Budowa wielowarstwowego arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych z systemem dynamicznej hodowli 3D

Podsumowanie

Ten artykuł dostarcza efektywnej i wykonalnej metody tworzenia wielowarstwowych arkuszy komórek macierzystych o korzystnych właściwościach komórek macierzystych.

Streszczenie

Terapia komórkami macierzystymi ma obiecującą przyszłość w regeneracji uszkodzonych organów i tkanek, a technika arkuszy komórkowych została opracowana w celu poprawy niskiej retencji komórek i słabej przeżywalności w strefie docelowej. Jednak podczas procesu budowy in vitro pilnie potrzebne jest rozwiązanie pozwalające utrzymać bioaktywność komórek macierzystych i zwiększyć ich ilość w arkuszu komórek. W tym przypadku protokół ten przedstawia metodę konstruowania wielowarstwowego arkusza komórek o korzystnej bioaktywności komórek macierzystych i optymalnej operatywności. Zdecelularyzowana osierdzie świni (DPP) jest wytwarzana metodą decelularyzacji fosfolipazy A₂ (PLA₂) jako rusztowanie arkusza komórkowego, a mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego szczura (BMSC) są izolowane i namnażane jako komórki nasienne. Tymczasowa wielowarstwowa struktura arkusza komórkowego jest zbudowana przy użyciu hydrożelu peptydowego RAD16-I. Na koniec arkusz komórek jest hodowany za pomocą dynamicznego systemu perfuzyjnego w celu ustabilizowania struktury trójwymiarowej (3D), a arkusz komórek można uzyskać po 48-godzinnej hodowli in vitro. Protokół ten zapewnia wydajną i wykonalną metodę konstruowania wielowarstwowego arkusza komórek macierzystych, a arkusz komórek może zostać opracowany jako korzystny produkt terapii komórkami macierzystymi w przyszłości.

Wprowadzenie

Terapia komórkami macierzystymi została uznana za skuteczną metodę leczenia wielu chorób; jednak niska retencja komórek i słaba przeżywalność w strefie docelowej pozostają krytycznymi problemami po tradycyjnym wstrzyknięciu komórek macierzystych. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zajmujący się inżynierią tkankową opracowali technikę arkusza komórkowego. Jednowarstwowy arkusz komórek z nienaruszoną macierzą zewnątrzkomórkową został najpierw przygotowany przy użyciu naczynia do hodowli temperaturowo-reakcji¹, a jego dalsze badania wykazały znaczącą poprawę retencji komórek macierzystych i przeżywalności w obszarze zawału^2,3. Wśród metod, konstruowanie wielowarstwowego arkusza komórkowego zostało zgłoszone jako skuteczna strategia poprawy przeżywalności komórek i efektu terapeutycznego arkusza komórkowego^3,4. Od tego czasu naukowcy pracowali nad opracowaniem różnych metod budowy arkuszy komórkowych w celu zwiększenia liczby komórek, właściwości komórek macierzystych i właściwości mechanicznych arkuszy komórek. Do tej pory skonstruowano i przebadano pewne typy arkuszy komórkowych w leczeniu zawału mięśnia sercowego⁵, chrząstki⁶ i skóry wound⁷.

Bioaktywność komórek macierzystych przed przeszczepem wykazywała pojawiający się wpływ na regenerację uszkodzonych tkanek, a różne strategie budowy arkuszy komórkowych mają różny wpływ na komórki macierzyste. Z jednej strony, zlewające się arkusze komórek składały się tylko z komórek macierzystych o dużej gęstości, a naturalne matryce zewnątrzkomórkowe można było uzyskać, układając w stosy jednowarstwowe arkusze komórek⁸ lub stosując techniki inżynierii tkanek magnetycznych⁹. Z drugiej strony, naukowcy opracowali różne rusztowania, aby zapewnić odpowiednią wytrzymałość mechaniczną i wspomóc wzrost komórek^10,11,12, co pozwoliło na niską gęstość wysiewu komórek macierzystych, aby zapewnić zaopatrzenie w składniki odżywcze. Jednak pomimo tych podejść, niskie efektywne zaopatrzenie w składniki odżywcze w wielowarstwowej strukturze arkusza komórkowego pozostaje poważnym problemem podczas budowy in vitro. Dlatego pilnie potrzebny jest wydajny i wykonalny system budowy arkuszy komórek.

Ten protokół opisuje kroki do przygotowania wielowarstwowego arkusza komórek mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). W tym systemie konstrukcyjnym wytrzymałość mechaniczna arkusza ogniw jest zapewniona przez DPP. W oparciu o to rusztowanie, strukturę komórkową 3D można szybko zbudować za pomocą hydrożelu peptydowego RAD16-I, a dynamiczny system perfuzyjny jest używany do hodowli wielowarstwowego arkusza komórkowego, w celu ustabilizowania struktury arkusza komórkowego 3D i zapewnienia wystarczającego zaopatrzenia komórek w składniki odżywcze. Korzystając z tego systemu, z powodzeniem przygotowano wielowarstwowy arkusz BMSC, który wykazał optymalny efekt terapeutyczny na model zawału mięśnia sercowego u szczurów¹³.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na komórkach macierzystych i zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi Krajowego Przewodnika po Opiece i Wykorzystaniu Zwierząt Laboratoryjnych i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jinan (Guangzhou, Chiny).

1. Przygotowanie rusztowania DPP za pomocą metody decelularyzacji PLA₂¹⁴

Uwaga: Zobacz Rysunek 1A dla schematu metody decelularyzacji PLA₂.

1. Przygotować 100 ml 200 U/ml roztworu PLA₂. Dodać 0,5 g deoksycholanu sodu i 2 ml PLA₂ do 198 ml roztworu buforu węglanowego. Roztwór ten należy zużyć w ciągu 24 godzin od jego przygotowania.
2. Pobrać świeże osierdzie świni (FPP) z rzeźni i zwrócić do laboratorium w ciągu 1 godziny
   UWAGA: FPP należy przechowywać w temperaturze 4 °C podczas transportu. Kroki 1.2 - 1.10 należy przeprowadzać z ciągłym wytrząsaniem w łaźni wodnej sterowanej termostatem.
3. Dokładnie przemyć FPP 200 ml roztworu buforu fosforanowego (PBS) zawierającego 1% penicyliny-streptomycyny w zlewce o pojemności 500 ml w temperaturze 10 °C przez 10 minut. Powtórzyć ten krok 2 razy.
4. Podziel FPP na dwie warstwy i usuń tkankę tłuszczową za pomocą kleszczy i nożyczek.
   UWAGA: Utrzymuj FPP w stanie mokrym, dodając 50 ml PBS co 20 minut podczas usuwania tkanki tłuszczowej.
5. Uformuj FPP na² części o wymiarach 10 x 10 cm za pomocą nożyczek. Przemyć FPP 200 ml roztworu buforu węglanowego (CBS) zawierającego 1% penicyliny-streptomycyny w zlewce o pojemności 500 ml w temperaturze 10 °C przez 10 minut. Powtórz ten krok 2 razy.
6. Przełóż FPP do czystej wody i moczyć w temperaturze 10°C przez 12 godzin.
7. Próbki o wymiarach 10 x 10^cm2 namoczyć w 50 ml CBS zawierającym 200 U/ml PLA₂ i 0,5% (m/v) roztworu deoksycholanu sodu w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.
8. Przemyć próbki CBS zawierającym 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 10 °C przez 10 minut. Powtórzyć ten krok 2 razy.
9. Zanurzyć każdą próbkę w 50 ml CBS zawierającym 200 U/ml PLA₂ i 0,5% (w/v) roztworu deoksycholanu sodu w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
10. Przemyć próbki CBS zawierającym 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 10 °C przez 2 godziny. Powtórzyć ten krok co najmniej 10 razy. Umieścić próbki na płaskich płytkach i wysuszyć je do stałej masy w piecu o stałej temperaturze 55 °C.
    UWAGA: Próbka musi być całkowicie wysuszona. Badać próbkę DPP co 10 minut i powtarzać tę czynność 3 razy lub do momentu, gdy masa przestanie się zmieniać.
11. Uformuj każdą próbkę DPP w okrąg o średnicy 10,5 mm z trepanacją. Zapakuj każdy DPP w sterylnie zamkniętą torbę.
12. Wysterylizować próbki DPP za pomocą promieniowania gamma (25 kGy). Próbki DPP przechowywano w temperaturze 4 °C przed użyciem.
    UWAGA: Wszystkie próbki mogą być przechowywane przez okres do sześciu miesięcy w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowania do budowy arkusza komórkowego

1. Wszystkie narzędzia i elementy nośnika tkanek należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut, w tym probówki odśrodkowe o pojemności 1,5 ml, kleszcze, kleszcze zębate, nożyczki, czarne zasady (składnik nośnika tkankowego) i białe pierścienie napinające (składnik nośnika tkankowego).
2. Przygotuj 20 ml wolnego od zarazków 10% roztworu sacharozy. Odważyć 2 g sacharozy i rozpuścić sacharozę w 18 ml ultraczystej wody. 10% roztwór sacharozy należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut lub przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
3. Urządzenia systemu dynamicznej perfuzji należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut, w tym urządzenie do wymiany gazowej, szklaną butelkę o pojemności 500 ml, pojemnik do hodowli perfuzyjnej i rurki łączące.
4. Przygotować autoklawowane narzędzia i elementy nośnika tkankowego. Umieść czarną część bazową nośnika tkankowego w naczyniu hodowlanym.
5. Podnieś wysuszone rusztowanie DPP i umieść je na środku czarnej podstawy. Umieść biały pierścień napinający na rusztowaniu DPP i zamocuj go w nośniku tkanek.
   UWAGA: Upewnij się, że rusztowanie jest całkowicie zamocowane w nośniku tkanek i nie ma przerwy między czarną podstawą a białym pierścieniem napinającym. Jeśli nie, oddziel nośnik tkanek i ponownie zamocuj rusztowanie.
6. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej na rusztowanie DPP w celu ponownego nawodnienia.
   UWAGA: Jeśli rusztowanie nie jest dobrze zamocowane w nośniku tkankowym, pożywka hodowlana przeniknie do szalki hodowlanej.
7. Umieścić rusztowanie w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozostawić do namoczenia przez 15 minut.

3. Przygotowanie komórek do budowy arkusza komórek

Uwaga: Ten protokół dotyczy hodowli komórkowej przy użyciu szalki o średnicy 100 mm. Zobacz Rysunek 1B dla schematu budowy wielowarstwowej struktury komórki.

1. Izoluj BMSCs¹³.
   UWAGA: Ta metoda jest przeznaczona do konstruowania wielowarstwowego arkusza komórek MSC. W tym protokole używane są szczurze BMSC. BMSC są izolowane metodą przylegania całego szpiku kostnego, a BMSC są namnażane in vitro w celu uzyskania wystarczającej ilości komórek.
   1. Autoklawuj narzędzia w temperaturze 121 °C przez 30 minut, w tym kleszcze, kleszcze zębate i nożyczki. Przygotuj strzykawkę do wstrzykiwań o pojemności 2 ml i pożywkę hodowlaną BMSC (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium [DMEM] firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny).
   2. Poddaj eutanazji trzytygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley (SD) przez zwichnięcie kręgów szyjnych. Namocz zwierzę w 100 ml 75% roztworu alkoholu w zlewce na 5 minut.
   3. Wyjmij zwierzę ze zlewki i połóż je na stole operacyjnym. Naciąć skórę na grzbiecie zwierzęcia nożyczkami i kleszczami. Odizoluj skórę i tkanki mięśniowe, aby odsłonić kości udowe.
   4. Odizoluj udowo-udowe i umieść je w 30 ml PBS w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Umieść dwie kości udowe w jednej rurce. Przekręć rurkę wirówkową, aby dokładnie umyć tkankę. Powtórz ten krok 2 razy.
   5. Odetnij oba końce kości udowych nożyczkami i odsłoń jamę szpiku.
   6. Odessać 2 ml pożywki hodowlanej BMSC za pomocą strzykawki do wstrzykiwań. Wprowadzić igłę do jamy szpiku kostnego i wypłukać szpik kostny pożywką hodowlaną. Wypłucz co dwie kości udowe do jednego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.
   7. Na każde 100 mm naczynie hodowlane dodać 2 ml pożywki do pożywki hodowlanej. Umieścić naczynie do hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C i hodowli statycznej na 72 godziny.
   8. Wyjmij naczynie hodowlane z inkubatora. Zastąp supernatant 6 ml świeżej pożywki hodowlanej.
   9. Obserwuj podstawowe BMSC pod mikroskopem. Następnie przechodź przez BMSC co 5 - 7 dni.
2. Wyjmij komórki z inkubatora. Obserwuj komórki pod mikroskopem i wybierz odpowiednie komórki do budowy arkusza komórek. Gdy BMSC osiągną 80% - 90% konfluencji, komórki można wybrać jako komórki zasiane.
3. Usuń pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego. Delikatnie umyj komórki 2 ml ciepłego PBS. Usuń cały PBS z naczynia hodowlanego i upewnij się, że nie pozostał żaden płyn. Dodać 2 ml 0,25% trypsyny (lub innego roztworu dysocjującego) do naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
4. Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając 2 ml pożywki hodowlanej i delikatnie umyj komórki z naczynia. Przenieść zawiesinę komórkową do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.
5. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml 10% (w/v) roztworu sacharozy.
   UWAGA: 10% (w/v) roztwór sacharozy służy do przemywania komórek w celu uzyskania jednolitej mieszaniny komórkowo-hydrożelowej w kolejnych etapach.
6. Odessać 10 μl zawiesiny komórek i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość potrzebną do następnego kroku. Na jeden arkusz komórek używane są trzy miliony BMSC.
7. Wyodrębnij trzy miliony komórek i przenieś je do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 225 x g przez 5 minut.
8. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 10% (w/v) roztworu sacharozy. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Użycie rurki odśrodkowej o pojemności 1,5 ml jest korzystne do przygotowania mieszaniny komórkowo-hydrożelowej.
9. Odwirować komórki przy 260 xg przez 5 minut. Całkowicie usunąć supernatant i uzyskać osad komórkowy.

4. Przygotowanie BMSC i mieszaniny peptydów hydrożelowych RAD16-I

Uwaga: Zobacz Rysunek 1B dla schematu budowy wielowarstwowej struktury komórki.

1. Dodać 20 μl 10% (w/v) roztworu sacharozy do probówki odśrodkowej o pojemności 1,5 ml. Delikatnie zawiesić BMSC i uzyskać jednolitą zawiesinę.
   UWAGA: Podczas ponownego zawieszania nie należy wytwarzać pęcherzyków powietrza.
2. Dodać 20 μl hydrożelu peptydowego RAD16-I na wierzch zawiesiny. Delikatnie wymieszaj peptyd RAD16-I i zawiesinę komórkową za pomocą końcówki pipety. Po zmieszaniu zawiesiny komórkowej i hydrożelu delikatnie odpipetuj mieszaninę kilka razy.
3. Wyjąć rusztowanie DPP z nośnika tkanek i delikatnie zassać pożywkę hodowlaną końcówką pipety.
   UWAGA: Upewnij się, że rusztowanie DPP jest w pełni nawodnione przed dodaniem mieszaniny komórkowo-hydrożelowej.
4. Odessać mieszaninę i równomiernie dodać ją do rusztowania DPP.
   UWAGA: Całkowita objętość mieszaniny wynosiłaby około 40 - 50 μL. Zaleca się dodawanie mieszaniny po 10 μl jednorazowo od środka na zewnątrz rusztowania.
5. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej na dno nośnika tkankowego. Umieścić arkusz komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
6. Wyjmij arkusz komórek z inkubatora. Delikatnie dodaj 4 ml pożywki hodowlanej do naczynia hodowlanego i zanurz arkusz komórek. Umieścić arkusz komórek w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 godziny hodowli statycznej.

5. Hodowla in vitro wielowarstwowego arkusza komórkowego 3D przy użyciu dynamicznego systemu hodowli

UWAGA: Zobacz Rysunek 1C dla schematu dynamicznego systemu 3D.

1. Przygotuj dynamiczny system perfuzyjny, w tym pompę perystaltyczną, sprzęt do wymiany gazowej, szklaną butelkę o pojemności 500 ml, pojemnik do hodowli perfuzyjnej i rurki łączące. Zmontuj dynamiczny system perfuzyjny, jak pokazano na Rysunek 2.
2. Dodać 200 ml pożywki hodowlanej do sterylnej szklanej butelki. Włóż arkusz komórek do komory pojemnika na hodowlę.
   UWAGA: Zwróć uwagę na kierunek górnej powierzchni arkusza komórek.
3. Dodać 3 ml pożywki hodowlanej do pojemnika na chusteczki i zamknąć pojemnik. Umieść dynamiczny system perfuzyjny w inkubatorze i uruchom pompę. Ustawić natężenie przepływu pompy perystaltycznej na 8 ml/min. Hodować arkusz komórek w systemie dynamicznej perfuzji przez 48 godzin.

6. Uzyskiwanie wielowarstwowego arkusza komórek MSC

1. Autoklawować narzędzia i elementy nośnika tkanek w temperaturze 121 °C przez 30 minut, w tym probówki odśrodkowe o pojemności 1,5 ml, kleszcze i kleszcze zębate.
2. Wyciągnij kanał wejściowy ze szklanej butelki, aby zatrzymać dopływ pożywki hodowlanej do pojemnika.
   UWAGA: Zatrzymaj pompę perystaltyczną, gdy pojemnik na kulturę jest pusty.
3. Wyjmij arkusz komórek z pojemnika na hodowlę i umieść go w naczyniu hodowlanym.
4. Użyj jednego kleszczyka, aby unieruchomić nośnik tkanki, a drugiego kleszczyka zębatego, aby oddzielić biały pierścień napinający od czarnej podstawy. Na koniec uzyskaj wielowarstwowy arkusz komórek BMSC.
5. W celu krótkiej konserwacji każdy arkusz komórek można przenieść do probówki odśrodkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą kleszczyków. Rusztowanie DPP powinno być przymocowane do wewnętrznej ścianki rurki odśrodkowej, a arkusz komórek powinien rozchodzić się jak najbardziej w probówce wirówkowej.
6. Delikatnie dodaj 1 ml pożywki hodowlanej do probówki odśrodkowej, aby zanurzyć arkusz komórek. Zamknąć nakrętkę rurki odśrodkowej i przechowywać arkusz komórek w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Arkusz komórek powinien zostać przeszczepiony lub przeanalizowany tak szybko, jak to możliwe. Zaleca się zużyć arkusz komórek w ciągu 4 godzin.

Wyniki

Schemat budowy wielowarstwowego arkusza komórek macierzystych jest pokazany w Rysunek 1. Pierwszym krokiem jest przygotowanie rusztowania arkusza komórkowego metodą decelularyzacji PLA₂. W oparciu o rusztowanie, tymczasowa struktura komórkowa 3D jest konstruowana poprzez zmieszanie komórek macierzystych z hydrożelem peptydowym RAD16-1. W celu uzyskania wielowarstwowego arkusza komórkowego o korzystnej bioaktywności komórek macierzystych i optymalne...

Dyskusja

Niniejszy protokół informuje o skutecznej metodzie konstruowania wielowarstwowego arkusza MSC. Ten arkusz komórek wykazuje optymalną wytrzymałość mechaniczną, wysoką gęstość wysiewu komórek i korzystną bioaktywność komórek macierzystych. Na przykładzie BMSC struktura komórki 3D jest szybko konstruowana za pomocą hydrożelu peptydowego RAD16-I. Po wyhodowaniu w systemie dynamicznej perfuzji, wielowarstwowy arkusz BMSC zostaje pomyślnie uzyskany, a BMSC utrzymują wysoką ekspresję markerów komórek macierzystych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fosfolipaza A2	Sigma-Aldrich	P6534
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Bufor fosforanowy	Gibco BRL	89033
Penicylina streptomycyna / amfoterycyna	Gibco BRL	15640055
Bufor wodorowęglan	Sigma-Aldrich	C3041
Koncentrator stołowy	Changzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
Południowoamerykańska płodowa surowica bydlęca	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-Glutamina	Corning Cellgro	25-005-CI
0,25% trypsyny/2,21 mM EDTA	Corning Cellgro	25-053-CI
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Esco,Singapur	AC2-2S1
Inkubator o stałej temperaturze	Esco,Singapur	CLS-170B-8
Probówka wirówkowa	Corning	430790
Rura EP	Axygen	31617934
Maszyna odśrodkowa	TOMOS	1-16R
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S9378-500G
Pura Matrix	BD	354250
Dynamiczny system hodowli perfuzyjnej	Minucells i Minutissue	D-93077
Pompa perystaltyczna	Ismatec	IPC N8
Rurka pompy	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	z Ratyzbony
perfuzji MINUSHEET	Regensburg
MINUSHEET 0006	Urządzenia do wymiany gazowej	w Ratyzbonie
MINUSHEET 0002	Regensburg		Butelka szklana 500 ml
MINUSHEET 1301			pojemnik do hodowli perfuzyjnej