Artykuł metodologiczny

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58651

⸱

7 stycznia 2019

 , 
1Department of Translational Oncology, German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences, Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology, NCT and Heidelberg University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Streszczenie

Skuteczna immunoterapia nowotworów ma potencjał, aby osiągnąć długoterminową kontrolę nowotworu. Pomimo ostatnich sukcesów klinicznych, nadal istnieje pilna potrzeba bezpiecznych i skutecznych terapii dostosowanych do indywidualnych profili immunologicznych guza. Wirusy onkolityczne umożliwiają indukcję przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych, a także ekspresję genów ograniczoną przez nowotwór. Protokół ten opisuje wytwarzanie i analizę ex vivo immunomodulujących wektorów onkolitycznych. Koncentrując się na przykład na wirusach szczepionki przeciwko odrze kodujących bispecyficzne komórki T, ogólna metodologia może zostać dostosowana do innych gatunków wirusów i transgenów. Prezentowany przepływ pracy obejmuje projektowanie, klonowanie, ratowanie i namnażanie rekombinowanych wirusów. Uwzględniono testy do analizy kinetyki replikacji i aktywności litycznej wektora, a także funkcjonalności izolowanego immunomodulatora ex vivo, co ułatwia generowanie nowych środków do dalszego rozwoju w modelach przedklinicznych i ostatecznie translacji klinicznej.

Wprowadzenie

Wirusy onkolityczne (OV) są opracowywane jako terapie przeciwnowotworowe, które specyficznie replikują się w komórkach nowotworowych i zabijają je, pozostawiając zdrowe tkanki nienaruszone. Obecnie powszechnie wiadomo, że wirusoterapia onkolityczna (OVT) w większości przypadków nie opiera się wyłącznie na całkowitej lizie guza poprzez efektywną replikację i rozprzestrzenianie się wirusa, ale wymaga dodatkowych mechanizmów działania dla powodzenia leczenia, w tym celowania naczyniowego i zrębowego oraz, co ważne, stymulacji immunologicznej1,2,3,4. Podczas gdy wiele wczesnych badań nad OV wykorzystywało niezmodyfikowane wirusy, obecne badania skorzystały z lepszego zrozumienia biologii, biobanków wirusów, które potencjalnie zawierają nowe OV, oraz możliwości oferowanych przez inżynierię genetyczną w celu stworzenia zaawansowanych platform OV5,6,7.

Biorąc pod uwagę niedawny sukces immunoterapii, immunomodulujące transgeny są szczególnie interesujące w odniesieniu do inżynierii genetycznej OV. Ukierunkowana ekspresja takich produktów genowych przez komórki nowotworowe zakażone OV zmniejsza toksyczność w porównaniu z podawaniem ogólnoustrojowym. Celowanie osiąga się albo za pomocą wirusów z wrodzoną onkoselektywnością, albo przez modyfikację tropizmu wirusowego8. Miejscowa immunomodulacja wzmacnia wieloaspektowe mechanizmy przeciwnowotworowe OVT. Co więcej, strategia ta odgrywa zasadniczą rolę w badaniu wzajemnych oddziaływań między wirusami, komórkami nowotworowymi i układem odpornościowym gospodarza. W tym celu protokół ten zapewnia odpowiedni i regulowany przepływ pracy do projektowania, klonowania, ratowania, propagacji i walidacji wektorów paramyksowirusa onkolitycznego (w szczególności wirusa odry) kodujących takie transgeny.

Modulacja odpowiedzi immunologicznej może być osiągnięta za pomocą szerokiej gamy produktów transgenicznych ukierunkowanych na różne etapy cyklu odporności nowotworowej9, w tym zwiększenie rozpoznawania antygenów nowotworowych [np. antygenów związanych z nowotworem (TAA) lub induktorów cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I] poprzez wspieranie dojrzewania komórek dendrytycznych w celu efektywnej prezentacji antygenu (cytokiny); rekrutacja i aktywacja pożądanych komórek odpornościowych, takich jak cytotoksyczne i pomocnicze limfocyty T [chemokiny, bispecyficzne zazębiacze limfocytów T (BTE)]; ukierunkowane na komórki supresyjne, takie jak limfocyty T regulatorowe, komórki supresorowe pochodzące z mieloidu, makrofagi związane z nowotworem i fibroblasty związane z rakiem (przeciwciała, aparaty zauszne, cytokiny); oraz zapobieganie hamowaniu i wyczerpaniu komórek efektorowych (inhibitory punktów kontrolnych). W ten sposób dostępnych jest mnóstwo czynników biologicznych. Ocena takich kodowanych przez wirusa immunomodulatorów pod kątem skuteczności terapeutycznej i możliwych synergii, a także zrozumienie odpowiednich mechanizmów jest niezbędna do poprawy terapii przeciwnowotworowej.

Jednoniciowe wirusy RNA z rodziny Paramyxoviridae charakteryzują się kilkoma cechami sprzyjającymi ich wykorzystaniu jako wektorów onkolitycznych. Należą do nich naturalny onkotropizm, duża zdolność genomowa dla transgenów (ponad 5 kb)10,11, efektywne rozprzestrzenianie się, w tym tworzenie syncytii, oraz wysoka immunogenność12. W związku z tym stworzono platformy OV oparte na wirusie nosówki psów13, wirus świnki14, wirus rzekomego pomoru drobiu15, Sendai virus16,17, małpi wirus 518 oraz paramyksowirus Tupaia19. Przede wszystkim żywe atenuowane szczepy szczepionki przeciwko wirusowi odry (MV) poczyniły postępy w rozwoju przedklinicznym i klinicznym20,21. Te szczepy wirusa są używane od dziesięcioleci do rutynowych szczepień z doskonałymi wynikami bezpieczeństwa22. Ponadto nie ma ryzyka mutagenezy insercyjnej ze względu na ściśle cytozolową replikację paramyksowirusów. Dostępny jest wszechstronny system genetyki odwrotnej oparty na antygenomowym cDNA, który pozwala na wprowadzanie transgenów do dodatkowych jednostek transkrypcyjnych (ATU)11,23,24. Wektory MV kodujące symporter jodku sodu (MV-NIS) do obrazowania i radioterapii lub rozpuszczalny antygen rakowo-embrionalny (MV-CEA) jako marker zastępczy ekspresji genów wirusa są obecnie oceniane w badaniach klinicznych (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 i NCT00408590). Potwierdzono bezpieczne podawanie, a przypadki skuteczności przeciwnowotworowej zostały zgłoszone w poprzednich badaniach25,26,27,28,29,30 (recenzja Msaouel et al.31), torując drogę dla dodatkowych onkolitycznych wirusów odry, które zostały opracowane i przebadane przedklinicznie. Wykazano, że cząsteczki immunomodulujące kodujące MV ukierunkowane na różne etapy cyklu rak-odporność opóźniają wzrost guza i / lub przedłużają przeżycie u myszy, z dowodami na skuteczność o podłożu immunologicznym i długotrwałą ochronną pamięć immunologiczną w syngenicznych modelach myszy. Transgeny kodowane wektorowo obejmują czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF)32,33, białko aktywujące neutrofile H. pylori34, inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych35, interleukina-12 (IL-12)36, TAAs37 oraz BTEs38, które sieciują antygen powierzchniowy guza z CD3, a tym samym indukują aktywność przeciwnowotworową przez poliklonalne limfocyty T, niezależnie od swoistości receptora limfocytów T i kostymulacji (Figura 1). Obiecujące wyniki przedkliniczne uzyskane dla tych konstruktów wymagają dalszych wysiłków translacyjnych.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), wirus opryszczki pospolitej typu typu kodujący GM-CSF, jest jedynym onkolitycznym środkiem terapeutycznym zatwierdzonym przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA). Badanie III fazy, które doprowadziło do zatwierdzenia pod koniec 2015 r., wykazało nie tylko skuteczność w miejscu wstrzyknięcia do guza, ale także efekty abskopijne (tj. remisje zmian bez wstrzyknięć) w zaawansowanym czerniaku39. Od tego czasu T-VEC rozpoczął dodatkowe badania kliniczne w celu zastosowania w innych jednostkach nowotworowych (np. nieczerniakowy rak skóry, NCT03458117 rak trzustki NCT03086642) oraz do oceny terapii skojarzonych, zwłaszcza z inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 i Ribas et al.40).

To pokazuje nie tylko potencjał immunoterapii onkolitycznej, ale także potrzebę dalszych badań w celu zidentyfikowania lepszych kombinacji OVT i immunomodulacji. Kluczowe dla tego przedsięwzięcia jest racjonalne zaprojektowanie dodatkowych wektorów i ich opracowanie do badań przedklinicznych. Pozwoli to również na lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw choroby nowotworowej i będzie miało wpływ na postęp w kierunku bardziej spersonalizowanego leczenia raka. W tym celu w niniejszej publikacji przedstawiono metodologię modyfikacji i rozwoju paramyksowirusów do celowanej immunoterapii nowotworów, a dokładniej onkolitycznych wirusów odry kodujących przeciwciała angażujące limfocyty T (Rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Oznaczenia [O], [P] i [M] wskazują na podsekcje odnoszące się odpowiednio do: OV w ogóle, (większości) paramyksobirusów lub wyłącznie MV. Oznaczenie [B] wskazuje na sekcje specyficzne dla transgenów BTE.

1 Klonowanie transgenów kodujących immunomodulatory do wektorów wirusa odry

  1. [O] Projektowanie sekwencji wstawki.
    1. [O] Wybrać interesujący immunomodulator na podstawie przeglądu literatury lub danych eksploracyjnych, takich jak przesiewy genetyczne41 oraz wyznaczyć odpowiednią sekwencję cDNA z właściwych baz danych, takich jak GenBank, European Nucleotide Archive lub międzynarodowy system informacji immunogenetycznej (IMGT).
    2. [O] Dodaj dodatkowe elementy do sekwencji transgenu (Rysunek 3). Poprzedzająca sekwencja Kozaka oraz optymalizacja kodonów specyficzna dla gatunku mogą zwiększyć ekspresję. Do sekrecji wymagane są sekwencje sygnałowe. Należy uwzględnić sekwencje kodujące białkowe znaczniki N- i/lub C-końcowe w celu detekcji i oczyszczania.42Należy uwzględnić miejsca cięcia enzymami restrykcyjnymi w celu wstawienia do wektora.
      UWAGA: Dodatkowe jednostki transkrypcyjne (ATU), zawierające sygnały startu i stopu polimerazy MV, są niezbędne do ekspresji transgenu z rekombinowanych genomów MV. Opracowano wcześniej odpowiednie wektory cDNA antygenomowego, sterowane przez promotory CMV i zawierające jednostki ATU z unikalnymi miejscami restrykcyjnymi do wprowadzania transgenów o sensie dodatnim w określonych pozycjach.11Odpowiednie rozmieszczenie transgenu jest kluczowe, ponieważ wpływa ono na replikację wirusa i ekspresję transgenu ze względu na gradient ekspresji typowy dla paramyksowirusów.43Wprowadzenie ATU w pobliżu końca 3' antygenomu (t.j.., w pozycji lidera lub w regionie downstream względem P genu) zazwyczaj skutkuje wysoką ekspresją transgenu kosztem zmniejszonej replikacji wirusa. Zwiększoną replikację i niższe poziomy ekspresji transgenu można oczekiwać przy zastosowaniu ATU w regionie downstream w stosunku do H gen. Pakowanie genomu kilku paramyksowirusów, w tym wirusa odry, wymaga związania sześciu nukleotydów przez każde białko nukleokapsydu44W celu wprowadzenia transgenów do takich wirusów należy upewnić się, że liczba nukleotydów w kompletnym genomie będzie podzielna przez sześć. Jest to określane mianem „reguły sześciu”.45,46W razie potrzeby należy dołączyć do insertu dodatkowe nukleotydy (powyżej sekwencji Kozaka lub poniżej kodonu stop), nie wprowadzając przy tym przesunięć ramki odczytu ani przedwczesnych kodonów stop. [M] Należy unikać w transgenie sekwencji podobnych do sygnałów startu (AGGRNCMARGW) i stopu (RTTAWANAAAA) genu MV oraz sekwencji edycji RNA (AAAAAGGG). Takie sekwencje konsensusowe zostały opublikowane (np. zob. Parks et al.47).
    3. [O] Należy zakupić oligonukleotyd o pożądanej sekwencji lub złożyć go z dostępnych sekwencji, stosując standardowe metody klonowania molekularnego48.
      UWAGA: [O] W celu amplifikacji transgenu metodą PCR należy zaprojektować starter forward zawierający przedłużenie z miejscą restrykcyjną po stronie 5' oraz pierwsze 15-20 nukleotydów wstawki, a także starter reverse zawierający ostatnie 15-20 nukleotydów wstawki, po których następuje miejsce restrykcyjne po stronie 3'.
  2. [O] Klonowanie wstawki do DNA kodującego (anty-)genom wirusa.
    1. [O] Klonowanie wkładki do wektorów DNA lub antygenomów DNA wirusów RNA przy użyciu standardowych technik klonowania molekularnego48 (t.j., restrykcja enzymatyczna, a następnie ligacja DNA).
      1. [O] Zapobiegać religacji wektora poprzez zastosowanie niekompatybilnych miejsc restrykcyjnych lub poprzez defosforylację przed ligacją.
      2. [O] Produkt ligacji należy wyizolować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie poddać oczyszczaniu z żelu przy użyciu dostępnych w handlu zestawów. Zazwyczaj optymalną wydajność ligacji osiąga się przy stosunku molowym wkładki do wektora wynoszącym 3:1.
    2. [O] Przenieś produkt ligacji do kompetentnych bakterii odpowiednich do wydajnego odzyskiwania dużych plazmidów (t.j., przeprowadzić szok termiczny *E. coli*49) i zidentyfikować klony bakteryjne zawierające prawidłowy DNA za pomocą PCR z kolonii50.
    3. [O] Wyizolujy amplifikowany DNA z pojedynczego klona bakteryjnego, korzystając z dostępnych komercyjnie zestawów do preparatyki DNA. Potwierdź integralność genomu poprzez trawienie kontrolne odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (np., HindIII dla genomów MV [M]). Potwierdzić poprawność insercji oraz integralność transgenu za pomocą sekwencjonowania.
      UWAGA: [M] W przypadku transgenów wprowadzonych do MV H-ATU, należy przeprowadzić sekwencjonowanie metodą Sangera z użyciem następujących starterów: H-9018 [starter bezpośredni, wiążący się z pozycją 9018 genomu MV w H otwarta ramka odczytu (ORF)]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (starter odwrotny, wiąże się z pozycją 9249 genomu MV w L ORF): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. Pozyskiwanie rekombinowanych cząsteczek wirusa odry kodujących immunomodulatory

  1. [O] Generowanie rekombinowanych cząsteczek wirusa z (anty-)genomicznego DNA poprzez transfekcja komórek produkujących wirusa zgodnie ze standardowym protokołem dla odpowiedniego wirusa. Należy przestrzegać wytycznych dotyczących pracy w warunkach sterylnych. Hodowlę komórkową należy prowadzić pod dygestoriami, a w szczególności wszystkie etapy z wykorzystaniem wirusa w komorach bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
    1. [M] Do regeneracji wirusów odry z cDNA23,24na płytkę 6-dołkową równomiernie wysiej komórki producenta MV (Vero pochodzące z nerki zielonej małpy afrykańskiej) na 24 h przed transfekcją. Wysiej 2 x 105 komórki w 2 mL pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na studzienkę, aby w momencie transfekcji uzyskać 65–75% konfluencji.
      UWAGA: [P] Zmniejszyć liczbę komórek, jeśli ulegną one nadmiernemu rozrostowi przed powstaniem syncytiów indukowanych przez wirusa.
    2. [P] Przeprowadzić transfekcję komórek DNA kodującym antygenom wirusowy, wymaganymi plazmidami pomocniczymi oraz, opcjonalnie, plazmidem kodującym fluorescencyjny reporter w celu oceny wydajności transfekcji.
      1. [M] Wymieszać 5 µg rekombinowanego DNA kodującego antygenom wirusa odry, po 500 ng plazmidów ekspresyjnych ssaczych kodujących białka N i L wirusa odry oraz po 100 ng plazmidów kodujących białko P i fluorescencyjny reporter w całkowitej objętości 200 µL DMEM.
      2. Dodać 18,6 µL odczynnika do transfekcji liposomalnej, niezwłocznie wymieszać poprzez delikatne potrząśnięcie probówką i inkubować przez 25 min w temperaturze pokojowej (RT).
      3. [P] Wymień pożywkę na 1,8 ml DMEM z dodatkiem 2% FBS i 50 µg/ml kanamycyny (lub innych antybiotyków zapobiegających kontaminacji) na każdą studzienkę, następnie dodaj kroplami mieszaninę do transfekcji do studzienki i ostrożnie zamieszaj ruchem okrężnym. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.2Następnego dnia wymienić pożywkę na 2 ml świeżego DMEM z dodatkiem 2% FBS i 50 µg/ml kanamycyny; powtarzać tę czynność, gdy pożywka zakwasi się.
        OSTRZEŻENIE: [O] Postępować z komórkami i materiałami zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ od momentu transfekcji aż do zakończenia następnych etapów może występować obecność wirusa. Odpady (potencjalnie) zakaźne utylizować w odpowiedni sposób.
  2. [P] Gromadzenie i propagacja cząsteczek wirusa.
    1. [P] Codziennie obserwować komórki pod mikroskopem w celu oceny ekspresji genu reporterowego oraz tworzenia się syncytiów (Rysunek 4). Zbierz wirusa, gdy widoczne są duże syncytia składające się z 20 lub więcej komórek lub gdy komórki stają się zbyt gęste (tj.., kiedy zaczynają rosnąć w wielu warstwach, zazwyczaj po 7–9 dniach).
      UWAGA: [P] Jeśli dla danej konstrukcji wektora nie zaobserwowano syncytiów, nie musi to oznaczać niepowodzenia procesu rescue. Ponieważ w próbce mogą mimo to znajdować się wirusy zakaźne, należy przenieść je do świeżych komórek producenta w celu pasażowania.
    2. [P] Wysiać około 1,5 x 106 komórki produkcyjne w 12 ml DMEM z 10% FBS, na płytkach 10 cm na 24 h przed planowanym zbiorem, lub 2,5 x 106 komórek na płytkę od 4 do 6 h przed pasażowaniem wirusa, aby uzyskać 65–75% konfluencji w momencie inokulacji wirusem.
    3. [P] Aby zebrać potomstwo wirusowe, należy ostrożnie zeskrobć adherentne komórki producenta z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść nadsącz zawierający komórki do probówki wirówek. Pozostałości komórkowe należy usunąć poprzez wirowanie przez 5 min przy 2 500 x g oraz 4 °C.
      UWAGA: Zeskrobane komórki można przenieść bezpośrednio, bez wirowania, aby zmaksymalizować przeniesienie wirusa kosztem nieoptymalnych warunków hodowli i potencjalnych artefaktów mikroskopowych.
      UWAGA[O] Należy unikać rozlania pożywki podczas zeskrobywania komórek. Należy zminimalizować powstawanie aerozoli.
    4. [P] Przygotować inokulum, mieszając nadsącz pozbawiony komórek z kroku 2.2.3 z pożywką bezsurowiczą do uzyskania końcowej objętości 4 ml. Wymienić pożywkę w hodowli komórek producenta na inokulum i inkubować komórki przez co najmniej 2 h w temperaturze 37 °C i 5% CO22Dodać 6 ml pożywki DMEM z 10% FBS i inkubować komórki przez noc, a następnie wymienić pożywkę na 12 ml świeżej pożywki DMEM z 10% FBS.
    5. [P] Obserwować komórki co najmniej dwa razy dziennie i zebrać wirus przed rozpadem syncytiów (tj., (gdy widoczna stanie się destrukcja błony). Aby zebrać pierwszy pasaż wirusa, należy usunąć supernatant z płytki, dodać 600 µL medium bezsurowiczego, zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do czystej probówki.
      UWAGA: [M] W zależności od szczepu wirusa51,52 or postępu infekcji, przenieś płytki z zainfekowanymi komórkami do temperatury 32 °C, aby ułatwić replikację i rozprzestrzenianie się wirusa. Co do zasady szczepy MV Schwarz dobrze propagują w temperaturze 37 °C, natomiast przeniesienie komórek zainfekowanych wirusami szczepu Edmonston B do temperatury 32 °C skutkuje wolniejszym tworzeniem się syncytiów, ale wyższymi mianami.
      UWAGA: [P] Nie należy dopuścić do wyschnięcia warstwy komórek podczas zbioru, ponieważ spowoduje to obniżenie zakaźności cząsteczek wirusowych. Mimo że część wirusa jest tracona podczas usuwania nadsączu z zainfekowanych komórek, z warstwy komórek można uzyskać wyższe miana.
    6. [P] Zawiesinę wirusa należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 h, aby zapewnić całkowite zamrożenie. W razie potrzeby czas ten można wydłużyć do kilku dni, aby przerwać procedurę.
    7. Uwolnić cząsteczki wirusowe poprzez rozmrożenie w temperaturze 37 °C. Zhomogenizować za pomocą wstrząsarki vortex i wirować przez 5 min przy 2 500 x g. g oraz 4 °C. Przenieść nadnad レイs do oznakowanych probówek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: [O] Wirusy należy przechowywać w alikwotach o objętościach dostosowanych do późniejszych eksperymentów, ponieważ powinny być one rozmrażane tylko raz i używane niezwłocznie. [P] Dalsze cykle zamrażania i rozmrażania lub przechowywanie w temperaturze 4 °C przez kilka dni prowadzą do znacznego obniżenia miana wirusa.
    8. [P] Na jeden dzień przed kolejnym pasażowaniem w celu uzyskania wymaganej ilości i miana, zaszczep 4 x 106 hodować komórki producentorskie w 12 ml pożywki DMEM z 10% FBS na płytkach 15 cm. Zaszczepić wirusem przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 0,03. Inkubować w 8 ml pożywki bezzserwatkowej na płytkę, a po co najmniej 2 godzinach inkubacji komórek wymienić pożywkę na DMEM z 10% FBS. Zwiększyć skalę hodowli, wykorzystując wiele płytek.
    9. Zebrać materiał zgodnie z opisem w kroku 2.2.5, gdy syncytia rozprzestrzenią się na całą warstwę komórek. Połączone zawiesiny przelać do probówek o pojemności 50 ml i przetworzyć zgodnie z opisem w krokach 2.2.6–2.2.7.
      UWAGA: [O] Przed zbiorem kluczowe jest przeprowadzenie wizualnej kontroli wszystkich płytek pod kątem zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych. Co do zasady, wszystkie linie komórkowe należy regularnie badać w kierunku zanieczyszczeń mykoplazmami lub wirusami przygodnymi za pomocą seryjnej reakcji PCR (multiplex PCR).
  3. [P] Oznacz miana wirusa. Wyznaczyć miana zapasów wirusa w ośmiu powtórzeniach na każdą porcję, wykorzystując płytki 96-dołkowe. Przeprowadzić miareczkowanie trzech oddzielnych porcji dla każdego procesu ratowania wirusa (virus rescue) i wykorzystać wartość średnią do obliczenia ilości zawiesiny wirusa do użycia w eksperymentach.
    1. [P] Połączyć komórki producenta, policzyć i dostosować ich liczbę do 1,5 x 105 komórek na ml w pożywce DMEM z 10% FBS.
    2. Do każdej studni płytki 96-dołkowej pipetować 90 µL DMEM z dodatkiem 10% FBS.
    3. [P] Do wszystkich 8 dołków w pierwszej kolumnie płytki dodać 10 µL z jednej alikwoty zapasu wirusa i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
    4. [P] Wykonać dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne wirusa. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 10 µL z każdego dołka z pierwszej do drugiej kolumny. Wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie w górę i w dół, używając nowych końcówek pipety dla każdego stopnia rozcieńczania. Odpipetować i odrzucić 10 µL z każdego dołka ostatniej kolumny.
      UWAGA: Każda płytka 96-dołkowa umożliwia wykonanie 12 etapów rozcieńczeń seryjnych. [M] W przypadku wektorów MV zazwyczaj wystarczające jest 8 etapów dziesięciokrotnych rozcieńczeń, ponieważ miana przekraczające 1 x 109 jednostki zakaźne komórek (ciu)/ml są rzadko uzyskiwane metodą namnażania opisaną w kroku 2.2. [P] Do porównania i monitorowania kontaminacji można wykorzystać studzienki kontrolne bez wirusa.
    5. [P] Do każdej studzienki należy dodać 100 µL zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO22 przez 48 h. Należy upewnić się, że w zawiesinie nie ma skupisk komórek, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek.
    6. [P] Sprawdzić obecność syncytiów za pomocą mikroskopu świetlnego. Policzyć syncytia w każdej studzience kolumny o najwyższym współczynniku rozcieńczenia, w której widoczne są syncytia.
    7. [P] Oblicz średnią liczbę syncytiów na studzienkę w danej kolumnie, dzieląc całkowitą liczbę syncytiów przez osiem. Pomnóż tę średnią przez czynnik rozcieńczenia dla odpowiedniej kolumny, zaczynając od 102 ciu na ml dla pierwszej kolumny53 (patrz Rycina 5 na przykład).

3. Określanie zdolności replikacyjnych i cytotoksycznych wektorów wirusowych kodujących immunomodulatory

  1. [O] Porównać kinetykę replikacji wygenerowanego wirusa rekombinowanego oraz niemodyfikowanego wektora za pomocą jednokrokowych lub wielokrokowych krzywych wzrostu (GC). W przypadku jednokrokowych krzywych wzrostu ocenie poddawane jest potomstwo wirusowe po jednoczesnej infekcji wszystkich komórek (teoretycznie 100% infekcji). Wielokrokowe krzywe wzrostu rozpoczynają się od niskiego odsetka zainfekowanych komórek, aby umożliwić śledzenie kilku rund replikacji wirusa.
    1. [M] W celu analizy kinetyki replikacji wirusa odry, zasiać 1 x 105 Komórki Vero w 1 ml pożywki DMEM z 10% FBS na każdą studzienkę w płytkach 12-dołkowych, przygotowane na jeden dzień przed infekcją. Dla każdego badanego punktu czasowego należy przygotować co najmniej dwie studzienki jako powtórzenia techniczne.
    2. [O] Zainfekuj komórki wirusem przy niskim MOI dla wieloetapowego lub przy wysokim MOI dla jednoetapowego wzrostu wirusa [M] (odpowiednio 0,03 i 3 dla replikacji MV w komórkach Vero). Wymień medium na 300 µL medium bezsurowiczego zawierającego odpowiednią ilość wirusa i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO22 przez co najmniej 2 h. Usunąć inokulum, dodać 1 ml DMEM z 10% FBS i kontynuować inkubację.
    3. [P] W odpowiednich punktach czasowych, takich jak 12, 24, 36, 48, 72 i 96 h po infekcji, należy zebrać potomstwo wirusowe poprzez bezpośrednie zeskrobnięcie komórek do medium. Zawartość każdej studzienki należy przenieść do osobnej probówki, zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu miareczkowania.
      UWAGA: [P] Na tym etapie można połączyć próbki powtórzone w celu analizy średnich mian.
    4. [P] Należy zebrać próbki ze wszystkich punktów czasowych. Odmrozić je jednocześnie w temperaturze 37 °C w celu oceny potomstwa wirusa. Wymieszać na wortexie i oddzielić szczątki komórkowe poprzez wirowanie przez 5 min przy 2 500 x g oraz 4 °C.
    5. Oblicz średnie miana dla każdego konstruktu i punktu czasowego zgodnie z powyższym opisem. Przedstaw miana w funkcji czasu na wykresie. Porównaj krzywe wzrostu wektorów z wstawionymi transgenami i bez nich, z różnymi transgenami lub z transgenami wstawionymi w różnych pozycjach (patrz Rysunek 6A).
  2. [O] Porównanie aktywności litycznej wirusów kodujących immunomodulator oraz wirusów niemodyfikowanych.
    1. [O] Wybrać jedną z możliwych metodologii, w tym pomiary impedancji, test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) lub kolorymetryczne testy żywotności komórek oparte na metabolizmie [np., testy z użyciem 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylo-tetrazoliu (MTT) oraz 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazoliu-5-karboksanilidu (XTT)].
      1. [M] Aby przeanalizować cytotoksyczność wektorów wirusa odry za pomocą testu XTT, należy wysiać komórki Vero zgodnie z opisem w kroku 3.1.1. Dla każdego punktu czasowego należy uwzględnić powtórzenia kontroli nieinfected.
        UWAGA: [O] Przeprowadzanie testu XTT w różnych punktach czasowych na tej samej próbce może ograniczyć błędy techniczne, jednak powtarzalne płukanie i ekspozycja na odczynnik XTT wpływają na liczbę żywych komórek. Impedancja stanowi alternatywny sposób odczytu dla pomiarów ciągłych.
    2. [M] Zainfekuj komórki Vero przy MOI równym 1, zgodnie z opisem w kroku 3.1.2.
      UWAGA: [M] W przypadku zakażania mniej podatnych komórek docelowych, takich jak niektóre mysie linie komórkowe nowotworu, konieczne może być zastosowanie wyższego MOI wynoszącego 3 lub 5.
    3. [O] W wybranych punktach czasowych (np.., 12, 24, 36, 48, 72 i 96 h po infekcji) przygotować wymaganą ilość odczynnika XTT (tj.., 300 µL na dołek oraz 10% nadmiaru). Unikać ekspozycji na światło.
    4. [M] W każdym punkcie czasowym należy usunąć medium z odpowiednich dołków. Zastąpić je 300 µL odczynnika XTT i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności. Zebrać nadsączone ciecze, gdy odczynnik w dołkach kontrolnych zmieni kolor na ciemnoczerwony (zazwyczaj trwa to od 15 min do 2 h), a następnie zamrozić w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: [O] Czas inkubacji zależy od konstruktu wirusa, typu komórek, ich gęstości oraz efektu cytopatycznego.
    5. [O] Po zebraniu wszystkich próbek należy je rozmrozić jednocześnie. Przenieść 100 µL każdej próbki na płytkę 96-dołkową i zmierzyć absorbancję optyczną przy 450 nm, przyjmując 630 nm jako długość fali referencyjnej.
    6. [O] Wykreśl punkty czasowe (oś x) w funkcji. absorpcja optyczna próbek w stosunku do kontroli, wskazująca na aktywność metaboliczną jako miernik żywotności komórek (oś y). Spadek absorpcji względnej w czasie świadczy o cytotoksyczności wirusa (patrz Rysunek 6B).

4. Analiza aktywności immunomodulatorów kodowanych przez wirusy, wydzielanych z zainfekowanych komórek

  1. [O] Izolacja wydzielonych produktów transgenu wyrażane przez zainfekowane wirusem komórki docelowe.
    1. [P] Hodować komórki produkujące wirusa w kolbach T175 do osiągnięcia 70% konfluencji.
    2. [P] Usunąć medium z komórek i dwukrotnie przemyć je 12 ml PBS w celu usunięcia surowicy. Zainfekować komórki wirusem przy MOI wynoszącym 0,03 w 12 ml medium bezsurowiczego i inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO22 przez noc. Po tym czasie wymienić pożywkę na 12 ml świeżej pożywki bezzrębnicowej.
      1. [M] W przypadku wirusów Edmonston B, po 40 h przenieś komórki z temperatury 37 °C do 32 °C i inkubuj przez kolejne 24 h, aby ułatwić infekcję i zapobiec przedwczesnemu pękaniu syncytiów. W zależności od szczepu wirusa51,52 or progresję syncytiów, temperatury i czasy inkubacji mogą zostać dostosowane w celu uzyskania optymalnej wydajności i czystości białka.
    3. [P] Ostrożnie zebrać nadsączniki, nie odrywając komórek przed pęknięciem syncytiów. Optymalnie syncytia powinny rozprzestrzenić się na całej warstwie komórek. Połączyć nadsączniki w probówkach o pojemności 50 ml.
      UWAGA: W celu wydajnego oczyszczania produktu transgenu należy unikać rozrywania syncytiów oraz zminimalizować ilość debris komórkowego podczas zbierania supernatantów z zainfekowanych komórek.
    4. [P] Usunąć szczątki komórkowe z supernatantu poprzez wirowanie przez 5 min przy 2 500 x g g oraz w temperaturze 4 °C i przepuszczając przez filtry 0,22 µm. W zależności od całkowitej objętości filtratu można to wykonać za pomocą strzykawki lub pompy próżniowej.
    5. [O] Wyizolować produkt transgenu, stosując odpowiednią metodę oczyszczania. Białka z etykietą heksahistydynową (His) należy oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa, wykorzystując minikolumny spinowe Ni-NTA.38 zgodnie z krótkim opisem zamieszczonym tutaj (kroki 4.1.5.1–4.1.5.4).
      UWAGA: [O] Wszystkie etapy należy przeprowadzać szybko i w warunkach chłodzenia (na lodzie). Bufor należy schłodzić wcześniej, a wirówkę ustawić w temperaturze 4 °C.
      1. [O] Przygotować po 100 mL buforu PBS z 200 mM chlorkiem sodu i imidazolem o stężeniach końcowych odpowiednio 10 mM (bufor płuczący 1, WB1), 20 mM (bufor płuczący 2, WB2) i 500 mM (bufor elucyjny, EB). Dostosować pH buforów WB1 i WB2 do wartości 8,0, a buforu EB do wartości 7,0. W zależności od oczyszczanego białka stężenia imidazolu mogą wymagać korekty.
      2. [O] Równoważyć kolumny 600 µL buforu WB1, a następnie odwirować przy 800 x g g przez 2 min z otwartą pokrywą.
      3. [O] Nanieś 600 µL przefiltrowanych supernatantów na kolumny. Umożliw wiązanie białek z tagiem His do macierzy kolumny poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min z zamkniętą pokrywką. Proces nakładania i wiązania można powtarzać aż do uzyskania łącznej ilości 300 µg białka z tagiem His na kolumnę.
      4. [O] Przemyć trzy razy buforem WB1 i raz buforem WB2 lub do momentu, aż przesącz stanie się bezbarwny. Dodać 600 µL buforu i wirować z prędkością 800 x g przez 2 min z otwartą pokrywą.
      5. [O] Eluuj białko do nowej probówki, wykonując dwa etapy elucji z użyciem 300 µL buforu EB oraz wirowania przez 2 min przy 800 x g g.
      6. [O] Odsolić i zagęścić produkt za pomocą filtrów wirówkowych, dobierając je zgodnie z wielkością produktu. Dodać PBS do objętości 15 ml i przefiltrować. poprzez wirowanie przez 10 min przy 4 000 x g gPowtarzać do uzyskania pożądanej czystości i stężenia. Aby zwiększyć stężenie białka, należy zmniejszyć objętość końcową do około 200 µL poprzez wirowanie przez 40 min przy 4 000 x g.
  2. [O] Potwierdzić czystość i tożsamość produktu.
    1. [O] Oznaczyć ilość całkowitego białka w izolatach, stosując standardowe testy kolorymetryczne, takie jak test z kwasem bicinchoninowym (BCA) lub metoda Bradforda54,55[M] Typowe wartości mogą mieścić się w zakresie 1–3 µg produktu transgenu na mL supernatantu z zakażonych komórek.
    2. [O] W celu względnej kwantyfikacji izolatów białek, należy rozdzielić poprzez elektroforeza w żelach poliakrylamidowych z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i barwienie Coomassie56.
    3. [O] Potwierdzić tożsamość oczyszczonych produktów za pomocą immunoblottingu z użyciem swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko białku lub powiązanemu z nim znacznikowi peptydowemu57.
    4. [O] Analiza specyficzności wiązania białek przy użyciu odpowiednich technik, które mogą obejmować enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA) lub cytometrię przepływową (patrz Rysunek 7). Wiązanie komórkowe można potwierdzić za pomocą niedawno opisanego testu magnetycznego wyciągania (magnetic pulldown assay)38.
      UWAGA: [O] Należy zastosować odpowiednie kontrole. W testach wiązania komórkowego należy uwzględnić kontrole negatywne z komórkami niewyrażającymi docelowej cząsteczki (tak jak w Rycina 9) oraz niespecyficznych białkowych substytutów (Rycina 8). W eksperymentach z wykorzystaniem cytometrii przepływowej należy uwzględnić kontrole pozytywne, negatywne oraz kontrole izotypowe (Rycina 7).
      1. [O] Inkubować wspólnie komórki docelowe oraz izolat białkowy, aby umożliwić wiązanie. [B] W celu analizy wiązania BTE do mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) wyizolowanych z krwi ludzkiej58, inkubować 2,5 x 106 komórki z 200 ng BTE w 100 µL PBS z 1% FBS (bufor wiążący, BB) przez 1 h w lodzie.
      2. [B] Przemyj komórki 1 ml buforu BB, aby usunąć niezwiązane białko. Wiruj przy 300 x g przez 5 min, odwiruj supernatant i resuspenduj osad w 100 µL buforu BB. Dodaj biotynilowane przeciwciało skierowane przeciwko białku docelowemu lub powiązanemu z nim znacznikowi peptydowemu i inkubuj w lodzie przez 30 min. W przypadku BTE ze znacznikiem hemaglutyniny (HA) wirusa grypy, należy użyć 100 ng przeciwciała anti-HA-Biotin (klon 3F10).
      3. [B] Komórki przemyć dwukrotnie 1 ml buforu BB i resuspender w 80 µl buforu BB. Dodać 20 µl magnetycznych mikrokuleczek sprzężonych ze streptawidyną i inkubować przez 15 min w temperaturze 4 °C.
      4. [B] Wypłukać raz, aby usunąć nadmiar kulek, a następnie resuspender osad w 500 µL buforu BB uzupełnionego o 2 mM EDTA (bufor kolumnowy, CB).
      5. [B] Wyizolować komórki przy użyciu kolumn i statywu magnetycznego zgodnie z instrukcją producenta.
        1. [B] Przeprowadzić równoważenie, przepuszczając 500 µL buforu CB przez kolumnę w przepływie grawitacyjnym.
          UWAGA: [B] Kolumna nigdy nie może wyschnąć. Należy pipetować ostrożnie i odgazować bufory, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
        2. [B] Pod kolumnę należy umieścić czystą probówkę, a następnie nanieść na kolumnę zawiesinę komórek/kulek. Kolumnę należy przemyć trzykrotnie, używając 500 µL buforu CB na każde przemycie. Próbki filtratu zawiesiny oraz co najmniej pierwszego etapu przemywania należy zebrać do probówki, a następnie przechowywać w lodzie.
        3. [B] Wymyć komórki związane z kulkami, które zostały zatrzymane przez pole magnetyczne. W tym celu wyjąć kolumnę ze statywu magnetycznego, umieścić ją nad czystą probówką, dodać 1 ml buforu CB i szybko przepchnąć bufor przez kolumnę do probówki za pomocą tłoka. Przechowywać probówkę w lodzie.
      6. [B] Wirować probówki zawierające frakcję nieprzepuszczoną oraz próbki elucji przez 20 min przy 16 000 x g oraz 4 °C, aby zpelletować komórki. Odpiąć nadsącz i lizować komórki w buforze do radioimmunoprecypitacji (RIPA) (zalecana objętość: 75 µL). Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE56.
      7. [B] Przeprowadź immunoblotting, używając odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego. Przeciwciała mogą być skierowane przeciwko produktowi transgenu lub białku komórkowemu (np.., β-aktyna, Rycina 8) w celu oceny wiązania komórek BTE.
  3. [O] Ocena funkcjonalności immunologicznej wyizolowanych immunomodulatorów.
    1. [O] Zidentyfikować odpowiednie testy zgodnie z charakterystyką kodowanego immunomodulatora. W zależności od oczekiwanej aktywności immunomodulacyjnej można zastosować metody oceniające proliferację, migrację, dojrzewanie, aktywację lub cytotoksyczność komórek.
      UWAGA: [O] Proliferację komórek można analizować za pomocą CFSE59 etykietowanie lub barwienie Ki6760Do analizy migracji komórek można wykorzystać eksperymenty typu Transwell lub testy gojenia ran (scratch assay).61Dojrzałość i aktywację komórek można ocenić, stosując odpowiednie protokoły barwienia dla poszczególnych markerów. [B] Dostępne techniki oceny cytotoksyczności komórkowej pośredniczonej przez BTE obejmują pomiary impedancji oraz test uwalniania chromu. W przypadku wyboru testu uwalniania chromu należy przestrzegać właściwych środków bezpieczeństwa podczas pracy z materiałem radioaktywnym.
    2. [B] Jako niepromieniotwórczą alternatywę, poniższy opis szczegółowo przedstawia sposób oceny cytotoksyczności komórkowej indukowanej przez BTE za pomocą testu uwalniania LDH (opisanego wcześniej w skrócie38).
      1. [B] Określ warunki, które zostaną przetestowane podczas eksperymentu (zob. Rycina 9 (na przykład). Punkty czasowe (od godzin do dni), stężenia immunomodulatora (od pg/mL do µg/mL) oraz stosunki liczby komórek efektorowych do komórek docelowych (E:T) (na przykład od 1:50 do 50:1) mogą być zróżnicowane. Próbki należy zawsze przygotowywać w trzech powtórzeniach.
      2. [B] Należy uwzględnić próbki bez białka i bez komórek efektorowych, które stanowią kontrole spontanicznego uwalniania LDH dla pojedynczych typów komórek (TProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. oraz Esp), kontrolę maksymalnej lizy komórek docelowych (Tmaks.) z dodatkiem detergentu przed odczytem, kontrolą zawierającą wyłącznie medium oraz kontrolą objętości dla Tmaks..
        UWAGA: [B] Wymagana liczba komórek docelowych oraz czasy inkubacji mogą się różnić. Należy przeprowadzić wstępne próby bez komórek efektorowych i immunomodulatorów w celu wyznaczenia optymalnych parametrów. Należy uwzględnić TProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. oraz Tmaks. próbki oraz odpowiadające im kontrole w celu oceny różnych liczb komórek i punktów czasowych.
      3. [B] Izolować komórki efektorowe układu odpornościowego (np. poprzez centryfugowanie krwi ludzkiej w gradiencie gęstości w celu otrzymania PBMC)58 lub selekcja negatywna limfocytów T mysich z splenocytów mysich62).
      4. [B] Wysiać komórki docelowe zgodnie z krokiem 4.3.2 (np., (5 x 10³ na dołek) w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U.
      5. [B] Dodaj wyizolowane białko w odpowiednich stężeniach do poszczególnych próbek. Dodaj efektorowe komórki immunologiczne w odpowiednich stosunkach. Dopełnij objętość pożywką do całkowitej objętości 100 µL na studzienkę.
      6. [B] Inkubować przez czas określony w kroku 4.3.2, zazwyczaj od 4 do 48 h (24 h dla niestymulowanych PBMC i 48 h dla świeżo wyizolowanych limfocytów T myszy; krótsze czasy inkubacji mogą mieć zastosowanie w przypadku wstępnie stymulowanych komórek odpornościowych), w temperaturze 37 °C i przy 5% CO22.
      7. [B] Na 45 minut przed pobraniem próbek dodać 10 µL 10-krotnego roztworu lizującego do studzienek zawierających Tmaksymalny próbki oraz odpowiadające im kontrole ośrodka. Kontynuować inkubację.
      8. [B] Odwirować komórki z prędkością 250 x g g przez 4 min. Przenieś 50 µL każdego supernatantu do płytki 96-dołkowej z płaskim dnem. Nie przenosić komórek, aby uniknąć obecności LDH związanej z komórkami.
      9. [B] Przygotować roztwór substratu zgodnie z instrukcją producenta. Dodać 50 µL do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 min lub do momentu Tmaksymalny próbki przybierają głęboki czerwony kolor.
      10. [B] Do każdej dołki dodaj 50 µL roztworu stopującego. Pęcherzyki powietrza usuń poprzez wirowanie przez 1 min przy 4 000 x gor ręcznie za pomocą igły pustej. Pomiar absorbancji optycznej należy przeprowadzić przy 490 nm.
      11. [B] Oblicz wartości procentowej lizy swoistej dla każdej próbki.
        1. [B] Oblicz średnie wartości dla powtórzeń kontroli ośrodka z roztworem lizującym i bez niego. Odejmij uzyskane wartości od próbek eksperymentalnych oraz od Tmaks. or odpowiednio kontrole uwalniania spontanicznego. W dalszych obliczeniach należy wykorzystać te wartości skorygowane o tło.
        2. [B] Oblicz średnie dla skorygowanego o tło Tmaksymalne, Tgat., oraz Egat. kontrole. Wykorzystując te średnie wartości, z poniższego równania można wyznaczyć procent specyficznej lizy dla każdej próbki:

          Calculation formula for percent specific lysis in cell assay; shown as equation.
        3. [B] Wykres wartości procentowej lizy swoistej kontra stężenie białka lub stosunek E:T i porównaj je z próbkami kontrolnymi z niecelującym kontrolerem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 ilustruje mechanizm działania onkolitycznych wirusów odry kodujących bispecyficzne engagery limfocytów T. Schemat blokowy przedstawiający przebieg tego protokołu zaprezentowano na Rysunku 2. Rysunek 3 pokazuje przykład zmodyfikowanego genomu onkolitycznego wirusa odry. Stanowi on wizualną reprezentację specyficznych zmian wprowadzonych do antygenomu wirusa odry oraz szczegó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Immunoterapia onkolityczna (tj. OVT w połączeniu z immunomodulacją) jest bardzo obiecująca w leczeniu nowotworów, wymagając dalszego rozwoju i optymalizacji wirusów onkolitycznych kodujących białka immunomodulujące. Protokół ten opisuje metody generowania i walidacji takich wektorów do późniejszych testów w odpowiednich modelach przedklinicznych i potencjalnego przyszłego przełożenia klinicznego na nowatorskie terapie przeciwnowotworowe.

Dostępnych jest wiele różnych platform wirusów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

C.E. Engeland jest wymieniony jako współtwórca patentu dotyczącego wirusów RNA do immunoterapii nowotworów, należącego do Uniwersytetu w Heidelbergu. J.P.W. Heidbuechel nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te metody zostały opracowane w Grupie Wiroterapii kierowanej przez Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts w Narodowym Centrum Chorób Nowotworowych w Heidelbergu. Jesteśmy wdzięczni jemu i wszystkim członkom zespołu laboratoryjnego, zwłaszcza dr Tobiasowi Speckowi, dr Rūcie Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler i Jessice Albert. Prace te były wspierane przez Else Kröner-Fresenius-Stiftung (grant 2015_A78 dla C.E. Engeland) oraz Niemiecką Narodową Fundację Nauki (DFG, grant EN 1119/2-1 dla C.E. Engeland). J.P.W. Heidbuechel otrzymuje stypendium Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szybki DNA Dephos & Zestaw do ligacjiRoche Life Science, Mannheim, Niemcy4898117001
Zestaw do klonowania CloneJET PCRThermo Fisher Scientific, St. Leon-RotK1231
AgarozaSigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyA9539-500G
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu QIAGEN, Hilden, Niemcy28704
NEB 10-beta Kompetentny E. coliNew England Biolabs (NEB), Frankfurt nad Menem, NiemcyC3019I
LB medium po LennoxCarl Roth, Karlsruhe, NiemcyX964.1
AmpicillinCarl Roth, Karlsruhe, NiemcyHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN, Hilden, Niemcy27104
Enzym restrykcyjny HindIII-HFNew England Biolabs (NEB), Frankfurt nad Menem, NiemcyR3104S
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen, Darmstadt, Niemcy31966-021
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Biosera, Boussens, FrancjaFB-1280/500
FugeneHDPromega, Mannheim, NiemcyE2311można zastąpić wybranym odczynnikiem do transfekcji
KanamycinSigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyK0129
Ogniwa VeroATCC, Manassas, VA, USACCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46J. Heidbuechel, DKFZ Heidelbergdostępne na żądanie
Granta-519DSMZ, Brunszwik, NiemcyACC 342
Opti-MEM (podłoże bez surowicy)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Niemcy31985070
Komórka kolorymetryczna Viability Kit III (XTT)PromoKine, Heidelberg, NiemcyPK-CA20-300-1000zawiera odczynnik XTT
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Niemcy14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin ColumnsQIAGEN, Hilden, Niemcy31014
Chlorek soduCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy3957.3
ImidazolCarl Roth, Karlsruhe, NiemcyI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10  kDaMerck, Darmstadt, NiemcyUFC901024
Zestaw do oznaczania białek BCA MerckMilipore71285-3
IgG z ludzkiej surowicySigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy130-092-257RRID: AB_871939
Mysia IgG1, kontrola izotypu kappa, fikoerytryna sprzężona, klon MOPC-21 przeciwciałoBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy555749RRID: AB_396091
Przeciwciało anty-HA-biotyny, klon 3F10Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy12158167001RRID: AB_390915
Mikrokulki antybiotynoweMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy130-042-201
Separator MiniMACSMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy130-042-303
Bufor RIPARockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USAMB-030-0050
CytoTox 96 Test cytotoksyczności nieradioaktywnejPromega, Mannheim, NiemcyG1780Zawiera 10x roztwór do lizy, roztwór substratowy (mieszanina substratów i bufor do oznaczania) i roztwór zatrzymujący
Podnośnik komórekCorning, Reynosa, Meksyk3008
Talerze 10 cmCorning, Oneonta, NY, USA430167
Szalki 15 cmGreiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy639160
Płytki 96-dołkowe, TPP z dnem U,Trasadingen, Szwajcaria92097
Płytki 96-dołkowe, płaskodenneNeolab, Heidelberg, Niemcy353072
Płytki 6-dołkoweNeolab, Heidelberg, Niemcy353046
Płytki 12-dołkoweNeolab, Heidelberg, Niemcy353043
Probówki 50 mlnerbe plus, Winsen/Luhe, Niemcy02-572-3001
Kolby do hodowli komórkowych T175Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot159910
0,22 &mikro; m filtersMerck, Darmstadt, NiemcySLGPM33RS

Bibliografia

  1. Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
  2. Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of Oncolytic Viruses. Viruses. 8 (2), (2016).
  3. Twumasi-Boateng, K., Pettigrew, J. L., Kwok, Y. Y. E., Bell, J. C. Oncolytic viruses as engineering platforms for combination immunotherapy. Nature Reviews Cancer. , (2018).
  4. Achard, C., et al. Lighting a Fire in the Tumor Microenvironment Using Oncolytic Immunotherapy. EBioMedicine. 31, 17-24 (2018).
  5. Kelly, E., Russell, S. J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 15 (4), 651-659 (2007).
  6. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nature Biotechnology. 30 (7), 658-670 (2012).
  7. Russell, S. J., Peng, K. W. Oncolytic Virotherapy: A Contest between Apples and Oranges. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (5), 1107-1116 (2017).
  8. Seymour, L. W., Fisher, K. D. Oncolytic viruses: finally delivering. British Journal of Cancer. 114 (4), 357-361 (2016).
  9. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  10. Gao, Q., Park, M. S., Palese, P. Expression of transgenes from newcastle disease virus with a segmented genome. Journal of Virology. 82 (6), 2692-2698 (2008).
  11. Billeter, M. A., Naim, H. Y., Udem, S. A. Reverse genetics of measles virus and resulting multivalent recombinant vaccines: applications of recombinant measles viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 329, 129-162 (2009).
  12. Matveeva, O. V., Guo, Z. S., Shabalina, S. A., Chumakov, P. M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. Molecular Therapy Oncolytics. 2, (2015).
  13. Suter, S. E., et al. In vitro canine distemper virus infection of canine lymphoid cells: a prelude to oncolytic therapy for lymphoma. Clinical Cancer Research. 11 (4), 1579-1587 (2005).
  14. Ammayappan, A., Russell, S. J., Federspiel, M. J. Recombinant mumps virus as a cancer therapeutic agent. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16019(2016).
  15. Schirrmacher, V. Oncolytic Newcastle disease virus as a prospective anti-cancer therapy. A biologic agent with potential to break therapy resistance. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (12), 1757-1771 (2015).
  16. Saga, K., Kaneda, Y. Oncolytic Sendai virus-based virotherapy for cancer: recent advances. Oncolytic Virotherapy. 4, 141-147 (2015).
  17. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Netesov, S. V., Onikienko, S. B., Chumakov, P. M. Mechanisms of Oncolysis by Paramyxovirus Sendai. Acta Naturae. 7 (2), 6-16 (2015).
  18. Gainey, M. D., Manuse, M. J., Parks, G. D. A hyperfusogenic F protein enhances the oncolytic potency of a paramyxovirus simian virus 5 P/V mutant without compromising sensitivity to type I interferon. Journal of Virology. 82 (19), 9369-9380 (2008).
  19. Engeland, C. E., et al. A Tupaia paramyxovirus vector system for targeting and transgene expression. The Journal of General Virology. 98 (9), 2248-2257 (2017).
  20. Russell, S. J., Peng, K. W. Measles virus for cancer therapy. Current Topics in Microbiology and Immunology. 330, 213-241 (2009).
  21. Aref, S., Bailey, K., Fielding, A. Measles to the Rescue: A Review of Oncolytic Measles Virus. Viruses. 8 (10), (2016).
  22. Demicheli, V., Rivetti, A., Debalini, M. G., Di Pietrantonj, C. Vaccines for measles, mumps and rubella in children. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), 004407(2012).
  23. Radecke, F., et al. Rescue of measles viruses from cloned DNA. The EMBO Journal. 14 (23), 5773-5784 (1995).
  24. Martin, A., Staeheli, P., Schneider, U. RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efficacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication. Journal of Virology. 80 (12), 5708-5715 (2006).
  25. Russell, S. J., et al. Remission of disseminated cancer after systemic oncolytic virotherapy. Mayo Clinic Proceedings. 89 (7), 926-933 (2014).
  26. Hardcastle, J., et al. Immunovirotherapy with measles virus strains in combination with anti-PD-1 antibody blockade enhances antitumor activity in glioblastoma treatment. Neuro-Oncology. 19 (4), 493-502 (2017).
  27. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  28. Galanis, E., et al. Phase I trial of intraperitoneal administration of an oncolytic measles virus strain engineered to express carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian cancer. Cancer Research. 70 (3), 875-882 (2010).
  29. Galanis, E., et al. Oncolytic measles virus expressing the sodium iodide symporter to treat drug-resistant ovarian cancer. Cancer Research. 75 (1), 22-30 (2015).
  30. Kurokawa, C., et al. Constitutive Interferon Pathway Activation in Tumors as an Efficacy Determinant Following Oncolytic Virotherapy. Journal of the National Cancer Institute. , (2018).
  31. Msaouel, P., et al. Clinical Trials with Oncolytic Measles Virus: Current Status and Future Prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  32. Grote, D., Cattaneo, R., Fielding, A. K. Neutrophils contribute to the measles virus-induced antitumor effect: enhancement by granulocyte macrophage colony-stimulating factor expression. Cancer Research. 63 (19), 6463-6468 (2003).
  33. Grossardt, C., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-armed oncolytic measles virus is an effective therapeutic cancer vaccine. Human Gene Therapy. 24 (7), 644-654 (2013).
  34. Iankov, I. D., et al. Expression of immunomodulatory neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori enhances the antitumor activity of oncolytic measles virus. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (6), 1139-1147 (2012).
  35. Engeland, C. E., et al. CTLA-4 and PD-L1 Checkpoint Blockade Enhances Oncolytic Measles Virus Therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (11), 1949-1959 (2014).
  36. Veinalde, R., et al. Oncolytic measles virus encoding interleukin-12 mediates potent antitumor effects through T cell activation. Oncoimmunology. 6 (4), 1285992(2017).
  37. Hutzler, S., et al. Antigen-specific oncolytic MV-based tumor vaccines through presentation of selected tumor-associated antigens on infected cells or virus-like particles. Scientific Reports. 7 (1), 16892(2017).
  38. Speck, T., et al. Targeted BiTE expression by an oncolytic vector augments therapeutic efficacy against solid tumors. Clinical Cancer Research. , (2018).
  39. Andtbacka, R. H., et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33 (25), 2780-2788 (2015).
  40. Ribas, A., et al. Oncolytic Virotherapy Promotes Intratumoral T Cell Infiltration and Improves Anti-PD-1 Immunotherapy. Cell. 170 (6), 1109-1119 (2017).
  41. Patel, S. J., et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature. 548 (7669), 537-542 (2017).
  42. Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science. 73, Unit 9.9 (2013).
  43. Cattaneo, R., Rebmann, G., Baczko, K., ter Meulen, V., Billeter, M. A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains. Virology. 160 (2), 523-526 (1987).
  44. Gutsche, I., et al. Structural virology. Near-atomic cryo-EM structure of the helical measles virus nucleocapsid. Science. 348 (6235), New York, N.Y. 704-707 (2015).
  45. Kolakofsky, D., et al. Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. Journal of Virology. 72 (2), 891-899 (1998).
  46. Kolakofsky, D., Roux, L., Garcin, D., Ruigrok, R. W. Paramyxovirus mRNA editing, the "rule of six" and error catastrophe: a hypothesis. The Journal of General Virology. 86, Pt 7 1869-1877 (2005).
  47. Parks, C. L., et al. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. Journal of Virology. 75 (2), 921-933 (2001).
  48. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  49. JoVE Science Education Database. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  50. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  51. Rota, J. S., Wang, Z. D., Rota, P. A., Bellini, W. J. Comparison of sequences of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Research. 31 (3), 317-330 (1994).
  52. Bankamp, B., Takeda, M., Zhang, Y., Xu, W., Rota, P. A. Genetic characterization of measles vaccine strains. The Journal of Infectious Diseases. 204, Suppl 1 533-548 (2011).
  53. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of Experimental Medicine. 99 (2), 167-182 (1954).
  54. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  55. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  56. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  57. JoVE Science Education Database. The Western Blot. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  58. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), e51554(2014).
  59. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visualized Experiments. (44), (2010).
  60. Gerdes, J. Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological diagnostic and prognostic evaluations in human malignancies. Seminars in Cancer Biology. 1 (3), 199-206 (1990).
  61. JoVE Science Education Database. The Transwell Migration Assay. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  62. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), e54596(2016).
  63. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  64. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
  65. Yu, F., et al. T-cell engager-armed oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (1), 102-111 (2014).
  66. Fajardo, C. A., et al. Oncolytic Adenoviral Delivery of an EGFR-Targeting T-cell Engager Improves Antitumor Efficacy. Cancer Research. 77 (8), 2052-2063 (2017).
  67. Freedman, J. D., et al. Oncolytic adenovirus expressing bispecific antibody targets T-cell cytotoxicity in cancer biopsies. EMBO Molecular Medicine. 9 (8), 1067-1087 (2017).
  68. Wing, A., et al. Improving CART-Cell Therapy of Solid Tumors with Oncolytic Virus-Driven Production of a Bispecific T-cell Engager. Cancer Immunology Research. 6 (5), 605-616 (2018).
  69. Myers, R. M., et al. Preclinical pharmacology and toxicology of intravenous MV-NIS, an oncolytic measles virus administered with or without cyclophosphamide. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (6), 700-710 (2007).
  70. Rittner, K., Schreiber, V., Erbs, P., Lusky, M. Targeting of adenovirus vectors carrying a tumor cell-specific peptide: in vitro and in vivo studies. Cancer Gene Therapy. 14 (5), 509-518 (2007).
  71. Nakamura, T., et al. Rescue and propagation of fully retargeted oncolytic measles viruses. Nature Biotechnology. 23 (2), 209-214 (2005).
  72. Campadelli-Fiume, G., et al. Retargeting Strategies for Oncolytic Herpes Simplex Viruses. Viruses. 8 (3), 63(2016).
  73. Leber, M. F., et al. MicroRNA-sensitive oncolytic measles viruses for cancer-specific vector tropism. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (6), 1097-1106 (2011).
  74. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-mediated multi-tissue detargeting of oncolytic measles virus. Cancer Gene Therapy. 21 (9), 373-380 (2014).
  75. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and oncolytic viruses. Current Opinion in Virology. 13, 40-48 (2015).
  76. Miest, T. S., Cattaneo, R. New viruses for cancer therapy: meeting clinical needs. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 23-34 (2014).
  77. Phuong, L. K., et al. Use of a vaccine strain of measles virus genetically engineered to produce carcinoembryonic antigen as a novel therapeutic agent against glioblastoma multiforme. Cancer Research. 63 (10), 2462-2469 (2003).
  78. Dingli, D., et al. Image-guided radiovirotherapy for multiple myeloma using a recombinant measles virus expressing the thyroidal sodium iodide symporter. Blood. 103 (5), 1641-1646 (2004).
  79. Abate-Daga, D., et al. Oncolytic adenoviruses armed with thymidine kinase can be traced by PET imaging and show potent antitumoural effects by ganciclovir dosing. PLoS One. 6 (10), 26142(2011).
  80. Ungerechts, G., et al. Lymphoma chemovirotherapy: CD20-targeted and convertase-armed measles virus can synergize with fludarabine. Cancer Research. 67 (22), 10939-10947 (2007).
  81. Ketzer, P., et al. Artificial riboswitches for gene expression and replication control of DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 554-562 (2014).
  82. Freedman, J., et al. Targeting T-cells to human cancer associated fibroblasts using an oncolytic virus expressing a FAP-specific T-cell engager. Keystone Symposia & Digitell, Inc. , (2018).
  83. Nishio, N., et al. Armed oncolytic virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid tumors. Cancer Research. 74 (18), 5195-5205 (2014).
  84. Bressy, C., Benihoud, K. Association of oncolytic adenoviruses with chemotherapies: an overview and future directions. Biochemical Pharmacology. 90 (2), 97-106 (2014).
  85. Wennier, S. T., Liu, J., McFadden, G. Bugs and drugs: oncolytic virotherapy in combination with chemotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (9), 1817-1833 (2012).
  86. Fillat, C., Maliandi, M. V., Mato-Berciano, A., Alemany, R. Combining oncolytic virotherapy and cytotoxic therapies to fight cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6513-6521 (2014).
  87. Li, H., Peng, K. W., Russell, S. J. Oncolytic measles virus encoding thyroidal sodium iodide symporter for squamous cell cancer of the head and neck radiovirotherapy. Human Gene Therapy. 23 (3), 295-301 (2012).
  88. Opyrchal, M., et al. Effective radiovirotherapy for malignant gliomas by using oncolytic measles virus strains encoding the sodium iodide symporter (MV-NIS). Human Gene Therapy. 23 (4), 419-427 (2012).
  89. Mansfield, D., et al. Oncolytic Vaccinia virus and radiotherapy in head and neck cancer. Oral Oncology. 49 (2), 108-118 (2013).
  90. Miest, T. S., et al. Envelope-chimeric entry-targeted measles virus escapes neutralization and achieves oncolysis. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (10), 1813-1820 (2011).
  91. Santiago, D. N., et al. Fighting Cancer with Mathematics and Viruses. Viruses. 9 (9), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wektory onkolitycznewirus odrybispecyficzny aktywator limfocyt w Tpropagacja wirusatworzenie syncyti wtest uwalniania LDHcytometria przep ywowaanaliza immunoblottingowamiareczkowanie wirusarekombinowane DNA

Powiązane artykuły