Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ze względu na ich kluczową rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej, makrofagi są nieustannie przedmiotem intensywnych badań i stanowią obiecujący cel terapeutyczny w wielu zaburzeniach, takich jak choroby autoimmunologiczne, miażdżyca i rak. Wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi jest cennym podejściem z wyboru do badania i manipulowania funkcją makrofagów; jednak transfekcja makrofagów za pomocą siRNA jest często uważana za wyzwanie techniczne, a obecnie dostępnych jest niewiele metodologii poświęconych transferowi siRNA do makrofagów. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI-SPIONs) jako nośnika do ukierunkowanego dostarczania siRNA do makrofagów. PEI-SPIONy są zdolne do wiązania i całkowitej kondensacji siRNA, gdy stosunek wagowy Fe:siRNA osiąga 4 i więcej. In vitro te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do pierwotnych makrofagów, a także do linii komórkowej RAW 264.7 podobnej do makrofagów, bez uszczerbku dla żywotności komórek w optymalnej dawce do transfekcji, a ostatecznie indukują wyciszanie docelowego genu za pośrednictwem siRNA. Oprócz tego, że PEI-SPIONy są wykorzystywane do transfekcji siRNA in vitro, są również obiecującym narzędziem do dostarczania siRNA do makrofagów in vivo. Ze względu na połączone cechy właściwości magnetycznych i zdolności wyciszania genów, oczekuje się, że podawane systemowo cząstki PEI-SPION/siRNA nie tylko modulują funkcję makrofagów, ale także umożliwiają obrazowanie i śledzenie makrofagów. W istocie, PEI-SPIONs stanowią prostą, bezpieczną i skuteczną niewirusową platformę do dostarczania siRNA do makrofagów zarówno in vitro, jak i in vivo.
Wprowadzenie
Makrofagi to rodzaj wrodzonych komórek odpornościowych rozmieszczonych we wszystkich tkankach ciała, choć w różnych ilościach. Wytwarzając różnorodne cytokiny i inne mediatory, odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed atakującymi patogenami mikrobiologicznymi, w naprawie tkanek po urazie oraz w utrzymaniu homeostazy tkanek1. Ze względu na swoje znaczenie, makrofagi są nieustannie przedmiotem intensywnych badań. Jednak pomimo jego rozpowszechnienia w badaniach nad regulacją genów i funkcjami, wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA ma mniejsze szanse powodzenia w makrofagach, ponieważ komórki te - szczególnie makrofagi pierwotne - są często trudne do transfekcji. Można to przypisać stosunkowo wysokiemu stopniowi toksyczności związanemu z większością dobrze ugruntowanych metod transfekcji, w których błona komórkowa jest chemicznie (np. za pomocą polimerów i lipidów) lub fizycznie (np. przez elektroporację i pistolety genowe) przerywana, aby umożliwić cząsteczkom siRNA przejście przez błonę, co drastycznie zmniejsza żywotność makrofagów2,3. Ponadto makrofagi są dedykowanymi fagocytami bogatymi w enzymy degradacyjne. Enzymy te mogą uszkadzać integralność siRNA, osłabiając jego skuteczność wyciszania, nawet jeśli specyficzne dla genu siRNA zostało dostarczone do komórki3,4. Dlatego skuteczny system dostarczania siRNA ukierunkowany na makrofagi musi chronić integralność i stabilność siRNA podczas dostarczania4.
Coraz bardziej oczywiste jest, że dysfunkcyjne makrofagi są zaangażowane w inicjację i postęp pewnych powszechnych zaburzeń klinicznych, takich jak choroby autoimmunologiczne, miażdżyca i rak. Z tego powodu modulacja funkcji makrofagów, na przykład za pomocą siRNA, staje się atrakcyjną metodologią leczenia tych zaburzeń5,6,7. Chociaż poczyniono znaczne postępy, głównym wyzwaniem strategii leczenia opartej na siRNA jest słaba swoistość komórkowa siRNA podawanego ogólnoustrojowo i niewystarczający wychwyt siRNA przez makrofagi, co w konsekwencji prowadzi do niepożądanych skutków ubocznych. W porównaniu z terapiami opartymi na wolnych kwasach nukleinowych, które zwykle nie mają optymalnej selektywności komórek i często prowadzą do działań niepożądanych poza celem, nanocząstki (NP), ze względu na ich spontaniczną skłonność do wychwytywania przez układ siateczkowo-śródbłonkowy, mogą być modyfikowane do pasywnego kierowania na makrofagi in vivo, co pozwala na poprawę skuteczności terapeutycznej przy minimalnych skutkach ubocznych8. Obecnie nanocząsteczki badane pod kątem dostarczania cząsteczek RNA obejmują nieorganiczne nanonośniki, różne liposomy i polimery9. Wśród nich polietylenoimina (PEI), rodzaj kationowych polimerów zdolnych do wiązania i kondensacji kwasów nukleinowych w stabilizowane nanocząsteczki, wykazuje najwyższą zdolność dostarczania RNA9,10. PEI chroni kwasy nukleinowe przed degradacją enzymatyczną i nieenzymatyczną, pośredniczy w ich przenoszeniu przez błonę komórkową i wspomaga ich uwalnianie wewnątrzkomórkowe. Chociaż początkowo wprowadzono go jako odczynnik do dostarczania DNA, następnie wykazano, że PEI jest atrakcyjną platformą do dostarczania siRNA in vivo, zarówno lokalnie, jak i ogólnoustrojowo9,10.
Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPION) okazały się bardzo obiecujące w biomedycynie, dzięki swoim właściwościom magnetycznym, biokompatybilności, porównywalnym rozmiarom do biologicznie ważnych obiektów, wysokiemu stosunkowi powierzchni do objętości i łatwej do adaptacji powierzchni do mocowania bioagentu11. Na przykład, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako środka kontrastowego i szybkie wchłanianie przez makrofagi, SPION-y stały się ulubionym narzędziem klinicznym do obrazowania makrofagów tkankowych12. Chociaż SPION-y były również szeroko badane jako nośniki dostarczania kwasów nukleinowych11,13,14,15, o ile nam wiadomo, literatura zawiera niewiele doniesień o SPIONach jako nośniku do dostarczania siRNA ukierunkowanego na makrofagi. W przypadku dostarczania genów przez SPION, ich powierzchnia jest zwykle pokryta warstwą hydrofilowych polimerów kationowych, na których ujemnie naładowane kwasy nukleinowe mogą być elektrostatycznie przyciągane i wiązane. W niniejszej pracy przedstawiono metodę syntezy SPION-ów, których powierzchnia jest modyfikowana za pomocą niskocząsteczkowych (10 kDa), rozgałęzionych PEI (PEI-SPIONs). Te magnetyczne nanoplatformy są następnie wykorzystywane do kondensacji siRNA, tworząc kompleksy PEI-SPION/siRNA, które umożliwiają transport siRNA do komórki. Uważamy, że spontaniczna fagocytoza SPION-ów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego16, w połączeniu z silną zdolnością wiązania i kondensacji kwasów nukleinowych przez PEI, sprawia, że PEI-SPIONs są odpowiednie do efektywnego transportu siRNA do makrofagów. Przedstawione tutaj dane potwierdzają wykonalność wyciszania genów za pośrednictwem PEI-SPION/siRNA w makrofagach w hodowli, a także in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie metody z udziałem żywych zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich użytkowania na Uniwersytecie Południowo-Wschodnim w Chinach.
1. Przygotowanie PEI-SPIONs
- Przygotowanie SPION-ów modyfikowanych kwasem oleinowym
- Rozpuścić FeCl3•6H2Oi FeSO4•7H2Ow wodzie pod ochronąN2.
- Dodać 28 g FeCl3•6H2O i 20 g FeSO4•7H2O do 80 ml wody dejonizowanej w zlewce. Wprowadzić N2 do wody przez szklany przewód i mieszać, aż ciało stałe się rozpuści.
- Podgrzać mieszaninę reakcyjną do temperatury 72 °C z szybkością mieszania 800 obr./min, a następnie dodać 40 ml wody amoniakalnej (28%). Mieszaj przez 5 minut.
- Dodać kroplami 9 ml kwasu oleinowego do wyżej wymienionego roztworu i mieszać w temperaturze 72 °C przez 3 godziny.
- Schłodzić powstały roztwór do temperatury pokojowej (RT). Wytrącić roztwór przez separację magnetyczną.
- Przepłukać osad zawierający SPIONs 3x absolutnym alkoholem etylowym, a następnie rozproszyć osad w 100 ml N-heksanu.
- Rozpuścić FeCl3•6H2Oi FeSO4•7H2Ow wodzie pod ochronąN2.
- Przygotowanie SPION-ów modyfikowanych kwasem dimerkaptobursztynowym
- Dodać 800 mg SPION-ów modyfikowanych kwasem oleinowym (OA) rozproszonych w 200 ml N-heksanu i 400 mg kwasu dimerkaptobursztynowego (DMSA) zdyspergowanego w 200 ml acetonu do kolby trójszyjkowej w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
Uwaga: Aby określić stężenie SPION modyfikowanego OA uzyskane w poprzednim kroku, należy pobrać niewielką objętość (np. 1 ml) dyspersji SPION, ulatniać N-heksan i zważyć otrzymany proszek. - Dodać kroplami 200 μl trietyloaminy do wyżej wymienionego roztworu, mieszając z prędkością 1 000 obr./min i refluksując.
- Po 5 godzinach mieszania i refluksowania uzyskać osad przez separację magnetyczną.
- Zdyspergować hydrofilowe SPION-y w wodzie dejonizowanej jednorodnie, regulując pH roztworu za pomocą wodorotlenku tetrametyloamonu.
- Dodać 800 mg SPION-ów modyfikowanych kwasem oleinowym (OA) rozproszonych w 200 ml N-heksanu i 400 mg kwasu dimerkaptobursztynowego (DMSA) zdyspergowanego w 200 ml acetonu do kolby trójszyjkowej w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
- Przygotowanie PEI-SPION-PION-ów
- Dodawać kroplami roztwór koloidalny SPION modyfikowany DMSA do roztworu PEI (10 kDa) w kolbie trójszyjkowej o pojemności 500 ml mieszając mechanicznie przy 1,000 obr./min przez 2 godziny (WFe:WPEI = 1:3).
Uwaga: Ładunek i rozmiar PEI-SPIONs różnią się w zależności od stosunku WFe do WPEI. Stosunek WFe:WPEI wynoszący 1:3 może być dobrym punktem wyjścia do syntezy PEI-SPIONs odpowiednich do dostarczania siRNA. - Dodać otrzymany roztwór do probówki ultrafiltracyjnej o masie cząsteczkowej odcięcia 100 kDa i zawartości 15 ml, a następnie odwirować przy 5,400 x g przez 10 minut, aż pozostały roztwór osiągnie 1 ml. Dodaj wodę dejonizowaną do roztworu, aby ponownie uzyskać objętość 15 ml i powtórz powyższy proces 10 razy, aby uzyskać produkt końcowy. Następnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać produkt końcowy w temperaturze 4 °C.
- Określić stężenie Fe w PEI-SPIONs metodą kolorymetryczną przy użyciu phenanthroline17. Rozcieńczyć PEI-SPIONs dejonizowaną sterylną wodą do stężenia 1 mg Fe/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Rozcieńczyć 10 μl roztworu PEI-SPION (1 mg Fe/ml) do 1 ml wodą dejonizowaną, a następnie sprawdzić jego wielkość hydrodynamiczną i potencjał zeta za pomocą urządzenia do dynamicznego rozpraszania światła.
Uwaga: Przygotować PEI-SPIONs w zakresie około 30 - 50 nm. W tym zakresie wielkości wpływ wielkości NP na wiązanie siRNA i wychwyt komórkowy nie wydaje się być znaczący. PEI-SPIONs o średnim potencjale zeta powyżej +37 mV mogą być toksyczne w zakresie dawek transfekcji, a w celu zapewnienia bezpieczeństwa należy przeprowadzić test cytotoksyczności. Ładunek powierzchniowy i rozmiar hydrodynamiczny nanocząstek można kontrolować w pożądanym zakresie, dostosowując zawartość PEI.
- Dodawać kroplami roztwór koloidalny SPION modyfikowany DMSA do roztworu PEI (10 kDa) w kolbie trójszyjkowej o pojemności 500 ml mieszając mechanicznie przy 1,000 obr./min przez 2 godziny (WFe:WPEI = 1:3).
2. Przygotowanie i elektroforeza w żelu agarozowym nanocząsteczek PEI-SPION/siRNA
- Rozcieńczyć siRNA wodą wolną od RNaz, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μM (0,26 μg/μL).
- Przygotuj pięć probówek mikrowirówek wolnych od RNaz oznaczonych 0, 1, 2, 4 i 8. Etykiety reprezentują różne proporcje wagowe Fe:siRNA. Odpipetować 3 μl roztworu siRNA do wszystkich probówek (~0,8 μg siRNA/probówkę).
- Dodaj 0, 0,8, 1,6, 3,2 i 6,4 μg Fe w postaci PEI-SPIONs do probówek oznaczonych odpowiednio 0, 1, 2, 4 i 8. Całkowita objętość próbki w każdej probówce nie powinna przekraczać 20 μl. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
- Inkubować mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić tworzenie kompleksu PEI-SPION/siRNA. W tym okresie przygotuj 3% żel agarozowy z agarozą o wysokiej czystości.
Uwaga: Można przygotować i przetestować dodatkowe kompleksy PEI-SPION/siRNA o innych proporcjach Fe:siRNA (np. 5 lub 6). - Dodać 1 μl 6-krotnego buforu obciążającego DNA na próbkę o objętości 5 μl i ostrożnie wymieszać. Załadować wszystkie próbki i przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 5 V/cm, aż błękit bromofenolowy będzie migrował aż do dwóch trzecich długości żelu. Żel barwić bromkiem etydyny (EB) przez 15 - 20 min.
Uwaga: Należy użyć świeżo przygotowanego buforu do elektroforezy i roztworu EB. - Wizualizacja pasm siRNA w systemie obrazowania UV. Sprawdź proporcje Fe:siRNA, w których siRNA tworzy kompleksy z PEI-SPION, w wyniku czego prążki reprezentujące wolne siRNA są opóźnione lub niewykrywalne.
3. Transfekcja makrofagów RAW264.7 in vitro
- Hodowla mysich komórek RAW264.7 podobnych do makrofagów w 10-centymetrowym naczyniu przy użyciu kompletnej pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 100 U/ml penicyliny na 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
- Na dzień przed transfekcją odessać pożywkę z komórek i przepłukać je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (pH 7,4). Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny do 10-centymetrowego naczynia. Trypsynizować komórki RAW264.7 przez około 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
- Gdy większość komórek odłączy się (po 5 - 10 minutach), dodaj 5 ml kompletnej pożywki DMEM do naczynia, aby dezaktywować trypsynę. Pigazuj w górę iw dół, aby rozproszyć klastry komórek na pojedyncze komórki.
- Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować go przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml świeżej kompletnej pożywki DMEM i policzyć komórki.
- Płytka 9 x 104 komórki na studzience na płytce 6-dołkowej z 2 ml kompletnej pożywki DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez około 24 godziny
Uwaga: W przypadku używania płytki o innym rozmiarze, dostosuj gęstość platerowanych komórek proporcjonalnie do względnej powierzchni, tak aby komórki osiągnęły 80% zbieżności w momencie transfekcji. - Gdy konfluencja komórek wynosi 80%, usuń pożywkę z komórek i zastąp ją 1 ml kompletnej pożywki DMEM na dołek. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do momentu, gdy kompleksy PEI-SPION/siRNA zostaną przygotowane i będą gotowe do użycia (około 30 min).
- Przygotuj kompleksy PEI-SPION/siRNA: oblicz ilość kompleksów PEI-SPION/siRNA potrzebną do eksperymentu transfekcyjnego. W 1,5 ml probówce wirówkowej bez RNaz wymieszaj odpowiednią ilość PEI-SPIONs z siRNA w danym stosunku Fe:siRNA. Na przykład, aby przygotować nanocząsteczki PEI-SPION/siRNA zawierające 100 μg Fe w stosunku Fe:siRNA 4, dodaj 100 μl (1 mg Fe/ml) PEI-SPIONs do 96 μl siRNA (0,26 μg/μL), a następnie delikatnie wymieszaj je mikropipetą. Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT.
Uwaga: Przygotuj objętość kompleksu PEI-SPION/siRNA, która jest o 10% większa od całkowitej masy końcowej, aby uwzględnić wszelkie przypadkowe straty. Wytwarzaj kompleksy PEI-SPION/siRNA o niskich proporcjach Fe:siRNA, w których cząsteczki siRNA są całkowicie ładowane na PEI-SPION, a zatem można użyć niewielkich ilości PEI-SPION, aby zminimalizować potencjalną cytotoksyczność. Konieczne są eksperymenty pilotażowe (test opóźnienia żelu) w celu optymalizacji stosunku Fe:siRNA. - Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora (krok 3.7). Do każdej studzienki dodawać kroplami wymaganą objętość kompleksu PEI-SPION/siRNA i ostrożnie obracać płytkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do czasu oceny wychwytu komórkowego lub skuteczności knockdownu genu (1 - 3 d).
Uwaga: Transfekcja makrofagów PEI-SPION/siRNA w stężeniu ~15 μg Fe/ml może zmaksymalizować wydajność transfekcji przy jednoczesnej minimalizacji potencjalnej cytotoksyczności.
4. Systemowe dostarczanie siRNA do makrofagów u szczurów z eksperymentalnym zapaleniem stawów
- Uzyskaj specyficzne, wolne od patogenów samce szczurów Wistar w wieku 7 tygodni. Przyzwyczaj szczury przez 7 dni przed użyciem i zapewnij im odpowiednią ilość pożywienia i wody. Wywołać adiuwantowe zapalenie stawów (AA) u szczurów, jak opisano wcześniej18.
- Przygotować kompleksy PEI-SPION/siRNA zgodnie z opisem w kroku 3.8.
- Wstrzyknąć NPs PEI-SPION/siRNA (0,3 mg siRNA/kg) szczurom AA przez żyłę ogonową. Oceń wychwyt komórkowy za pomocą, na przykład, cytometrii przepływowej, biodystrybucji tkanek za pomocą, na przykład, systemu obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym lub efektów terapeutycznych na podstawie, na przykład, analiz klinicznych, histologicznych i radiograficznych w żądanych punktach czasowych18.
Uwaga: W przypadku badań biodystrybucji komórkowej i tkankowej należy potraktować szczury pojedynczym wstrzyknięciem pożądanych nanocząsteczek; w przypadku badań terapeutycznych należy wstrzykiwać szczurom NP, które mają być testowane 1 raz w tygodniu przez trzy kolejne tygodnie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wielkość i potencjał zeta PEI-SPIONs przygotowanych zgodnie z tym protokołem mieściły się odpowiednio w zakresie 29 - 48 nm (indeks polidyspersyjności: 0,12 - 0,23) oraz 30 - 48 mV. Pozostawały one stabilne w wodzie w temperaturze 4 °C przez ponad 12 miesięcy bez wyraźnej agregacji. Aby ocenić ich zdolność do wiązania siRNA, PEI-SPIONs zmieszano z siRNA w różnych stosunkach masowych Fe:siRNA. Rysunek 1 pokazuje, że gdy stosunek masowy Fe:siRNA osiąga wartość ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Makrofagi są oporne na transfekcję za pomocą powszechnie stosowanych metod niewirusowych, takich jak elektroporacja, liposomy kationowe i gatunki lipidów. Tutaj opisaliśmy niezawodną i wydajną metodę transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Korzystając z obecnego protokołu, ponad 90% komórek RAW 264.7 podobnych do makrofagów (Figura 2B) i makrofagów otrzewnowej szczura18 można transfekować siRNA bez znaczącego upośledzenia żywotności komórek. Metoda ta zależy od platfo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81772308) oraz Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (nr 2017YFA0205502).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Ciepły w 37& C kąpiel wodna przed użyciem |
| Surowica bydlęca | Gibco | A31608-02 | |
| Penicylina/streptomycyna (1,5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Zestaw do oznaczania MTS na bazie tetrazolii | Promega | G3582 | Do analizy cytotoksyczności |
| Linia komórkowa RAW 264.7 | Bank Komórek Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny | TCM13 | |
| Płytki do hodowli tkankowych (6-dołkowe) | Corning | 3516 | |
| Naczynia do hodowli tkankowych (10 cm) | Probówki | ||
| (1,5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Szczury Wistar | Centrum Zwierząt Doświadczalnych w Szanghaju Akademii Chińskiej | ||
| Nauki Bacillus Calmette– Gué liofilizowany proszek rin | National Institutes for Food and Drug Control, Chiny | do wywoływania adiuwantowego zapalenia stawów u szczurów | |
| siRNA | GenePharma (Szanghaj, Chiny) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, Chiny) | ||
| Polietylenimina (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Woda amoniakalna | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Kwas oleinowy | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Odczynnik chemiczny dimetylosulfotlenku | Aladdin Co., Ltd. | ||
| FeSO4 i byk; 7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3• 6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Kwas dimerkaptochtynowy | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| rurka ultrafiltracyjna | Millipore | UFC910096 | |
| roztwór wodorotlenku tetrametyloamonu | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Analizator wielkości cząstek i potencjału zeta | Malvern, Anglia | Nano ZS90 |
Bibliografia
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723(2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960(2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472(2015).
- Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224(2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129(2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125(2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577(2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703(2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39(2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
