Osadzanie biofilmu we wzorze w wysokiej rozdzielczości przy użyciu pDawn-Ag43

Podsumowanie

Pokazujemy metodę osadzania biofilmów bakteryjnych Escherichia coli w dowolnych wzorach przestrzennych z wysoką rozdzielczością, wykorzystując stymulację optyczną genetycznie kodowanego konstruktu adhezji powierzchniowej.

Streszczenie

Struktura przestrzenna i wzór odgrywają ważną rolę w biofilmach bakteryjnych. W tym miejscu demonstrujemy przystępną metodę hodowli biofilmów E. coli w dowolne wzory przestrzenne w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Technika ta wykorzystuje genetycznie zakodowany konstrukt optogenetyczny – pDawn-Ag43 – który łączy tworzenie biofilmu u E. coli ze stymulacją optyczną za pomocą światła niebieskiego. Szczegółowo opisujemy proces transformacji E. coli z pDawn-Ag43, przygotowanie wymaganego układu optycznego oraz protokół hodowli wzorzystych biofilmów przy użyciu bakterii pDawn-Ag43. Korzystając z tego protokołu, biofilmy o rozdzielczości przestrzennej poniżej 25 μm mogą być wzorowane na różnych powierzchniach i środowiskach, w tym w zamkniętych komorach, bez konieczności mikrowytwarzania, pomieszczeń czystych lub wstępnej obróbki powierzchni. Technika ta jest wygodna i odpowiednia do stosowania w aplikacjach, które badają wpływ struktury biofilmu, zapewniając dostrajalną kontrolę nad modelowaniem biofilmu. W szerszym ujęciu ma również potencjalne zastosowania w biomateriałach, edukacji i biosztuce.

Wprowadzenie

Biofilmy są powierzchniowo przyczepionymi społecznościami mikrobów i są dobrze znane ze swojego silnego sprzężenia struktura-funkcja. Geometria przestrzenna i wzory biofilmów odgrywają ważną rolę w ogólnym funkcjonowaniu społeczności (i vice versa)¹. Małe skale długości zaangażowane w strukturę biofilmu - rzędu dziesiątek mikronów² - sprawiają, że przestrajalna i wygodna kontrola wzoru biofilmu jest trudnym problemem. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który pozwala na precyzyjne modelowanie biofilmów w dowolnych geometriach, w oparciu o oświetlenie optyczne.

Protokół prezentowany tutaj wykorzystuje pDawn-Ag43³, konstrukt optogenetyczny, który łączy tworzenie biofilmu u bakterii E. coli z oświetleniem optycznym poprzez sterowanie ekspresją Ag43 (gen adhezyny odpowiedzialny za adhezynę powierzchniową i tworzenie biofilmu) pod kontrolą pDawn⁴ (regulator transkrypcji sterowany przez oświetlenie optyczne). Metoda jest wygodna w użyciu i umożliwia modelowanie biofilmów w różnych środowiskach powierzchniowych, w tym w zamkniętych (przezroczystych) komorach hodowlanych. W porównaniu z istniejącymi metodami osadzania komórek, takimi jak osadzanie kropelkowe⁵ lub wstępne modelowanie/obróbka powierzchni⁶, pDawn-Ag43 nie wymaga mikrofabrykacji ani pomieszczeń czystych i nie wymaga materiałów poza tymi, które są dostępne dla typowego laboratorium mikrobiologicznego. Jest w stanie tworzyć wzorce z rozdzielczością przestrzenną poniżej 25 μm, zbliżając się do wymiarów przestrzennych mikrokolonii w naturalnie istniejących biofilmach². Ogólnie rzecz biorąc, technika ta daje możliwość manipulowania strukturą biofilmu, co z kolei otwiera wiele możliwości badania mikroekologii w społecznościach bakteryjnych⁷. Dodatkowo, wzorzyste biofilmy mogą stanowić wygodną platformę, na której można projektować użyteczne biomateriały^8,9. W tym artykule omawiamy podstawowy protokół wymagany do modelowania biofilmów przy użyciu pDawn-Ag43 oraz zajmujemy się potencjalnymi modyfikacjami i rozwiązywaniem problemów związanych z tą metodą.

Protokół

1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych pDawn-Ag43

1. Przekształć pDawn-Ag43 w interesujący szczep E. coli (Rysunek 1).
   1. Wyhoduj szczep klonujący zawierający plazmid pDawn-Ag43 (możliwy do uzyskania z repozytorium plazmidu) poprzez zaszczepienie szczepu w bulionie LB uzupełnionym 50 μg / ml spektynomycyny (LB + spec) w probówce hodowlanej (przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem przy ~ 250 obr./min, 37 °C). Następnie użyj zestawu miniprep, aby zebrać oczyszczony plazmid pDawn-Ag43 ¹⁰.
   2. Wybierz szczep E. coli, który Cię interesuje, aby uzyskać wzór. Do tej pory zweryfikowano, że pDawn-Ag43 działa w MG1655³ i BW25113.
   3. Użyj ustalonego protokołu, aby wygenerować kompetentne (np. kompetentne chemicznie¹¹ lub elektrokompetentne¹²) zapasy wybranego szczepu E. coli (np. MG1655).
   4. Przekształć plazmid pDawn-Ag43 w kompetentną bakterię^11,12, a następnie 1 godzina odzyskiwania i płytka na płytkach agarowych LB+spec. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Przechowuj przekształcone szczepy pDawn-Ag43.
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię pDawn-Ag43 z płytki agarowej LB+spec do bulionu LB+spec w probówce hodowlanej i wyhodować ją w inkubatorze z wytrząsaniem (przy ~250 obr./min, 37 °C) do fazy wykładniczej (OD600 ~0,4 - 0,8).
   2. Przygotuj wywar do długotrwałego przechowywania przekształconego szczepu pDawn-Ag43 w temperaturze -80 °C, mieszając 1 ml kultury z 1 ml 50% sterylnego glicerolu w krioprobówce, aby uzyskać 25% bulion do zamrażania glicerolu. Przechowuj go w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
   3. Jeśli dodatkowe plazmidy (np. fluorescencyjne plazmidy reporterowe) muszą zostać przekształcone, utwórz kompetentne komórki^11,12 z przekształconego szczepu pDawn-Ag43 i powtórz proces transformacji^11,12 dla dodatkowych plazmidów w razie potrzeby.
      UWAGA: W przypadku korzystania z electroporation⁸, możliwa jest jednoczesna kotransformacja wielu plazmidów (w tym pDawn-Ag43); jednak jednoczesna transformacja nie jest zalecana przy użyciu metod przemian chemicznych, ponieważ duży rozmiar (> 10 kB) pDawn-Ag43 oznacza, że wydajność transformacji jest zmniejszona.

2. Przygotowanie zestawu optycznego projektora do oświetlania bakterii

1. Zaopatrz się w inkubator bakteryjny z nieprzezroczystymi ściankami i otworem do prowadzenia, przenośny projektor zdolny do zamontowania i funkcjonowania wewnątrz inkubatora bakteryjnego oraz laptop wyposażony w oprogramowanie do prezentacji-projekcji (patrz tabela materiałów). Wybierając projektor i inkubator, upewnij się, że minimalna odległość ustawiania ostrości projektora jest mniejsza niż wysokość wnętrza inkubatora.
2. Umieść projektor wewnątrz inkubatora na dole, z otworem skierowanym bezpośrednio do góry, na suficie, gdzie przymocowana jest komora do hodowli biofilmu (Rysunek 2).
3. Zamocuj projektor na miejscu, konstruując zestaw z podstawą płytki stykowej optycznej podłączoną do pionowego słupka, który z kolei jest połączony z poziomym słupkiem, który przykręca się do projektora (Rysunek 2). Należy pamiętać, że ta konfiguracja może być modyfikowana w zależności od projektora/dostępnych części. Ostatecznie kluczowym wymaganiem jest, aby projektor był solidnie zamocowany w dolnej części inkubatora, z otworem skierowanym do góry.
4. Podłącz laptopa za pomocą wyświetlacza (np. HDMI) do projektora wewnątrz inkubatora.
5. Jeśli powierzchnie – zwłaszcza sufit – wnętrza inkubatora odbijają światło (np. powierzchnia polerowana metalem), przykryj je ciemnymi matowymi powierzchniami, aby zminimalizować odbicia.
6. Użyj taśmy, aby przymocować pustą "atrapę" naczynia hodowlanego do sufitu inkubatora. Należy pamiętać, że podobnie jak w przypadku projektora, istnieje wiele akceptowalnych sposobów dołączenia naczynia hodowlanego; Upewnij się, że przezroczysta dolna powierzchnia komory hodowlanej, na której występuje oświetlenie, nie jest zakryta.
7. Wyreguluj ostrość na projektorze, obracając pokrętło ostrości tak, aby płaszczyzna ostrości pokrywała się z dolną powierzchnią naczynia do hodowli biofilmu (np. płytki studzienki) przymocowanej do sufitu inkubatora (Rysunek 2). Projektor powinien oświetlić ostry, nierozmyty obraz na dnie naczynia hodowlanego. Usuń "fikcyjną" miskę hodowlaną po zoptymalizowaniu projekcji.
8. Za pomocą oprogramowania laptopa skieruj projektor tak, aby oświetlił pełne pole view z maksymalnym niebieskim podświetleniem (np. RGB = [0, 0, 255]), prezentując pełny niebieski slajd.
9. Zmierz natężenie oświetlenia projektora za pomocą miernika mocy optycznej, umieszczając głowicę fotodetektora na suficie inkubatora i odczytując natężenie na odpowiednim mierniku mocy skalibrowanym do długości fali światła 460 nm. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi podłączania i kalibracji fotodetektora dla konkretnego używanego miernika mocy.
   1. Zmniejsz ilość światła otoczenia (np. wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu lub umieść inkubator z dala od źródeł światła) tak bardzo, jak to możliwe przed wykonaniem pomiarów natężenia oświetlenia.
10. Dostosuj intensywność oświetlenia za pomocą regulowanego filtra o neutralnej gęstości umieszczonego na przysłonie projektora. Obróć filtr, aby wyregulować intensywność oświetlenia mierzoną przez miernik mocy, aż intensywność oświetlenia w środku obszaru wyświetlanego na niebiesko wskaże 50 μW/cm².
    UWAGA: Chociaż możliwe jest dostosowanie intensywności oświetlenia za pomocą niższych wartości niebieskiego RGB po stronie oprogramowania, użycie filtra przy jednoczesnej maksymalizacji wartości niebieskiego RGB ma tę zaletę, że maksymalizuje kontrast optyczny systemu między oświetlonymi i ciemnymi obszarami.
11. Narysuj dowolne wzory za pomocą oprogramowania do prezentacji/projektora na laptopie i wyświetl te wzory na suficie inkubatora za pomocą projektora.
    UWAGA: Obszary tworzące biofilm powinny być rysowane przy maksymalnym niebieskim oświetleniu (np. RGB = [0, 0, 255]), obszary nietworzące biofilmu bez oświetlenia (np. RGB = [0, 0, 0]).

3. Hodowla wzorzystych biofilmów

1. Przed oświetleniem przygotuj bakterie pDawn-Ag43, zaczynając od materiału do zamrażania glicerolu, tak aby zostały niezawodnie indukowane w późnej fazie wzrostu wykładniczego do oświetlenia (Rysunek 3A).
   1. Smugi szczepu pDawn-Ag43 z wywaru glicerolu na płytki agarowe LB+spec. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc (37 °C).
      UWAGA: Od tego momentu aż do etapu hodowli oświetlenia upewnij się, że komórki pozostają w ciemności tak długo, jak to możliwe - dopuszczalne są krótkie okresy oświetlenia otoczenia (np. w celu rozcieńczenia).
   2. Zaszczepić kolonię bakterii pDawn-Ag43 z płytki agarowej w bulionie LB+spec i hodować kulturę przez noc do fazy stacjonarnej (w inkubatorze z wytrząsaniem przy ~250 obr./min, 37 °C, przez ~16 godzin).
   3. Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:1,000 bulionem LB+spec (np. dodać 1 μl kultury na noc do 1 ml świeżej LB+spec).
   4. Pozostawić rozcieńczoną kulturę do wzrostu do późnej fazy wykładniczej/wczesnej stacjonarnej (OD ~1,0, ~6 h w inkubatorze z wytrząsaniem przy ~250 obr./min, 37 °C).
   5. Czekając, aż kultura wyrośnie, przygotuj pożywkę M63 z 1x solami M63, 1 mM MgSO₄, 0,2% glukozy, 0,1% casaminokwasów i 50 μg/ml spektynomycyny w wodzie (upewnij się, że części składowe są sterylne).
   6. Rozcieńczyć kulturę późnej fazy wykładniczej w stosunku 1:100 pożywką M63 uzupełnioną 50 μg/ml spektynomycyny. Następnie wprowadzić rozcieńczenie do naczynia do hodowli biofilmu (np. odpipetować rozcieńczoną próbkę do płytki dołka).
      UWAGA: Objętości wymagane do tego rozcieńczenia w stosunku 1:100 zależą od używanej płytki hodowlanej (np. w przypadku użycia 6-dołkowej płytki z polistyrenu [niepoddanej działaniu kultur tkankowych], pojedyncza próbka wymagałaby dodania 20 μl kultury do 2 ml M63+spec, ponieważ standardowa objętość dołka płytki 6-dołkowej wynosi ~2 ml).
2. Gdy próbki są już gotowe do oświetlenia, przyklej naczynie hodowlane do sufitu inkubatora, upewniając się, że powierzchnia na dnie naczynia jest przezroczysta, aby projektor oświetlił ją od dołu.
   UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że sufit inkubatora nie odbija światła, aby zminimalizować rozproszone oświetlenie. Rozproszone oświetlenie można również zmniejszyć, używając płyt o czarnych ściankach jako naczyń hodowlanych, chociaż nie jest to absolutnie konieczne - jeśli używasz takich płyt, upewnij się, że dolna powierzchnia jest przezroczysta.
3. Pozostawić biofilmy do hodowli w inkubatorze przez noc (16 godzin bez wstrząsania, w temperaturze 37 °C). Należy pamiętać, że niektóre projektory stają się mniej niezawodne w wyższych temperaturach. W takim przypadku należy przeprowadzić hodowlę w niższych temperaturach (np. 30 °C), mając na uwadze, że może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji, w zależności od szczepu E. coli.

4. Obrazowanie wzorzystych biofilmów

1. Po nocnym wzroście próbek biofilmu należy wyjąć szalkę hodowlaną z inkubatora. Naczynie będzie miało bakterie biofilmu przyczepione do jego dolnej powierzchni, gdzie zostało oświetlone, a także bakterie planktonowe rozproszone w płynnych mediach powyżej.
2. Komórki planktonu należy wyrzucić, usuwając płynną pożywkę z naczynia hodowlanego (np. delikatnie zasysając pipetą).
3. Przepłukać próbkę 2x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w celu usunięcia pozostałych komórek planktonowych (Rysunek 3B) przez delikatne pipetowanie w PBS, a następnie aspirację.
4. Jeśli komórki są znakowane fluorescencyjnie, bezpośrednio zobrazuj próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej¹³ (np. wide-field¹³, 3-D confocal¹⁴, etc.).
   UWAGA: Biofilmy fluorescencyjne mogą być również konserwowane za pomocą samoutwardzalnego podłoża mocującego. Nałóż jedną kroplę podłoża montażowego na próbkę biofilmu, przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie uchwycić żadnych pęcherzyków pod spodem, i pozostaw do stwardnienia przez noc przed obrazowaniem.
5. Jeśli użyte komórki bakteryjne nie są znakowane fluorescencyjnie, zastosuj technikę barwienia fioletem krystalicznym¹⁵ (Rysunek 3B), aby zwiększyć kontrast biofilmu przed obrazowaniem.

5. Modyfikacje protokołu/alternatywy

1. Hoduj bakterie pDawn-Ag43 na różnych powierzchniach.
   1. Umieść próbki szkła lub poli-dimetylosiloksanu (PDMS) (np. szkiełka nakrywkowe lub cienkie paski PDMS) w płytkach studzienkowych przed dodaniem próbki/oświetlenia bakteryjnego i postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co poprzednio, aby stworzyć biofilmy pDawn-ag43 na szkle i PDMS.
2. Hoduj bakterie pDawn-Ag43 w przezroczystej, zamkniętej komorze hodowlanej.
   1. Wygeneruj formę komory hodowlanej dla PDMS.
      1. W przypadku podstawowej komory hodowlanej wygeneruj pleśń, przymocowując twardy, prostokątny pryzmat do płaskiej powierzchni (pryzmat stanie się wnęką w PDMS, która służy jako komora hodowlana po odlaniu formy). Zwróć uwagę, że bardziej skomplikowane formy do komór hodowlanych można wytwarzać za pomocą miękkiej litografii¹⁶.
   2. Odlej wnękę PDMS, wlewając PDMS do formy i pozwalając jej się utwardzić (szczegółowy protokół miękkiej litografii można znaleźć w bazie danych edukacji naukowej JoVE¹⁶).
   3. Po utwardzeniu przyciąć nadmiar PDMS, przebić kanały wlotowe/wylotowe do komory hodowlanej i przymocować wgłębienie do płaskiej powierzchni (np. szkła/polistyrenu), mocno dociskając PDMS do płaskiej powierzchni, pozostawiając wnękę między powierzchnią a sufitem PDMS jako komorę hodowli biofilmu.
      UWAGA: Można również zastosować bardziej trwałe wiązanie oparte na obróbce plazmowej¹⁶, ale chipy nie będą wtedy nadawały się do ponownego użycia.
   4. Postępuj zgodnie z protokołem hodowli, jak poprzednio, używając strzykawki z igłami (zamiast pipety), aby wprowadzić próbkę bakteryjną do komory hodowlanej/przepłukać buforem PBS (Rysunek 3C).
      1. W przypadku korzystania z tymczasowo połączonej wnęki, należy używać wyłącznie podciśnienia do wciągania cieczy do/z komory, aby zapewnić, że wnęka nie zostanie odłączona od leżącej pod spodem powierzchni szkła/polistyrenu.
3. Hoduj bakterie pDawn-Ag43 za pomocą filmowej fotomaski do oświetlenia strukturalnego.
   1. Zaprojektuj wzór biofilmu za pomocą oprogramowania CAD kompatybilnego z drukarką/drukarstwem fotomaski filmowej. Projekt filmu fotomaski powinien być wyraźny w miejscach, w których biofilm ma zostać wydrukowany, a/nieprzezroczysty w innych miejscach. Po zakończeniu wyślij plik fotomaski do drukarki/usługi drukarskiej i poczekaj na zwrot fizycznej fotomaski.
   2. Poinstruuj projektor, aby oświetlił pełne pole widzenia z maksymalnym niebieskim podświetleniem (np. RGB = [0, 0, 255]) za pomocą oprogramowania laptopa.
   3. Wytnij obszar zainteresowania z większej fotomaski filmowej i przyklej go bezpośrednio do dna naczynia do hodowli biofilmu przed wprowadzeniem próbki bakteryjnej do oświetlenia przez noc (Rysunek 3D). Hoduj biofilmy jak poprzednio i zdejmij fotomaskę po hodowli, przed obrazowaniem.

Wyniki

Jak widać w Rysunek 4A, bakterie pDawn-Ag43 zostały użyte do wytworzenia biofilmów wzorowanych na płytkach studzienki polistyrenowej z oświetleniem projektora (projektor był ustawiony tak, aby oświetlać wzór w kropki), zobrazowanych za pomocą mikroskopii jasnego pola z barwnikiem fioletu krystalicznego jako środka kontrastowego, oraz mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu bakterii eksprymujących białka czerwonej fluorescencji. Próbki biofilmu fluorescencyjnego można również obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej¹⁴ w celu uzyskania obrazów biofilmu w 3D (Rysunek 4B). W Rysunek 4C, ilustrujemy możliwe tworzenie wzorów w wysokiej rozdzielczości za pomocą filmowej fotomaski, aby zapewnić wzorzyste oświetlenie próbki biofilmu. Na koniec, w Rysunek 4D i 4E, pokazujemy przykłady wzorców na powierzchniach szklanych i PDMS, a także w zamkniętych komorach hodowlanych PDMS - ilustrują one różne typy środowisk, w których można zastosować wzorce pDawn-Ag43.

Rycina 1: Przygotowanie bakterii pDawn-Ag43 (punkt 1 protokołu). Przygotowanie bakterii pDawn-Ag43 zdolnych do tworzenia biofilmu regulowanego światłem polega na oczyszczeniu plazmidu pDawn-Ag43 ze szczepu klonującego gospodarza, przekształceniu go w interesujący szczep E. coli i stworzeniu bakteryjnego materiału zamrażalniczego do długotrwałego przechowywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie zestawu optycznego do oświetlania próbki biofilmu (sekcja 2 protokołu). Układ optyczny jest umieszczony w inkubatorze bakteryjnym i składa się z podłączonego do komputera projektora oświetlającego próbkę biofilmu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Protokół hodowli do modelowania biofilmów (sekcja 3 protokołu). (A) Przed oświetleniem bakterie pDawn-Ag43 są przygotowywane przed modelowaniem w taki sposób, aby były niezawodnie indukowane we właściwej fazie wzrostu. (B) Po całonocnym naświetlanym wzroście, na dnie szalki hodowlanej pojawi się wzorzysty biofilm wraz z komórkami planktonu w płynnym podłożu, a po dalszym przetwarzaniu biofilm jest gotowy do obrazowania. (C) Jako alternatywę dla płytek studziennych, biofilmy mogą być hodowane w zamkniętych komorach hodowlanych, takich jak formowana jama PDMS. W takim przypadku strzykawki przymocowane do igieł z końcówką mogą być używane do wprowadzania próbki i wypłukiwania płynów z komory. (D) Jako alternatywę dla wzorów oświetlenia opartych na projektorach, wzory mogą być również generowane przez przyklejanie fotomasek filmowych bezpośrednio do dna komór do hodowli biofilmu. W takim przypadku projektor powinien być ustawiony tak, aby oświetlał niebieskie światło w całym polu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Reprezentatywne wyniki biofilmów wziętych przy użyciu pDawn-Ag43. Wszystkie wyniki uzyskano przy użyciu szczepu gospodarza MG1655 E. coli. (A) Bakterie pDawn-Ag43 wykorzystano do wytworzenia biofilmów wzorowanych na płytkach studzienek polistyrenowych z oświetleniem projektora (projektor był ustawiony tak, aby oświetlać wzór w kropki), zobrazowanych za pomocą mikroskopii jasnego pola z barwieniem fioletu krystalicznego jako środka kontrastowego oraz mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu bakterii eksprymujących białka czerwonej fluorescencji. (B) Próbki biofilmu fluorescencyjnego są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów 3D biofilmu. (C) Biofilmy o wysokiej rozdzielczości mogą być wzorowane za pomocą filmowej fotomaski, aby zapewnić wzorzyste oświetlenie próbki biofilmu. (D) Biofilmy mogą być wzorowane na powierzchniach szklanych i PDMS. (E) Biofilmy mogą być wzorowane w zamkniętych komorach hodowlanych. Ten rysunek został zaadaptowany z poprzedniej pracy³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

problem	Potencjalne przyczyny/rozwiązania
Przekształcanie pDawn-Ag43 w szczep gospodarza - brak kolonii	Niskie stężenie plazmidu - sprawdź stężenie plazmidu na spektrometrze. Typowy minipreparat pDawn-Ag43 powinien dać co najmniej 100 ng/μL; Zużycie do 10-100 ng do transformacji
Sprawdź/przerób kompetentne komórki: kompetentne komórki powinny mieć wydajność transformacji co najmniej 10^6 jtk/μg zweryfikowaną przy użyciu standardowego plazmidu, takiego jak pUC19 - jeśli nie, przerób kompetentne komórki
Nieprawidłowy (poziom) antybiotyku na płytce agarowej LB - upewnij się, że używasz 50 μg/ml spektynomycyny do wyboru
Podświetlenie projektora wyłącza się / jest niespójne z dnia na dzień	Wyłącz problematyczne oprogramowanie, takie jak: automatyczna nocna aktualizacja oprogramowania/systemu operacyjnego, nocny filtr światła niebieskiego
Projektor może się przegrzewać - ustaw inkubator na niższą temperaturę, gdy projektor jest włączony (np. 30 °C zamiast 37 °C) - zwróć uwagę, że projektor jako źródło ciepła może przegrzać inkubator powyżej wartości zadanej
Usuń niepotrzebne źródła wilgoci z inkubatora, ponieważ mogą one mieć wpływ na elektronikę projektora
Brak lub niski poziom biofilmu powstał po nocnym naświetleniu, brak wzrostu komórek planktonowych (tj. płyn jest klarowny)	Niewłaściwy (poziom) antybiotyku - upewnij się, że używasz 50 μg/ml spektynomycyny
Sprawdź, czy wszystko zostało prawidłowo dodane do receptury M63
Brak/niski poziom biofilmu powstał po nocnym naświetleniu, tylko komórki planktonowe (tj. ciecz jest mętna)	Sprawdź poziom światła, projektor powinien świecić niebieskim światłem o mocy 50 μW/cm^2 przy długości fali 460 nm
Spróbuj pozwolić bakteriom rosnąć przez krótszy/dłuższy czas po etapie rozcieńczania 1:1000 LB przed dodaniem do M63
Ponownie rozprowadź bakterie na płytce LB, zacznij od świeżej kolonii, aby wytworzyć nocną hodowlę w fazie stacjonarnej
Upewnij się, że projektor działa nieprzerwanie przez noc - patrz punkt powyżej
Rozmyte wzory biofilmu, wysoki poziom szumu tła	Zmniejsz światło rozproszone z systemu oświetlenia optycznego, zakryj powierzchnie odbijające światło po wewnętrznej stronie inkubatora
Rozważ użycie oświetlenia strukturalnego opartego na fotomasce (w przeciwieństwie do projektora)
Sprawdź, czy projektor jest prawidłowo ustawiony na dolnej powierzchni komory hodowli biofilmu

Tabela 1: Typowe problemy z rozwiązywaniem problemów.

Dyskusja

W związku z zapotrzebowaniem na narzędzia badawcze pozwalające na kontrolę struktury biofilmu, przedstawiliśmy łatwy w użyciu protokół modelowania biofilmów bakteryjnych z wykorzystaniem konstruktu optogenetycznego pDawn-Ag43. Dzięki tej technice biofilmy E. coli mogą być optycznie wzorowane na różnych środowiskach powierzchniowych, w tym w zamkniętych komorach, z rozdzielczością przestrzenną poniżej 25 μm.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można podzielić na cztery główne sekcje: (1) przygotowanie bakterii pDawn-Ag43, (2) przygotowanie sprzętu do ustawiania optyki i hodowli, (3) etapy wzrostu bakterii przed oświetleniem oraz (4) płukanie i obrazowanie po oświetleniu.

Krytyczną częścią sekcji 1 jest pomyślne przekształcenie plazmidu pDawn-Ag43 w interesujący szczep E. coli . Jest to możliwe dzięki wyizolowaniu wysokiej jakości oczyszczonego plazmidu i wygenerowaniu wysokiej jakości kompetentnych komórek do transformacji (Tabela 1, rozwiązywanie problemów).

Krytyczną częścią sekcji 2 jest optymalizacja ustawień projektora tak, aby intensywność oświetlenia była dostosowana do 50 μW/^cm2 przy długości fali 460 nm, a projektor był odpowiednio ustawiony na wysokości próbki biofilmu. Należy pamiętać, że w tym protokole opisujemy konfigurację odwróconego oświetlenia, w której projektor świeci światłem od dołu, w górę w kierunku próbki biofilmu. Zaletą tej konfiguracji jest to, że światło musi tylko przejść przez dno naczynia hodowlanego, zanim dotrze do powierzchni tworzącej biofilm. Oświetlenie od góry oznacza, że światło musiałoby przejść przez ciekły ośrodek nad powierzchnią biofilmu, który w trakcie wzrostu mętnieje wraz z komórkami planktonowymi. Oprócz tych obaw ważne jest również, aby w jak największym stopniu zminimalizować światło rozproszone w układzie optycznym, na przykład poprzez zakrycie powierzchni odbijających światło we wnętrzu inkubatora - pomaga to uzyskać ostrzejsze wzory biofilmów. W związku z tym, ostrzejsze wzory biofilmu można również uzyskać, używając fotomaski do kontrolowania wzoru oświetlenia (Rysunek 3D, Rysunek 4C). Typowe problemy wymagające rozwiązania obejmują problemy z niezawodnością projektora w wyższych temperaturach (np. 37 °C), które można zminimalizować poprzez inkubację wzrostu biofilmu w niższych temperaturach (np. 30 °C), a także oprogramowanie komputerowe, które powoduje aktualizacje systemu operacyjnego lub filtrowanie światła niebieskiego podczas wzrostu w nocy (Tabela 1). Należy również zauważyć, że w zależności od zastosowanego modelu projektora i inkubatora możliwe jest również, że ciepło wytwarzane przez projektor spowoduje wyższą temperaturę wnętrza niż temperatura ustawiona w inkubatorze, co może wymagać korekty.

Krytyczną częścią sekcji 3 jest uzyskanie wiarygodnych i powtarzalnych próbek bakterii, zanim zostaną one wywołane przez oświetlenie. Z tego powodu zaleca się uzyskanie kolonii klonalnych bakterii pDawn-Ag43 poprzez rozrzucenie ich na płytce agarowej, a następnie użycie etapów hodowli płynnej, aby zapewnić, że bakterie są oświetlone/indukowane w późnej fazie wzrostu wykładniczego w powtarzalny sposób.

Wreszcie, krytyczną częścią sekcji 4 jest dokładne, ale także delikatne zmycie komórek planktonowych pozostałych po protokole modelowania biofilmu; dlatego zaleca się wykonanie wielu delikatnych etapów płukania za pomocą PBS.

W porównaniu z istniejącymi technikami modelowania komórek ^5,6, optyczne modelowanie biofilmu oparte na pDawn-Ag43 ma dość niską barierę wejścia do użycia, ponieważ nie wymaga mikrowytwarzania, pomieszczeń czystych, złożonej chemii ani wstępnej obróbki powierzchni, ale nadal jest w stanie modelować z wysoką rozdzielczością (25 μm) zwykle kojarzoną z technikami mikrowytwarzania. Metoda ta stanowi rozszerzenie wcześniejszych prac nad fotolitografią bakteryjną w celu kontrolowania ekspresji genów¹⁷. Obecnie plazmid pDawn-Ag43 jest ograniczony do E. coli, ponieważ wykorzystuje pochodzenie replikacji oparte na pUC, ale pDawn i Ag43 są kompatybilne w innych (Gram-ujemnych) gatunkach bakterii. Dostępne są techniki genetyczne umożliwiające potencjalne wprowadzenie regulowanego światłem tworzenia biofilmu do różnych gatunków bakterii i stanowią możliwy kierunek przyszłych badań. Innym potencjalnym ograniczeniem tej techniki jest to, że działa ona poprzez zwiększenie tworzenia biofilmu w szczepach o słabym natywnym tworzeniu biofilmu (np. MG1655 E. coli). Jednak szczepy z silnym tworzeniem natywnego biofilmu tworzą biofilmy niezależnie od warunków oświetlenia, co wyklucza tworzenie wzorzystego biofilmu przy użyciu pDawn-Ag43, jak opisano tutaj; Jednak techniki optogenetyczne mogą nadal okazać się przydatne w regulacji tworzenia biofilmu. Zwracamy uwagę, że w innych kontekstach mogą być dostępne alternatywne metody modelowania biofilmu, takie jak optyczna modulacja c-di-GMP¹⁸.

Ogólnie rzecz biorąc, wzorcowanie oparte na pDawn-Ag43 będzie odpowiednie do wykorzystania w aplikacjach, które badają wpływ struktury biofilmu na funkcję¹, a zatem mogą skorzystać z przestrajalnej kontroli nad wzorcami biofilmu - szczególnie istotnym przykładem do podkreślenia jest badanie ekologii mikrobiologicznej w biofilmach². Przyszłe kierunki obejmują tworzenie wzorzystych biomateriałów ^8,9 i/lub ustrukturyzowanych zbiorowisk bakteryjnych. Alternatywne zastosowania tego dostępnego protokołu obejmują również bio-sztukę¹⁹, biorąc pod uwagę wyraźny potencjał estetyczny, a także formalną i nieformalną edukację w zakresie nauk przyrodniczych 20,21,22^. Z perspektywy edukacyjnej opisany tutaj protokół łączy w sobie wiele istotnych technik (hodowla bakterii, transformacja, optyka/optogenetyka), a także można go modułowo rozszerzać (np. obejmuje mikrofluidykę).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DH5alpha/pDawn-Ag43	Addgene	107742	Szczep klonujący DH5alpha goszczący plazmid pDawn-Ag43 - plazmid musi zostać przeniesiony do szczepu E. coli przed użyciem
MG1655 E. coli	Coli Genetic Stock Center - Yale University	CGSC #6300	MG1655 został użyty jako szczep E. coli będący przedmiotem zainteresowania w reprezentatywnych wynikach tego artykułu
Ekspresja RFP plazmid	iGEM biobricks	J04450-pSB4K5bb	Istnieje wiele opcji uzyskania bakterii fluorescencyjnych - jeśli używasz plazmidu, upewnij się, że szkielet nie koliduje z colE1 ori pDawn-Ag43
Zestaw miniprep plazmidu	Qiagen	27104
LB bulion w proszku	Affymetrix	75852	Dodaj 20 g / L do wody, autoklaw, dodaj 50 μ g / ml spektynomycyny, aby uzyskać sterylny
proszek agarowy	Affymetrix	75851	Dodaj 35 g / L do wody, autoklawu, dodaj 50 μ g / ml spektynomycyny, wlej do szalek Petriego, aby uzyskać sterylne płytki LB+spec
Szalki Petriego	Fisherbrand	431760
Chlorowodorek spektynomycyny pentahydrat	abcam	ab141968	Zrób 1000x zapas 50 mg / ml w wodzie, przefiltruj, sterylizuj i rozcieńczaj w pożywce w razie potrzeby
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Wymieszaj w stosunku 1:1 z wodą, sterylizuj w autoklawie lub filtrze, aby uzyskać 50% glicerolu
Sole pożywki M63 5X roztwór	Bio-world	705729	Dodaj cas-aminokwasy, glukozę i MgSO4, doprowadź do stężenia soli 1X, dodając sterylną wodę
Aminokwasy Casamino	Amresco	J851	Zrób 20% zapasu w wodzie, przefiltruj, sterylizuj i dodaj do M63 jako suplement (końcowe stężenie 0,1%)
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	Zrobić 20% bulionu w wodzie, przefiltrować, wysterylizować i dodać do M63 jako suplementu (stężenie końcowe 0,2%)
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M7506	Zrobić 1 M bulionu w wodzie, autoklawać i dodać do M63 jako suplement (końcowe stężenie 1 mM)
Fiolet krystaliczny	Acros organics	212120250	użyciem rozcieńczyć do 0,1% w wodzie
Samoutwardzalne media montażowe (Shandon immumount)	Thermo Scientific	9990402	Służy do długotrwałego przechowywania próbek do obrazowania fluorescencyjnego
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)	Gibco	10010023	Może również używać PBS przygotowanego z proszku / tabletek
Płytka 6-dołkowa	Fisherbrand	351146	Używany jako naczynie do hodowli biofilmu w celu uzyskania reprezentatywnych wyników
Zestaw PDMS	Dow	SYLGARD 184	Może być używany do wykonywania zamkniętych jam mikrokomór za pomocą miękkiej litografii
Strzykawka 1 ml	Strzykawka BD	309659	Do stosowania przy obchodzeniu się z cieczami w zamkniętych mikrokomorach
Igła z końcówką	CML	901-23-050	Mocuje się do strzykawki 1 ml
Taśma laboratoryjna	Fisherbrand	15-901	Służy do mocowania komory hodowlanej do sufitu inkubatora
Inkubator bakteryjny	Sheldon Manufacturing	SMI6	Upewnij się, że wysokość wewnętrzna inkubatora jest wystarczająco wysoka, aby ustawić ostrość projektora na suficie
Projektor przenośny		Ivation IV-PJ-PRO-4-1	Istnieje wiele modeli projektorów przenośnych, pDawn-Ag43 został przetestowany z wieloma modelami, w tym opartymi na diodach LED / laserze, z kanałem światła niebieskiego w zakresie od 450 do 460 nm centralna długość fali
Podstawa optycznej płytki prototypowej	ThorLabs	MSB6	Podstawa do konfiguracji optycznej do trzymania projektora - możliwe jest wiele innych konfiguracji, wystarczy mocno trzymać projektor na dnie inkubatora, skierowany do góry
Słupek optyczny	ThorLabs	TR8	Potrzebne są 2 słupki - jeden do ustawienia pionowego wystającego z podstawy płytki stykowej, jeden mocowany poziomo za pomocą zacisku kątowego
słupka optycznego	ThorLabs	RA90	Łączy słupki pionowe i poziome
Podstawa montażowa	ThorLabs	BA1S	Łączy podstawę płytki stykowej optycznej i słupek pionowy
Śruba 1/4"-20	ThorLabs	SH25S050	Mocuje słupek pionowy do podstawy montażowej, podstawę montażową do podstawy płytki stykowej
śruba dociskowa 1/4"-20	ThorLabs	SS25E63D	Łączy słupek poziomy z projektorem za pomocą otworu na statywu
Miernik mocy optycznej	Newport	840	Używaj z detektorem miernika mocy do pomiaru natężenia oświetlenia projektora - istnieje wiele modeli mierników mocy, użycie takiego, który ma wysuwany detektor, ułatwi pomiar
Detektor miernika mocy optycznej	Newport	818-UV	Łączy się z miernikiem mocy (powyżej) - Detektor UV nie jest absolutnie konieczny, ponieważ niebieskie światło znajduje się w zakresie widzialnym
Regulowany filtr ND	K& F Koncepcja	SKU0689	Regulowany (poprzez obracanie) filtr o neutralnej gęstości - umieść nad otworem projektora
Oprogramowanie do prezentacji - projektora	Microsoft	Powerpoint	Wystarczy dowolne oprogramowanie umożliwiające rysowanie / prezentację
Oprogramowanie CAD	Autodesk	AutoCAD	Używany do projektowania fotomasek, wiele usług drukowania masek jest kompatybilnych z plikami AutoCAD
Filmowa maska	fotograficzna Fineline Imaging	n/a	Istnieje wiele usług drukowania fotomasek w wysokiej rozdzielczości (>30000 DPI) na kliszy