Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58640

⸱

17 listopada 2018

 , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Streszczenie

Opracowaliśmy narzędzie zarówno do wzbogacania, jak i rozszerzania limfocytów T specyficznych dla antygenu. Może to być pomocne w takich przypadkach, jak: A) wykrycie istnienia limfocytów T specyficznych dla antygenu, B) zbadanie dynamiki odpowiedzi specyficznych dla antygenu, C) zrozumienie, w jaki sposób odpowiedzi specyficzne dla antygenu wpływają na stan choroby, taki jak autoimmunizacja, D) demistyfikacja heterogenicznych odpowiedzi na limfocyty T specyficzne dla antygenu lub E) wykorzystanie komórek specyficznych dla antygenu do terapii. Narzędzie opiera się na cząstce magnetycznej, którą sprzęgamy sygnały swoiste dla antygenu i kostymulujące limfocyty T, i którą nazywamy sztucznymi komórkami prezentującymi antygen (aAPC). W związku z tym, ponieważ technologia jest prosta w produkcji, może być łatwo przyjęta przez inne laboratoria; w związku z tym naszym celem jest szczegółowe opisanie produkcji i późniejszego wykorzystania APC. Wyjaśniamy, jak przyłączać sygnały specyficzne dla antygenu i kostymulujące do aAPC, jak wykorzystać je do wzbogacania limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz jak rozszerzać limfocyty T specyficzne dla antygenu. Ponadto podkreślimy względy projektowania inżynieryjnego oparte na eksperymentalnych i biologicznych informacjach z naszego doświadczenia w charakteryzowaniu limfocytów T specyficznych dla antygenu.

Wprowadzenie

Wraz z rozwojem wielu immunoterapii, istnieje potrzeba scharakteryzowania i kontrolowania odpowiedzi immunologicznych. W szczególności interesująca jest adaptacyjna odpowiedź immunologiczna ze względu na specyficzność i trwałość komórek. Ostatnio terapie limfocytami T z receptorem antygenu chimerycznego zostały zatwierdzone do terapii raka; jednak receptory antygenowe są oparte na wspólnym antygenie powierzchniowym CD19, a nie na antygenach specyficznych dla raka1. Poza specyficznością, immunoterapie mogą również cierpieć z powodu braku kontroli i ograniczonego zrozumienia dynamicznej odpowiedzi immunologicznej w obrębie raka lub autoimmunizacji.

Jednym z wyzwań związanych z badaniem odpowiedzi specyficznych dla antygenu jest ich bardzo niska częstotliwość, np. limfocyty T specyficzne dla antygenu to 1 z każdych 104 do 106 limfocytów T2,3. Tak więc, aby zbadać, które limfocyty T są obecne lub reagują, komórki muszą zostać wzbogacone i rozszerzone lub ich sygnał musi zostać wzmocniony. Utrzymanie komórek zasilających przy użyciu obecnych technik, które koncentrują się na ekspansji komórek specyficznych dla antygenu, jest kosztowne i trudne. Obecne techniki, które koncentrują się na wzmacnianiu sygnału limfocytów T specyficznych dla antygenu, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISPOT), ograniczają ponowne użycie tych limfocytów T4. Wreszcie, ze względu na niską czułość, często te dwie techniki muszą być połączone w celu wyliczenia specyficznego dla antygenu.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy sztuczną komórkę prezentującą antygen (aAPC) opartą na nanocząstkach magnetycznych5,6,7,8. aAPC może być funkcjonalizowany za pomocą specyficznego dla antygenu głównego kompleksu zgodności tkankowej (pMHC) i cząsteczek kostymulujących - np. Przeciwciała anty-CD28 - w celu wzbogacenia limfocytów T specyficznych dla antygenu, a następnie stymulowania ich ekspansji (Figura 1). Cząsteczki mogą być zatem opłacalnym, gotowym produktem, który można zarówno dostosować do stymulacji specyficznej dla antygenu, jak i ustandaryzować w eksperymentach i u pacjentów. Przeprowadzenie procesu wzbogacania i ekspansji powoduje od setek do tysięcy razy ekspansję limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu i może skutkować częstością do 60 procent już po tygodniu, umożliwiając scharakteryzowanie lub terapeutyczne zastosowanie dużej liczby komórek. W tym miejscu opisujemy, jak wytwarzać nanocząsteczki aAPC, kilka krytycznych kwestii projektowych przy wyborze właściwości nanocząstek i demonstrujemy niektóre typowe wyniki wykorzystania tych cząstek do izolowania i rozszerzania rzadkich limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy były utrzymywane zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Institutional Review Board Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Załaduj dimeryczne białko fuzyjne immunoglobuliny o dużej zgodności tkankowej (MHC-Ig) z pożądaną sekwencją peptydów antygenowych.

UWAGA: Jeśli używasz H-2Kb:Ig, postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.1; jeśli używasz H-2Db:Ig, postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.2.

  1. Aktywne ładowanie sekwencji peptydowej do H-2Kb:Ig.
    1. Przygotuj niezbędne. Przygotować bufor denaturacyjny, sporządzając roztwór 150 mM NaCl i 15mM Na2CO3 w wodzie dejonizowanej, a następnie dostosowując pH do 11,5. Przygotować bufor renaturyzacyjny, sporządzając roztwór 250 mM Tris HCl w wodzie dejonizowanej i dostosowując pH do 6.8,
      UWAGA: Zazwyczaj wymaga to około 5 ml zarówno denaturacji, jak i renaturacji dla 1 mg H-2Kb:Ig.
    2. Denaturacja H-2Kb:Ig, aby umożliwić lepsze wiązanie peptydów. Doprowadzić stężenie H-2Kb:Ig do zakresu 0,5-2 mg/ml za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie rozcieńczyć H-2Kb:Ig do końcowego stężenia 100-200 μg/ml z 5-10 równoważnikami objętości buforu denaturacyjnego i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    3. Dodać 50 molowy nadmiar sekwencji peptydowej (zwykle peptyd podstawowy jest utrzymywany w temperaturze 1 mM w temperaturze -80 °C) do roztworu H-2Kb:Ig.
      UWAGA: Zwykle antygeny peptydowe będą musiały zostać rozpuszczone w co najmniej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie powoli dodawane do PBS, aby pozostały rozpuszczalne. W zależności od sekwencji aminokwasów, może być konieczne zwiększenie ilości DMSO.
    4. Renatura H-2Kb:Ig z peptydem. Natychmiast po dodaniu peptydu doprowadzić roztwór do pH 7,4 poprzez dodanie buforu renaturacyjnego. Pozostawić zobojętniony roztwór do inkubacji przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
    5. Skoncentrować i przemyć peptyd obciążony peptydem H-2Kb:Ig. Wykorzystując koncentrator odśrodkowy z odcięciem masy cząsteczkowej 50 kDa (MWCO), postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta, aby przepłukać roztwór H-2Kb:Ig obciążony peptydami 3 razy PBS, stężić do co najmniej 1 mg / ml i określić ilościowo stężenie na spektrofotometrze.
  2. Aktywne ładowanie sekwencji peptydowej do H-2Db:Ig.
    1. Przygotuj niezbędne. Przygotować bufor denaturacyjny, sporządzając roztwór 131 mM kwasu cytrynowego, 150 mM NaCl i 124 mM Na2HPO4 w wodzie dejonizowanej, a następnie dostosowując pH do 6,5. Przygotować bufor renaturyzacyjny, sporządzając roztwór 120 mM Tris HCl w wodzie dejonizowanej i dostosowując pH do 8,8,
      UWAGA: Zazwyczaj będzie to wymagało około 5 ml buforu denaturacyjnego i 1 ml buforu renaturacyjnego na 1 mg H-2Db:Ig.
    2. Denaturacja H-2Db:Ig, aby umożliwić lepsze wiązanie peptydów. Doprowadzić stężenie H-2Db:Ig do końcowego stężenia 0,5-2 mg/ml za pomocą PBS. Następnie rozcieńczyć H-2Db:Ig do końcowego stężenia 100-200 μg/ml z 5-10 równoważnikami objętości buforu denaturacyjnego.
    3. Dodać 50 molowy nadmiar sekwencji peptydowej (zwykle peptyd podstawowy utrzymuje się w temperaturze 1 mM w temperaturze -80 °C) do roztworu H-2Db:Ig i pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Dodaj β2 mikroglobulinę i zrenaturyzuj H-2Db:Ig za pomocą peptydu. Dodaj 2-krotny molowy nadmiar β2 mikroglobuliny. Następnie doprowadzić roztwór do pH 7,4, dodając bufor renaturyzacyjny. Pozostawić zobojętniony roztwór do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    5. Skoncentrować i przemyć peptyd obciążony H-2Db:Ig. Wykorzystując koncentrator odśrodkowy z MWCO 50 kDa, postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta, aby przemyć roztwór H-2Kb:Ig obciążony peptydami 3 razy PBS, stężyć do co najmniej 1 mg / ml i określić ilościowo stężenie na spektrofotometrze.

2. Sprzęgnij kompleksy MHC-peptyd i cząsteczki kostymulujące z powierzchnią magnetycznych nanocząstek, tworząc nanocząsteczki sztucznego antygenu prezentującego komórki. Użyj jednej z trzech różnych metod w zależności od wielkości cząstek i zastosowania.

UWAGA: Do koniugacji białek na powierzchni cząstek można użyć wielu różnych technik. W niniejszym dokumencie opisano 3 odrębne podejścia: cząstki pokryte aminą (krok 2.1), cząstki pokryte N-hydroksysukcynimidem (NHS) (krok 2.2) i cząstki pokryte antybiotyną (krok 2.3). Procesy te zostały również szczegółowo opisane w sekcji metod w dwóch opublikowanych artykułach6,7. Wykonaj wszystkie czynności w dygestoria bezpieczeństwa biologicznego ze sterylnymi roztworami, aby utrzymać sterylność podstawowych cząstek aAPC.

  1. Pokryj sygnały specyficzne dla antygenu i stymulujące cząstki magnetyczne pokryte aminami (Rysunek 2). Proces ten opisano dla nanocząstek superparamagnetycznych pokrytych aminą o długości fali 100 nm.
    UWAGA: Szczegółowe protokoły przyłączania przeciwciała do powierzchni cząstki pokrytej aminą można znaleźć na stronie https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, gdzie Technote 201 opisuje, jak tiolatować przeciwciała i koniugować z cząstkami funkcjonalizującymi maleimid, a 202 opisuje proces potrzebny do funkcjonalizacji cząstek pokrytych aminą z maleimidowymi grupami funkcyjnymi. Tutaj podkreślono tylko niewielkie modyfikacje dla MHC-Ig i sygnałów kostymulujących dołączonych do tych cząstek.
    1. Tiolatować przeciwciała odczynnikiem Trauta (Technote 201).
      1. Przygotować 10x PBS-bufor kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,1 M PBS i 100 mM EDTA). Dodaj 10x bufor PBS-EDTA do przeciwciał w stosunku 1:10, aby zapobiec utlenianiu wolnych tioli dodanych do przeciwciał.
      2. Dodać 20 molowy nadmiar odczynnika Trauta (2-iminotiolan) do przeciwciała i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Odmierz odczynnik Traut (suchy proszek) w dygestorii chemicznej, aby uniknąć oddychania, ponieważ przekształca grupy aminowe w grupy tiolowe.
      3. Dokładnie przemyć 1x buforem PBS-EDTA 3 razy za pomocą koncentratora odśrodkowego z MWCO 50 kDa i postępować zgodnie ze wskazówkami producenta, zagęszczając do końcowej objętości 500 μL. Zmierzyć stężenie roztworu przeciwciała za pomocą spektrofotometru.
    2. Przekształć aminowe grupy funkcyjne na nanocząstce magnetycznej w grupy maleimidowe za pomocą 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sulfosukcynimidylu (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. Dodaj 10x bufor PBS-EDTA do przeciwciał w stosunku 1:10 do cząstek.
      2. Rozpuścić Sulfo-SMCC w wodzie dejonizowanej i ponownie zawiesić w stężeniu 1 mg/ml. Odmierz Sulfo-SMCC (suchy proszek) w dygestorii chemicznej, aby uniknąć oddychania, ponieważ przekształca grupy aminowe w grupy maleimidowe.
      3. Dodać 0,016 nmol roztworu Sulfo-SMCC na każdy milimetr kwadratowy powierzchni cząstek. Dla 1 mg cząstek o długości fali 100 nm należy użyć 0,3 mg Sulfo-SMCC. Pozostawić do reakcji na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
      4. Przemyć cząstki 1x buforem PBS-EDTA 3 razy za pomocą pola magnetycznego z kolumną magnetyczną i ponownie zawiesić w 500 μL 1x buforu PBS-EDTA.
        UWAGA: W przypadku używania cząstek mniejszych niż 200 nm, takich jak opisane tutaj cząstki o długości 100 nm, najprawdopodobniej magnesy trwałe nie będą wystarczająco silne, aby przyciągnąć cząstki do celów mycia lub koncentracji. Tak więc, aby umyć mniejsze cząstki, użyj kolumny magnetycznej złożonej z kul ferromagnetycznych do wzmocnienia pola magnetycznego.
    3. Reaguj cząstkami funkcjonalizowanymi maleimidem z tiolowanymi przeciwciałami (Technote 201).
      1. Dodaj cząstki do szklanej fiolki scyntylacyjnej, dodaj mini-magnetyczny pręt mieszający, umieść zaledwie cal nad magnetyczną płytką mieszającą i wywołaj magnetyczne mieszanie roztworu cząstek.
      2. Do roztworu mieszającego dodawać kroplami tiolowane przeciwciała (0,5 mg przeciwciała na każdy 1 mg cząstek). Pozostawić na noc do reakcji w temperaturze pokojowej.
      3. Przemyć 1x buforem PBS 3 razy za pomocą pola magnetycznego i ponownie zawiesić w 500 μL 1x PBS. Etykietować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
        UWAGA: Maksymalna wydajność koniugacji występuje, gdy cząstki funkcjonalizowane maleimidem są natychmiast mieszane z tiolowanym białkiem.
  2. Pokryj sygnały specyficzne dla antygenu i stymulujące cząstki magnetyczne pokryte NHS (Rysunek 3). Proces ten jest opisany dla nanocząstek superparamagnetycznych o długości 200 nm, pokrytych NHS.
    1. Przygotować bufor do ponownego zawieszania, bufor do gaszenia i bufor do przechowywania. Bufor do reprodukcji składa się z 25 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) z 0,01% Tween 20 dostosowanego do pH 6,0. Bufor hartowniczy jest 100 mM roztworem Tris-HCl o pH 7,4. Bufor magazynujący jest roztworem 10 mM PBS i 0,01% Tween o pH 7,4.
    2. Zawiesić liofilizowane cząstki w 1 ml buforu do sporządzania zawiesiny. Wirować energicznie przez co najmniej 15 minut, aż nie będą widoczne żadne agregaty.
    3. Umieścić cząstki magnetyczne na stojaku magnetycznym w celu usunięcia supernatantu, ponownie zawiesić z 0,5 ml buforu do respekcji i przenieść do szklanej fiolki scyntylacyjnej. Wirować, aż nie będą widoczne żadne agregaty.
    4. Dodać 0,1 mg białka całkowitego na 1 mg zawieszonych cząstek. Wirować do mieszania i reagować w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny podczas mieszania.
    5. Dodać 0,1 ml buforu hartowniczego i reagować w temperaturze pokojowej przez 30 minut podczas mieszania.
    6. Umieść fiolkę scyntylacyjną na stojaku magnetycznym i umyj cząstki. Poczekaj, aż supernatant będzie czysty do usunięcia. Usuń cząstki ze stojaka magnetycznego, dodaj 1 ml buforu do respensji i wiruj, aż nie będą widoczne żadne agregaty. Powtórzyć ten proces trzy razy i ponownie zawiesić cząstki w 1 ml buforu do rekompozycji. Cząstki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Pokryj specyficzne dla antygenu i stymulujące sygnały do cząstek magnetycznych pokrytych antybiotyną (Rysunek 4). Proces ten jest opisany dla superparamagnetycznych nanocząstek antybiotyny o długości fali 50-100 nm.
    1. Biotynylan MHC-Ig lub cząsteczki kostymulujące.
      1. Dostosuj stężenie białka do 0,5-2 mg/ml w buforze PBS. Zawiesić sulfo-NHS-biotynę w stężeniu 10 mg/ml w wodzie dejonizowanej i dodać 20-krotny nadmiar molowy do przeciwciała stymulującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
      2. Dokładnie przemyć PBS 3 razy za pomocą koncentratora odśrodkowego o pojemności MWCO 50 kDa, postępować zgodnie ze wskazówkami producenta, zagęszczając do końcowej objętości 500 μL. Zmierzyć stężenie roztworu przeciwciała za pomocą spektrofotometru.
    2. Sprzężone biotynylowane sygnały MHC-Ig i/lub kostymulujące z nanocząstkami antybiotyny. Na 500 μl podstawowych cząstek antybiotyny dodać 0,5 nmol przeciwciała stymulującego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Umyć sprzężone nanocząstki APC. Ponieważ cząstki te są mniejsze niż 200 nm, zwilż kolumnę magnetyczną i umieść na stojaku magnetycznym.
    4. Dodać zawiesinę cząstek/białka do kolumny. Pozwolić, aby wszystkie białka/cząstki całkowicie dostały się do kolumny.
    5. Przemyć, dodając trzykrotnie 0,5 ml PBS do kolumny.
    6. Elucję, wyjmując kolumnę ze stojaka magnetycznego, dodając 0,5 ml PBS do kolumny i używając tłoka, wyrzuć cząstki aAPC do szklanej fiolki scyntylacyjnej. Cząstki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
      UWAGA: Cząstki są stabilne w temperaturze 4 °C (nie powinny być zamrażane) przez okres do 6 miesięcy. Wyższe temperatury zmniejszają funkcjonalność cząstek i zaobserwowano pewną agregację cząstek (dane nie pokazane). Nie przechowywać w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas, ponieważ znacznie skraca to okres przydatności do spożycia cząstek.

3. Scharakteryzuj zawartość białka na sztucznym antygenie prezentującym nanocząstki komórkowe za pomocą fluorescencyjnego wykrywania przeciwciał.

UWAGA: To jest użyteczna kontrola jakości wyprodukowanych komórek prezentujących sztuczny antygen. Ponadto ilość sygnału stymulującego jest wykorzystywana do produkcji równoważnych dawek aAPC w różnych partiach i różnych typach aAPC (np. Różne rozmiary).

  1. Zmierzyć stężenie cząstek w powlekanych aAPC.
    1. Użyć niesprzężonych cząstek z roztworu podstawowego i wykonać miareczkowanie dawki w stosunku 1:2 w roztworze PBS na 96-dołkowej płaskodennej płytce do hodowli tkankowej w ilości 100 μl na basenik.
    2. Odczytaj cząstki na spektrofotometrze z odczytem płytkowym przy 405 nm, aby utworzyć krzywą wzorcową ze znanego stężenia cząstek.
    3. Pobrać próbkę sprzężonych aAPC, rozcieńczyć w PBS do całkowitej objętości 100 μl i odczytać na spektrofotometrze.
  2. Usunąć próbkę wytworzonych aAPC i zabarwić przeciwciałami fluorescencyjnymi.
    1. Aby obliczyć, ile próbki należy usunąć, oszacuj liczbę przeciwciał na powierzchni cząstki.
      UWAGA: W przypadku tych technik należy przyjąć gęstość około 1000 przeciwciał/μm2 powierzchni cząstek. Aby móc wykryć fluorescencję, potrzeba łącznie około 1011 cząsteczek MHC-Ig lub CD28 na test fluorescencyjny.
    2. Doprowadzić całkowitą objętość aAPC do 100 μl w PBS, dodać przeciwciała barwiące w rozcieńczeniu 1:100 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Przykładowe przeciwciała z powodzeniem stosowane to sprzężony przez FITC łańcuch lekki Ig λ1, λ2, λ3, klon R26 46 do wykrywania MHC-Ig oraz sprzężony z FITC mysz anty ormiańsko-syryjski chomik IgG, klon G192-1, do wykrywania anty-mysiego CD28.
  3. Umyj cząstki i odczytaj fluorescencję na czytniku fluorescencyjnym.
    1. Przepłukać magnetycznie (zgodnie z opisem w kroku 2) wybarwione frakcje aAPC trzykrotnie 0,5 ml PBS.
    2. Umyte aAPC należy wypłukać 0,5 ml PBS.
    3. Dodać 100 μl eluowanych aAPC do 96-dołkowej płytki płaskodennej, aby odczytać stężenie przy użyciu absorbancji, jak w kroku 3.1.
    4. Weź pozostałe 400 μl, podziel na dwie podwielokrotności po 200 μl i dodaj do dwóch studzienek na czarną, polistyrenową 96-dołkową płytkę z płaskim dnem. Miareczkować w stosunku 1:2 w dół płytki, pobierając 100 μl roztworu i mieszając z następnym dołkiem, który zawiera 100 μl PBS w każdym dołku co najmniej cztery razy.
      UWAGA: Uśrednij wielokrotne powtórzenia pomiaru, aby zredukować szum w pomiarze.
    5. Na tej samej czarnej 96-dołkowej płytce należy wykonać wzorcową krzywą przeciwciała fluorescencyjnego używanego do barwienia, dodając je w stosunku 1:200 do studzienki z 200 μl PBS i miareczkując w dół w stosunku 1:2 dla co najmniej 12 dołków.
    6. Po tym, jak na płytce znajdą się zarówno przeciwciała aAPC, jak i przeciwciała fluorescencyjne, odczytaj płytkę za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych.
  4. Oblicz ilość białka na cząsteczkę. Określić stężenie przeciwciała, porównując wartości z krzywą standardową, na której znane jest stężenie przeciwciał, przyjmując stosunek przeciwciał barwiących do wykrytego przeciwciała 1:1. Następnie dzieląc to stężenie wykrytego przeciwciała przez stężenie cząstek określone za pomocą testu absorbancji, otrzymamy liczbę przeciwciał na cząstkę.

4. Wzbogać specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8+ za pomocą przygotowanych nanocząsteczek sztucznych komórek prezentujących antygen.

  1. Wyizoluj limfocyty T CD8 +.
    1. Poddaj zwierzęta eutanazji poprzez wystawienie na działanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Usuń śledzionę i węzły chłonne z myszy typu dzikiego C57BL/6j i umieść w roztworze PBS. Macerować narządy i eluować komórki przez sterylne sitko do komórek o średnicy 70 μm z częstym płukaniem PBS.
    3. Aby wyeliminować limfocyty T inne niż CD8+, użyj bezdotykowego zestawu do izolacji limfocytów T CD8+ i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Każdy warunek antygenowy wymaga co najmniej 3 x 106 limfocytów T CD8 +.
  2. Dodaj nanocząstki aAPC, aby związać się z limfocytami T CD8 +.
    1. Po izolacji skoncentrować do objętości 100 μl w PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA.
    2. Określ liczbę aAPC do dodania, obliczając na podstawie stosunku 1011 związanych z aAPC, załadowanych peptydami MHC-Ig na każde 106 limfocytów T CD8 +.
    3. Inkubować cząstki APC i limfocyty T CD8+ przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z ciągłym mieszaniem w sterylnej probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu.
  3. Przygotuj uzupełnione pożywki i czynnik wzrostu limfocytów T (TCGF) do elucji i hodowli limfocytów T CD8 +.
    1. W przypadku pożywek uzupełniających, uzupełnij kompletną pożywkę RPMI 1640 (z glutaminą) w 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronianu sodu, 0,4x roztwór witaminy, 92 μM 2-merkaptoetanol, 10 μM cyprofloksacyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Aby utworzyć TCGF, postępuj zgodnie z już ustalonymi protokołami, do których odwołuje się tutaj9.
      UWAGA: TCGF to autorski koktajl ludzkich cytokin odpornościowych, który jest niezbędny do zapewnienia limfocytom T dodatkowych sygnałów stymulacyjnych potrzebnych do wzrostu. TCGF można wymienić na znane cytokiny stymulujące limfocyty T, takie jak IL-2, IL-7 lub IL-15; jednak każdy z nich może odpowiednio spolaryzować odpowiedź limfocytów T. Opisany tutaj protokół nie został zoptymalizowany pod kątem tych koktajli; w związku z tym należy zapoznać się z innymi technikami w celu uzyskania stężeń i kombinacji, jeśli TCGF nie jest używany z wymienionymi przykładami10,11.
  4. Umyj i wzbogac mieszaninę limfocytów T APC i CD8+.
    1. Umyj cząstki magnetyczne aAPC zgodnie z opisem w kroku 2. Jednak najpierw przemyj za pomocą buforu PBS z 0,5% BSA i 2 mM EDTA, następnie używając pożywki uzupełnionej, a po trzecie używając pożywki uzupełnionej o zawartości 1% TCGF.
    2. Elute aAPC i wzbogacone limfocyty T CD8+ w 500 μl pożywki z dodatkiem 1% TCGF.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki na płytce z dnem 96 w kształcie litery U w 160 μl na studzienkę pożywki z dodatkiem 1% TCGF w stężeniu 2,5 x 105 limfocytów T CD8 + / ml.
    4. W przypadku izolacji za pomocą aAPC z tylko peptydowym MHC-Ig na powierzchni (brak sygnałów kostymulujących), wykonaj krok 4.5. W przypadku izolacji za pomocą aAPC z zarówno MHC-Ig załadowanym peptydami na powierzchni, jak i sygnałami kostymulującymi, przejdź do kroku 5.
  5. Dodaj cząstki magnetyczne pokryte sygnałami kostymulującymi na powierzchni do wzbogaconej frakcji i dodaj pole magnetyczne, aby skupić sygnały stymulujące na powierzchni limfocytów T.
    1. Do wzbogaconych frakcji dodać równomolową (lub większą w zależności od zastosowania - patrz rozdział o właściwościach aAPC do kontroli) przeciwciała stymulującego do liczby MHC-Ig obciążonych peptydem na cząstce.
    2. Pozwolić, aby kostymulujące cząstki magnetyczne związały się ze wzbogaconymi limfocytami T CD8 + przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    3. Dodaj pole magnetyczne, umieszczając płytkę hodowlaną między dwoma neodymowymi magnesami dyskowymi N52 o długości 1.9 cm (0.75 cala).
      UWAGA: Magnesy dyskowe N52 mają niezwykle silne pole. Należy zachować ostrożność zarówno podczas przechowywania ich z przekładkami między magnesami, ponieważ trudno je wyjąć od siebie, jak i podczas umieszczania ich na płytkach hodowlanych. Aby zminimalizować przywieranie magnesów do metalowych elementów inkubatora, umieść je w stożkowych pojemnikach styropianowych o pojemności 50 ml zarówno na dole, jak i na górze.

5. Rozszerzanie i wykrywanie limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu za pomocą przygotowanych komórek prezentujących sztuczny antygen nanocząsteczkowy.

  1. Dodać 96 płytek studzienkowych z dnem w kształcie litery U z APC i limfocytami T CD8 + do nawilżonego inkubatora o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 3 dni. W dniu 3 nakarmić komórki 80 μl na studzienkę uzupełnionej pożywki z 2% TCGF i umieścić z powrotem w inkubatorze do dnia 7.
  2. W dniu 7 zbierz stymulowane komórki do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml w celu zliczenia.
  3. Po zebraniu całego roztworu należy odwirować zebrane komórki w celu ponownego zawieszenia w 0,5 ml PBS z 0,05% azydkiem sodu i 2% FBS. Policz żywe komórki, barwiąc błękitem trypanowym i licząc na hemocytometrze.
  4. Usuń 50 000-500 000 zliczonych komórek do dwóch nowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml w celu barwienia specyficznego dla antygenu. Jedna probówka zostanie użyta do barwienia pokrewnym peptydem-MHC, a druga rurka zostanie użyta do barwienia niepokrewnego w celu określenia barwienia tła.
  5. Dodać 1 μg biotynylowanego MHC-Ig (przy użyciu techniki opisanej w kroku 2) do odpowiednich probówek pokrewnych i niepokrewnych w 100 μl PBS z 0,05% azydkiem sodu i 2% FBS ze szczurzym anty-mysim CD8a sprzężonym z allofikocyjaniną (APC), klon 53-6,7 (stosunek rozcieńczenia 1:100) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  6. Dodaj wtórną streptawidynę i żywą martwą plamę. Wypłukać nadmiar biotynylowanego MHC-Ig za pomocą PBS poprzez odwirowanie. Następnie wybarwić wszystkie próbki streptawidyną znakowaną fikoerytryną (PE) w stosunku 1:350 i stosunkiem 1:1000 żywego/martwego, możliwego do utrwalenia zielonego barwnika martwych komórek przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odczytaj wszystkie próbki na cytometrze przepływowym, aby określić swoistość i liczbę komórek specyficznych dla antygenu.
    1. Wypłukać nadmiar wtórnej i żywej/martwej plamy przez odwirowanie i ponownie zawiesić za pomocą 150 μl buforu PBS z 0,05% azydkiem sodu i 2% FBS do odczytu na cytometrze przepływowym.
  8. Określ liczbę i procent komórek specyficznych dla antygenu za pomocą oprogramowania do analizy danych.
    1. Aby określić procent komórek specyficznych dla antygenu, użyj następujących bramek w odpowiedniej kolejności: live+, limphocyty+ (rozpraszanie do przodu przez rozpraszanie boczne), CD8+ i Dimer+. Określ bramkę Dimer+, porównując barwę niepokrewną z pokrewną.
    2. Określ procent komórek specyficznych dla antygenu w próbce, odejmując procent Dimer+ pokrewnego barwienia MHC-Ig od niepokrewnego barwienia MHC-Ig.
    3. Korzystając z tego procentu komórek specyficznych dla antygenu, pomnóż go przez liczbę zliczonych komórek, uzyskując liczbę komórek specyficznych dla antygenu powstałych w wyniku wzbogacenia i ekspansji.
      UWAGA: Kompensacja będzie musiała być ustawiona na cytometrze przepływowym, ponieważ widmo pokrywa się z fluoroforami używanymi w tym panelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby pomyślnie przeprowadzić wzbogacenie i ekspansję limfocytów T swoistych dla antygenu, MHC-Ig obciążone peptydem oraz cząsteczki kostymulujące muszą zostać prawidłowo przyłączone do cząsteczki aAPC. W zależności od 3 metod przyłączania cząsteczek, przedstawiamy reprezentatywne dane dla pomyślnego wyniku procedury koniugacji (Rysunek 5a). Rzeczywiście, jeśli gęstość ligandów jest zbyt niska, nie dojdzie do efektywnej stymulacji swoistych dla antygenu limfocy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stworzyliśmy nowatorską technologię izolacji limfocytów T swoistych dla antygenu w oparciu o nanocząsteczkowe sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC). Nanocząstki aAPC mają na powierzchni MHC załadowany peptydami, który umożliwia wiązanie i aktywację limfocytów T specyficznych dla antygenu wraz z aktywacją kostymulacyjną. aAPC są również paramagnetyczne, a zatem mogą być wykorzystywane do wzbogacania rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą pola magnetycznego. Zoptymalizowaliśmy i zbadaliśmy kluczo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: zgodnie z umową licencyjną między NexImmune a Uniwersytetem Johnsa Hopkinsa, Jonathan Schneck jest uprawniony do udziału w tantiemach otrzymywanych przez uniwersytet od sprzedaży produktów opisanych w tym artykule. Był także założycielem NexImmune i posiada udziały w spółce. Pełni funkcję członka Rady Dyrektorów i naukowej rady doradczej NexImmune. Warunki tych ustaleń zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa zgodnie z jego polityką przeciwdziałania konfliktom interesów.

Podziękowania

J.W.H. dziękuje NIH Cancer Nanotechnology Training Center w Johns Hopkins Institute for NanoBioTechnology, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) oraz fundacji ARCS za wsparcie stypendialne. Prace te zostały sfinansowane dzięki wsparciu National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative oraz Coulter Foundation (JPS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DimerX I: Rekombinowany rozpuszczalny dimeryczny ludzki HLA-A2: Białko fuzyjne IgBD Biosciences551263
DimerX I: Rekombinowana rozpuszczalna mysz dimeryczna H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Rekombinowana rozpuszczalna mysz dimeryczna H-2K[b]: Białko fuzyjne IgBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Nauki Przyrodnicze28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Nauki przyrodnicze28932257
Oczyszczona ludzka mikroglobulina beta 2Bio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, nanocząstki 100 nmMicromod79-01-102
Super Mag NHS Aktywowane kulki, 0,2 i mikro; mOcean NanotechSN0200 
Mikrokulki antybiotynowe UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotynaThermoFisher20217
Środek sieciujący Sulfo-SMCC ProteoChemc1109-100mg
chlorowodorek 2-iminotiolanuSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, polistyrenCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ 1, λ 2, & λ 3 Lekki łańcuch  Klon   Czynnik chłodniczy R26-46   BD Biosciences553434
FITC Mysz Chomik antyormiański i syryjski IgG  Klon   G192-1BD Nauki biologiczne554026
B6. Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgeniczny PMEL) myszyJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 typu dzikiego) myszyJackson Laboratory000664
CD8a+ Zestaw do izolacji komórek T, myszMiltenyi130-104-075
Kolumny MSMiltenyi130-042-201
Kolumny LSMiltenyi130-042-401
Streptawidyna-Fikoerytryna, SAv-PEBiolegend405203
Magnesy dyskowe N52 o średnicy 0,75 cala K& J MagneticsDX8C-N52
APC anty-mysie przeciwciało CD8a, klon 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 488 nm ThermoFisherL-34969

Bibliografia

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149(2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572(2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Sztuczne komórki prezentujące antygenTechnika ekspansji wzbogaconejAnaliza cytometrycznaIzolacja limfocytów T CD8+MHC-Ig obciążone peptydemCzynnik wzrostu limfocytów TBiotynilowany MHC-IgPrzeciwciało sprzężone ze streptawidyną
Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.