Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58642

⸱

26 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek apoptotycznego raka piersi poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i dalsze wykrywanie przejścia komórek raka piersi niebędących komórkami macierzystymi do komórek podobnych do komórek macierzystych raka piersi po odwróceniu apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Nawrót raka jest od dawna badany przez onkologów, podczas gdy mechanizmy leżące u jego podstaw pozostają niejasne. Niedawno my i inni odkryliśmy, że zjawisko zwane odwróceniem apoptozy prowadzi do zwiększonej rakotwórczości w różnych modelach komórkowych pod wpływem różnych bodźców. Wcześniejsze badania koncentrowały się na śledzeniu tego procesu in vitro i in vivo; Jednak izolacja prawdziwych odwróconych komórek nie została jeszcze osiągnięta, co ogranicza naszą wiedzę na temat konsekwencji odwrócenia apoptozy. Tutaj wykorzystujemy barwnik Caspase-3/7 Green Detection do znakowania komórek aktywowanymi kaspazami po indukcji apoptozy. Komórki z sygnałami dodatnimi są dalej sortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu odzyskania. Badanie morfologiczne pod mikroskopią konfokalną pomaga potwierdzić stan apoptozy przed FACS. Wzrost rakotwórczości można często przypisać zwiększeniu odsetka komórek podobnych do rakowych komórek macierzystych (CSC). Ponadto, biorąc pod uwagę niejednorodność raka piersi, identyfikacja pochodzenia tych komórek podobnych do CSC miałaby kluczowe znaczenie w leczeniu raka. W ten sposób przygotowujemy komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi przed wywołaniem apoptozy, wyizolowaniem komórek aktywowanych kaspazą i przeprowadzeniem procedury odwrócenia apoptozy. Analiza cytometrii przepływowej ujawnia, że komórki podobne do CSC piersi pojawiają się ponownie w odwróconej grupie, co wskazuje, że komórki podobne do CSC piersi są tranzycowane z komórek raka piersi innych niż macierzysty podczas odwrócenia apoptozy. Podsumowując, protokół ten obejmuje izolację apoptotycznych komórek raka piersi i wykrywanie zmian procentowego CSC w odwróconych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Rak jest główną przyczyną zgonów, powodując duże obciążenie dla krajów na całym świecie1. Rak piersi plasuje się wysoko zarówno pod względem zachorowalności, jak i śmiertelności u kobiet wśród wszystkich rodzajów raka1. Ze względu na niejednorodność nowotworów, w chemioterapii zwykle stosuje się kombinację leków w celu osiągnięcia śmierci komórek rakowych2,3,4. Ponieważ jednak popularne leki chemioterapeutyczne często celują w DNA5,6, synteza białek7,8 i/lub dynamika mikrotubul9, szybko rosnące komórki są najbardziej dotknięte, podczas gdy komórki w stanie spoczynku, takie jak rakowe komórki macierzyste (CSC), są zwykle mniej dotknięte10. W związku z tym CSC mają większe szanse na przeżycie po leczeniu, które później prowadzi do oporności na leki i nawrotu raka10,11. W związku z tym eliminacja CSC stała się ważnym tematem w leczeniu nowotworów i konieczne jest badanie pochodzenia CSC.

W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono więcej badań nad zjawiskiem odwrócenia apoptozy12,13,14,15,16,17,18,19. Przed pojawieniem się tej koncepcji powszechnie akceptowano, że komórki nieodwracalnie ulegną apoptozie po aktywacji kaspazy. Kaspazy to rodzina enzymów białkowych, które odgrywają kluczową rolę w etapach inicjacji i realizacji apoptozy, w tym w tworzeniu kompleksu apoptotycznego i rozszczepianiu dalszych substratów20. Aktywacja kaspaz egzekucyjnych, takich jak kaspaza 3 lub kaspaza 7, została uznana za "punkt bez powrotu" dla apoptozy21. Jednak naukowcy zaobserwowali niedawno, że odwrócenie apoptozy następuje zarówno in vitro, jak i in vivo, podczas którego komórki mogą odzyskać sprawność po apoptozie nawet po aktywacji kaspazy12,13,14,15,16,17,18,19. Co więcej, agresywne cechy, takie jak wyższa odporność na oryginalny induktor apoptozy i większa inwazyjność, są wykrywane w odwróconych komórkach nowotworowych15. W związku z tym zaproponowano, że odsetek komórek podobnych do CSC byłby wyższy w odwróconej populacji w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co ostatecznie przyczyniłoby się do bardziej złośliwych cech po odwróceniu apoptozy18.

Poprzednio podjęto wiele wysiłków, aby śledzić odwrócenie apoptozy in vitro, a co ważniejsze, in vivo, co bardzo pomaga w potwierdzeniu uniwersalności tego procesu16,17,19. Brakuje jednak ogólnoustrojowych badań nad konsekwencjami odwróconych komórek ze względu na niezadowalającą izolację komórek, które rzeczywiście przeszły odwrócenie apoptozy. Istnieje potrzeba pozyskania czystych komórek apoptotycznych i odzyskania ich do dalszych badań. W związku z tym używamy tradycyjnie dobrze akceptowanego markera aktywacji kaspazy kata jako markera "punktu bez powrotu"21 dla apoptozy i wykorzystujemy sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do rozróżniania komórek aktywowanych kaspazą wybarwionych barwnikiem kaspazy-3/7 Green Detection. Barwnik jest kowalencyjnie połączony z krótką sekwencją aminokwasów, DEVD, która może być rozpoznana i rozszczepiona przez aktywne kaspazy 3/7. Rozszczepienie pomaga uwolnić barwnik, który przemieszcza się z cytozolu do jądra, gdzie wiąże się z DNA i emituje silną fluorescencję. Ta procedura pozwala uniknąć użycia masowej populacji komórek, w której niektóre komórki mogły nie zostać poddane apoptozie.

CSC lub komórki inicjujące nowotwór zostały zidentyfikowane w wielu guzach litych przy użyciu jednego lub kombinacji kilku markerów powierzchniowych, a bardzo niewiele tych komórek jest wystarczających do powstania guzów u myszy z niedoborem odporności22,23,24,25,26,27. Kombinacja CD44 i CD24 była powszechnie stosowana w badaniach CSC piersi, a komórki CD44+/CD24- zostały zdefiniowane jako CSCs piersi26,27,28,29,30. Ostatnio przeprowadziliśmy serię eksperymentów, aby potwierdzić proponowany związek między odwróceniem apoptozy a CSC i wykazać, że odwrócone komórki raka piersi uzyskały zwiększoną zdolność do tworzenia guza in vitro i in vivo z podwyższonym odsetkiem komórek z markerami CSC18. Chociaż nie mogliśmy wykluczyć możliwości, że CSC piersi przetrwają lepiej, a tym samym wzbogacą się po odwróceniu apoptozy, co ważne, gdy wyizolujemy komórki raka innego niż macierzyste i poddamy je odwróceniu apoptozy, CSC pojawi się w populacji komórek pierwotnie niebędących komórkami raka macierzystego, co sugeruje, że komórki niebędące komórkami raka macierzystego mogą przyczyniać się do wzrostu odsetka CSC podczas odwrócenia apoptozy.

Ten artykuł ma na celu pokazanie przejścia od komórek niemacierzystych raka piersi do komórek podobnych do komórek CSC piersi po odwróceniu apoptozy i wykrycie tego przejścia za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi są początkowo przygotowywane przez wyizolowanie komórek raka piersi CD44-/CD24+ za pomocą FACS. Następnie indukowana jest apoptoza, która jest potwierdzana zmianami morfologicznymi pod mikroskopem. Następnie komórki apoptotyczne pozytywnie znakowane barwnikiem Caspase 3/7 Green Detection są izolowane przez FACS i dalej hodowane przy braku induktorów apoptozy w celu odwrócenia apoptozy. Odwrócone komórki są następnie barwione markerami CSC po 7 dniach od wyzdrowienia w celu analizy cytometrii przepływowej. Komórki z markerami CD44 + / CD24- pojawiają się ponownie w odwróconej populacji, co sugeruje, że przejście z komórek raka niemacierzystego do komórek podobnych do CSC nastąpiło podczas odwrócenia apoptozy.

Odwrócenie apoptozy zaobserwowano w wielu liniach komórek rakowych, jak również w normalnych komórkach pierwotnych leczonych różnymi bodźcami apoptozy in vitro12,13. Proces ten został również prześledzony w modelu Drosophila in vivo16,17,19. Wiele informacji na temat mechanizmu leżącego u podstaw nawrotu choroby nowotworowej w różnych modelach choroby nowotworowej oraz pochodzenia CSC można uzyskać dzięki zastosowaniu techniki opisanej w tym manuskrypcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek raka piersi niepochodzących z macierzystego

  1. Hodowla komórek MCF-7 i MDA-MB-231 w 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) w naczyniu o średnicy 100 mm. Kultura T47D w 10 ml pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1% v/v penicyliny-streptomycyny (PS) w naczyniu o średnicy 100 mm. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 / 95% powietrzem.
    nuta: Czerwień fenolowa wpływa na wykrywanie oparte na fluorescencji, ale ma również potencjalny wpływ na wzrost komórek raka piersi ze względu na swoje działanie podobne do estrogenów31. Na przykład czerwień fenolowa może stymulować receptor progesteronu i wzrost komórek MCF-731. Może również stymulować wzrost komórek T47D31.
  2. Umyj komórki dwukrotnie 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do MCF-7 i MDA-MB-231 lub 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do komórek T47D.
    nuta: Stężenie trypsyny-EDTA potrzebne do separacji komórek między różnymi typami komórek raka piersi jest różne, podczas gdy niewłaściwe stężenie może wpływać na wzorzec ekspresji niektórych markerów powierzchni komórek, takich jak CD44 i CD2432.
  3. Hodować naczynia przez 5 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza. Często sprawdzaj oderwanie komórek pod mikroskopem, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu komórek przez trypsynę-EDTA.
  4. Gdy ponad 90% komórek odłączy się, dodaj 5 ml gotowej pożywki RPMI do naczynia i kilkakrotnie pipetuj ją po powierzchni warstwy komórek.
  5. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 5 min.
    nuta: Zwykle około 6 x 106 komórek można uzyskać z szalki o średnicy 100 mm, gdy konfluencja osiągnie 70%.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 106 komórkach/100 μl buforu FACS (PBS zawierający 0,5% BSA i 0,1% azydku sodu) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  7. Podziel komórki na kilka probówek. W przypadku komórek MCF-7 podziel komórki na 4 probówki: dwie do kontroli izotypu, jedną do pojedynczego barwienia CD24 jako kontroli pozytywnej CD24 i jedną do podwójnego barwienia.
  8. W przypadku komórek T47D podziel komórki na 3 probówki: dwie do kontroli izotypu i jedną do podwójnego barwienia.
  9. W przypadku komórek MDA-MB-231 podziel komórki na 4 probówki: dwie do kontroli izotypu, jedną do pojedynczego barwienia CD44 jako kontroli pozytywnej CD44 i jedną do podwójnego barwienia.
  10. Ponownie odwirować probówki w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant, a następnie dodać blok Fc rozcieńczony w stosunku 1:50 do buforu FACS.
  11. Próbki inkubować na lodzie przez 20 minut w ciemności, a następnie odwirować w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad.
  12. Dodać sprzężone z fluorochromem przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim CD44 (PerCP-Cy5.5) i CD24 (PE) w rozcieńczeniach 1:40 i 1:10 (w buforze FACS) w podwójnych grupach barwienia. W przypadku kontroli pozytywnych dodaj odpowiednio CD44 (PerCP-Cy5.5) do MDA-MB-231 i dodaj CD24 (PE) do komórek MCF-7 w tym samym stężeniu.
    nuta: Kombinacja CD44 i C24 była powszechnie stosowana w badaniu CSC piersi26,27,28,29,30.
  13. Dla grup kontrolnych izotypu dodać PerCP-Cy5.5 IgG2b myszy, κ w rozcieńczeniu 1:40 jako kontrolę izotypu dla przeciwciał CD44 i PE IgG2a, κ w rozcieńczeniu 1:10 jako kontrolę izotypu dla przeciwciał CD24 w 10 6 komórkach/100 μL.
    nuta: Kontrole izotypu dla przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania są zalecane jako kontrole negatywne33.
  14. Inkubować próbki (z etapów 1.12 i 1.13) w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut. Wirować przy 300 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  15. Przemyć osad dwukrotnie 500 μl PBS i odwirować w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 5 minut.
  16. Ponownie zawiesić granulat w 0,5 ml PBS i przefiltrować przez nylonową siatkę 40 μm przed uruchomieniem na aktywowanym fluorescencją sortowniku komórek.
  17. W celu bramkowania i kompensacji wybarwić komórki MCF-7 przeciwciałami anty-CD24 sprzężonymi z PE i wybarwić komórki MDA-MB-231 przeciwciałami anty-CD44 sprzężonymi z PerCP-Cy5.5 jako kontrolami pozytywnymi. Użyj komórek zabarwionych kontrolkami izotypu jako kontroli negatywnych (Rysunek 1).
  18. Zebrać komórki za pomocą markerów CD44-/CD24+ w probówkach z polistyrenu okrągłodennego o wymiarach 12 x 75 mm zawierających 1 ml pożywki zbiorczej (pożywka RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej uzupełniona 20% inaktywowanym termicznie FBS i 2% v/v PS). Odwirować probówki o sile 300 x g i temperaturze pokojowej przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
    nuta: Komórki podobne do CSC w komórkach raka piersi są zdefiniowane jako komórki CD44+/CD24-26,27,28,29,30, a komórki raka piersi niebędące komórkami macierzystymi są zdefiniowane jako komórki CD44-/CD24+18 (Rysunek 1).
  19. Posortowane komórki raka piersi niepochodzące z raka piersi umieścić na płytce zawierającej świeżą pożywkę do dalszej hodowli w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 .

2. Indukcja i detekcja apoptozy

  1. Przygotuj 1 mM staurosporine12,34 w DMSO. W przypadku grupy leczonej MCF-7 dodać 25 μl 1 mM staurosporyny do gotowej pożywki komórek MCF-7, aby uzupełnić do 10 ml końcowej objętości (2,5 μM staurosporyny) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, przemyć komórki jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodaj 10 ml pożywki z 2,5 μM staurosporyną do komórek MCF-7 przez 6 godzin, aby wywołać apoptozę, gdy gęstość komórek osiągnie 70% zbieżności.
  3. Przygotuj 1 mM paclitaxel35,36 w DMSO. W przypadku leczonej grupy T47D dodać 12,5 μl 1 mM paklitakselu do gotowej pożywki komórek T47D, aby uzupełnić do końcowej objętości 10 ml (5 μM paklitakselu) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.
  4. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć komórki jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodaj 10 ml pożywki z 5 μM paklitakselem do komórek T47D przez 10 godzin, aby wywołać apoptozę, gdy gęstość komórek osiągnie 70% konfluencji.
    nuta: Czas indukcji i stężenie induktorów indukujących apoptozę powinny być optymalizowane za każdym razem, gdy nowa linia komórkowa jest używana po raz pierwszy.
  5. W przypadku grupy MCF-7 poddanej działaniu rozpuszczalnika dodać 25 μl sterylnego dimetylosulfotlenku (DMSO) do gotowej pożywki komórek MCF-7, aby uzyskać końcową objętość 10 ml (tj. 0,25% v/v DMSO) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.
  6. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek MCF-7 poddanych działaniu rozpuszczalnika, przemyć jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodaj 10 ml pożywki z 0,25% v/v DMSO przez 6 godzin jako kontrolę rozpuszczalnika dla STS.
  7. W przypadku grupy T47D poddanej działaniu rozpuszczalnika dodać 5 μl sterylnego DMSO do gotowej pożywki komórek T47D, aby uzyskać do 10 ml końcowej objętości (tj. 0,05% v/v DMSO) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować, aby równomiernie wymieszać zawartość.
  8. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek T47D poddanych działaniu rozpuszczalnika, przemyć jednorazowo 2 ml PBS. Następnie dodać 10 ml pożywki z 0,05% v/v DMSO przez 10 godzin jako kontrolę rozpuszczalnika dla paklitakselu.
  9. Aby zaobserwować zmiany morfologiczne leczonych komórek, wybarwić komórki 50 nM Mitotracker Red CMXRos i 250 ng/ml Hoechst 33342 i inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 / 95% powietrza. Obserwuj typową morfologię komórek apoptotycznych pod 60-krotnym konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym (Ryc. 2).
    nuta: Typowa morfologia apoptozy obejmuje kurczenie się komórek, pęcherzenie błony, fragmentację mitochondriów i kondensację jądrową, ale z nienaruszoną błoną komórkową12,13,14,15,18,37.

3. Izolacja komórek apoptotycznych i procedura odwrócenia apoptozy

  1. Zabarwić zarówno komórki MCF-7 lub T47D potraktowane induktorem apoptozy, jak i rozpuszczalnikiem, barwnikiem 3 μM kaspazy-3/7 Zielona detekcja o stężeniu komórek 106/ml w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza.
  2. Przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 40 μm przed uruchomieniem na sortowniku w celu sortowania.
  3. Dla celów bramkowania, najpierw przebramuj główną populację (R1) i wyklucz szczątki, wykreślając wykres w kropkach z rozproszeniem do przodu i rozproszeniem bocznym (Rysunek 3).
  4. Użyj nieleczonych komórek bez dodawania zielonego barwnika wykrywającego kaspazę-3/7 jako kontroli ujemnej, aby zabramować region ujemny (R2) (Rysunek 3A).
  5. Użyj komórek potraktowanych staurosporyną12,18,34 przez 24 godziny i wybarwionych barwnikiem jako kontroli pozytywnej, aby zabramować region dodatni (R3) (Rysunek 3B).
  6. Zebrać komórki dodatnie (R3) z grup traktowanych induktorem w probówkach z polistyrenu okrągłodennego o wymiarach 12 x 75 mm zawierających 1 ml pożywki zbiorczej (takiej samej jak pożywka w kroku 1.18) (Rysunki 3 C-3D). Odwirować probówki o sile 300 x g i RT przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  7. Zebrać komórki ujemne (R2) z grup traktowanych rozpuszczalnikiem w probówkach z polistyrenu okrągłodennego 12 × 75 mm z 1 ml pożywki zbiorczej, jak w kroku 3.6 (Rysunki 3 E-3F).
    nuta: Niewielka część komórek (np. 10 000 komórek) może zostać zebrana i ponownie uruchomiona w sortowniku w celu sprawdzenia wzoru markera aktywnych kaspaz. Jeśli ponad 90% posortowanych komórek potraktowanych rozpuszczalnikiem znajduje się w regionie kaspazo-ujemnym lub ponad 90% posortowanych komórek potraktowanych induktorem jest pokazanych w regionie kaspazo-dodatnim, uważa się, że te zebrane komórki są stosunkowo czyste (ryc. 3C-3F). W przeciwnym razie region sortowania i/lub sorter powinny zostać zresetowane.
  8. Ponownie zawiesić posortowane komórki w świeżej pożywce do zbierania i wysiać je na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i hodowli w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza przez 7 dni w celu odwrócenia apoptozy.

4. Potwierdzenie apoptozy w komórkach aktywowanych kaspazą

  1. Wymieszać 10 mM HEPES, 140 mM NaCl i 2,5 mM CaCl2 w celu przygotowania buforu wiążącego anektynę (pH 7,4). Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C i unikać wystawiania buforu na działanie światła.
  2. Przygotować 100 μg/ml roztworu roboczego jodku propidyny (PI), rozcieńczając 5 μl roztworu podstawowego PI o stężeniu 1 mg/ml w 45 μl buforu wiążącego aneksynę. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i unikać wystawiania roztworu na działanie światła.
    nuta: PI jest potencjalnym mutagenem i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  3. Przygotować komórki poddane działaniu induktora jak w krokach 2.1-2.5.
  4. Zbierz komórki MCF-7 lub T47D potraktowane induktorem, pipetując pożywkę przez warstwę komórkową 3-5 razy, aby odłączyć komórki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Odwirować przy 300 x g i RT przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  6. Ponownie zawiesić komórki z gotowym podłożem o stężeniu komórek 106/ml w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wybarwić komórki 3 μM kaspazą 3/7 Green Detection barwnikiem w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Odwirować przy 300 x g i RT przez 5 minut. Odrzucić supernatanty.
  8. Przemyć komórki 1 ml lodowatego PBS i odwirować w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatanty.
  9. Zawiesić komórki w 100 μl buforu wiążącego anektynę, dodając 5 μl koniugatu aneksyny V i 1 μl roztworu roboczego 100 μg/ml PI na każde 100 μl zawiesiny komórkowej i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    nuta: Aneksyna V i PI są powszechnie używane razem do oznaczania komórek apoptotycznych w cytometrii przepływowej38,39,40.
  10. Dodać 400 μl buforu wiążącego aneksynę, delikatnie wymieszać. Utrzymuj próbki na lodzie przed uruchomieniem na cytometrze przepływowym.

5. Pomiar komórek CSC piersi za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zbierz odwrócony MCF-7 w obu grupach traktowanych induktorem lub rozpuszczalnikiem z 0,05% trypsyną-EDTA. Zbierz komórki T47D zarówno w grupach traktowanych induktorem, jak i rozpuszczalnikiem lub z 0,25% trypsyną-EDTA, jak w krokach od 1,2 do 1,5.
  2. Wybarwić komórki przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochromem przeciwko ludzkim CD44 (PerCP-Cy5.5) i CD24 (PE) jak w kroku 1.12. W międzyczasie przygotuj kontrolki izotypu, jak w kroku 1.13.
  3. Uruchom komórki na cytometrze przepływowym i wykryj procent komórek z markerami CD44+/CD24-.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zaobserwować przejście z nieplemiennych komórek raka piersi w komórki raka piersi o charakterystyce CSC, konieczne było przeprowadzenie wstępnego sortowania komórek raka piersi CD44-/CD24+. W przypadku linii komórkowej MCF-7, w której w populacji wyjściowej znajduje się około 0,15% komórek z markerami CSC (Rycina 1), krok ten pomógł wykluczyć możliwość wzbogacenia frakcji CSC podczas odwracania procesu apoptozy. Z kolei w przypadku b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje bezpośredni i jasny sposób wykrywania przejścia komórek niemacierzystych raka piersi w komórki podobne do CSC piersi w wyniku odwrócenia apoptozy. Potwierdzenie właściwości CSC tych odwróconych komórek może być wspomagane przez zastosowanie testu tworzenia mammosfery invitro i przeszczepu ksenoprzeszczepu in vivo u myszy z niedoborem odporności 18,24,26,27,42,43,44,45

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundusz Innowacyjnych Technologii Komisji Technologii Innowacyjnych: Wsparcie Finansowe od Państwowego Kluczowego Laboratorium Agrobiotechnologii (CUHK), Funduszu Badań Biomedycznych Lo Kwee-Seong oraz Fundacji Lee Hysana. Y.X. był wspierany przez stypendium podyplomowe z CUHK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MCF-7Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)HTB-22
MDA-MB-231Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)HTB-26
T47DKolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)HTB-133
odczynnik
0,05% trypsyna-EDTAInvitrogen25300054
0,25% trypsyna-EDTAInvitrogen25200072
Alexa Fluor 680 koniugat aneksyny VInvitrogenA35109
albumina surowicy bydlęcejUSB9048-46-8
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC-5080
CellEvent kaspaza-3/7 zielony barwnik fluorescencyjnyInvitrogenC10423
dimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650
Fc blokMiltenyi Biotec130-059-901
płodowa surowica bydlęcaInvitrogen16000044inaktywowany termicznie
HEPESUSB16926
Hoechst 33342InvitrogenH3570
L-glutaminaInvitrogen25030081
Mitotracker Red CMXRosInvitrogenM7512
przeciwko ludzkiemu CD24BD Biosciences555428PE Klon: ML5
Partia: 5049759
RRID: AB_395822
przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD44BD Biosciences560531PERCP-CY5.5 Klon: G44-26
Partia: 7230770
RRID:AB_1727485
NaClSigma-Aldrich31434
paklitakselSigma-AldrichT7402
PE Mysz IgG2a, κ Kontrola izotypuBD Biosciences554648klon: G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15070-063
PerCP-Cy5.5 Mysz IgG2b, κ Kontrola izotypuBD Biosciences558304klon: 27-35
RRID:
fizjologiczna buforowana fosforanemThermo Fisher Scientific21600010
jodek propidiumInvitrogenP1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 podłożeInvitrogen11835055fenol
azydek soduSigma-AldrichS2002
staurosporynaSigma-AldrichS4400
Equipment
100 mm naczynie hodowlaneGreiner Bio-One664160
12-dołkowe płytki do hodowli tkankowychThermo Fisher Scientific150628
Cell Sitko 40 μ m siatka nylonowaBD Biosciences08-771-1
Pakiet oprogramowania FACSuite v1.0BD Biosciences651360
FACSVerseBD Biosciences651155
Mikroskop konfokalny FluoView FV1000OlympusIX8160X obiektyw
FV10-ASW Przeglądarka Ver.4.2b
12 &czasy; Rurki 75 mmBD Biosciences352003
Sorter S3eBio-Rad1451006
Przeciwciała monoklonalne sól AB_647257 bez czerwieni Polistyren okrągłodenny Olympus

Bibliografia

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015(2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357(2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685(2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki macierzyste raka piersicytometria przepływowasortowanie komórek aktywowane fluorescencjąmikroskopia konfokalnadetekcja kaspazy-3/7markery CD44 i CD24nieplemienne komórki nowotworoweanaliza tumorigeniczności
Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.