Artykuł metodologiczny

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

DOI:

10.3791/58627

⸱

1 lutego 2019

 ,  , 
1Laboratory for Transcriptome Technology, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, 2TransSINE Technologies Co. Ltd.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SINEUPs to syntetyczne, antysensowne, niekodujące RNA, które zawierają domenę wiążącą (BD) i domenę efektorową (ED) oraz regulują w górę translację docelowego mRNA. W tym miejscu opisujemy metody wykrywania SINEUP w hodowanych liniach komórkowych, analizę ich aktywności promującej translację za pomocą Western-blot oraz półautomatyczny system obrazowania o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulepszenie białka docelowego ma znaczenie nie tylko dla badania procesów biologicznych, ale także dla zastosowań terapeutycznych i biotechnologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę selektywnej regulacji ekspresji białek pożądanych genów w hodowanych komórkach za pomocą syntetycznych antysensownych niekodujących RNA znanych jako SINEUPs. Ta pozytywna kontrola ekspresji genów odbywa się na poziomie potranskrypcyjnym i jest wywierana przez odwrócone powtórzenie krótkiego przeplatanego elementu jądrowego (SINE) na końcu 3ʹ SINEUPs, który obejmuje jego domenę efektorową (ED). SINEUP mogą specyficznie wiązać się z dowolnym mRNA kodującym białko poprzez jego domenę wiążącą (BD), region zaprojektowany w celu uzupełnienia sekwencji w regionie 5ʹ nieulegającym translacji (5ʹ UTR) i wokół kodonu start mRNA. Zaprojektowane w ten sposób SINEUPy specyficzne dla celu są transfekowane do hodowanych komórek, a białka i RNA są ekstrahowane do dalszych analiz, zwykle 24-48 godzin po transfekcji. Indukowana przez SINEUP regulacja białka w górę jest wykrywana za pomocą analizy Western-blot, a ekspresja RNA jest mierzona za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Zaobserwowaliśmy, że konstrukcja BD ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnej aktywności SINEUP i że zaleca się testowanie różnych rozmiarów i pozycji BD w odniesieniu do kodonu start docelowego mRNA. Dlatego opisujemy tutaj półautomatyczną, wysokoprzepustową metodę obrazowania opartą na detekcji fluorescencji, którą można zaimplementować do celowania w mRNA połączone z białkiem zielonej fluorescencji (GFP). SINEUP specyficznie wzmacniają translację w normalnym fizjologicznym zakresie komórki, bez zmiany docelowego poziomu transkryptu. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana przeciwko wielu endogennym i egzogennym celom, w szerokiej gamie linii komórkowych ludzi, myszy i owadów wraz z systemami in vivo. Co więcej, donoszono, że SINEUP zwiększają produkcję przeciwciał i działają jako terapia RNA przeciwko genom haploniedostatecznym. Wszechstronny i modułowy charakter SINEUPS sprawia, że są one odpowiednim narzędziem do kontroli translacyjnej specyficznej dla genów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W erze postgenomicznej, dzięki rozwojowi technologii sekwencjonowania nowej generacji, uzyskano wiele wglądów w regulacyjną rolę genów niekodujących transkryptów antysensownych1,2,3 i narzędzia do edycji genów. Ta kategoria transkryptów, która wcześniej była uważana za "śmieci transkrypcyjne", jest obecnie uznawana za kluczowego gracza regulacji genetycznej. Doniesiono, że transkrypty antysensowne modulują chromatynę oraz kontrolują stabilność i ekspresję ich pokrewnego mRNA4,5. W większości przypadków ten sposób regulacji jest negatywny, a transkrypty antysensowne wyciszają swoje odpowiedniki zmysłowe poprzez interakcje RNA-RNA6,7. Ta cecha naturalnych transkryptów antysensownych została wykorzystana do obniżenia pożądanych genów w postaci syntetycznego małego interferującego RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) i oligonukleotydów antysensownych (ASO)8,9,10,11, pozostawiając pustkę technologiczną dla ukierunkowanej regulacji genów w górę.

Jedno intrygujące badanie zmieniło perspektywę antysensownego pola RNA, wykazując, że antysensowne długie niekodujące RNA (AS lncRNAs) genów Uchl1 (ubikwityna C-końcowa hydrolaza L1) i Uxt (wszechobecnie wyrażony transkrypt) pozytywnie regulują translację ich pokrewnego mRNA na poziomie posttranskrypcyjnym u myszy12. Koniec 5ʹ tych lncRNA AS nakłada się na kilka zasad w regionie 5ʹ nieulegającym translacji (5ʹ UTR) odpowiadających im transkryptów zmysłowych, a nienakładający się koniec 3ʹ zawiera odwrócone powtórzenie retrotranspozonu należącego do rodziny krótkich przeplatanych elementów jądrowych (SINE). Co ciekawe, odkryliśmy, że główną siłą napędową tej translacyjnej regulacji w górę jest wbudowana liczba powtórzeń SINE i nie ogranicza się ona tylko do mysich powtórzeń SINE. Ludzkie lncRNA AS zawierające powtórzenia Alu również usprawniły translację mRNA o docelowym wyczuciu, wzmacniając ideę nowej klasy regulatorowych antysensownych niekodujących RNA sterowanych SINE, odpowiednio nazwanych SINEUPs13. Ostatnie badania wykazały, że potencjał naturalnych SINEUPs jest zachowany w syntetycznych SINEUPs zaprojektowanych specjalnie do celowania w różne endogenne i egzogenne geny14,15. SINEUP mają dwie ważne cechy: po pierwsze "domenę wiążącą" (BD), która jest na ogół regionem końcowym 5ʹ komplementarnym do sekwencji obejmującej główny kodon start mRNA kodującego białko, a po drugie "domenę efektorową" (ED), ponieważ zawiera odwrócone powtórzenie SINE, co jest warunkiem wstępnym dla funkcji SINEUP14 (Rysunek 1). SINEUPy można dostosować do potrzeb klienta w celu zaprojektowania BD ukierunkowanego na wybrany gen. Można to następnie wykorzystać do analizy funkcji konkretnego genu zaangażowanego w szlak biologiczny, jako lepszą alternatywę dla konwencjonalnej strategii nadekspresji mRNA. Ponadto to wszechstronne narzędzie może być stosowane w celu zwiększenia produkcji przeciwciał oraz jako lek do leczenia chorób haploniewystarczających spowodowanych niewystarczającymi dawkami funkcjonalnych białek16,17,18,19,20,21.

Zalety technologii SINEUP są wielorakie. Nie zmienia ekspresji celu na poziomie transkrypcji. Dłuższe BD zapewniają większą specyficzność SINEUPs, jednocześnie nie wywołując zależnej od dsRNA odpowiedzi na stres15. Indukcja białka jest utrzymywana w normalnym zakresie fizjologicznym komórki, zapobiegając wszelkim szkodliwym skutkom spowodowanym nieprawidłową lub nadmierną ekspresją białka. SINEUPy są kompatybilne z szeroką gamą linii komórkowych hodowanych u myszy, ludzi i chomików, na przykład HEK293T/17, HepG2, HeLa, CHO, MN9D i wielu innych12,13,14,15,18,19. SINEUP mogą skutecznie celować w geny endogenne, geny przejściowo nadmiernie eksprymowane oraz geny znakowane FLAG lub geny fuzyjne lucyferazy, eliminując potrzebę stosowania przeciwciał specyficznych dla genu14,18. Podstawowa analiza SINEUP wymaga rutynowej hodowli komórkowej, transfekcji, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), ilościowych instrumentów i ustawień reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) w czasie rzeczywistym, a wiedzę można zdobyć w krótkim czasie.

Tutaj opisujemy metodę celowania w geny za pomocą syntetycznych SINEUP w celu zwiększenia translacji, co jest efektem przeciwnym do innych technologii, takich jak interferencja RNA9 i ASO gapmers11,22,23. Szeroko stosowaną metodą aktywacji genów sterowanej przez RNA jest grupowana aktywacja oparta na krótkich powtórzeniach palindromicznych (CRISPRa), w której ekspresja genu jest wyzwalana na poziomie transkrypcji24. Ta metoda, choć prosta i szybka, wymaga wielu pojedynczych przewodników RNA (sgRNA) ukierunkowanych na ten sam gen w celu uzyskania wyższej wydajności, zwiększając w ten sposób szanse na wiązanie poza celem25. Ponadto kluczowy enzym systemu CRISPRa, katalitycznie martwe białko 9 związane z CRISPR (dCas9) ma niską specyficzność wiązania, a sgRNA ukierunkowane na dwukierunkowe regiony promotora mogą niespecyficznie regulować w górę pobliskie geny25. I odwrotnie, SINEUPy wiążą się z docelowym mRNA w pojedynczym regionie wiązania o wysokiej specyficzności i nie wpływają na ekspresję pobliskich genów. Omawiamy podstawowe etapy związane z projektowaniem SINEUP, transfekcją, analizą ekspresji białek i RNA. Ponadto prezentujemy półautomatyczny, wysokowydajny system obrazowania do badania wielu SINEUP jednocześnie, co jest przydatne do wykrywania optymalnych SINEUPs.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie BD konstruktów SINEUP dla docelowych mRNA

  1. Sprawdź miejsce początkowe transkrypcji (TSS) i miejsce rozpoczęcia translacji docelowych mRNA w interesujących komórkach. Pozyskanie danych TSS zarówno z projektów ENCODE, jak i FANTOM (analiza ekspresji genów cap, CAGE) (ZENBU: http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/).
  2. Otwórz przeglądarkę, wyszukaj interesujące Cię geny i sprawdź TSS według szczytów CAGE.
  3. Zapoznaj się z przykładową analizą specyficznego dla komórek i tkanek TSS białka 7 (PARK7) choroby Parkinsona pokazanego na Rysunek 2.
  4. Zaprojektuj sekwencje BD o kilku różnych długościach odpowiadających 40 zasadom przed i 32 zasadom za pierwszą metioniną (AUG), w sumie 72 nt.
  5. Zamówienie niestandardowe zaprojektowanych płyt BD w wektorze wyrażeń SINEUP (patrz Tabela materiałów).
    nuta: Sprawdź specyficzność sekwencji za pomocą podstawowego lokalnego narzędzia do wyszukiwania wyrównania (BLAST), aby uniknąć efektów niedocelowych26.

2. Hodowla komórkowa i transfekcja SINEUP

  1. Komórki nasienne będące przedmiotem zainteresowania na płytce 6-dołkowej lub 24-dołkowej przez 24 godziny przed transfekcją SINEUPs. W przypadku ludzkiej linii komórkowej zarodka nerki (HEK293T/17) (zob. tabela materiałów), wysiewa się 0,5 x 106 komórek na basenik na płytce 6-dołkowej lub 1,5 x 10,55 komórek na basenik na 24-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną (zob. tabela materiałów). Po 24 godzinach staje się zlewny w 70%.
  2. Po 24 godzinach zmień pożywkę na 1,5 ml świeżej pożywki w przypadku płytki 6-dołkowej lub 0,4 ml świeżej pożywki w przypadku płytki 24-dołkowej. W przypadku SINEUP-GFP, transfekować 0,6 μg pEGFP-C2 (patrz tabela materiałów) i 3,4 μg SINEUP-GFP w jednym basenie na płytce 6-dołkowej lub 130 ng na płytce 6-dołkowej i 670 ng na płytce 24-dołkowej w jednym basenie na płytce 24-dołkowej odczynnikiem do transfekcji (10 μl w płytce 6-dołkowej i 3 μl w płytce 24-dołkowej), postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów), i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Przemyć komórki 2 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) (37 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 2,6 mM KCl i 1,5 mM KH2PO4) w każdym dołku na płytce 6-dołkowej lub 0,5 ml PBS w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Tylko w przypadku 24-dołkowej płytki pokrytej poli-D-lizyną dodać 25 μl trypsyny o zawartości 0,05% wagowych na objętość, inkubować w inkubatorze z 5% CO2 przez 5 minut i dodać 275 μl pożywki komórkowej na dołek. W przypadku płytki 6-dołkowej dodać 2 ml PBS do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół, aby zebrać 3/4 komórek (1,5 ml dla płytki 6-dołkowej lub 225 μl dla płytki 24-dołkowej) z 1 dołka w celu ekstrakcji białka (przejdź do protokołu 3 w przypadku ekstrakcji białka) i 1/4 komórek (0,5 ml w przypadku płytki 6-dołkowej lub 75 μl w przypadku płytki 24-dołkowej) do ekstrakcji RNA i odwirować w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (przejdź do kroku 5 do ekstrakcji RNA).
    UWAGA: Przeanalizuj wpływ SINEUP-GFP w 24-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną za pomocą obrazowania. Przejdź do kroku 7 (analiza obrazowa).

3. Ekstrakcja białka

  1. Ostrożnie odessać 1,5 ml PBS i dodać 140 μl roztworu do lizy (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% (w/v) Triton, 2,5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM β-glicerofosforanu, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptyny i 0,005% (w/v) fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)) (patrz tabela materiałów) dla płytki 6-dołkowej lub 60 μl dla 24 dobrze płytka do granulek komórki.
  2. Wymieszać pipetując, a następnie dokładnie wymieszać, obracając z małą prędkością przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Sprawdź stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego (patrz tabela materiałów). Przygotuj wszystkie reakcje w temperaturze pokojowej.
    1. Przygotować 5-6-krotne rozcieńczenie wzorca białkowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w ultraczystej wodzie o stężeniach w zakresie 0,2-1,5 mg/ml białka. Za każdym razem przygotowuj nowe standardy.
    2. Przygotować odczynnik roboczy A, mieszając 1 ml odczynnika A (alkaliczny roztwór winianu miedzi) z 20 μl odczynnika S (roztwór środka powierzchniowo czynnego).
    3. Załadować 5 μl wody (kontrola ujemna), wzorca BSA (wzorzec białka i kontrola pozytywna) lub próbki białka do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
    4. Do każdego dołka dodać 25 μl odczynnika A. Ostrożnie dodać 200 μl odczynnika B (odczynnik folinowy) do studzienki, unikając tworzenia się pęcherzyków. Przykryj talerz folią aluminiową i odczekaj 5-10 min.
    5. Zmierzyć absorbancję białka przy długości fali 750 nm za pomocą spektrofotometru. Absorbancja jest stabilna przez co najmniej 1 godzinę.
    6. Przygotować krzywą wzorcową, wykreślając standardowe stężenia białka BSA (mg/ml) na osi x i ich odpowiednią absorbancję na osi y. Obliczyć stężenie białka w próbce, stosując równanie krzywej standardowej.
      nuta: W razie potrzeby wstrzymaj protokół na tym etapie lub przejdź do kroku 4. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki białek należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Separacja białek za pomocą SDS-PAGE i wykrywanie docelowych białek z przeciwciałami (analiza Western-blot)

  1. Dodać jedną objętość 2x barwnika ładującego (0,1 M Tris-HCl (pH 6,8), 4% SDS, 20% glicerolu, 1,42% 2-merkaptenolu i 0,2% błękitu bromofenolowego) do każdej objętości próbki białka z kroku 3.3. Ogrzewać w temperaturze 90 °C przez 5 minut i natychmiast schłodzić na lodzie przez 1 minutę.
  2. Załadować 10-20 μg próbek białka do 10% żelu poliakrylowego SDS i rozdzielić przy 100-150 V) (patrz tabela materiałów).
  3. Przenieść białko z żelu do membrany nitrocelulozowej 0,45 μm (patrz tabela materiałów) za pomocą półsuchego przyrządu do przenoszenia z buforem transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny i 20% metanolu) przy 25 V przez 30 min.
  4. Dodać roztwór blokujący (5% odtłuszczone mleko w proszku w 1x bufor TBST (137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1% Tween-20)) (patrz Tabela Materiałów) do pojemnika, aż membrana zostanie całkowicie nasiąknięta i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. W przypadku SINEUP-GFP należy zhybrydyzować białko z przeciwciałem anty-GFP (rozcieńczonym w stosunku 1:2000 w roztworze blokującym) (patrz Tabela Materiałów) poprzez inkubację błony przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Jako białko kontroli wewnętrznej, wykryj białko β-aktyny poprzez hybrydyzację z przeciwciałem anty-β-aktyny (rozcieńczonym w stosunku 1:2000 w roztworze blokującym) (patrz tabela materiałów) przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  6. Dodaj 1x bufor TBST do pojemnika, aż membrana całkowicie nasiąknie i myj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy (w sumie trzy prania).
  7. Hybrydyzować białko GFP do rozcieńczonego (1:1000 w roztworze blokującym) przeciwciała anty-królika sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) i hybrydyzować białko β-aktyny do rozcieńczonego (1:1000 w roztworze blokującym) przeciwciała przeciw myszy sprzężonego z HRP na membranie przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  8. Płukać membranę 1x buforem TBST przez 5 min w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy (w sumie trzy prania).
  9. Wymieszać równą objętość odczynnika 1 i 2 do wykrywania chemiluminescencji wzmocnionej HRP (ECL) (patrz tabela materiałów). Przenieś membranę do 2 ml mieszanki odczynników ECL, przykryj pudełko folią aluminiową i pozostaw do inkubacji przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyjmij membranę z mieszanki odczynników ECL i naświetl ją za pomocą przyrządu do obrazowania luminescencyjnego.

5. Ekstrakcja RNA i leczenie DNazą

  1. Ekstrahuj całkowite RNA zgodnie ze standardowym protokołem ekstrakcji RNA z komórek hodowanych w monowarstwie27 lub alternatywnie użyj dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA (patrz Tabela Materiałów). Aby krótko mówiąc, dodaj dowolny odczynnik do lizy jednofazowej (MLR) izotiocyjanianu guanidyny i fenolu do pobranych komórek w kroku 2.3 (1 ml MLR na ~ 5 milionów komórek)27.
    nuta: Często zmieniaj rękawice. Używaj odczynników wolnych od RNaz oraz wyrobów plastikowych i szklanych nasączonych dietylowęglanem (DEPC), aby zapobiec degradacji RNA. W razie potrzeby wstrzymaj protokół na tym etapie. Wyekstrahowany RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Dodać 0,1 objętości 10x bufora DNazy i 2 U DNazy do oczyszczonego RNA z kroku 5.1 (patrz Tabela materiałów).
  3. Ustawić objętość reakcji na 50 μl wodą wolną od nukleaz i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Dodać 0,1 objętości ponownie zawieszonego odczynnika do inaktywacji DNazy i dobrze wymieszać (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  5. Wirować przy 10 000 x g przez 90 s. Przenieść supernatant (RNA wolny od DNA) do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. Uważaj, aby nie dotknąć osadu, ponieważ może to spowodować przeniesienie DNazy, co jest kłopotliwe dla dalszych etapów.
  6. Określ ilościowo RNA, mierząc stosunek A260 i A260/A280 (dla czystego RNA zakres wynosi 1,8-2,0) w spektrofotometrze UV.

6. Synteza pierwszej nici cDNA i analiza qRT-PCR

  1. Przeprowadzić syntezę pierwszej nici cDNA zgodnie ze standardowym protokołem syntezy cDNA, jak poniżej (patrz Tabela materiałów).
    1. Wymieszać 0,75 μM startera oligo dT, 4,3 μM startera losowego, dNTP (po 10 mM każdy) z 200-500 ng całkowitego RNA (z kroków 5-8) w 10 μl całkowitej objętości reakcji. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
    2. Wymieszać 1x bufor odwrotnej transkryptazy, 1 U inhibitora RNazy, 10 U odwrotnej transkryptazy i dodać do 10 μl mieszaniny RNA-starter z 6.1.1.
    3. W razie potrzeby ustawić całkowitą objętość reakcji na 20 μl z wodą wolną od nukleaz. Delikatnie wymieszać i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 °C przez 10 minut, następnie w temperaturze 42 °C przez 60 minut, a na koniec w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu inaktywacji enzymu. Ostudzić rurki na lodzie.
      nuta: Rozmrozić próbki RNA i wszystkie odczynniki na lodzie i przygotować mieszaninę reakcyjną na lodzie. Jeśli docelowe RNA to tylko RNA poliA, należy użyć tylko startera oligo dT (2,5 μM). W razie potrzeby wstrzymaj protokół. Zsyntetyzowane cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przeprowadzić qRT-PCR w trzech próbach technicznych (n=3, odchylenie standardowe Cт > 0,2) oraz w kontrpróbach biologicznych (n ≥ 3) przy użyciu 1 μl 10 ng cDNA, 0,4 μl startera odwrotnego (10 μM), 0,4 μl startera (10 μM), 10 μl roztworu mieszaniny polimerazy DNA, 0,4 μl dwuniciowego barwnika barwiącego DNA, 10 μl wody wolnej od nukleaz (objętość reakcji wynosiła 20 μl) w celu wykrycia produktów PCR w następujących warunkach; Etap utrzymywania (1 cykl) przez 30 s w temperaturze 95 °C, etap cykliczny (40 cykli) przez 5 s w temperaturze 95 °C i przez 30 s w temperaturze 60 °C, etap krzywej topnienia. Przykłady elementarzy dotyczą Gapdh_Fw ludzkiej: TCTCTGCTCCCTCTTC, Gapdh_Rv ludzkie: GCCCAATACGACCAAATCC, EGFP_Fw: GCCCGACAACCACTACCTGAG, EGFP_Rv: CGGCGGTCACGAACTCCAG, SINEUP-GFP_Fw: CTGGTGTGTATTATCTCTTATG i SINEUP-GFP_Rv: CTCCCGAGTCTCTGTAGC. Zobacz tabelę materiałów. Analizuj ilościową ekspresję RNA za pomocą metody 2-∆∆Ct ± SD28.

7. Analiza obrazowa SINEUPS za pomocą półautomatycznej metody wykrywania

  1. Umyj komórki 0,5 ml PBS dla jednego dołka na płytce 24-dołkowej.
  2. Dodać 2,0 μg Hoechst 33342 (patrz tabela materiałów) (rozpuszczając się w 500 μl PBS) do każdego dołka na płytce 24-dołkowej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu wybarwienia jądra.
  3. Zmierzyć komórki barwione metodą Hoechsta, aby policzyć całkowitą liczbę komórek przy maksimum emisji niebieskiej 461 nm i intensywności zielonej fluorescencji, aby policzyć liczbę komórek GFP dodatnich przy maksimum zielonej emisji 510 nm, używając wysokoprzepustowego cytometru obrazowego mikrostudzienki (patrz tabela materiałów). Analizuj efekt regulacji w górę białek SINEUPs, obliczając zintegrowaną intensywność GFP, która jest sumą wszystkich intensywności pikseli wyświetlających sygnał w segmentowanych obiektach obliczonych dla każdego kanału, przy użyciu oprogramowania do obrazowania29.
  4. Zbierz komórki, aby sprawdzić ekspresję RNA (powrót do kroków 5 i 6).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SINEUP-GFP to syntetyczny SINEUP zawierający zarówno optymalne BD (-28/+4 nakładanie się mRNA GFP), jak i ED (odwrócony SINE B2 z AS-Uchl1), który może regulować w górę translację mRNA GFP (Rysunek 3A i 3B) bez zmiany ekspresji mRNA GFP (Rysunek 3C i 3D). Aby przebadać optymalne BD i ED dla SINEUPs, opracowaliśmy protokół półautomatycznej analizy obrazu, który skrócił czas wykrywania i zwiększył liczbę próbek poddawanych jednocześnie badaniom przesiewowym w porównaniu z konwencjonalną analizą Western-blot15. Jak pokazano na Rysunek 4, ten wysokoprzepustowy system obrazowania potrzebował 3 dni (analiza Western-blot zajęła 2 tygodnie dla 48 SINEUPs). Po wykazaniu, że SINEUP-GFP zwiększa translację GFP, wykryliśmy intensywność zintegrowanej GFP za pomocą cytometru obrazowego. Optymalna chAD SINEUP-GFP indukowała 1,4-krotny wzrost ekspresji białka GFP. Chociaż zaobserwowaliśmy kompresję sygnałów od 2,6-krotnej (analiza Western-blot, patrz Rysunek 3A) do 1,4-krotnej (Analiza obrazowa, patrz Rysunek 5), różnica może wynikać z kalibracji oprogramowania przyrządu do obrazowania. Niemniej jednak wykryliśmy znacznie wyższe poziomy fluorescencji GFP w porównaniu z kontrolą (Rysunek 5A i 5B).

figure-results-1
Rysunek 1: Podstawowa konstrukcja syntetycznych SINEUPs. BD = domena wiążąca z docelowym mRNA, ED = domena efektorowa zawierająca odwróconą sekwencję SIN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Miejsca początkowe transkrypcji (TSS) mRNA ludzkiego białka 7 (PARK7) choroby Parkinsona w określonych tkankach i komórkach, wykryte za pomocą analizy CAGE. (A) Migawka przedstawiająca wynik wyszukiwania TSS dla ludzkiego mRNA PARK7 przy użyciu systemu integracji danych omicznych i interaktywnej wizualizacji30. Pozioma zielona strzałka na ścieżce genu Entrez hg19 wskazuje pozycję genomiczną referencyjnego ludzkiego mRNA PARK7, a pionowe zielone paski na ścieżkach FANTOM5 CAGE 1 i 2 wskazują sumę TSS (mierzonych jako transkrypty na milion (tpm)) z 1 829 typów tkanek i komórek. (B) Powiększenie zaznaczonego obszaru TSS w panelu A (skala 1/354: 35.4 kb do 100 bp). Szary zacieniony obszar na ścieżkach fazy 1 i 2 FANTOM5 CAGE wskazuje TSS 6 określonych komórek z łącznej liczby 1 829, które są wymienione na dole rysunku. Liczby (11.369, 4.998, 4.304, 3.509, 3.477 i 3.055) odpowiadające tym wymienionym komórkom wskazują transkrypty na milion dla każdej określonej komórki w szarych zacienionych pozycjach TSS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Analiza Western-blot potwierdzająca regulację w górę translacji przez SINEUP-GFP. (A) SINEUP-GFP został przebadany metodą Western-blot z przeciwciałem anty-GFP. (B) Wyniki zostały znormalizowane do intensywności pasma białka β-aktyny. (C) ekspresję mRNA GFP i (D) SINEUP RNA wykryto za pomocą qRT-PCR. p < 0,0005, n = 3, dwustronny test t-Studenta, słupki błędów są odchyleniem standardowym. Ten rysunek został zmodyfikowany z Takahashi et al.15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Schemat półautomatycznej analizy obrazu SINEUP. Dzień 1: Interesujące komórki nasienne na płytce 24-dołkowej. Dzień 2: Transfect GFP i SINEUP-GFP. Dzień 3: Przeanalizuj wpływ SINEUPs, mierząc intensywność zintegrowanej GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wysokoprzepustowa analiza regulacji w górę translacji za pomocą SINEUP-GFP. (A) Porównanie fluorescencji GFP między komórkami kontrolnymi i transfekowanymi SINEUP-GFP15. Podziałka liniowa = 2 mm. (B) Intensywność integracji GFP została znormalizowana do całkowitej liczby komórek zliczonej przez barwienie jądrowe za pomocą Hoechst 33342. p < 0,0005, n = 3, dwustronny test t-Studenta, słupki błędów są odchyleniem standardowym. FOV: pole widzenia. Ten rysunek został zmodyfikowany z Takahashi et al.15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy tutaj protokół mający na celu specyficzne zwiększenie produkcji białka docelowego mRNA za pomocą niekodującego RNA zawierającego SINE, zwanego SINEUPs. Jako reprezentatywny przykład, wykazano, że optymalna syntetyczna SINEUP-GFP zwiększa 2,6-krotnie translację mRNA GFP, mierzoną za pomocą analizy Western-blot.

Zaprojektowanie optymalnego BD ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia swoistości i siły działania SINEUP (zakresu regulacji białka w górę). Wcześniej przeprowadziliśmy badanie przesiewowe 17 BD SINEUP-GFP za pomocą analizy Western-blot15 i stwierdziliśmy, że optymalna BD nakłada się na sekwencję AUG-KOZAK mRNA GFP, chociaż może tak nie być w przypadku innych mRNA i powinna być weryfikowana dla każdego przypadku. Inna niezależna grupa również przeprowadziła badanie przesiewowe BD przy użyciu innej metody31. Ponieważ przesiewanie wielu BD może być dość czasochłonne i kłopotliwe, wprowadziliśmy tutaj metodę wykrywania SINEUP o wysokiej przepustowości. Metoda ta mierzy względne zmiany gęstości zintegrowanej GFP w komórkach transfekowanych SINEUP w porównaniu z komórkami transfekowanymi wektorem kontrolnym. Aby zapewnić, że komórki w konkretnym dołku płytki hodowlanej są transfekowane równomiernie, a sygnał GFP nie jest skoncentrowany tylko w określonym obszarze studzienki, bardzo ważne jest równomierne rozmieszczenie komórek w studzienkach w kroku 2.1. W tym celu delikatnie potrząśnij płytką 10 razy w przód iw tył (↑↓) po wysianiu komórek w czystej ławce i powtórz w inkubatorze 5% CO2 przed rozpoczęciem inkubacji.

Kolejnym krytycznym krokiem jest obliczenie stężenia białka w kroku 3.3. Błędne obliczenia w tym przypadku mogą prowadzić do załadowania błędnej ilości białka podczas analizy Western-blot, co w konsekwencji uniemożliwi wykrycie niewielkich zmian w ekspresji białka przez niektóre ze słabych SINEUP lub generuje wyniki fałszywie dodatnie z powodu przeciążenia. Zaleca się za każdym razem świeże przygotowanie krzywej wzorca białka, upewniając się, że w kroku 3.3.3 zmierzono równe ilości wzorców i próbek białka. Opisany tutaj protokół koncentruje się na SINEUP-GFP, ale analiza Western-blot może być stosowana dla dowolnego docelowego mRNA, które Cię interesuje. Czas inkubacji i stężenie przeciwciał powinny być zoptymalizowane dla każdego celu, aby uzyskać najlepszy wynik.

Jedną z unikalnych cech SINEUPS jest to, że poziom ekspresji docelowego mRNA pozostaje niezmieniony. Ważne jest, aby traktować RNA DNazą, aby uniknąć wykrycia transfekowanych SINEUPs i genomowego DNA za pomocą qRT-PCR. SINEUP RNA i docelowa ekspresja mRNA powinny być mierzone za pomocą qRT-PCR, aby potwierdzić powodzenie zarówno transfekcji, jak i aktywności SINEUP. SINEUPs zawierają sekwencję SINE, która występuje obficie zarówno w genomie człowieka, jak i myszy. Aby uniknąć nieswoistego wykrywania sekwencji SINE, nie zaleca się projektowania starterów qRT-PCR do sekwencji SINE.

W tym protokole użyliśmy ludzkich linii komórkowych, ale SINEUPy są skuteczne w wielu liniach komórkowych z kilku różnych gatunków 12,13,14,18,19. Warunki hodowli komórkowej i transfekcji mogą być modyfikowane w zależności od różnych linii komórkowych, o ile utrzymują one wydajność transfekcji wektorów SINEUP. Ponadto można zastosować alternatywne metody ekstrakcji RNA, syntezy cDNA i kontroli stężenia białka, biorąc pod uwagę, że zachowują one wymaganą jakość RNA i białka do analizy qRT-PCR i Western-blot. Podczas gdy użyliśmy specyficznego wysokoprzepustowego cytometru mikrostudziennego, który umożliwił wykrycie fluorescencji GFP w całej studzience, można zastosować inne cytometry o podobnym zakresie wykrywania31. Należy zauważyć, że jeśli rozmieszczenie komórek i transfekcja są równe w całej studzience, nie jest konieczne skanowanie całej studni pod kątem fluorescencji GFP: połowa lub jedna czwarta obszaru studzienki może wystarczyć, aby dostrzec efekt SINEUP w zależności od umiejętności eksperymentalnych.

Ustanowienie wysokoprzepustowego protokołu detekcji SINEUP pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe wielu BD ukierunkowanych na dane mRNA w hodowanych komórkach. Jest to o tyle istotne, że przepisy regulujące optymalne targetowanie przez BD są nadal niejasne. Taki multipleksowy system przesiewowy pozwala na testowanie na dużą skalę wielu SINEUP pod kątem różnych genów, co jest przydatne na przykład do celowania w wiele genów zaangażowanych w określony szlak sygnałowy. Co więcej, można go wykorzystać do rozszerzenia poszukiwań skutecznych SINEUP ukierunkowanych na kilka mRNA, projektowania różnych BD SINEUP wokół regionu AUG-Kozak (patrz rysunek 1), kotransfekcji docelowych mRNA o pełnej długości (5ʹ UTR-CDS-3ʹ UTR) połączonych z mRNA GFP w hodowanych komórkach w celu znalezienia optymalnych SINEUPs, a następnie testowania kandydatów na BD przeciwko endogennym mRNA w hodowanych komórkach i zwierzętach modelowych in vivo, od ludzi i myszy po inne gatunki zwierząt i roślin.

Ten protokół przesiewowy jest bardzo szybki. Nie musimy naprawiać i zbierać komórek, wystarczy umieścić żywą płytkę do hodowli komórek w przyrządzie do obrazowania. Proponujemy wykorzystanie tego wysokoprzepustowego protokołu badań przesiewowych do wyboru optymalnych BD SINEUP i oceny potencjalnych kandydatów za pomocą analizy Western-blot. W ten sposób wybrani kandydaci z optymalnymi BD mogą być zastosowani w celu zwiększenia produkcji przeciwciał 18,19,21. Obecnie dziedzina terapii RNA dramatycznie się rozwija. Na przykład terapie siRNA, ASO, mRNA i CRISPR RNA są szeroko stosowane do kontrolowania ekspresji mRNA odpowiednich celów 9,32. W tym kontekście, SINEUPy są w powijakach, ale jak dotąd żaden z badanych SINEUPów nie zmienił ekspresji docelowych mRNA. Ponadto SINEUPy nie edytują docelowego mRNA, a jedynie regulują translację mRNA w górę. Co więcej, choroby związane z utratą funkcji wynikające z haploinsuficjencji mogą być zwalczane przez terapię SINEUP, osiągając 2-krotną indukcję niedoboru białka17,33. Chociaż efekty off-target muszą być dalej badane, SINEUP potencjalnie i specyficznie celują w pojedyncze, ekspresyjne mRNA z sekwencją komplementarną do BD.

Ograniczeniem tego wysokoprzepustowego protokołu jest to, że nie nadaje się on do badań przesiewowych BD SINEUP w modelach mysich in vivo, ponieważ protokół mierzy tylko intensywność zintegrowanej GFP. Ponieważ SINEUPy są naturalnymi antysensownymi lncRNA, które działają potranskrypcyjnie, nie można ich zastosować, gdy w komórkach lub próbkach tkanek brakuje docelowego mRNA.

Niemniej jednak SINEUPs mogą być stosowane w badaniach nad wzmocnieniem funkcji, w celu zwiększenia produkcji przeciwciał oraz jako terapia RNA w celu zwiększenia ekspresji niedoborów białek w zakresie 1,5-3,0-krotnym. Opisane tutaj metody stanowią użyteczny przewodnik do celowania i wykrywania indukowanego przez SINEUP wzmocnienia translacji pożądanego mRNA i zapewniają nowe narzędzie do potranskrypcyjnej regulacji genów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor korespondencyjny Piero Carninci jest jednym z założycieli firmy TransSINE Technologies Co. Ltd., która posiada własność intelektualną na podstawie zgłoszonego patentu (EP2691522A4 i JP2017169573A) oraz udzielonego patentu (US9353370B2) na technologię SINEUP.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Basic Science and Platform Technology Program for Innovative Biological Medicine, no. 17am0301014, przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (AMED), Research Grant od MEXT dla RIKEN Center for Life Science Technologies oraz Research Grant od MEXT dla RIKEN IMS. Dziękujemy członkom PC lab i sieci SINEUP (SISSA, University of Eastern Piemont i RIKEN) za prowokujące do myślenia dyskusje. Dziękujemy dr Matthew Valentine'owi za korektę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Synthetic SINEUPCell Guidance Systems Ltd. w Wielkiej Brytanii i K.K.DNAFORM w Japoniihttps://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html i https://www.dnaform.jp/en/information/20130320Krok 1.5
HEK293T/17ATCC ATCC CRL-11268Krok 2.1
Falcon Multiwell Plate do hodowli komórkowych Płytka 6-dołkowaCorning6902A01Krok 2.1
Corning BioCoat Poli-D-lizyna Płytka 24-dołkowaCorning08-774-124Krok 2.1
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027Krok 2.2
pEGFP-C2Clontech#6083-1Krok 2.2
Bufor do lizy komórek (10x)Technologia sygnalizacji komórkowej#9803SKrok 3.1 Jest to wstępnie zmieszany roztwór do lizy komórek.
Technologia sygnalizacji komórkowejPMSF#8553SKrok 3.1 Aby uzupełnić bufor do lizy komórek, dodaj 0,005% (w/v) PMSF do 1x bufora do lizy komórek.
Zestaw do oznaczania białek DC IIBIO RADKrok 3.3
10% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 12-dołkowe, 20 i mikro; LBIO RAD#4561035Krok 4.2
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm× 4 m)Amasham10600013Krok 4.3, to jest 0,45 &mikro; m membrana nitrocelulozowa.
Technologia sygnalizacji komórekbeztłuszczowego mleka w proszku#9999SKrok 4.4 Składnik roztworu blokującego.
GFP Tag PrzeciwciałoThermo Fisher ScientificA-6455Krok 4.5 Numer serii: 1495850, RRID: AB_221570
Przeciwciało monoklonalne anty-β-aktynowe wytwarzane u myszySIGMAA5441Krok 4.5 Numer serii: 026M4780V, RRID: AB_476744
Poliklonalne kozie immunoglobuliny przeciw królikomDakoP0448Krok 4.5 Jest to przeciwciało wtórne sprzężone z HRP dla przeciwciała anty GFP. Numer serii: 20017525, RRID:AB_2617138
Poliklonalne kozie immunoglobuliny przeciw mysimDakoP0447Krok 4.5 Jest to przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP dla przeciwciała anty β-aktyny. Numer serii: 20019698, RRID:AB_2617137
Odczynniki do wykrywania Western Blotting ECLAmershamRPN2109Krok 4.9
Przyrząd do szybkiego koncentratora próbek Maxwella (RSC) PromegaAS4500Krok 5.1 Jest to dostępny na rynku instrument do eksreakcji RNA.
Maxwell RSC simplyRNA Cells KitPromegaAS1390Krok 5.1 Jest to dostępny na rynku zestaw do eksreakcji RNA.
Zestaw TURBO DNA-freeambionAM1907Krok 5.2 i 5.4 Zestaw zawiera DNazę, bufor DNazy i odczynnik inaktywacyjny.
Zestaw do syntezy 1. nici cDNA PrimeScripTaKaRa6110AKrok 6.1 Zestaw zawiera odczynniki do syntezy pierwszej nici cDNA.
TB Green Premix Ex Taq IITaKaRaRR820AStep 6.2
Hoechst3342Thermo Fisher ScientificH3570Step 7.2
Celigo SNexcelom Bioscience200-BFFL-SStep 7.3 Jest to cytometr obrazowy do mikrostudzienek o wysokiej przepustowości.
#5000112JA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309 (5740), 1564-1566 (2005).
  2. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  3. Hon, C. C., et al. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends. Nature. 543 (7644), 199-204 (2017).
  4. Tufarelli, C., et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nature Genetics. 34 (2), 157-165 (2003).
  5. Yu, W., et al. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA. Nature. 451 (7175), 202-206 (2008).
  6. Carninci, P., Hayashizaki, Y. Noncoding RNA transcription beyond annotated genes. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 139-144 (2007).
  7. Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter. Nucleic Acids Research. 38 (21), 7736-7748 (2010).
  8. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 509-524 (2014).
  9. Takahashi, H., Carninci, P. Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (2), 294-301 (2014).
  10. Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252(2015).
  11. Nishina, K., et al. DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing. Nature communications. 6, 7969(2015).
  12. Carrieri, C., et al. Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat. Nature. 491 (7424), 454-457 (2012).
  13. Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells. Scientific Reports. 6, 33605(2016).
  14. Zucchelli, S., et al. SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174(2015).
  15. Takahashi, H., et al. Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation. PLOS ONE. 13 (2), e0183229(2018).
  16. Deutschbauer, A. M., et al. Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast. Genetics. 169 (4), 1915-1925 (2005).
  17. Indrieri, A., et al. Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo. Scientific Reports. 6, 27315(2016).
  18. Patrucco, L., et al. Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins. Gene. , (2015).
  19. Sasso, E., et al. A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells. MAbs. , 1-8 (2018).
  20. Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications. European Journal of Human Genetics. 16 (11), 1350-1357 (2008).
  21. Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs. Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).
  22. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24 (15), 1634-1644 (2010).
  23. Watts, J. K., Corey, D. R. Silencing disease genes in the laboratory and the clinic. Journal of Pathology. 226 (2), 365-379 (2012).
  24. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  25. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).
  26. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  27. Liu, X., Harada, S. RNA isolation from mammalian samples. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4.16 (2013).
  28. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  30. Severin, J., et al. Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU. Nature Biotechnology. 32 (3), 217-219 (2014).
  31. Yao, Y., et al. RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat. Nucleic Acids Research. 43 (9), e58(2015).
  32. Savić, N., Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Translational Research. 168, 15-21 (2016).
  33. Long, H., et al. RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy. Biotechnology Letters. , (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Niekoduj ce RNA SINEUPzwi kszenie translacji mRNAprojektowanie domeny wi cejanaliza Western blotqPCR w czasie rzeczywistymobrazowanie fluorescencyjnemRNA z tagiem GFPupregulacja bia kaprotok transfekcji

Powiązane artykuły