Pokazujemy metodę osadzania biofilmów bakteryjnych Escherichia coli w dowolnych wzorach przestrzennych z wysoką rozdzielczością, wykorzystując stymulację optyczną genetycznie kodowanego konstruktu adhezji powierzchniowej.
Artykuł metodologiczny
Osadzanie biofilmu we wzorze w wysokiej rozdzielczości przy użyciu pDawn-Ag43
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Struktura przestrzenna i wzór odgrywają ważną rolę w biofilmach bakteryjnych. W tym miejscu demonstrujemy przystępną metodę hodowli biofilmów E. coli w dowolne wzory przestrzenne w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Technika ta wykorzystuje genetycznie zakodowany konstrukt optogenetyczny – pDawn-Ag43 – który łączy tworzenie biofilmu u E. coli ze stymulacją optyczną za pomocą światła niebieskiego. Szczegółowo opisujemy proces transformacji E. coli z pDawn-Ag43, przygotowanie wymaganego układu optycznego oraz protokół hodowli wzorzystych biofilmów przy użyciu bakterii pDawn-Ag43. Korzystając z tego protokołu, biofilmy o rozdzielczości przestrzennej poniżej 25 μm mogą być wzorowane na różnych powierzchniach i środowiskach, w tym w zamkniętych komorach, bez konieczności mikrowytwarzania, pomieszczeń czystych lub wstępnej obróbki powierzchni. Technika ta jest wygodna i odpowiednia do stosowania w aplikacjach, które badają wpływ struktury biofilmu, zapewniając dostrajalną kontrolę nad modelowaniem biofilmu. W szerszym ujęciu ma również potencjalne zastosowania w biomateriałach, edukacji i biosztuce.
Wprowadzenie
Biofilmy są powierzchniowo przyczepionymi społecznościami mikrobów i są dobrze znane ze swojego silnego sprzężenia struktura-funkcja. Geometria przestrzenna i wzory biofilmów odgrywają ważną rolę w ogólnym funkcjonowaniu społeczności (i vice versa)1. Małe skale długości zaangażowane w strukturę biofilmu - rzędu dziesiątek mikronów2 - sprawiają, że przestrajalna i wygodna kontrola wzoru biofilmu jest trudnym problemem. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który pozwala na precyzyjne modelowanie biofilmów w dowolnych geometriach, w oparciu o oświetlenie optyczne.
Protokół prezentowany tutaj wykorzystuje pDawn-Ag433, konstrukt optogenetyczny, który łączy tworzenie biofilmu u bakterii E. coli z oświetleniem optycznym poprzez sterowanie ekspresją Ag43 (gen adhezyny odpowiedzialny za adhezynę powierzchniową i tworzenie biofilmu) pod kontrolą pDawn4 (regulator transkrypcji sterowany przez oświetlenie optyczne). Metoda jest wygodna w użyciu i umożliwia modelowanie biofilmów w różnych środowiskach powierzchniowych, w tym w zamkniętych (przezroczystych) komorach hodowlanych. W porównaniu z istniejącymi metodami osadzania komórek, takimi jak osadzanie kropelkowe5 lub wstępne modelowanie/obróbka powierzchni6, pDawn-Ag43 nie wymaga mikrofabrykacji ani pomieszczeń czystych i nie wymaga materiałów poza tymi, które są dostępne dla typowego laboratorium mikrobiologicznego. Jest w stanie tworzyć wzorce z rozdzielczością przestrzenną poniżej 25 μm, zbliżając się do wymiarów przestrzennych mikrokolonii w naturalnie istniejących biofilmach2. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta daje możliwość manipulowania strukturą biofilmu, co z kolei otwiera wiele możliwości badania mikroekologii w społecznościach bakteryjnych7. Dodatkowo, wzorzyste biofilmy mogą stanowić wygodną platformę, na której można projektować użyteczne biomateriały8,9. W tym artykule omawiamy podstawowy protokół wymagany do modelowania biofilmów przy użyciu pDawn-Ag43 oraz zajmujemy się potencjalnymi modyfikacjami i rozwiązywaniem problemów związanych z tą metodą.
Protokół
1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych pDawn-Ag43
- Przekształć pDawn-Ag43 w interesujący szczep E. coli (Rysunek 1).
- Wyhoduj szczep klonujący zawierający plazmid pDawn-Ag43 (możliwy do uzyskania z repozytorium plazmidu) poprzez zaszczepienie szczepu w bulionie LB uzupełnionym 50 μg / ml spektynomycyny (LB + spec) w probówce hodowlanej (przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem przy ~ 250 obr./min, 37 °C). Następnie użyj zestawu miniprep, aby zebrać oczyszczony plazmid pDawn-Ag43 10.
- Wybierz szczep E. coli, który Cię interesuje, aby uzyskać wzór. Do tej pory zweryfikowano, że pDawn-Ag43 działa w MG16553 i BW25113.
- Użyj ustalonego protokołu, aby wygenerować kompetentne (np. kompetentne chemicznie11 lub elektrokompetentne12) zapasy wybranego szczepu E. coli (np. MG1655).
- Przekształć plazmid pDawn-Ag43 w kompetentną bakterię11,12, a następnie 1 godzina odzyskiwania i płytka na płytkach agarowych LB+spec. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C.
- Przechowuj przekształcone szczepy pDawn-Ag43.
- Zaszczepić pojedynczą kolonię pDawn-Ag43 z płytki agarowej LB+spec do bulionu LB+spec w probówce hodowlanej i wyhodować ją w inkubatorze z wytrząsaniem (przy ~250 obr./min, 37 °C) do fazy wykładniczej (OD600 ~0,4 - 0,8).
- Przygotuj wywar do długotrwałego przechowywania przekształconego szczepu pDawn-Ag43 w temperaturze -80 °C, mieszając 1 ml kultury z 1 ml 50% sterylnego glicerolu w krioprobówce, aby uzyskać 25% bulion do zamrażania glicerolu. Przechowuj go w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
- Jeśli dodatkowe plazmidy (np. fluorescencyjne plazmidy reporterowe) muszą zostać przekształcone, utwórz kompetentne komórki11,12 z przekształconego szczepu pDawn-Ag43 i powtórz proces transformacji11,12 dla dodatkowych plazmidów w razie potrzeby.
UWAGA: W przypadku korzystania z electroporation8, możliwa jest jednoczesna kotransformacja wielu plazmidów (w tym pDawn-Ag43); jednak jednoczesna transformacja nie jest zalecana przy użyciu metod przemian chemicznych, ponieważ duży rozmiar (> 10 kB) pDawn-Ag43 oznacza, że wydajność transformacji jest zmniejszona.
2. Przygotowanie zestawu optycznego projektora do oświetlania bakterii
- Zaopatrz się w inkubator bakteryjny z nieprzezroczystymi ściankami i otworem do prowadzenia, przenośny projektor zdolny do zamontowania i funkcjonowania wewnątrz inkubatora bakteryjnego oraz laptop wyposażony w oprogramowanie do prezentacji-projekcji (patrz tabela materiałów). Wybierając projektor i inkubator, upewnij się, że minimalna odległość ustawiania ostrości projektora jest mniejsza niż wysokość wnętrza inkubatora.
- Umieść projektor wewnątrz inkubatora na dole, z otworem skierowanym bezpośrednio do góry, na suficie, gdzie przymocowana jest komora do hodowli biofilmu (Rysunek 2).
- Zamocuj projektor na miejscu, konstruując zestaw z podstawą płytki stykowej optycznej podłączoną do pionowego słupka, który z kolei jest połączony z poziomym słupkiem, który przykręca się do projektora (Rysunek 2). Należy pamiętać, że ta konfiguracja może być modyfikowana w zależności od projektora/dostępnych części. Ostatecznie kluczowym wymaganiem jest, aby projektor był solidnie zamocowany w dolnej części inkubatora, z otworem skierowanym do góry.
- Podłącz laptopa za pomocą wyświetlacza (np. HDMI) do projektora wewnątrz inkubatora.
- Jeśli powierzchnie – zwłaszcza sufit – wnętrza inkubatora odbijają światło (np. powierzchnia polerowana metalem), przykryj je ciemnymi matowymi powierzchniami, aby zminimalizować odbicia.
- Użyj taśmy, aby przymocować pustą "atrapę" naczynia hodowlanego do sufitu inkubatora. Należy pamiętać, że podobnie jak w przypadku projektora, istnieje wiele akceptowalnych sposobów dołączenia naczynia hodowlanego; Upewnij się, że przezroczysta dolna powierzchnia komory hodowlanej, na której występuje oświetlenie, nie jest zakryta.
- Wyreguluj ostrość na projektorze, obracając pokrętło ostrości tak, aby płaszczyzna ostrości pokrywała się z dolną powierzchnią naczynia do hodowli biofilmu (np. płytki studzienki) przymocowanej do sufitu inkubatora (Rysunek 2). Projektor powinien oświetlić ostry, nierozmyty obraz na dnie naczynia hodowlanego. Usuń "fikcyjną" miskę hodowlaną po zoptymalizowaniu projekcji.
- Za pomocą oprogramowania laptopa skieruj projektor tak, aby oświetlił pełne pole view z maksymalnym niebieskim podświetleniem (np. RGB = [0, 0, 255]), prezentując pełny niebieski slajd.
- Zmierz natężenie oświetlenia projektora za pomocą miernika mocy optycznej, umieszczając głowicę fotodetektora na suficie inkubatora i odczytując natężenie na odpowiednim mierniku mocy skalibrowanym do długości fali światła 460 nm. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi podłączania i kalibracji fotodetektora dla konkretnego używanego miernika mocy.
- Zmniejsz ilość światła otoczenia (np. wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu lub umieść inkubator z dala od źródeł światła) tak bardzo, jak to możliwe przed wykonaniem pomiarów natężenia oświetlenia.
- Dostosuj intensywność oświetlenia za pomocą regulowanego filtra o neutralnej gęstości umieszczonego na przysłonie projektora. Obróć filtr, aby wyregulować intensywność oświetlenia mierzoną przez miernik mocy, aż intensywność oświetlenia w środku obszaru wyświetlanego na niebiesko wskaże 50 μW/cm2.
UWAGA: Chociaż możliwe jest dostosowanie intensywności oświetlenia za pomocą niższych wartości niebieskiego RGB po stronie oprogramowania, użycie filtra przy jednoczesnej maksymalizacji wartości niebieskiego RGB ma tę zaletę, że maksymalizuje kontrast optyczny systemu między oświetlonymi i ciemnymi obszarami. - Narysuj dowolne wzory za pomocą oprogramowania do prezentacji/projektora na laptopie i wyświetl te wzory na suficie inkubatora za pomocą projektora.
UWAGA: Obszary tworzące biofilm powinny być rysowane przy maksymalnym niebieskim oświetleniu (np. RGB = [0, 0, 255]), obszary nietworzące biofilmu bez oświetlenia (np. RGB = [0, 0, 0]).
3. Hodowla wzorzystych biofilmów
- Przed oświetleniem przygotuj bakterie pDawn-Ag43, zaczynając od materiału do zamrażania glicerolu, tak aby zostały niezawodnie indukowane w późnej fazie wzrostu wykładniczego do oświetlenia (Rysunek 3A).
- Smugi szczepu pDawn-Ag43 z wywaru glicerolu na płytki agarowe LB+spec. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc (37 °C).
UWAGA: Od tego momentu aż do etapu hodowli oświetlenia upewnij się, że komórki pozostają w ciemności tak długo, jak to możliwe - dopuszczalne są krótkie okresy oświetlenia otoczenia (np. w celu rozcieńczenia). - Zaszczepić kolonię bakterii pDawn-Ag43 z płytki agarowej w bulionie LB+spec i hodować kulturę przez noc do fazy stacjonarnej (w inkubatorze z wytrząsaniem przy ~250 obr./min, 37 °C, przez ~16 godzin).
- Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:1,000 bulionem LB+spec (np. dodać 1 μl kultury na noc do 1 ml świeżej LB+spec).
- Pozostawić rozcieńczoną kulturę do wzrostu do późnej fazy wykładniczej/wczesnej stacjonarnej (OD ~1,0, ~6 h w inkubatorze z wytrząsaniem przy ~250 obr./min, 37 °C).
- Czekając, aż kultura wyrośnie, przygotuj pożywkę M63 z 1x solami M63, 1 mM MgSO4, 0,2% glukozy, 0,1% casaminokwasów i 50 μg/ml spektynomycyny w wodzie (upewnij się, że części składowe są sterylne).
- Rozcieńczyć kulturę późnej fazy wykładniczej w stosunku 1:100 pożywką M63 uzupełnioną 50 μg/ml spektynomycyny. Następnie wprowadzić rozcieńczenie do naczynia do hodowli biofilmu (np. odpipetować rozcieńczoną próbkę do płytki dołka).
UWAGA: Objętości wymagane do tego rozcieńczenia w stosunku 1:100 zależą od używanej płytki hodowlanej (np. w przypadku użycia 6-dołkowej płytki z polistyrenu [niepoddanej działaniu kultur tkankowych], pojedyncza próbka wymagałaby dodania 20 μl kultury do 2 ml M63+spec, ponieważ standardowa objętość dołka płytki 6-dołkowej wynosi ~2 ml).
- Smugi szczepu pDawn-Ag43 z wywaru glicerolu na płytki agarowe LB+spec. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc (37 °C).
- Gdy próbki są już gotowe do oświetlenia, przyklej naczynie hodowlane do sufitu inkubatora, upewniając się, że powierzchnia na dnie naczynia jest przezroczysta, aby projektor oświetlił ją od dołu.
UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że sufit inkubatora nie odbija światła, aby zminimalizować rozproszone oświetlenie. Rozproszone oświetlenie można również zmniejszyć, używając płyt o czarnych ściankach jako naczyń hodowlanych, chociaż nie jest to absolutnie konieczne - jeśli używasz takich płyt, upewnij się, że dolna powierzchnia jest przezroczysta. - Pozostawić biofilmy do hodowli w inkubatorze przez noc (16 godzin bez wstrząsania, w temperaturze 37 °C). Należy pamiętać, że niektóre projektory stają się mniej niezawodne w wyższych temperaturach. W takim przypadku należy przeprowadzić hodowlę w niższych temperaturach (np. 30 °C), mając na uwadze, że może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji, w zależności od szczepu E. coli.
4. Obrazowanie wzorzystych biofilmów
- Po nocnym wzroście próbek biofilmu należy wyjąć szalkę hodowlaną z inkubatora. Naczynie będzie miało bakterie biofilmu przyczepione do jego dolnej powierzchni, gdzie zostało oświetlone, a także bakterie planktonowe rozproszone w płynnych mediach powyżej.
- Komórki planktonu należy wyrzucić, usuwając płynną pożywkę z naczynia hodowlanego (np. delikatnie zasysając pipetą).
- Przepłukać próbkę 2x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w celu usunięcia pozostałych komórek planktonowych (Rysunek 3B) przez delikatne pipetowanie w PBS, a następnie aspirację.
- Jeśli komórki są znakowane fluorescencyjnie, bezpośrednio zobrazuj próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej13 (np. wide-field13, 3-D confocal14, etc.).
UWAGA: Biofilmy fluorescencyjne mogą być również konserwowane za pomocą samoutwardzalnego podłoża mocującego. Nałóż jedną kroplę podłoża montażowego na próbkę biofilmu, przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie uchwycić żadnych pęcherzyków pod spodem, i pozostaw do stwardnienia przez noc przed obrazowaniem. - Jeśli użyte komórki bakteryjne nie są znakowane fluorescencyjnie, zastosuj technikę barwienia fioletem krystalicznym15 (Rysunek 3B), aby zwiększyć kontrast biofilmu przed obrazowaniem.
5. Modyfikacje protokołu/alternatywy
- Hoduj bakterie pDawn-Ag43 na różnych powierzchniach.
- Umieść próbki szkła lub poli-dimetylosiloksanu (PDMS) (np. szkiełka nakrywkowe lub cienkie paski PDMS) w płytkach studzienkowych przed dodaniem próbki/oświetlenia bakteryjnego i postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co poprzednio, aby stworzyć biofilmy pDawn-ag43 na szkle i PDMS.
- Hoduj bakterie pDawn-Ag43 w przezroczystej, zamkniętej komorze hodowlanej.
- Wygeneruj formę komory hodowlanej dla PDMS.
- W przypadku podstawowej komory hodowlanej wygeneruj pleśń, przymocowując twardy, prostokątny pryzmat do płaskiej powierzchni (pryzmat stanie się wnęką w PDMS, która służy jako komora hodowlana po odlaniu formy). Zwróć uwagę, że bardziej skomplikowane formy do komór hodowlanych można wytwarzać za pomocą miękkiej litografii16.
- Odlej wnękę PDMS, wlewając PDMS do formy i pozwalając jej się utwardzić (szczegółowy protokół miękkiej litografii można znaleźć w bazie danych edukacji naukowej JoVE16).
- Po utwardzeniu przyciąć nadmiar PDMS, przebić kanały wlotowe/wylotowe do komory hodowlanej i przymocować wgłębienie do płaskiej powierzchni (np. szkła/polistyrenu), mocno dociskając PDMS do płaskiej powierzchni, pozostawiając wnękę między powierzchnią a sufitem PDMS jako komorę hodowli biofilmu.
UWAGA: Można również zastosować bardziej trwałe wiązanie oparte na obróbce plazmowej16, ale chipy nie będą wtedy nadawały się do ponownego użycia. - Postępuj zgodnie z protokołem hodowli, jak poprzednio, używając strzykawki z igłami (zamiast pipety), aby wprowadzić próbkę bakteryjną do komory hodowlanej/przepłukać buforem PBS (Rysunek 3C).
- W przypadku korzystania z tymczasowo połączonej wnęki, należy używać wyłącznie podciśnienia do wciągania cieczy do/z komory, aby zapewnić, że wnęka nie zostanie odłączona od leżącej pod spodem powierzchni szkła/polistyrenu.
- Wygeneruj formę komory hodowlanej dla PDMS.
- Hoduj bakterie pDawn-Ag43 za pomocą filmowej fotomaski do oświetlenia strukturalnego.
- Zaprojektuj wzór biofilmu za pomocą oprogramowania CAD kompatybilnego z drukarką/drukarstwem fotomaski filmowej. Projekt filmu fotomaski powinien być wyraźny w miejscach, w których biofilm ma zostać wydrukowany, a/nieprzezroczysty w innych miejscach. Po zakończeniu wyślij plik fotomaski do drukarki/usługi drukarskiej i poczekaj na zwrot fizycznej fotomaski.
- Poinstruuj projektor, aby oświetlił pełne pole widzenia z maksymalnym niebieskim podświetleniem (np. RGB = [0, 0, 255]) za pomocą oprogramowania laptopa.
- Wytnij obszar zainteresowania z większej fotomaski filmowej i przyklej go bezpośrednio do dna naczynia do hodowli biofilmu przed wprowadzeniem próbki bakteryjnej do oświetlenia przez noc (Rysunek 3D). Hoduj biofilmy jak poprzednio i zdejmij fotomaskę po hodowli, przed obrazowaniem.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 4A, bakterie pDawn-Ag43 zostały wykorzystane do wytworzenia biofilmów uformowanych w płytkach polistyrenowych za pomocą naświetlania projektorem (projektor został ustawiony tak, aby wyświetlać wzór w kropki), obrazowano je za pomocą mikroskopii w polu jasnym z użyciem barwnika fioletem krystalicznym jako środka kontrastowego oraz mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem bakterii wykazujących ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego. Próbki fluorescencyjnych biofilmów można również obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej14, aby uzyskać obrazy biofilmów w 3D (Rysunek 4B). Na Rysunku 4C przedstawiamy wysokorozdzielcze formowanie możliwe dzięki zastosowaniu fotomaski foliowej w celu zapewnienia wzorcowanego naświetlania próbki biofilmu. Na koniec, na Rysunku 4D i 4E prezentujemy przykłady formowania wzorów na powierzchniach szklanych i PDMS, a także w zamkniętych komorach hodowlanych z PDMS — obrazują one różne rodzaje środowisk, w których można zastosować formowanie z użyciem pDawn-Ag43.
Rycina 1: Przygotowanie bakterii pDawn-Ag43 (sekcja protokołu 1). Przygotowanie bakterii pDawn-Ag43 zdolnych do tworzenia biofilmu regulowanego światłem obejmuje oczyszczanie plazmidu pDawn-Ag43 ze szczepu klonującego gospodarza, jego transformację do interesującego szczepu E. coli oraz stworzenie mrożonych zapasów bakterii do długoterminowego przechowywania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Przygotowanie układu optycznego do oświetlania próbki biofilmu (sekcja 2 protokołu). Układ optyczny znajduje się wewnątrz inkubatora bakteriologicznego i składa się z podłączonego do komputera projektora oświetlającego próbkę biofilmu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Protokół hodowli w celu tworzenia wzorów biofilmów (sekcja protokołu 3). (A) Przed naświetlaniem bakterie pDawn-Ag43 są przygotowywane do tworzenia wzorów w taki sposób, aby zostały niezawodnie indukowane we właściwej fazie wzrostu. (B) Po całonocnym wzroście z naświetlaniem na dnie naczynia hodowlanego powstanie ustrukturyzowany biofilm, a w płynnym medium znajdą się komórki planktoniczne; po przeprowadzeniu dalszej obróbki biofilm jest gotowy do obrazowania. (C) Jako alternatywę dla płytek wielodołkowych, biofilmy można hodować w zamkniętych komorach hodowlanych, takich jak odlewana wnęka z PDMS. W tym przypadku do wprowadzania próbki i wypłukiwania cieczy z komory można użyć strzykawek z igłami o tępym ostrzu. (D) Jako alternatywę dla wzorów naświetlania generowanych przez projektor, wzory można tworzyć poprzez przyklejanie foliowych masek fotolitograficznych bezpośrednio do dna komór hodowli biofilmów. W takim przypadku projektor powinien być ustawiony tak, aby naświetlać całe pole światłem niebieskim. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki biofilmów ukształtowanych za pomocą pDawn-Ag43. Wszystkie wyniki uzyskano przy użyciu szczepu gospodarza E. coli MG1655. (A) Bakterie pDawn-Ag43 wykorzystano do wytworzenia biofilmów ukształtowanych w polistyrenowych płytkach wielodołkowych przy użyciu naświetlania projektorem (projektor ustawiono tak, aby wyświetlał wzór w kropki); obrazy wykonano za pomocą mikroskopii w polu jasnym z zastosowaniem fioletu krystalicznego jako środka kontrastującego oraz mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem bakterii ekspresyjnych dla czerwonego białka fluorescencyjnego. (B) Próbki fluorescencyjne biofilmu obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów 3D biofilmu. (C) Biofilmy o wysokiej rozdzielczości można kształtować za pomocą fotomaski filmowej, aby zapewnić ukształtowane naświetlanie próbki biofilmu. (D) Biofilmy można kształtować na powierzchniach szklanych i PDMS. (E) Biofilmy można kształtować w zamkniętych komorach hodowlanych. Rycina została zaadaptowana z wcześniejszych prac3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Problem | Potencjalne przyczyny/rozwiązania |
| Transformacja pDawn-Ag43 do szczepu gospodarza – brak kolonii | Niskie stężenie plazmidu – należy sprawdzić stężenie plazmidu za pomocą spektrometru. Typowa minipreparatyka pDawn-Ag43 powinna dać wydajność co najmniej 100 ng/μL; do transformacji należy użyć od 10 do 100 ng |
| Kontrola/przygotowanie komórek kompetentnych: komórki kompetentne powinny wykazywać wydajność transformacji na poziomie co najmniej 10^6 cfu/µg zweryfikowano przy użyciu standardowego plazmidu, takiego jak pUC19 – w przeciwnym razie należy ponownie przygotować komórki kompetentne | |
| Błędny (poziom) antybiotyku na płytce z agarem LB – należy upewnić się, aby użyć 50 μg/mL spektynomycyna do selekcji | |
| Oświetlenie projektora wyłącza się / działa niestabilnie w nocy | Wyłącz problematyczne oprogramowanie, takie jak: automatyczne nocne aktualizacje oprogramowania/systemu operacyjnego, nocny filtr światła niebieskiego |
| Projektor może się przegrzewać – podczas gdy projektor jest włączony, należy ustawić inkubator na niższą temperaturę (np. 30 °C zamiast 37 °C) – należy pamiętać, że projektor jako źródło ciepła może spowodować przegrzanie inkubatora powyżej ustalonej wartości zadanej | |
| Należy usunąć zbędne źródła wilgoci z inkubatora, ponieważ mogą one wpłynąć na elektronikę projektora | |
| Brak lub niski poziom utworzonego biofilmu po całonocnym naświetlaniu, brak również wzrostu komórek planktonicznych (tj. ciecz jest klarowna) | Niewłaściwy (poziom) antybiotyku – należy upewnić się co do zastosowania 50 μg/mL spektynomycyna |
| Należy sprawdzić, czy wszystkie składniki zostały prawidłowo dodane do receptury M63. | |
| Brak lub niski poziom utworzonego biofilmu po całonocnym naświetlaniu, obecne jedynie komórki planktoniczne (tj. ciecz jest mętna) | Sprawdź poziom natężenia światła; projektor powinien emitować światło niebieskie o 50 μW/cm^2 przy długości fali 460 nm |
| Należy sprawdzić wpływ skrócenia lub wydłużenia czasu inkubacji bakterii po etapie rozcieńczenia w bulionie LB w stosunku 1:1000 przed dodaniem do medium M63. | |
| Przesiew bakterii na płytkę LB, zaczynając od świeżej kolonii, w celu otrzymania nocnej hodowli w fazie stacjonarnej | |
| Należy upewnić się, że projektor pracuje stabilnie przez całą noc – patrz punkt powyżej | |
| Rozmyte wzory biofilmu, wysoki poziom szumu tła | Ograniczenie światła rozproszonego z optycznego systemu oświetlenia, pokrycie powierzchni odbijających we wnętrzu inkubatora |
| Należy rozważyć zastosowanie strukturalnego oświetlenia opartego na maskach fotolitograficznych (w przeciwieństwie do oświetlenia opartego na projektorze) | |
| Należy sprawdzić, czy projektor jest prawidłowo ustawiony w ognisku na dolnej powierzchni komory do hodowli biofilmu |
Tabela 1: Typowe problemy i sposoby ich rozwiązywania.
Dyskusja
W związku z zapotrzebowaniem na narzędzia badawcze pozwalające na kontrolę struktury biofilmu, przedstawiliśmy łatwy w użyciu protokół modelowania biofilmów bakteryjnych z wykorzystaniem konstruktu optogenetycznego pDawn-Ag43. Dzięki tej technice biofilmy E. coli mogą być optycznie wzorowane na różnych środowiskach powierzchniowych, w tym w zamkniętych komorach, z rozdzielczością przestrzenną poniżej 25 μm.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można podzielić na cztery główne sekcje: (1) przygotowanie bakterii pDawn-Ag43, (2) przygotowanie sprzętu do ustawiania optyki i hodowli, (3) etapy wzrostu bakterii przed oświetleniem oraz (4) płukanie i obrazowanie po oświetleniu.
Krytyczną częścią sekcji 1 jest pomyślne przekształcenie plazmidu pDawn-Ag43 w interesujący szczep E. coli . Jest to możliwe dzięki wyizolowaniu wysokiej jakości oczyszczonego plazmidu i wygenerowaniu wysokiej jakości kompetentnych komórek do transformacji (Tabela 1, rozwiązywanie problemów).
Krytyczną częścią sekcji 2 jest optymalizacja ustawień projektora tak, aby intensywność oświetlenia była dostosowana do 50 μW/cm2 przy długości fali 460 nm, a projektor był odpowiednio ustawiony na wysokości próbki biofilmu. Należy pamiętać, że w tym protokole opisujemy konfigurację odwróconego oświetlenia, w której projektor świeci światłem od dołu, w górę w kierunku próbki biofilmu. Zaletą tej konfiguracji jest to, że światło musi tylko przejść przez dno naczynia hodowlanego, zanim dotrze do powierzchni tworzącej biofilm. Oświetlenie od góry oznacza, że światło musiałoby przejść przez ciekły ośrodek nad powierzchnią biofilmu, który w trakcie wzrostu mętnieje wraz z komórkami planktonowymi. Oprócz tych obaw ważne jest również, aby w jak największym stopniu zminimalizować światło rozproszone w układzie optycznym, na przykład poprzez zakrycie powierzchni odbijających światło we wnętrzu inkubatora - pomaga to uzyskać ostrzejsze wzory biofilmów. W związku z tym, ostrzejsze wzory biofilmu można również uzyskać, używając fotomaski do kontrolowania wzoru oświetlenia (Rysunek 3D, Rysunek 4C). Typowe problemy wymagające rozwiązania obejmują problemy z niezawodnością projektora w wyższych temperaturach (np. 37 °C), które można zminimalizować poprzez inkubację wzrostu biofilmu w niższych temperaturach (np. 30 °C), a także oprogramowanie komputerowe, które powoduje aktualizacje systemu operacyjnego lub filtrowanie światła niebieskiego podczas wzrostu w nocy (Tabela 1). Należy również zauważyć, że w zależności od zastosowanego modelu projektora i inkubatora możliwe jest również, że ciepło wytwarzane przez projektor spowoduje wyższą temperaturę wnętrza niż temperatura ustawiona w inkubatorze, co może wymagać korekty.
Krytyczną częścią sekcji 3 jest uzyskanie wiarygodnych i powtarzalnych próbek bakterii, zanim zostaną one wywołane przez oświetlenie. Z tego powodu zaleca się uzyskanie kolonii klonalnych bakterii pDawn-Ag43 poprzez rozrzucenie ich na płytce agarowej, a następnie użycie etapów hodowli płynnej, aby zapewnić, że bakterie są oświetlone/indukowane w późnej fazie wzrostu wykładniczego w powtarzalny sposób.
Wreszcie, krytyczną częścią sekcji 4 jest dokładne, ale także delikatne zmycie komórek planktonowych pozostałych po protokole modelowania biofilmu; dlatego zaleca się wykonanie wielu delikatnych etapów płukania za pomocą PBS.
W porównaniu z istniejącymi technikami modelowania komórek 5,6, optyczne modelowanie biofilmu oparte na pDawn-Ag43 ma dość niską barierę wejścia do użycia, ponieważ nie wymaga mikrowytwarzania, pomieszczeń czystych, złożonej chemii ani wstępnej obróbki powierzchni, ale nadal jest w stanie modelować z wysoką rozdzielczością (25 μm) zwykle kojarzoną z technikami mikrowytwarzania. Metoda ta stanowi rozszerzenie wcześniejszych prac nad fotolitografią bakteryjną w celu kontrolowania ekspresji genów17. Obecnie plazmid pDawn-Ag43 jest ograniczony do E. coli, ponieważ wykorzystuje pochodzenie replikacji oparte na pUC, ale pDawn i Ag43 są kompatybilne w innych (Gram-ujemnych) gatunkach bakterii. Dostępne są techniki genetyczne umożliwiające potencjalne wprowadzenie regulowanego światłem tworzenia biofilmu do różnych gatunków bakterii i stanowią możliwy kierunek przyszłych badań. Innym potencjalnym ograniczeniem tej techniki jest to, że działa ona poprzez zwiększenie tworzenia biofilmu w szczepach o słabym natywnym tworzeniu biofilmu (np. MG1655 E. coli). Jednak szczepy z silnym tworzeniem natywnego biofilmu tworzą biofilmy niezależnie od warunków oświetlenia, co wyklucza tworzenie wzorzystego biofilmu przy użyciu pDawn-Ag43, jak opisano tutaj; Jednak techniki optogenetyczne mogą nadal okazać się przydatne w regulacji tworzenia biofilmu. Zwracamy uwagę, że w innych kontekstach mogą być dostępne alternatywne metody modelowania biofilmu, takie jak optyczna modulacja c-di-GMP18.
Ogólnie rzecz biorąc, wzorcowanie oparte na pDawn-Ag43 będzie odpowiednie do wykorzystania w aplikacjach, które badają wpływ struktury biofilmu na funkcję1, a zatem mogą skorzystać z przestrajalnej kontroli nad wzorcami biofilmu - szczególnie istotnym przykładem do podkreślenia jest badanie ekologii mikrobiologicznej w biofilmach2. Przyszłe kierunki obejmują tworzenie wzorzystych biomateriałów 8,9 i/lub ustrukturyzowanych zbiorowisk bakteryjnych. Alternatywne zastosowania tego dostępnego protokołu obejmują również bio-sztukę19, biorąc pod uwagę wyraźny potencjał estetyczny, a także formalną i nieformalną edukację w zakresie nauk przyrodniczych 20,21,22. Z perspektywy edukacyjnej opisany tutaj protokół łączy w sobie wiele istotnych technik (hodowla bakterii, transformacja, optyka/optogenetyka), a także można go modułowo rozszerzać (np. obejmuje mikrofluidykę).
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują D. Glassowi, H. Kimowi, N. Cirze, A. Choksi, S. Rajanowi i B. Keysowi za pomocne sugestie, a laboratorium Spormann za dostęp do ich mikroskopu konfokalnego. Ponadto autorzy doceniają wsparcie ze strony stypendiów Stanford Bio-X Bowes i NSERC PGS, Narodowego Instytutu Zdrowia (R21-AI-139941) oraz Amerykańskiego Towarzystwa Onkologicznego (RSG-14-177-01).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | Szczep klonujący DH5alpha goszczący plazmid pDawn-Ag43 - plazmid musi zostać przeniesiony do szczepu E. coli przed użyciem |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 został użyty jako szczep E. coli będący przedmiotem zainteresowania w reprezentatywnych wynikach tego artykułu |
| Ekspresja RFP plazmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Istnieje wiele opcji uzyskania bakterii fluorescencyjnych - jeśli używasz plazmidu, upewnij się, że szkielet nie koliduje z colE1 ori pDawn-Ag43 |
| Zestaw miniprep plazmidu | Qiagen | 27104 | |
| LB bulion w proszku | Affymetrix | 75852 | Dodaj 20 g / L do wody, autoklaw, dodaj 50 μ g / ml spektynomycyny, aby uzyskać sterylny |
| proszek agarowy | Affymetrix | 75851 | Dodaj 35 g / L do wody, autoklawu, dodaj 50 μ g / ml spektynomycyny, wlej do szalek Petriego, aby uzyskać sterylne płytki LB+spec |
| Szalki Petriego | Fisherbrand | 431760 | |
| Chlorowodorek spektynomycyny pentahydrat | abcam | ab141968 | Zrób 1000x zapas 50 mg / ml w wodzie, przefiltruj, sterylizuj i rozcieńczaj w pożywce w razie potrzeby |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Wymieszaj w stosunku 1:1 z wodą, sterylizuj w autoklawie lub filtrze, aby uzyskać 50% glicerolu |
| Sole pożywki M63 5X roztwór | Bio-world | 705729 | Dodaj cas-aminokwasy, glukozę i MgSO4, doprowadź do stężenia soli 1X, dodając sterylną wodę |
| Aminokwasy Casamino | Amresco | J851 | Zrób 20% zapasu w wodzie, przefiltruj, sterylizuj i dodaj do M63 jako suplement (końcowe stężenie 0,1%) |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G8270 | Zrobić 20% bulionu w wodzie, przefiltrować, wysterylizować i dodać do M63 jako suplementu (stężenie końcowe 0,2%) |
| Siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M7506 | Zrobić 1 M bulionu w wodzie, autoklawać i dodać do M63 jako suplement (końcowe stężenie 1 mM) |
| Fiolet krystaliczny | Acros organics | 212120250 | użyciem rozcieńczyć do 0,1% w wodzie |
| Samoutwardzalne media montażowe (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Służy do długotrwałego przechowywania próbek do obrazowania fluorescencyjnego |
| Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) | Gibco | 10010023 | Może również używać PBS przygotowanego z proszku / tabletek |
| Płytka 6-dołkowa | Fisherbrand | 351146 | Używany jako naczynie do hodowli biofilmu w celu uzyskania reprezentatywnych wyników |
| Zestaw PDMS | Dow | SYLGARD 184 | Może być używany do wykonywania zamkniętych jam mikrokomór za pomocą miękkiej litografii |
| Strzykawka 1 ml | Strzykawka BD | 309659 | Do stosowania przy obchodzeniu się z cieczami w zamkniętych mikrokomorach |
| Igła z końcówką | CML | 901-23-050 | Mocuje się do strzykawki 1 ml |
| Taśma laboratoryjna | Fisherbrand | 15-901 | Służy do mocowania komory hodowlanej do sufitu inkubatora |
| Inkubator bakteryjny | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Upewnij się, że wysokość wewnętrzna inkubatora jest wystarczająco wysoka, aby ustawić ostrość projektora na suficie |
| Projektor przenośny | Ivation IV-PJ-PRO-4-1 | Istnieje wiele modeli projektorów przenośnych, pDawn-Ag43 został przetestowany z wieloma modelami, w tym opartymi na diodach LED / laserze, z kanałem światła niebieskiego w zakresie od 450 do 460 nm centralna długość fali | |
| Podstawa optycznej płytki prototypowej | ThorLabs | MSB6 | Podstawa do konfiguracji optycznej do trzymania projektora - możliwe jest wiele innych konfiguracji, wystarczy mocno trzymać projektor na dnie inkubatora, skierowany do góry |
| Słupek optyczny | ThorLabs | TR8 | Potrzebne są 2 słupki - jeden do ustawienia pionowego wystającego z podstawy płytki stykowej, jeden mocowany poziomo za pomocą zacisku kątowego |
| słupka optycznego | ThorLabs | RA90 | Łączy słupki pionowe i poziome |
| Podstawa montażowa | ThorLabs | BA1S | Łączy podstawę płytki stykowej optycznej i słupek pionowy |
| Śruba 1/4"-20 | ThorLabs | SH25S050 | Mocuje słupek pionowy do podstawy montażowej, podstawę montażową do podstawy płytki stykowej |
| śruba dociskowa 1/4"-20 | ThorLabs | SS25E63D | Łączy słupek poziomy z projektorem za pomocą otworu na statywu |
| Miernik mocy optycznej | Newport | 840 | Używaj z detektorem miernika mocy do pomiaru natężenia oświetlenia projektora - istnieje wiele modeli mierników mocy, użycie takiego, który ma wysuwany detektor, ułatwi pomiar |
| Detektor miernika mocy optycznej | Newport | 818-UV | Łączy się z miernikiem mocy (powyżej) - Detektor UV nie jest absolutnie konieczny, ponieważ niebieskie światło znajduje się w zakresie widzialnym |
| Regulowany filtr ND | K& F Koncepcja | SKU0689 | Regulowany (poprzez obracanie) filtr o neutralnej gęstości - umieść nad otworem projektora |
| Oprogramowanie do prezentacji - projektora | Microsoft | Powerpoint | Wystarczy dowolne oprogramowanie umożliwiające rysowanie / prezentację |
| Oprogramowanie CAD | Autodesk | AutoCAD | Używany do projektowania fotomasek, wiele usług drukowania masek jest kompatybilnych z plikami AutoCAD |
| Filmowa maska | fotograficzna Fineline Imaging | n/a | Istnieje wiele usług drukowania fotomasek w wysokiej rozdzielczości (>30000 DPI) na kliszy |
Bibliografia
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial Biofilms. Annual Review of Microbiology. 49 (1), 711-745 (1995).
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945(2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437(2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110(2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7(2013).
Przedruki i uprawnienia
