITC dla zielonych monomerów o wzbudzeniu przy 450–490 nm i emisji przy 515–565 nm.
    3. Wizualizacja pod kanałem PI dla czerwonych agregatów o wzbudzeniu przy 488 nm i emisji przy 590 nm.
    4. Wizualizacja pod JC-1 czerwonych agregatów o wzbudzeniu przy 559 nm i emisji w zakresie 574–627 nm; Zielone monomery JC-1 o wzbudzeniu przy 488 nm i emisji w zakresie 500–535 nm.
  11. Scal trzy obrazy otrzymane z filtrów w formacie JPG/JPEG, korzystając z opcji "scal" w oprogramowaniu aparatu.
  12. Otwórz scalony obraz za pomocą narzędzia "Paint" i użyj opcji pędzla, aby oznaczyć zliczone plemniki.
  13. Klasyfikuj plemniki na podstawie fluorescencji emitowanej przez każdą sondę:
    1. Ogólnie rzecz biorąc, oceniaj co najmniej 200 plemników na szkiełku - wszystkie komórki są niebieskie (DAPI).
    2. Oceń żywotność, licząc martwe komórki, które wydają się fioletowe (PI [czerwony] + DAPI [niebieski]) i oblicz procent martwych komórek (martwe komórki/całkowita liczba zliczonych komórek x 100).
    3. Oceń status akrosomów za pomocą wzorców barwienia fluorescencyjnego (FITC-PSA). Oblicz procenty różnych wzorców (nienaruszone, uszkodzone lub przereagowane komórki akrosomowe/całkowita liczba komórek x 100).
      UWAGA: Uszkodzona błona akrosomalna wygląda jak w pełni wybarwiona, zielona czapeczka akrosomowa; przereagowana błona akrosomalna wykazuje szczątkowe zielone zabarwienie równikowe lub górne; Komórki zawierające nienaruszoną błonę akrosomalną nie będą wykazywać żadnego zielonego zabarwienia obszaru akrosomalnego.
    4. Oceń ΔΨm, rozróżniając plemniki o wysokim ΔΨm, które mają zabarwioną na czerwono część środkową, i plemniki o niskim ΔΨm, które wykazują zabarwioną na zielono część środkową. Policz osobno czerwone i zielone części środkowe i oblicz ich stosunek (czerwony/zielony).

3. Technika #2: Ocena błon plemników za pomocą gotowych do użycia zestawów i cytometrii przepływowej

UWAGA: Ocena integralności błony plazmatycznej, potencjału błony mitochondrialnej i integralności błony akrosomalnej została przeprowadzona za pomocą gotowych do użycia zestawów do cytometrii przepływowej zawierających liofilizowane fluorochromy w każdym dołku. Zabieg został wykonany zgodnie z zaleceniami producentów z pewnymi modyfikacjami.

  1. Ocena integralności błony plazmatycznej
    1. Weź żądaną liczbę studzienek z opakowania zestawu żywotności i koncentracji (PI i SYbr14), przenieś je do podstawy roboczej i przykryj elastyczną pokrywką (chronić przed światłem).
    2. Dodać 199 μl buforowanego roztworu do cytometrii na studzienkę.
    3. Dodać 1 μl jednorodnego nasienia o wymiarach 57 x 106/ml (57 000 komórek na studzienkę) i homogenizować przez pipetowanie.
    4. Przykryj talerz czarną pokrywką.
    5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, chronić przed światłem.
    6. Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy z ustawieniem "żywotność".
  2. Potencjał błony mitochondrialnej
    1. Weź żądaną liczbę studzienek z opakowania zestawu do aktywności mitochondrialnej (JC-1), przenieś je do podstawy roboczej i przykryj elastyczną pokrywką (chronić przed światłem).
    2. Dodać 10 μl absolutnego etanolu do studzienki i odpipetować w celu ponownego zawieszenia proszku znajdującego się w studzience.
    3. Dodać 190 μl PBS do dołka i homogenizować przez pipetowanie.
    4. Dodać 0,75 μl jednorodnego nasienia o wymiarach 57 x 106/ml (50 000 komórek na studzienkę) i homogenizować przez pipetowanie.
    5. Przykryj talerz czarną pokrywką.
    6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
    7. Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy z ustawieniem "aktywność mitochondriów".
  3. Integralność membrany akrosomalnej
    UWAGA: Barwienie FITC-PSA (patrz Technika #1) umożliwia ocenę 3 kategorii akrosomów (nienaruszony akrosom, akrosom przereagowany i akrosom uszkodzony). Korzystając z cytometru przepływowego i zestawu żywotności i integralności akrosomów (PI i FITC-PNA), plemniki są rozdzielane na te 3 kategorie.
    1. Weź żądaną liczbę studzienek z opakowania zestawu żywotności i integralności akrosomów, przenieś je do podstawy roboczej i przykryj elastyczną pokrywką (chronić przed światłem).
    2. Dodać 200 μl buforowanego roztworu do cytometrii na studzienkę.
    3. Dodać 0,7 μl jednorodnego nasienia o wymiarach 57 x 106/ml (40 000 komórek na studzienkę) i homogenizować przez pipetowanie.
    4. Przykryj talerz czarną pokrywką.
    5. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C, chronić przed światłem.
    6. Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy z ustawieniem "InCyte".
    7. Przeanalizuj wynikowy histogram, bramkując trzy obszary markerów zgodnie z intensywnością fluorescencji, reprezentujące znikome, niskofluorescencyjne komórki z nienaruszonym, niebarwionym akrosomem (R1), komórki o niskiej fluorescencji z resztkową barwioną częścią akrosomu (R2) i wysoce fluorescencyjne komórki z zakłóconym akrosomem (R3).
      UWAGA: Skorzystaj z sekcji "Analizowanie plików uzyskanych za pomocą innych modułów" w podręczniku użytkownika instrumentu, aby utworzyć trzy regiony (R1, R2, R3).

4. Technika #3: Ocena błon plemników za pomocą sond fluorescencyjnych i cytometrii przepływowej

UWAGA: Użycie aneksyny V w połączeniu z fluorochromami PI umożliwia ocenę apoptozy i obliczenie proporcji apoptotycznych plemników (indeks apoptozy).

  1. Przygotować 1x bufor wiążący anektynę V z 20x roztworu podstawowego (rozcieńczyć 500 μl buforu wiążącego anekynę V, 20x roztwór podstawowy 9,5 ml sterylnej wody destylowanej).
  2. Oszacować liczbę plemników za pomocą hemocytometru Neubauera, jak opisano w punkcie 1.7.
  3. Przemyć 106 plemników w 1 ml 1x buforu wiążącego anektynę V i odwirować przy 300 x g przez 10 min.
  4. Całkowicie odessać supernatant.
  5. Zawiesić osad w 100 μL 1x bufora wiążącego aneksynę V.
  6. Dodać 10 μl aneksyny V sprzężonej z FITC.
  7. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyć plemniki, dodając 1 ml 1x buforu wiążącego anektynę V na 106 komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min.
  9. Całkowicie odessać supernatant.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl 1x bufora wiążącego anektynę V na 106 komórek ogółem.
  11. Dodać 1 μg/ml PI bezpośrednio przed analizą za pomocą cytometru przepływowego.
  12. Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy ustawiony na "InCyte".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia jednoczesną ocenę fluorometryczną błon plemników (plazmatycznej, akrosomalnej i mitochondrialnej) z użyciem PI, DAPI, FITC-PSA i JC-1. Ocena błon plemników z wykorzystaniem jednoczesnego barwienia czterema sondami fluorescencyjnymi pozwala na przykład na jednoczesną ocenę dla każdego plemnika proporcji komórek w każdej kategorii – żywych vs. martwych; o wysokim vs. niskim ΔΨm; z nienaruszonym vs. uszkodzonym ak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Potencjał zapłodnienia plemników zależy od wielu czynników wpływających na ich jakość. Wysokie stężenie plemników i wysoki odsetek plemników o bardzo ruchliwej ruchliwości można uznać za nasienie wysokiej jakości. Niemniej jednak taka ocena nie uwzględnia innych parametrów komórkowych i funkcjonalnych. Zastosowanie "stacjonarnego" mikrokapilarnego cytometru przepływowego można łatwo dostosować do oceny różnych struktur plemników za pomocą sond fluorescencyjnych, jak to wcześniej wykazano przez innych17<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować izraelskiej firmie "SION" zajmującej się sztucznym zapłodnieniem i hodowlą (Hafetz-Haim, Izrael) za pomoc i współpracę, a także Pani Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francja) za pomoc w konfiguracji i szkoleniu instrumentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
MOPS [kwas 3-N-morfilinopropanosulfonowy]SigmaM1254
PBSSigmaP5493
DMSOSigmaD2438
Etanol absolutnySigma64-17-5
HemacytometrHemocytometr Neubauer Germany
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)Sonda fluorescencyjnaSigmaD9542
PI (jodek propidyny)Sonda fluorescencyjnaSigmaP4170
FITC-PSA (aglutynina Pisum sativum sprzężona z izotiocyjanianem fluoresceiny)Sonda
fluorescencyjna Sigma L0770JC-1 (jodek karbocyjaniny 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraetylobenzimidazolilu)ENZOBiochem, Nowy Jork, NY, USAENZ52304sonda fluorescencyjna
Aneksyna V sprzężona z FITCfluorescencyjnaMiltenyi Biotec130-093-060
Bufor wiążący załącznika V 20x roztwór podstawowyMACS, bufor Miltenyi Biotec130-092-820Nikon
Eclipse, TE-2000-uNikon, Tokio, Japoniaodwrócony mikroskop fluorescencyjny
Nis ElementsNikon, Tokio, Japoniaoprogramowanie
Nikon DXM1200FNikon, Tokio, Japoniaaparat cyfrowy
Guava EasyCyte PlusIMV Technologies, L'Aigle, Francjamikrokapilarny cytometr przepływu plemników
CytoSoftGuava Technologies Inc., Hayward, Kalifornia, Stany Zjednoczone; dystrybuowane przez oprogramowanie IMV Technologies
Buforowany roztwór do cytometriiIMV Technologies, L'Aigle, FrancjaZestaw do 023862 bufora
Żywotność i stężenieIMV Technologies, L'Aigle, Francja024708zestaw do oceny żywotności
mitochondrialnejIMV Technologies, L'Aigle, Francja024864zestaw do aktywności mitochondrialnej zestaw do oceny
żywotności i integralności akrosomówIMV Technologies, L'Aigle, Francja025293zestaw do oceny integralności akrosomów
JMP-13SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USAoprogramowanie
Nasienie bydlęce"SION", izraelska firma do sztucznego zapłodnienia i odmrażania, Hafetz-Haim, Izrael
MACS, sonda Zestaw do aktywności

Bibliografia

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Integralność błony plemnikówsondy fluorescencyjnecytometria przepływowamikroskopia fluorescencyjnabłona plazmatycznabłona akrosomalnabłona mitochondrialnabarwienie DAPIbarwienie PIFITC-PSA
Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.