Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.
Artykuł metodologiczny
Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Syntetyczne dsRNA, używane do wywoływania interferencji RNA, mogą mieć zależne od dawki efekty fenotypowe. Efekty te są trudne do zdefiniowania, jeśli dsRNA są dostarczane przy użyciu metody nieilościowej. Dokładne dostarczenie znanych ilości kwasów nukleinowych lub innych substancji chemicznych ma kluczowe znaczenie dla zmierzenia skuteczności badanego związku i umożliwienia wiarygodnego porównania między związkami.
Tutaj zapewniamy powtarzalny, ilościowy protokół mikroiniekcji, który zapewnia dokładne dostarczanie określonych dawek dsRNA, zmniejszając śmiertelność zwykle wywoływaną przez urazy spowodowane wstrzyknięciem. Modyfikacje te obejmują dodanie rodaminy B, igły do wstrzykiwań z podziałką oraz ulepszonej metody odzyskiwania zapożyczonej od Isoe i Collinsa. Metoda ta pozwala na obliczenie reakcji na dawkę i ułatwia porównania między związkami. Wersje tej metody zostały z powodzeniem zastosowane na trzech rodzajach komarów, a także na muchach domowych, w celu oceny zmniejszenia płodności wynikającego z wyciszenia genów transkryptów rybosomalnego RNA.
Ten protokół dostarcza strategii mających na celu zmniejszenie kilku wyzwań związanych z mikroiniekcją małych owadów. Mechaniczne dostarczanie dsRNA, któremu towarzyszy weryfikacja wizualna, identyfikacja skutecznych miejsc dostarczania oraz uwzględnienie okresu rekonwalescencji po wstrzyknięciu, zapewnia dokładne dawkowanie i niską śmiertelność z powodu urazów. W protokole tym opisano również test biologiczny składania jaj w celu jednolitego określenia wpływu na płodność.
Wprowadzenie
Dostarczanie małych biomolekuł, takich jak kwasy nukleinowe, dorosłym muchówkom okazało się wyzwaniem zarówno u Culicidae, jak i Muscidae. Doniesiono, że doustne wychwytywanie dsRNA powoduje bezpłodność (w przypadku celowania w geny ulegające ekspresji wyłącznie w jądrach dorosłych) i śmiertelność (w przypadku celowania w SNF7 i koaktywator receptora steroidowego) u larw Aedes aegypti1,2. Śmiertelność zaobserwowano również w przypadku celowania w HSP70 u larw Musca domestica3. Takie efekty fenotypowe nie wystąpiły jednak po podaniu dsRNA dorosłym Ae. aegypti w mączkach cukrowych4,5.
Mikroiniekcja została użyta do obejścia jelita środkowego podczas wprowadzania patogenów lub kwasów nukleinowych, wywołując w ten sposób reakcję ogólnoustrojową5,6,7,8,9,10. Istnieje kilka technik mikroiniekcji, obejmujących różne urządzenia, od aparatów własnej produkcji, które wymagają wizualnego pomiaru objętości wtrysku, po wtryskiwacze sterowane mikroprocesorem, które pozwalają na automatyczne dostarczanie objętości już od 2,3 nL5,9,10,11. Interferencja RNA (RNAi) wyzwala ukierunkowanie na rybosomalne mRNA, zakłóca rozwój jajników u stawonogów tak różnorodnych, jak kleszcz bydlęcy Rhipicephalus microplus, komary Aedes aegypti i Culex pipiens oraz mucha domowa Musca domestica5,9,12,13. W tych badaniach monitorowanie przerwania składania jaj było niezbędne do określenia skuteczności inokulantu, ponieważ fenotyp może objawiać się terminacją lub zmniejszeniem potomstwa. Jest to forma wielopokoleniowego śmiertelnego fenotypu, który jest krytycznym i pożądanym efektem w wielu nietradycyjnych metodach kontroli biologicznej, takich jak wprowadzenie samców zakażonych Wolbachią (niezgodność płciowa) i bezpłodność wywołana przez RNAi5,9,14. Śledzenie zarówno śmiertelności, jak i płodności jest niezbędne do scharakteryzowania i rozwoju wysoce specyficznych czynników bioracjonalnych (naturalnie występujących patogenów i/lub naturalnych pochodnych)15.
Ten protokół przedstawia szczegółowe techniki mikroiniekcji zarówno dla dorosłych komarów, jak i much domowych; proces, który często nie jest dobrze opisany w literaturze. Ponadto opisano metodologie testów biologicznych składania jaj w celu odpowiedniej oceny wpływu dsRNA na dorosłe muchówki. Protokoły te zostały opracowane specjalnie dla Aedes aegypti i Musca domestica, ale mogą być modyfikowane dla innych gatunków.
Protokół
1. Przygotowanie owadów
- Znieczulenie komarów należy poprzez schładzanie ich w temperaturze 4 °C przez kilka godzin lub przez 2 minuty ekspozycji na CO2 , a następnie utrzymywanie w temperaturze 4 °C przed wstrzyknięciem. Zimne znieczulenie muchy w temperaturze 4 °C 2\u20123 h przed wstrzyknięciami. Upewnij się, że komary i muchy są kojarzone, jeśli składanie jaj jest zmienną odpowiedzi.
UWAGA: Metoda znieczulenia komarów zależy od gatunku i szczepu, np. Culex znacznie szybciej regeneruje się po znieczuleniu na zimno niż Aedes aegypti i dlatego preferowany jest knockdown CO2. - Na lodzie ostrożnie ułóż komary lub muchy za pomocą miękkich kleszczy, aby ułożyć je brzusznie odsłonięte na szkiełkach mikroskopowych w odległości ~0,5 cm od siebie. Standardowe zjeżdżalnie mogą pomieścić dwa rzędy po 6 komarów każdy lub 6–7 much domowych. Pozostaw 1–1.5 cm wolnej przestrzeni po lewej lub prawej stronie zjeżdżalni od komarów lub much, aby ułatwić obsługę zjeżdżalni.
- Szkiełka z inscenizowanymi owadami należy przechowywać w temperaturze 4 °C na dużych szalkach Petriego do momentu, gdy będą gotowe do wstrzyknięcia.
UWAGA: Wywiercenie otworu w pokrywie szalki Petriego pomoże zapobiec przeszkadzaniu owadom przez przemieszczanie się powietrza podczas zamykania. Umieszczenie szkiełek na kilku szklanych kapilarnach przymocowanych do dna naczynia ułatwi wyjęcie z szalki Petriego.
2. Iniekcja owadów
- Przygotuj dsRNA zgodnie z opisem Estep i wsp.5 oraz Sanscrainte et al.9. Jeśli dsRNA jest wolne od zanieczyszczeń, można je określić ilościowo za pomocą spektrofotometru do pomiaru absorbancji przy 260 nm i obliczając stężenie RNA w μg/ml jako współczynnik rozcieńczenia A260 × × 40.
- Ustaw mikroskop preparacyjny i mikrowstrzykiwacz nad stołem chłodzącym lub płytkim wiadrem z lodem, aby wykonywać zastrzyki na znieczulone zimnem komary i muchy (patrz krok 1.1–1.3 i Rysunek 1).
- Pociągnij szklane kapilary do cienkiej końcówki za pomocą ściągacza igłowego (ustawienia: grzałka = 15 jednostek, elektrozawór = 4 A).
UWAGA: Szczegółowe informacje o producencie znajdują się w tabeli materiałów. - Umieść igłę kapilarną w mikrowstrzykiwaczu zgodnie z instrukcjami producenta i złamij końcówkę igły, ściskając ją kleszczami, aby uzyskać ostry koniec.
UWAGA: Sugerowane rozmiary otworów igieł to ~150 μm dla komarów i ~250 μm dla muchy domowej. - Ustaw mikrowtryskiwacz dla żądanej objętości podawania. Ruch łąkotki z ~50 nL podwielokrotności jest łatwo zauważalny i zalecany do mikroiniekcji komarów. Jeśli to możliwe, włącz ustawienia szybkiego wstrzykiwania. Wypłucz igłę, napełniając i usuwając wodę wolną od nukleaz 3 razy.
- Przygotuj roztwory do wstrzykiwań o takim stężeniu, aby 100\u2012150 nL zapewniało pożądaną dawkę dla komarów, a 500 nL zapewniało pożądaną dawkę dla much domowych.
UWAGA: Sugerowane dawki początkowe: 1 μg dla każdego komara i 5 μg dla każdej muchy domowej5,9. - Opcjonalnie w przypadku komarów dodać rodaminę B (aby pomóc w wizualizacji) do roztworów w końcowym stężeniu 3,0 μg/ml.
UWAGA: Barwnik będzie wyraźnie widoczny po różowym kolorze po wstrzyknięciu przez prawie przezroczysty naskórek na powierzchni brzusznej na skrzyżowaniu brzucha i klatki piersiowej. - Pobrać pipetą 3–4 μl roztworu, aby wstrzyknąć na czystą powierzchnię (taką jak kawałek filmu parafinowego) i wciągnąć do szklanej igły bez zasysania powietrza. Kilkakrotnie nacisnąć przycisk wstrzykiwania, aż płyn zacznie dozować z igły, a następnie delikatnie zetrzeć kropelki delikatną wycieraczką zadaniową.
UWAGA: Podczas gdy niektóre modele mikrowstrzykiwaczy wymagają napełniania strzykawki, wtryskiwacz, o którym mowa w Tabeli materiałów, nie wymaga. - Za pomocą bardzo cienkiego markera punktowego narysuj znaki krzyżyka w odległości ~1 mm od siebie, zaczynając od płynnego menisku do trzonka igły. Pomoże to w wizualizacji ruchu łąkotki i zapewni, że roztwór dostanie się do komara podczas wstrzykiwania.
- Umieść szkiełko z komarami lub muchami (przygotowane w krokach 1.2–1.3) pod igłą na stole chłodzącym lub lodzie (Rysunek 1). Upewnij się, że pole widzenia w mikroskopie jest wystarczająco szerokie, aby zobaczyć menisk roztworu w igle.
- W przypadku komarów wyrównaj igłę ze środkową jedną trzecią mesokatepisternum (Rysunek 2A) i opierając komara o igłę za pomocą kleszczy umieszczonych po przeciwnej stronie, delikatnie nakłuj naskórek końcówką igły za pomocą mikrometru do mikroiniektora.
- W przypadku much domowych wyrównaj igłę z mezopleuronem (Ryc. 2B) i, opierając muchę o igłę, delikatnie nakłuj naskórek końcówką igły.
- Delikatnie wsuń igłę w ciało komara lub muchy, aż końcówka przejdzie przez linię środkową.
UWAGA: Zbyt płytkie włożenie igły często powoduje wyciek wstrzykniętego płynu z owada (patrz krok 2.15). - Obserwując ruch płynnej menisku w igle, należy naciskać przycisk wstrzykiwania, aż do wstrzyknięcia żądanej ilości płynu. W przypadku komarów, jeśli ustawiono podwielokrotności 50,6 nL, naciśnij 2X, aby uzyskać ~100 nL, lub 3X, aby uzyskać ~150 nL. W przypadku much domowych należy naciskać przycisk wstrzykiwania, aż zostanie wstrzyknięte ~500 nL (tj. przy porcjach 69 nL naciśnij 7X, aby uzyskać 483 nL).
- Jeśli łąkotka się nie porusza, powoli zsuń komara lub odleć z igły, obserwując ruch łąkotki. Jeśli część wstrzykniętego roztworu wydostaje się z naskórka po usunięciu igły lub jeśli łąkotka nie porusza się, należy wyrzucić owada, ponieważ wstrzyknięcie nie powiodło się.
- Przenieś pomyślnie wstrzyknięte komary w grupach po 10-15 lub muchy domowe w grupach po 5, aby usunąć kubki o pojemności 3,5 uncji. Przykryj tiulem lub siatką i odzyskaj w temperaturze pokojowej.
- Po wyzdrowieniu komarów i much (1 – 2 godziny) odwróć każdą miseczkę na wacik nasączony 10% roztworem sacharozy.
UWAGA: Odwrócenie kubka na wierzchu bawełny sacharozowej pomaga w przetrwaniu, zapewniając łatwiejszy dostęp do posiłku z cukrem10. - Przepłukać igłę jak w kroku 2.5 pomiędzy roztworami do wstrzykiwań. Po zakończeniu wstrzykiwania zużyte igły należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty.
3. Test biologiczny śmiertelności i składania jaj u Aedes aegypti
- Przez trzy dni po wstrzyknięciu należy nadal podawać komarom 10% sacharozy i rejestrować liczbę widocznie martwych komarów.
- Napełnij ≤12-calową sztuczną membranę (taką jak osłonka kiełbasy kolagenowej) świeżą krwią (tj. bydlęcą w przypadku Aedes aegypti) i podgrzej do 60 °C w gorącej kąpieli wodnej.
- Krótko osusz membranę, zwijając się na ręczniku papierowym i połóż na tiulowych nasadkach przezroczystych miseczek o pojemności 3.5 uncji. Aby usprawnić karmienie, po podgrzaniu jako fagostymulantu należy nakłuć krew 1 mM ATP lub obsłużyć podgrzaną czystymi, gołymi rękami, aby pozostawić ludzkie substancje lotne na powierzchni osłonki.
- Po podaniu krwi umieść wacik nasączony 10% sacharozą na wierzchu miseczek podtrzymujących i pozwól komarom odpocząć przez ~ 24 godziny przed przeniesieniem do miseczek do składania jaj .
- Zbuduj kubki do składania jaj, wypełniając przezroczyste kubki do testów biologicznych o pojemności 3,5 uncji ~ 30 ml dejonizowanegoH 2O i umieszczając kawałek papieru do kiełkowania nasion (~ 4 cm szerokości i 5 cm długości z grzbietami biegnącymi pionowo) na dnie kubka i z boku (Rysunek 3A). Przykryj tiulem lub siatką i wytnij małe nacięcie (~1 cm) w tiulu lub siatkowej czapce.
- Po 24 godzinach od karmienia krwią wytnij małą szczelinę (~1 cm) w tiulowej czepce miseczki i przenieś tylko pojedyncze samice, które pomyślnie karmiły się - z widocznym bolusem krwi w jamie brzusznej - przez delikatne aspiracje ust do miseczek do składania jaj (1 samica/miseczka do składania jaj). Uszczelnij małe nacięcie w nasadce do składania jaj wacikiem nasączonym sacharozą 10%.
- Trzymaj kubki w temperaturze ~27 °C przez 5-7 dni, aby komary mogły w pełni złożyć jaja, śledząc dzienną śmiertelność. Policz jaja pod lunetą sekcyjną.
4. Test biologiczny śmiertelności i składania jaj z Musca domestica
- Przez trzy dni po wstrzyknięciu należy podawać muszkom 10% sacharozy i rejestrować liczbę widocznie martwych much.
- Trzy dni po wstrzyknięciu znieczulenie much, umieszczając na krótko rurkę polietylenową dozującą CO2 nad kubkami do trzymania, aż wszystkie muchy pozostaną nieruchome na dnie bańek.
- Przenieś muchy do czystej klatki składającej się z plastikowego słoika o pojemności 4 litrów z rękawem dżersejowym zakrywającym otwór (10 cm, Ryc. 3B). Dostarczaj muchom wodę i mieszaninę granulowanej sacharozy, mleka w proszku i suszonego żółtka jaja w stosunku 8:8:1 (objętościowo) przez cztery dni, rejestrując i usuwając martwe muchy codziennie.
- Przygotuj suche składniki na świeże podłoże do hodowli larw much, mieszając 75% otrębów pszennych z 25% granulowanej paszy dla zwierząt gospodarskich. Dodaj wodę, aby osiągnąć 62% wilgotności (aż ledwo będzie można wycisnąć kroplę wody).
- Przygotować kulę o średnicy 2,5 cm z mieszaniny 1:1 powyższej świeżej pożywki larwalnej i "zużytej" pożywki larwalnej muchowej (pożywki, w której muchy wcześniej się przepoczwarzały). Zawiń piłkę w kwadrat czarnej bawełnianej szmatki, lekko ściśnij, aż przesiąknie średni płyn, a następnie użyj gumek, aby przytrzymać szmatkę na miejscu wokół piłki.
- Umieść piłkę w kubku o pojemności 60 ml i umieść ją w klatce na muchy na 5 godzin (Rysunek 3B).
- Opłucz jajka z kulki do składania jaj i upewnij się, że jajka zostały usunięte spod fałd w szmatce. Potrząśnij jajkami, aby rozbić grona i przenieś je do wyskalowanej probówki wirówkowej o pojemności 20 ml z pipetą transferową.
- Poczekaj, aż jaja osiądną i zanotuj objętość osadzonych jaj w rurki z podziałką. Dodaj tyle wody, aby zwiększyć objętość do 20 razy większą niż objętość osadzonych jaj. Zapisz całkowitą objętość wody i jaj.
- Mieszając wodę i zawiesinę jajeczną za pomocą mieszadła magnetycznego lub energicznego mieszania, użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml (z odciętym końcem końcówki), aby dozować 0,5 ml wody i zawiesiny jajecznej na kawałek wstępnie zwilżonej czarnej szmatki w szeregu linii. Policz jaja pod mikroskopem preparacyjnym.
- Powtórz krok 4.9 jeszcze dwa razy. Jeśli jedno z obliczeń jest poważnym wartością odstającą (tj. różni się od pozostałych dwóch liczb o >35%), wykonaj czwarte zliczanie i zignoruj wartość odstającą.
- Obliczyć średnią liczbę jaj w próbce i pomnożyć tę wartość przez 2, aby uzyskać liczbę jaj/ml zawiesiny. Pomnóż otrzymaną wartość jaj/ml przez objętość zawiesiny jaj z kroku 4.8. Jest to szacunkowa wartość całkowitej liczby złożonych jaj.
Wyniki
Mikroiniekcja dsRNA u komarów
Tę metodę mikroiniekcji stosowano w naszym laboratorium do oceny ekspresji genów, śmiertelności i odpowiedzi w zakresie składania jaj dla ponad 80 wyzwalaczy dsRNA w kilku rodzajach komarów (Aedes, Anopheles, Culex). Iniekcja samic z linii koloniowej Ae. aegypti (ORL1952) 1 µg dsRNA pochodzącego z transkrypcji rybosomalnych RPS6 i RPL26 (metody produkcji dsRNA i dane sekwencyjne patrz w Estep et al.5) wykazała znaczną redukcję względnej ekspresji (RE) w wielu cyklach składania jaj w porównaniu z komarami wstrzykniętymi kontrolnym dsGFP. Względna ekspresja (RE) u Aedes aegypti zmierzona po 2nd cyklu gonotroficznym wykazała znaczną redukcję ekspresji RPS6 (P < 0.05) u komarów wstrzykniętych dsRPS6, co ustalono za pomocą testu t-Studenta pomiędzy grupą kontrolną dsGFP z tej samej serii (Rycina 4)5.
Płodność poszczególnych samic oceniano za pomocą opisanego tutaj bioanalizy składania jaj. 3 dni po wstrzyknięciu komary poddano żywieniu krwią, przeniesiono do indywidualnych pojemników do składania jaj i pozwolono im na pełne zniesienie jaj. Średnia wielkość sprzęgła w pierwszym cyklu gonotroficznym była znacznie mniejsza zarówno dla osobników Ae. aegypti traktowanych dsRPS6 (n = 102 samice, 1,3 ± 0,8 (średnia ± SE) jaj) i traktowanych dsRPL26 (n = 86 samic, 4,0 ± 1,1 jaj) w porównaniu do wstrzyknięć dsGFP (n = 79 samic, 49,3 ± 3,5 jaj, Rysunek 5A). Ocena sprzęgła po drugim cyklu gonotroficznym również wykazała znacząco zmniejszone składanie jaj dla obu grup traktowanych dsRNA, lecz przy mniejszym rozmiarze efektu. Wielkości grup Ae. aegypti były zmienne, dlatego rozdzielenie średnich wykonano za pomocą testu Dunna5. Dobowa śmiertelność wynosiła zazwyczaj 3% lub mniej.
Wyraźny efekt dawka-odpowiedź zaobserwowano po wstrzyknięciu dsRPS6 w dawkach od 1 µg do 50 ng samicom Ae. aegypti, a wielkość sprzęgła różniła się znacząco w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi dawką 1 µg/samica dsGFP we wszystkich grupach poza dawką 25 ng/samica dsRPS6 (Rysunek 5B).
Mikroiniekcja dsRNA u muszek domowych
Kolonia Musca domestica (normalna ORL) została wstrzyknięta z 5 µg konstruktów dsRNA zaprojektowanych przeciwko transkryptom RPS6 i RPL26 muchy domowej9. Podobnie jak zaobserwowano u Ae. aegypti, odnotowano znaczną redukcję ekspresji obu specyficznych transkryptów (RPS6 i RPL26) oraz zmniejszenie liczebności sprzęgieli (Rysunek 4 i Rysunek 5A). Istotną redukcję RE określono za pomocą testu t Student'a w porównaniu z grupą kontrolną dsGFP z tej samej serii (P < 0.05), natomiast do określenia istotności różnic między liczebnością sprzęgieli w różnych grupach badawczych M. domestica zastosowano test Holm-Sidak. Sekcje jajników wykazały ograniczoną oogenezę w grupach traktowanych dsRPS6 i dsRPL26, podczas gdy muchy karmione dsGFP wykazywały prawidłowe odkładanie witellogeniny oceniane według skali Tyndale-Biscoe9.
Rysunek 1: Układ do mikroiniekcji służący do podawania mikrob objętości dorosłym komarom i muchom domowym. Iniekcje wykonuje się u owadów znieczulonych zimnem, umieszczonych na przedmiotach szkiełek mikroskopowych na stole chłodzącym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Miejsca mikroiniekcji dla Ae. aegypti i M. domestica(A) Dorosły Ae. aegypti wstrzykuje się w środkową jedną trzecią mezokatepisternum. (B) Dorosły *M. domestica* zostają wstrzyknięte do mezopleury. Strzałki wskazują miejsca wstrzyknięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Układ bioanalizy składania jaj. (A) Ae. aegypti kubki do testów składania jaj z papierem do kiełkowania nasion jako podłożem do składania jaj, zamknięte tiulem i nasączoną 10% sacharozą watą. (B) Dorosła samica M. domestica w pojemniku do testu składania jaj z pożywką (A), wodą (B) oraz podłożem dla larw (C). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.
Rycina 4: Względna ekspresja RPS6 w Ae. aegypti i M. domestica wstrzyknięte gatunkowo specyficzne dsRNA. Aedes aegypti i M. domestica wstrzyknięto 1 i 5 µg odpowiednio kontrolnego dsRNA (dsGFP) lub dsRNA zaprojektowanego przeciwko transkryptom RPS6 lub RPL26 z każdego owada. Istotna redukcja (P < Obserwowano spadek (p < 0,05) ekspresji RPS6 u komarów i much wstrzykniętych dsRPS6 oraz u much wstrzykniętych dsRPL26 (oznaczono gwiazdkami). Słupki błędu reprezentują średnią ± SE, a liczba u podstawy słupka oznacza liczbę badanych osobników. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Estep i inni5 orzy Sanscrainte i wsp.9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Średnia wielkość sprzęgła *Ae. aegypti* i M. domestica wstrzyknięto specyficzne dla gatunku dsRNA. (A) Depozycja jaj była istotnie zredukowana (P < 0,05) w obu przypadkach Ae. aegypti i M. domestica po wstrzyknięciu 1 i 5 µg odpowiednio dla kontrolnego dsRNA (dsGFP) lub dsRNA zaprojektowanego przeciwko transkrypcjom RPS6 lub RPL26 z każdego owada. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w stosunku do kontroli dsGFP w tej samej grupie. Słupki błędów reprezentują średnią ± SE, a liczba u podstawy słupka określa liczbę przebadanych osobników. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Estepa i wsp.5 orzeczenie o braku ograniczeń i wsp.9. (B) Krzywa dawkowa Ae. aegypti po wstrzyknięciu dsRPS6 w dawkach od 50 ng/samiczkę do 10 ng/samiczkę wykazują znaczące zmniejszenie płodności w porównaniu z grupami po wstrzyknięciu dsGFP (50, 10 i 100 ng/samiczkę). Słupki błędów reprezentują średnią ± 95% CI dla 36–81 poszczególnych organizmów na dawkę. Punkty oznaczone literami reprezentują istotną różnicę między grupami (P < 0,05) zidentyfikowano za pomocą analizy ANOVA. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Estepa i wsp.5. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Dyskusja
Mikroiniekcja jest cenną techniką laboratoryjną zapewniającą dostarczanie dsRNA lub innych substancji biologicznych (tj. pestycydów, wirusów, mikrosporydiów). Podczas gdy wiele laboratoriów wykonuje mikroiniekcję, dokładna ilość wstrzykiwanej dawki jest często niejasna ze względu na ograniczenia techniczne systemu dostarczania, w którym dostarczana objętość nie jest bezpośrednio mierzona11. Dostarczona objętość i stężenie są parametrami krytycznymi, które umożliwiają obliczenie standardowych środków toksykologicznych, takich jak EC50 lub IC50, lub określenie minimalnych skutecznych dawek 5,16. Jest to szczególnie ważne w badaniach funkcjonalnych z zastosowaniem RNAi u dorosłych owadów, w których podawanie przez karmienie nie zawsze powoduje ogólnoustrojową ekspozycję na pożądane cząstki, a rzeczywista dawka przenikająca przez jelito środkowe jest niejasna5.
Chociaż procedura mikroiniekcji może być początkowo trudna, szybką poprawę szybkości i dokładności podawania osiąga się dzięki praktyce i cierpliwości. Opanowanie samej procedury wstrzykiwania jest inwestycją czasu, ale po jej zakończeniu procedura daje powtarzalne wyniki i śmiertelność z powodu urazów na poziomie <3%. Współczynnik udanych zastrzyków będzie wzrastał wraz ze wzrostem biegłości, co pozwoli na wstrzyknięcie 300 komarów lub much dziennie.
Wiele wyzwań związanych z mikroiniekcją wynika z używanej igły. Określenie właściwego punktu złamania igły kapilarnej i kąta końcówki jest trudnym aspektem procedury i wymaga pewnych prób i błędów, aby określić najbardziej efektywny rozmiar otworu dla danego gatunku. Drobna igła najbardziej przydatna do mikroiniekcji komarów (~150 μm) jest zbyt mała, aby szybko dostarczyć większą objętość wstrzykniętą muchom, podczas gdy odwrotnie, większy otwór igły, który działa na muchy (~250 μm), powoduje rozległe uszkodzenia mniejszych komarów i niedopuszczalną śmiertelność po wstrzyknięciu. Igła złamana końcem jest często trudna do przebicia przez naskórek bez uszkodzenia tkanek i zwiększonej śmiertelności. Łuski owadów lub kawałki tkanek mogą zatykać igły w trakcie eksperymentu, dlatego często pomocne jest wyciągnięcie kilku igieł, jeśli wymagana jest wymiana. Odkryliśmy, że łatwiej jest wymienić trudną igłę, niż poświęcić czas na próbę usunięcia zakleszczonej lub zabrudzonej igły.
Obserwacja roztworu do wstrzykiwań dostającego się do organizmu owada ma kluczowe znaczenie dla usunięcia nieudanych wstrzyknięć (patrz kroki 2.14-2.15). Dodatek rodaminy B do roztworów do wstrzykiwań zapewnia wyraźny efekt wizualny, aby zapewnić, że owady w zimnym stadium otrzymują właściwe dawkowanie i jest szczególnie pomocny podczas ćwiczeń (patrz krok 2.7).
Przedstawione tutaj metody testów biologicznych polegających na wstrzykiwaniu i składaniu jaj z powodzeniem wywołały knockdown genów i mierzalne efekty fenotypowe u dorosłych Ae. aegypti i M. domestica przy użyciu dsRNA zaprojektowanych przeciwko specyficznym dla gatunku transkryptom rybosomalnym (Figura 4 i Figura 5A). Dodatkowo, zdolność tej metody do dokładnego dostarczania mikroobjętości do osób pozwala na generowanie krzywych odpowiedzi na dawkę dla niewielkich ilości materiału (tak niskie, jak 50 ng; Rysunek 5B). Jest to szczególnie przydatne w przypadku metod takich jak badania przesiewowe siRNA lub dsRNA, ponieważ produkcja dużych ilości tych cząsteczek może być zbyt kosztowna.
Metoda ta może być zmodyfikowana w celu wstrzykiwania czynników biologicznych (wirusów, bakterii, mikrosporydiów) lub pestycydów chemicznych, po upewnieniu się, że wszelkie dostarczające są nieszkodliwe przez wstrzyknięcie. Ponieważ objętość dostawy jest ograniczona wielkością owada, wytwarzanie skoncentrowanych roztworów testowych ma znaczenie.
Aby odpowiednio ocenić skuteczność dsRNA, konieczne jest śledzenie składania jaj, ponieważ letalne fenotypy mogą objawiać się tylko u potomstwa. Jak przedstawiono tutaj, trzymanie samic Ae. aegypti oddzielnie po przekrwieniu pozwala na indywidualne określenie wielkości lęgu, a dalsze testy na tych samych osobnikach można przeprowadzić po złożeniu jaj (tj. badania ekspresji genów, dodatkowe cykle gonotroficzne, knockdown specyficzny dla tkanki) w celu skorelowania wydajności reprodukcyjnej z innymi miarami, takimi jak ekspresja genów. Ponieważ M. domestica zazwyczaj składa jaja w odpowiedzi grupowej, pobudzanie izolowanych much ciężarnych do składania jaj jest bardzo pracochłonne i niepraktyczne dla dużej liczby osobników17. W związku z tym przedstawiono metodę wyznaczania średniej wielkości sprzęgła.
Przedstawiona tutaj metoda mikroiniekcji zapewnia spójne dostarczanie ogólnoustrojowe komarom i muchom domowym. W połączeniu z testami biologicznymi śledzącymi śmiertelność i składanie jaj, te wszechstronne narzędzia mogą być wykorzystywane do oceny transkrypcyjnych i fenotypowych skutków małych cząsteczek RNA, czynników biologicznych i tradycyjnych pestycydów, w przypadku gdy podawanie doustne nie jest możliwe.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy są pracownikami lub zleceniobiorcami Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych lub Departamentu Obrony. Rękopis ten został sporządzony w trakcie wykonywania obowiązków służbowych i zgodnie z prawem znajduje się w domenie publicznej. Wyrażone poglądy reprezentują opinię autorów i nie reprezentują oficjalnego stanowiska ani poparcia ze strony rządu USA. Wzmianka o produkcie komercyjnym nie jest zaleceniem użytkowania.
Podziękowania
Autorzy dziękują Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li i Roxie White (USDA-ARS) za pomoc w pozyskiwaniu i analizie danych. Dziękujemy również dr Pii Olafson (USDA-ARS) i dr Ke Wu (University of Florida) za krytyczną recenzję manuskryptu oraz Niklausowi Hostettlerowi (University of Florida) za sfilmowanie materiału filmowego z mikroskopu. Finansowanie zostało zapewnione przez USDA, projekt WII-141C Centrum Zdrowia Publicznego Marynarki Wojennej i Korpusu Piechoty Morskiej oraz Program Ochrony Rozmieszczonych Bojowników Wojennych. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu ani kierowaniu badaniami lub rozwojem manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| <>< > ciągnięcie igły | |||
| pionowy ściągacz do pipet | Kopf | 720 | ustawienia: grzałka = 15 sztuk, elektromagnes = 4 ampery |
| szklane kapilary, długość 3,5", ID = 0,530 mm ± 25 μ m, OD 1,14 mm | World Precision Instruments | 504949 | kapilary do ciągnięcia szklanych igieł |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| stacja mikrowtryskiwaczy | |||
| Nanolitr 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | mikroiniektor |
| ręczny mikromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | leworęczny stojak magnetyczny manipulatora KITE |
| World Precision Instruments | M9 | trzyma mikromanipulator | |
| precyzyjny mikroskop lornetkowy stereo zoom na stojaku na wysięgniku | Luneta sekcyjna World Precision Instruments | PZMIII-BS | do mikroiniekcje |
| Obiektyw 1,5X | World Precision Instruments | 501377 | obiektyw do światła mikroskopu |
| Pierścień LED | World Precision Instruments | 504134 | pierścień świetlny do mikroskopu iniekcyjnego |
| laboratoryjny stół chłodzący | BioQuip Products | 1431 | do mikroiniekcji |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-544-1 | dla inscenizacja owadów podczas iniekcji |
| Rodamina B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| testy biologiczne składania jaj komarów | |||
| duża szalka Petriego | Fisher Scientific | FB0875714 | do trzymania szkiełek etapowych plastikowy kubek |
| - 3 1/2 uncji | Dart Container Corporation | TK35 | kubki do testów biologicznych na składanie komarów |
| matowa tkanina tiulowa | Joanne Tkaniny | 1103068 | czapki do testów biologicznych składania jaj |
| źródło krwi | lokalnie pozyskiwane | zwykle bydlęce lub żywe kurczaki, | |
| 1 x 30 mm przezroczysta jadalna osłonka kolagenowa | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| papier do kiełkowania | nasion o dużej gramaturzeAspirator doustny Anchor Paper Co | SD7615L | |
| z filtrem HEPA | John W. Hock Company | 612 | |
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| domowe testy biologiczne składania jaj much | |||
| 4-litrowy plastikowy kanister do przechowywania żywności | Walmart | 555115143 | |
| 10-calowy rękaw pończochy | Medonthego.com | FS15001H | |
| otrębów pszennych | pozyskiwanych | zwykle spotykanych w sklepach paszowych | |
| Suplement wydajności Manna cielęca | ValleyVetSupply.com | 16731 | granulowana pasza dla zwierząt gospodarskich |
| suszone żółtko jaja | BulkFoods.com | 40506 | |
| bawełniana ściereczka | pozyskiwana | lokalnie, zwykle w dziale artykułów rzemieślniczych | |
| kubek 60 ml | Dart Container Corporation | P200-N |
Bibliografia
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353(2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20(2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834(2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534(2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
Przedruki i uprawnienia
