Artykuł metodologiczny

Jak ustabilizować białko: badania przesiewowe stabilności do testów przesunięcia termicznego i nanoróżnicowej fluorymetrii skaningowej w projekcie Virus-X

29.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58666

⸱

11 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Chemistry, Durham University

W tym artykule

Podsumowanie

A przedstawiono protokół do szybkiego testowania stabilności termicznej białek w różnych warunkach za pomocą testów przesunięcia termicznego i nano różnicowej fluorymetrii skaningowej. Systemy buforowe, sole i dodatki, składające się z trzech unikalnych ekranów stabilności, są testowane z białkami w celu zidentyfikowania odpowiednich do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Streszczenie

Projekt Horizon2020 Virus-X został założony w 2015 roku w celu zbadania wirosfery wybranych ekstremalnych biotopów i odkrycia nowych białek wirusowych. Aby ocenić potencjalną wartość biotechniczną tych białek, głównym wyzwaniem w tym programie jest analiza struktur i funkcji białek. Stabilność próbki białka jest niezbędna do uzyskania miarodajnych wyników testów i zwiększenia krystalizacji celów. Test przesunięcia termicznego (TSA), technika oparta na fluorescencji, jest popularną metodą optymalizacji warunków stabilności białek w wysokoprzepustowości. W TSA stosowane fluorofory są barwnikami zewnętrznymi, wrażliwymi na środowisko. Alternatywną, podobną techniką jest nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa (nanoDSF), która opiera się na natywnej fluorescencji białek. Prezentujemy tutaj nowatorskie sito osmolitowe, 96-stopniowe przesiewanie dodatków organicznych, zaprojektowane w celu przeprowadzenia prób krystalizacji przez wstępne eksperymenty TSA. Wraz z wcześniej opracowanymi sitami pH i soli, zestaw trzech sit zapewnia kompleksową analizę stabilności białek w szerokiej gamie systemów buforowych i dodatków. Użyteczność badań przesiewowych została zademonstrowana w analizie TSA i nanoDSF lizozymu i białka X, białka docelowego projektu Virus-X.

Wprowadzenie

Wiele biotechnologicznie użytecznych enzymów pochodzi ze źródeł wirusowych, takich jak proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV)1 i proteaza ludzkiego rinowirusa typu 3C (HRV 3C)2. Projekt Horizon2020 Virus-X (Rysunek 1)3. Celem tego programu jest (a) rozszerzenie zakresu właściwości znanych rodzin enzymów oraz (b) scharakteryzowanie nowych enzymów o nieznanej jeszcze funkcji (Enzym X). Określenie struktury krystalograficznej odgrywa kluczową rolę w charakterystyce białka docelowego, w szczególności w tych przypadkach, w których sekwencje białek ewoluowały poza rozpoznanie4. Stabilność białka jest kluczowym czynnikiem w procesie krystalizacji; Próbki muszą być konformacyjnie jednorodne i strukturalnie zdrowe przez pewien okres czasu, aby utworzyć wysokiej jakości kryształy dyfrakcyjne. Ponadto do oznaczania aktywności niezbędne jest, aby białka występowały w swojej aktywnej konformacji, co może być również ułatwione przez korzystne środowisko molekularne.

Pomimo rozwoju technologii dostępnej dla krystalografów, krystalizacja białek pozostaje czasochłonnym i pracochłonnym procesem empirycznym5. Wstępne eksperymenty biofizyczne mające na celu poprawę stabilności białka w roztworze dają wyraźnie lepszy punkt wyjścia do krystalizacji białek i zwykle zużywają tylko stosunkowo niewielką ilość próbki białka6,7,8,9. Duża liczba białek docelowych, które mają być badane w ramach tego projektu, wymaga również skalowalnych, wysokoprzepustowych testów stabilności. Jedną z najpopularniejszych metod biofizycznej charakterystyki białek przed krystalizacją jest test przesunięcia termicznego (znany również jako TSA lub różnicowa fluorymetria skaningowa, DSF)10,11.

TSA używają wrażliwego na środowisko barwnika fluorescencyjnego do śledzenia denaturacji termicznej próbek białek. Wiele powszechnie stosowanych barwników ma zmienną aktywność fluorescencyjną w zależności od polaryzacji ich środowiska, często wykazując wysoką moc fluorescencji w środowiskach hydrofobowych, ale ulegając szybkiemu wygaszaniu w środowiskach polarnych12. Białka na ogół powodują wyraźny wzrost fluorescencji barwnika, ponieważ ich hydrofobowe rdzenie zostają odsłonięte podczas denaturacji, po czym często następuje spadek fluorescencji barwnika w bardzo wysokich temperaturach, gdy białka zaczynają się agregować (Rysunek 2).

Podczas gdy barwnik wrażliwy na hydrofobowość jest często dobrym wyborem dla ogólnego zastosowania barwnika TSA, może być nieodpowiedni dla białek z dużymi, odsłoniętymi przez rozpuszczalnik obszarami hydrofobowymi, które często wykazują niekorzystnie wysoką fluorescencję tła. Istnieją fluorofory o alternatywnych sposobach działania (patrz Dyskusja), ale zamiast tego pożądane może być śledzenie denaturacji poprzez wewnętrzną fluorescencję białek za pomocą nanoDSF.

Reszty tryptofanu, które są zakopane w niepolarnych obszarach białka, fluoryzują z maksymalną emisją 330 nm. Gdy próbka białka rozwija się, a pozostałości te zostają wystawione na działanie rozpuszczalnika polarnego, ich maksymalna emisja ulega przesunięciu batochromowemu do 350 nm13. nanoDSF wykorzystuje to przesunięcie maksimum emisji do badania rozwoju próbki białka bez potrzeby stosowania zewnętrznych fluoroforów14.

Krzywe topnienia pokazujące pojedyncze etapy denaturacji mogą być analizowane poprzez dopasowanie danych do modelu sigmoidalnego Boltzmanna. Temperatura w punkcie przegięcia rozwijającego się przejścia (Tm) jest używana jako ilościowa miara stabilności termicznej białka i punkt odniesienia do porównania korzystnego charakteru różnych warunków.

Krzywe topnienia tego samego białka w różnych warunkach czasami mają stopień niejednorodności, który może sprawić, że dopasowanie sigmoidalne Boltzmanna stanie się niewykonalne. Aby odróżnić wartości Tm od danych, które odbiegają od klasycznej topologii krzywych, można użyć metod numerycznych, takich jak te stosowane w NAMI, programie do analizy danych TSA o otwartym kodzie źródłowym11. Alternatywne ramy termodynamiczne mogą być również wykorzystywane do analizy bardziej złożonych krzywych z wieloma etapami denaturacji, takie jak metodologia ProteoPlex15.

Ekrany stabilności zostały zaprojektowane do użytku w eksperymentach TSA i nanoDSF w celu szybkiego zidentyfikowania korzystnych warunków dla docelowego białka (Rysunek 3, kompozycje ekranu są dostępne w dodatkowych informacjach). Informacje zebrane za pomocą sit mogą być wykorzystane na wielu etapach procesu krystalograficznego, w tym: przechowywania próbek; oczyszczanie, minimalizacja strat plonu poprzez rozwijanie się białka podczas procesu oczyszczania; Projektowanie testów, wzmacnianie funkcjonalności białek w testach aktywności za pomocą stabilizujących termicznie i wreszcie krystalizacji, prowadzenie racjonalnie zaprojektowanych prób krystalizacji.

Wybór odpowiedniej podstawy systemu buforowego dla próbki białka jest kluczowy; niezgodne wartości pH mogą prowadzić do dezaktywacji lub denaturacji białka. Jednak obecność skrystalizowanych cząsteczek buforowych rozwiązanych w dużej liczbie krystalicznych struktur rentgenowskich (Tabela 1) może również wskazywać na efekt stabilizujący, który jest niezależny od prostej regulacji pH i zamiast tego wynika z cech chemicznych cząsteczki buforu.

Sformułowany przy użyciu kilku Good's class17,18,19 wraz z innymi powszechnie biologicznie kompatybilnymi systemami buforowymi, ekran pH ma na celu dekonwolucję chemicznego wpływu cząsteczki buforu na stabilność białka na podstawie rzeczywistego pH otrzymanego roztworu. Zapewniając trzy wartości pH dla każdego systemu buforowego i uwzględniając redundancję wartości pH między różnymi systemami, badanie przesiewowe pH może zidentyfikować zarówno korzystne wartości pH, jak i korzystne systemy buforowe dla białka docelowego.

Ekran solny zawiera zwykle sole laboratoryjne, a także chaotropy, chelanty, metale ciężkie i środki redukujące. Badanie przesiewowe może dać ogólne wskazanie powinowactwa próbki białka do środowisk o wysokiej sile jonowej, ale każda podgrupa związków może również dostarczyć informacji na temat potencjalnej struktury białka. Na przykład chelant znacznie destabilizujący białko może wskazywać na obecność ważnych metali strukturalnych w próbce. Jeśli próbka jest również silnie stabilizowana przez kation metalu w sitku, może to stanowić obiecujący punkt wyjścia do dalszych eksperymentów strukturalnych.

Osmolity to rozpuszczalne związki, które wpływają na właściwości osmotyczne swojego środowiska. W naturze mogą być używane jako "chemiczne białka opiekuńcze", wymuszając fałdowanie nieuporządkowanych białek i stabilizując je, szczególnie w warunkach stresu20,21,22. Te cechy sprawiają, że są atrakcyjnymi dodatkami w krystalografii białek; Mogą być używane jako krioprotektanty podczas procesów zbierania, montażu i przechowywania kryształów23. Potencjalne zastosowanie osmolitów rozciąga się również na oczyszczanie białek. Znaczna część rekombinowanych białek ulegających ekspresji w E. coli może być nierozpuszczalna i trudna do odzyskania w stanie natywnym przy użyciu standardowych metod oczyszczania. Osmolity mogą być używane do stabilizacji i odzyskiwania białek z nierozpuszczalnych frakcji, zwiększając wydajność oczyszczania24.

Ekran osmolitu został zaprojektowany przy użyciu sprawdzonych związków obecnych we wpisach Banku Danych Białek25 i bazie danych Dragon Explorer of Osmoprotector-Associated Pathways (DEOP)26 i iteracyjnie zoptymalizowany przy użyciu standardowych białek. Sito jest zbudowane wokół ośmiu podklas osmolitów: glicerolu, cukrów i polioli, sulfobetainy niezawierające detergentów (NDSB), betainy i ich analogi, fosforoorganiczne, dipeptydy, aminokwasy i ich pochodne oraz ostatnia grupa różna. Każdy osmolit występuje w wielu stężeniach w oparciu o jego rozpuszczalność i efektywne zakresy stężeń dla porównania.

Protokół

1. Przygotowanie próbki białka

  1. Sformułować sita stabilności jako podwielokrotności 500 μl w blokach 96-dołkowych i uszczelnić do przechowywania. Przenieś 10 μl każdego stanu sita stabilności do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą pipety wielokanałowej, aby zaoszczędzić czas (Rysunek 4A).
  2. Przygotować 1 ml roztworu białkowego o stężeniu około 1 mg ml-1 w odpowiednim układzie buforowym. Podczas gdy skład odpowiedniego buforu różni się w zależności od próbki białka, dobrym pierwszym buforem do wypróbowania jest 10 mM fosforan sodu ze 100 mM NaCl, pH 7,2,
    UWAGA: Dopuszczalne stężenia białka różnią się w zależności od przypadku, ale zakresy stężeń 0,5 - 5 mg mL-1 zazwyczaj dają możliwe do analizy krzywe. Rozcieńczone są zalecane do stosowania z ekranami stabilności, aby uniknąć maskowania skutków każdego stanu. Typowe kompozycje to około 10 mM bufor z około 100 mM NaCl.
  3. Jeśli wykonujesz eksperyment TSA, dodaj barwnik SYPRO Orange do próbki białka do końcowego stężenia 20x. Wymieszaj przez odwrócenie lub krótkie wirowanie.
  4. Przenieś 10 μl roztworu białkowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki przygotowanej w kroku 1.1 (Rysunek 4B).
  5. Uszczelnij i odwiruj 96-dołkową płytkę przez 2 minuty przy 600 x g, aby upewnić się, że próbka białka i składnik sitowy są wymieszane (Rysunek 4C).
  6. Ponownie uszczelnić głęboki blok studni stabilizującej i przechowywać sitko w temperaturze 4 °C przez okres do 4 miesięcy. Przechowuj ekran solny w ciemności, ponieważ niektóre elementy są światłoczułe.
  7. Jeśli wykonujesz eksperyment nanoDSF, przejdź do kroku 2. Jeśli wykonujesz eksperyment TSA, przejdź do kroku 4.

2. Przygotowanie eksperymentu nanoDSF

  1. Upewnij się, że sprzęt jest czysty, zwracając szczególną uwagę na kurz w pobliżu stojaka na próbki. Jeśli system jest wyposażony w lustro rozpraszania wstecznego, wyczyść je za pomocą etanolu i niestrzępiącej się chusteczki.
  2. Otwórz szufladę na próbki, naciskając przycisk Otwórz szufladę. (Rysunek 5A).
  3. Załaduj kapilary około 10 μl z każdej studzienki 96-dołkowej płytki, dotykając jednego końca kapilary roztworem, a następnie umieść je w odpowiednich uchwytach kapilarnych stojaka na próbki (Rysunek 5B). Uważaj, aby nie zanieczyścić środka naczyń włosowatych odciskami palców itp., ponieważ może to zakłócić odczyty fluorescencji podczas całego eksperymentu.
  4. Unieruchomij kapilary za pomocą magnetycznego paska uszczelniającego (Rysunek 5C).

3. Programowanie eksperymentu nanoDSF

  1. Uruchom skanowanie wstępne, aby wykryć położenie i intensywność każdej kapilary, naciskając przycisk Start Discovery Scan na karcie Discovery Scan. Zwiększ lub zmniejsz siłę wzbudzenia padającego z początkowej mocy 10% do momentu, gdy szczyt każdego skanowania kapilarnego wyniesie od 4 000 do 12 000 jednostek (Rysunek 5D).
  2. Aby upewnić się, że próbka jest złożona i wystarczająco zagęszczona, zaleca się wstępne skanowanie stopu ze stromym gradientem temperatury. Na karcie Melting Scan zaprogramuj skanowanie stopionego materiału, ustawiając opcję Nachylenie temperatury na 7.0 °C min-1, Temperaturę początkową na 25 °C i Temperaturę końcową na 95 °C, a następnie uruchom eksperyment nanoDSF, naciskając przycisk Rozpocznij topienie. Jeśli wynikowe krzywe topnienia nie wykazują wykrywalnego punktu przegięcia, należy rozważyć dalsze zagęszczenie próbki lub sprawdzenie, czy białko jest prawidłowo pofałdowane.
  3. Powtórz kroki 2.1-2.4, aby przygotować próbki do pełnego eksperymentu.
  4. Na karcie Melting Scan zaprogramuj skanowanie stopienia, ustawiając opcję Nachylenie temperatury na 1.0 °C min-1, Temperatura początkowa na 25 °C i Temperatura końcowa na 95 °C, a następnie uruchom eksperyment nanoDSF, naciskając przycisk Rozpocznij topnienie.

4. Przeprowadzanie eksperymentu TSA

  1. Otwórz szufladę na próbki, mocno naciskając wgłębienie po prawej stronie szuflady. Umieść 96-dołkową tackę w systemie RT-PCR z dołkiem A1 z tyłu po lewej stronie (Rysunek 4D).
  2. Kliknij przycisk Nowy eksperyment, aby rozpocząć konfigurowanie eksperymentu TSA.
  3. Na karcie Właściwości eksperymentu kliknij opcję Krzywa topnienia, gdy pojawi się pytanie Jakiego typu eksperyment chcesz skonfigurować? oraz opcję Inne, gdy pojawi się pytanie Jakich odczynników chcesz użyć do wykrycia sekwencji docelowej?
  4. Na karcie Plate Setup/ Define Targets and Samples (Ustawienia płyty) / Define Targets and Samples (Definiowanie obiektów docelowych i próbek) wprowadź nazwę obiektu, a następnie ustaw Reporter jako ROX i Quencher (Brak).
  5. W zakładce Plate Setup/Assign Targets and Samples (Ustawienia płytki) / Assign Targets and Samples (Ustawienia płytki) / Przypisz cele i próbki przypisz każdą studzienkę z 96-dołkowej płytki do nazwy celu wprowadzonej w poprzednim kroku. Na tej samej karcie ustaw opcję Wybierz barwnik do użycia jako odniesienie pasywne jako Brak.
  6. Na karcie Uruchom metodę usuń kroki, aż będzie w sumie trzy. Ustaw pierwszy krok na 25,0 °C, szybkość narastania 100%, czas 00:05; drugi stopień do 95,0 °C, szybkość narastania 1%, czas 01:00; trzeci krok do 95,0 °C, szybkość narastania 100%, czas 00:05. Wybierz zbieranie danych za pomocą menu rozwijanego Zbieraj dane lub naciskając ikonę Zbieranie danych (Rysunek 6).
  7. Ustawić objętość reakcyjną na studzienkę na 20 μl.
  8. Naciśnij przycisk Start Run, aby rozpocząć eksperyment TSA.

5. Analiza danych

  1. Wybierz długość fali, za pomocą której chcesz wykreślić krzywą topnienia. W eksperymentach nanoDSF powszechnie stosuje się stosunek intensywności fluorescencji przy 330 nm i 350 nm (odpowiadający tryptofanowi odpowiednio w środowiskach niepolarnych i polarnych)13. Dla większości TSA maksimum emisji barwnika jest odpowiednie do wykreślenia krzywej topnienia (maksimum emisji SYPRO Orange wynosi 569 nm)12.
  2. Obliczyć wartości Tm dla każdego warunku, określając punkt (punkty) przegięcia każdej krzywej topnienia. Większość systemów nanoDSF automatycznie oblicza wartości Tm poprzez numeryczne różnicowanie krzywych topnienia po pozyskaniu danych. Jeśli używane oprogramowanie nie oblicza automatycznie wartości Tm, bezpłatne, alternatywne oprogramowanie oparte na graficznym interfejsie użytkownika, takie jak NAMI11, może zautomatyzować analizę danych i dalsze przetwarzanie, dając możliwość stworzenia mapy cieplnej podsumowującej wartości Tm dla całego eksperymentu z 96 odwiertami (dołączone odniesienie zawiera wskazówki i zasoby dotyczące przetwarzania danych za pomocą NAMI).
  3. Porównaj wartości Tm wszystkich badanych warunków. Ekrany stabilności zawierają dwie studzienki w każdym ekranie (A1 i A2), które zawierają tylko wodę. Przyjęcie wartości samej wody jako punktu odniesienia pozwala na obliczenie wartości ΔTm, wyeliminowanie błędów systematycznych i umożliwienie łatwego porównania efektów stabilizujących. Wyższe wartościT m wskazują na warunki stabilizacji termicznej, które są zalecane do dalszego stosowania. Obiecujące warunki często wykazują zależność koncentracji w ich stabilizacji.

Wyniki

Lizozym został poddany analizie w ramach badań stabilności, natomiast Protein X, białko docelowe w projekcie Virus-X, został przeanalizowany w badaniu osmolitów. Oba białka generowały zazwyczaj krzywe topnienia z wyraźnie zdefiniowanymi przejściami denaturacyjnymi zarówno w eksperymentach TSA, jak i nanoDSF (reprezentatywne krzywe przedstawiono na towarzyszących rycinach). W nielicznych przypadkach, gdy próbki nie generowały interpretowalnych krzywych z określonym przejściem denaturacyjnym, uznano je za zdenaturowane i nie uwzględniono ich w porównaniach Tm.

Rysunek 7 przedstawia przykładowe wyniki screeningu soli, obrazujące właściwości termostabilizujące chlorku amonu w odniesieniu do lizozymu. Zależności od stężenia, takie jak ta pokazana powyżej, często wskazują na obiecujące warunki, jednak pomocne może być porównanie wyników zwiększania stężenia jonów dla kilku różnych soli, aby sprawdzić, czy stabilizacja termiczna wynika ogólnie ze wzrostu siły jonowej buforu, czy też obecność konkretnych jonów nadaje dodatkową stabilność.

Porównanie wartości Tm lizozymu w ramach badania pH (Rycina 8) pozwala na wyciągnięcie dwóch wniosków. Po pierwsze, widoczny jest ogólny trend wzrostu stabilności wraz ze spadkiem wartości pH. Po drugie, zakres wartości Tm uzyskanych przy użyciu różnych układów buforowych o identycznych wartościach pH może być znaczący.

Dane przedstawione na Rysunku 8 sugerują, że zgodność między metodami TSA i nanoDSF w tym eksperymencie jest ogólnie dobra, jednak nanoDSF wykazuje tendencję do wyznaczania nieco wyższych wartości Tm oraz nieco większych przesunięć Tm niż TSA. Niemniej jednak w niektórych studzienkach o wartościach pH powyżej 8,5 występują duże rozbieżności między wartościami Tm uzyskanymi za pomocą TSA i nanoDSF. Różnice te mogą wynikać z mechanizmu denaturacji białka przy różnych wartościach pH; na przykład barwnik czuły na hydrofobowość może dawać porównawczo niską wartość Tm, jeśli regiony hydrofobowe białka zostaną odsłonięte na rozpuszczalnik znacznie szybciej, niż zmieni się polarność otoczenia reszt tryptofanu.

Rysunek 9 przedstawia mapę ciepła wartości Tm uzyskanych dla lizozymu podczas przesiewu osmolitów. Warunki, w których odnotowano najwyższe wzrosty Tm w porównaniu z dołkami kontrolnymi (dołki A1 i A2, zawierające wodę dejonizowaną), są zaznaczone kolorem ciemnoniebieskim. Szczególnie stabilizujące warunki zidentyfikowane na Rysunku 9 obejmują glicerol, 1 M D-sorbitol, 100 mM hypotaurinę oraz 10 mM Ala-Gly (odpowiednio dołki A4-A6, A9, E7 i F8).

Rycina 10 przedstawia mapę ciepła wartości Tm uzyskanych dla Białka X. Eksperymenty TSA i nanoDSF z wykorzystaniem panelu osmolitów wykazują, że większość testowanych osmolitów powoduje albo niewielki wzrost Tm (w granicach 1 °C), albo ma niekorzystny wpływ na stabilność Białka X. W szczególności kwas dipikolinowy w stężeniu 10 mM (dołek D1) wydaje się denaturować próbkę w temperaturze pokojowej. Wyniki TSA i nanoDSF pozwalają szybko zidentyfikować kwas dipikolinowy jako dodatek niekompatybilny z Białkiem X, którego należy unikać podczas pracy z tym białkiem. Niemniej jednak, wysokie stężenia D-sorbitolu i arabinozy (dołki A9 i B9, oba w stężeniu 1 M), a także glicerolu i TMAO (odpowiednio dołki A4-A6 i E1), zostały zidentyfikowane jako stabilizujące termicznie.

W przypadku lizozymu, w celu zbadania synergistycznego efektu łączonego, przetestowano kombinacje warunków dających najwyższe wartości Tm z każdego badania stabilności. Rysunek 11 pokazuje ogólny wzrost wartości Tm wraz z dodawaniem kolejnych komponentów systemu buforowego (pH, soli i osmolitu). W przypadku MES, siarczanu amonu i D-sorbitolu, można zaobserwować wzrost Tm aż o 10 °C w obecności wszystkich komponentów w porównaniu do samego MES. Rysunek 11 wykazuje, że zauważalny efekt synergistyczny może wystąpić, gdy poszczególne składniki buforu zostaną zoptymalizowane i połączone w ramach badań stabilności.

W ujęciu bardziej ogólnym, Rycina 11 ilustruje również wielkość wartości ΔTm, które można zaobserwować w eksperymentach TSA i nanoDSF. Wielkość osiągalnego ΔTm różni się znacznie w zależności od systemu białkowego, jednak każda wartość ΔTm w okolicy i powyżej 5 °C często świadczy o korzystnym efekcie stabilizującym.

Badania terenowe w obszarze geotermalnym; badacze analizujący aktywność geotermalną, widoczne otwory parowe.
Rycina 1: Bioprospekcja. Pobieranie próbek ze środowiska ekstremalnego w ramach projektu Virus-X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres stabilności białka; fluorescencja w funkcji temperatury; fazy denaturacji i agregacji.
Rycina 2: Schemat TSA. Opisany przykład typowej krzywej topnienia uzyskanej z eksperymentu TSA. Krzywa ta jest charakterystyczna dla klasycznego „dwustanowego” rozfałdowania białka, w którym populacja próbki przechodzi ze stanu sfałdowanego do zdenaturowanego bez wykrywalnych częściowo sfałdowanych produktów pośrednich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat optymalizacji buforu: pH, sól, osmolity dla dodatków stabilizujących i analiza siły jonowej.
Rycina 3: Schemat przepływu badań stabilności. Standardowy schemat optymalizacji buforu z wykorzystaniem badań stabilności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat analizy ELISA na płytce 96-dołkowej z wykorzystaniem pipety wielokanałowej i czytnika mikropłytek.
Rycina 4: Schemat standardowego eksperymentu TSA z badaniami stabilności. Od lewej do prawej: (A) Pipetowanie alikwotów z badań stabilności do płytki 96-dołkowej. (B) Pipetowanie próbki białka z barwnikiem fluorescencyjnym do płytki. (C) Uszczelnianie płytki przed wirowaniem. (D) Umieszczanie płytki w systemie RT-PCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza stabilności termicznej z użyciem instrumentu nanoDSF; rozfałdowanie białka; eksperyment naukowy.
Rycina 5: Schemat standardowego eksperymentu nanoDSF. (A) Otwieranie statywu do ładowania kapilar. (B) Ładowanie kapilar do statywu. (C) Unieruchamianie kapilar za pomocą magnetycznego paska uszczelniającego. (D) Programowanie eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy krzywej topnienia, test stabilności termicznej, faza denaturacji DNA, układ eksperymentalny.
Rysunek 6: Interfejs użytkownika systemu RT-PCR. Zaprogramowano eksperyment TSA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres fluorescencji w funkcji temperatury; efekt chlorku amonu, dane eksperymentalne, wyniki przedstawione na wykresie słupkowym.
Rysunek 7: Przykładowe dane z przesiewania soli. (A) Stosunek intensywności fluorescencji przy 350 nm do 330 nm dla eksperymentu nanoDSF bez użycia znaczników z wykorzystaniem lysozymu. Próbki odpowiadają dołkom C7-C12 przesiewania soli (1,5 M - 0,2 M chlorku amonu). Obliczone wartości Tm dla każdego warunku naniesiono na wykres. (B) Podsumowanie wartości Tm obliczonych na podstawie danych przedstawionych na Rysunku 7A. (C) Intensywności fluorescencji przy 590 nm dla eksperymentu TSA z wykorzystaniem lysozymu i barwnika reporterowego wrażliwego na hydrofobowość. Podobnie jak na Rysunku 7A, próbki odpowiadają dołkom C7-C12 przesiewania soli. Obliczone wartości Tm naniesiono na wykres. (D) Podsumowanie wartości Tm obliczonych na podstawie danych przedstawionych na Rysunku 7C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres stabilności termicznej, ΔTm w funkcji pH, wyniki analizy białek metodą Thermofluor i nanoDSF.
Rycina 8: Przykładowe dane z przesiewu pH. Podsumowanie przesunięć Tm uzyskanych dla lizozymu w ramach przesiewu pH. Każdy punkt reprezentuje niezależny warunek; punkty przy tej samej wartości pH odpowiadają różnym systemom buforowym w tym samym pH. Przesunięcia Tm obliczono względem kontrolnej wartości Tm wynoszącej 68.0 °C dla eksperymentów TSA oraz 71.9 °C dla eksperymentów nanoDSF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram mapy ciepła przedstawiający macierz rozkładu danych temperaturowych dla analizy naukowej.
Rycina 9: Dane próbkowe z przesiewania osmolitów (lizozym). Podsumowanie wartości Tm uzyskanych w eksperymencie nanoDSF bez użycia znaczników z lizozymem i każdym ze studzienek przesiewania osmolitów. Wartości Tm (w °C) są porównane do studzienek A1 i A2, które zawierają wodę jako kontrolę. Mapa ciepła została wygenerowana na podstawie porównanych wartości ΔTm (kolor niebieski oznacza wzrost Tm, a czerwony spadek Tm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mapa ciepła i wykres stosunku fluorescencji dla wpływu temperatury na próbki z sorbitolem i kwasem dipikolinowym.
Rysunek 10: Dane z prób screeningowych osmolitów (Białko X). (A) Podsumowanie wartości Tm uzyskanych w eksperymencie nanoDSF bez znakowania z użyciem Białka X i screeningu osmolitów. Wartości Tm są porównywane z dołkami A1 i A2, które zawierają wodę jako kontrolę. Mapa ciepła została wygenerowana na podstawie porównanych wartości ΔTm (kolor niebieski oznacza wzrost Tm, a czerwony spadek Tm). (B) Krzywe nanoDSF uzyskane z dołka A9 (1 M D-sorbitolu, warunek stabilizujący) oraz D1 (10 mM kwasu dipikolinowego, warunek destabilizujący). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący stabilność termiczną buforów pH z dodatkami takimi jak D-sorbitol i chlorek litu.
Rycina 11: Wpływ optymalizacji buforu na Tm. Wartości Tm w TSA dla lizozymu w połączeniu z warunkami każdego przesiewu, które zapewniły największy wzrost Tm. Jako systemy buforowe wybrano 100 mM kwasu octowego (pH 4,2) oraz 100 mM MES (pH 5,6), a jako sól 1,5 M siarczan amonu. Stężenia osmolitów były identyczne z tymi z przesiewu osmolitów: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitolu, 50 mM L-lizyny i 100 mM hipotauryny. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe z sześciu powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

CząsteczkaKod PDBCzęstotliwość kokrystalizacji
FosforanPO45132
OctanACT4521
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)MES1334
Tris(hydroksymetyl)aminometan (tris)TRS1155
FormiatTMT (transplant microbiota fekalna)1072

Tabela 1: Podsumowanie częstotliwości kokrystalizacji cząsteczek buforowych w wpisach Protein Data Bank (PDB). Dane uzyskane poprzez PDBsum16 z łącznej liczby 144 868 wpisów (stan na 12-5-18).

Informacje uzupełniające. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kluczowe aspekty protokołu obejmują etap wirowania oraz prawidłowe uszczelnienie płytki 96-dołkowej w przypadku eksperymentów TSA (krok 1.5). Wirowanie zapewnia kontakt i wymieszanie próbki białka z warunkami przesiewowymi. Dodatkowo, w przypadku użycia nieuszczelnionej płytki w eksperymencie TSA, istnieje znaczne ryzyko odparowania rozpuszczalnika w trakcie trwania doświadczenia, co prowadzi do wzrostu stężenia próbki i zwiększa prawdopodobieństwo przedwczesnej agregacji białek.

Metody TSA i nanoDSF są odpowiednie dla szerokiego zakresu próbek białkowych; ogromna większość próbek pozwala na uzyskanie interpretowalnych krzywych topnienia przy użyciu barwnika raportującego opartego na hydrofobowości lub poprzez bezbarwnikowy nanoDSF. Jeśli standardowe źródła fluorescencji nie są odpowiednie dla danego białka, najprostszą modyfikacją protokołu, którą można rozważyć, jest wybór fluoroforu. W eksperymentach TSA mogą być odpowiednie kilka alternatywnych barwników. Przykłady obejmują N-[4-(7-dietyloamino-4-metylo-3-kumarinyl)fenylo]maleimid (CPM), związek fluorescencyjny po reakcji z tiolem27, oraz 4-(dicyjanowinyl)julolidynę (DCVJ), związek, którego fluorescencja zmienia się w zależności od sztywności środowiska, zwiększając się w miarę rozwijania się próbki białka28,29 (ten drugi barwnik często wymaga wysokich stężeń próbki).

Alternatywne metody analizy krzywych topnienia są dostępne w przypadku, gdy Tm nie jest obliczana automatycznie przez oprogramowanie urządzenia. Jeśli dane są jednorodne i na krzywych topnienia widoczny jest tylko jeden etap denaturacji, przycięty zestaw danych można dopasować do sigmoidy Boltzmanna za pomocą następującego równania:

Równanie przejścia zwijania, analiza stabilności białek, formuła termodynamiczna, schemat badawczy.

Gdzie F to intensywność fluorescencji w temperaturze T, Fmin i Fmax to odpowiednio intensywności fluorescencji przed i po przejściu denaturacyjnym, Tm to temperatura środkowa przejścia denaturacyjnego, a C to nachylenie w Tm. Chociaż metoda ta sprawdza się w przypadku prostych dwuetapowych procesów denaturacji, nie nadaje się ona do złożonych krzywych topnienia z wieloma przejściami.

Jedną z głównych zalet TSA jest jego dostępność; eksperymenty TSA można przeprowadzić w dowolnym systemie RT-PCR wyposażonym w filtry o długościach fal odpowiednich dla zastosowanego barwnika fluorescencyjnego. W połączeniu z niskim kosztem materiałów eksploatacyjnych, łatwością obsługi i stosunkowo niewielką ilością wymaganego białka, czyni to TSA cenną techniką dla projektów o różnej skali, zarówno w przemyśle, jak i w nauce.

Oprócz wskazywania optymalnych warunków buforowych, panele przesiewowe zawierają niektóre studzienki, które mogą dostarczyć wskazówek dotyczących obecności metali strukturalnych w próbce białka. Studzienkami, które mogą być szczególnie interesujące w panelu soli, są G6 i G7, zawierające odpowiednio 5 mM EDTA i 5 mM EGTA. Znacząca destabilizacja termiczna w tych studzienkach może wskazywać na obecność istotnych jonów metali w białku, które są sekwestrowane przez chelatory. Związki w panelu osmolitów mogą również potencjalnie dostarczać wskazówek co do funkcji białka. Wiele związków w tym panelu należy do klas cząsteczek, które są powszechnymi substratami enzymów. Na przykład ogólna stabilizacja lizozymu zapewniana przez sacharidy (obecne w studzienkach A11-B10) może być przypisana do ich podobieństwa strukturalnego do uznanych substratów tego enzymu, oligomerów N-acetyloglukozaminy30.

Opisane powyżej protokoły TSA i nanoDSF mogą zostać również przystosowane do badania oddziaływań białko-ligand. Ligandy, które wiążą się specyficznie z białkiem, mogą zwiększyć jego stabilność termiczną poprzez wprowadzenie nowych oddziaływań w obrębie kompleksu. Zależna od dawki dodatnia zmiana Tm białka jest obiecującym sygnałem udanego oddziaływania białko-ligand. Szybkość, wydajność i niski koszt screeningu bibliotek związków za pomocą TSA sprawiły, że metoda ta stała się bardzo popularna we wczesnych etapach projektowania leków.

Optymalizacja warunków buforowych dla białek docelowych i ich kompleksów z ligandami może być kluczowa dla sukcesu projektu, co wykazuje wiele przykładów literaturowych31,32,33,34. Biorąc pod uwagę, że typowy pomiar trwa mniej niż 2 h, wliczając czas przygotowania, analizy TSA oraz nanoDSF w połączeniu z badaniami stabilności stanowią szybką i niedrogą technikę optymalizacji buforów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 685778). Prace te były wspierane przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC, numery grantów BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB dziękuje Partnerstwu Kształcenia Doktoranckiego BBSRC Newcastle-Liverpool-Durham za stypendium oraz Wydziałowi Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Durham za wkład w finansowanie tej pracy. Dziękujemy Ianowi Edwardsowi za jego pomoc oraz Wydziałowi Spektrometrii Mas Uniwersytetu w Durham za instrumentalną analizę białka X. Jesteśmy wdzięczni Arnthorowi Ævarssonowi za jego pracę przy projekcie Virus-X, a także dziękuję Claire Hatty i firmie NanoTemper GmbH za użyczenie i pomoc w stworzeniu systemu Prometheus NT.48 dla tego projektu. Na koniec dziękuję Frances Gawthrop i Tozer Seeds za ich wsparcie w ramach nagrody BBSRC iCASE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LizozymMelford LaboratoriesL38100Skrystalizowany i liofilizowany lizozym białka jaja kurzego.
Ekran pH DurhamWymiary molekularneMD1-10196-dołkowy ekran stabilności białka. Zawartość znajduje się powyżej.
Durham SaltScreen Molecular DimensionsMD1-10296-dołkowy ekran stabilności białka. Zawartość znajduje się powyżej.
osmolitu DurhamRóżne#N/A96-dołkowe badanie stabilności białka, niedostępne w handlu w momencie publikacji. Zawartość znajduje się powyżej.
SYPRO OrangeInvitrogenS6651Szeroko stosowany barwnik fluorescencyjny do barwienia białek w żelach i DSF.
96-dołkowa płytka do PCRStarlab1403-7700Przezroczysty plastik z półspódniczką do użytku z systemem AB 7500 Fast RT-PCR.
7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems436214396-dołkowy system RT-PCR. Można zastosować alternatywne systemy. Analiza danych wykonywana za pomocą bezpłatnego, ogólnodostępnego oprogramowania NAMI. Oprogramowanie AB dostosowane do eksperymentów DSF z wykorzystaniem 7500 Fast dostępne za dodatkową opłatą.
Prometheus NT.48NanoTemper Technologies#N/ASystem DSF bez etykiet o pojemności do 48 próbek. Potrafi obliczać temperatury rozkładania (Tm i Tonset), krytyczne stężenia denaturantu (Cm), energię swobodnego fałdowania (Δ G oraz Δ Złącze Delta; G) i wyniki agregacji (Tagg) za pomocą wbudowanego oprogramowania.
Standardowe kapilary nanoDSF serii Prometheus NT.48NanoTemper TechnologiesPR-C002Standardowe kapilary nanoDSF serii Prometheus NT.48. Warianty o "wysokiej czułości" są dostępne po wyższej cenie do stosowania z próbkami o niskim stężeniu (< 200 i mikro; g ML-1).
Badanie przesiewowe

Bibliografia

  1. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expression and Purification. 19 (2), 312-318 (2000).
  2. Cordingley, M. G., Register, R. B., Callahan, P. L., Garsky, V. M., Colonno, R. J. Cleavage of small peptides in vitro by human rhinovirus 14 3C protease expressed in Escherichia coli. Journal of Virology. 63 (12), 5037-5045 (1989).
  3. Hjorleifsdottir, S., Aevarsson, A., Hreggvidsson, G. O., Fridjonsson, O. H., Kristjansson, J. K. Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage. Extremophiles. 18 (2), 261-270 (2014).
  4. Alva, V., Nam, S. Z., Söding, J., Lupas, A. N. The MPI bioinformatics Toolkit as an integrative platform for advanced protein sequence and structure analysis. Nucleic Acids Research. 44, Issue W1 410-415 (2016).
  5. McPherson, A. Protein Crystallization. Methods in molecular biology. 1607, Clifton, N.J. 17-50 (2017).
  6. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  7. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. IUCr Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 69 (2), 209-214 (2013).
  8. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  9. Kozak, S., Lercher, L., Karanth, M. N., Meijers, R., Carlomagno, T., Boivin, S. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular NMR. 64 (4), 281-289 (2016).
  10. Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Razgulyaev, O. I., Uversky, V. N., Gripas', A. F., Gilmanshin, R. I. Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers. 31 (1), 119-128 (1991).
  11. Grøftehauge, M. K., Hajizadeh, N. R., Swann, M. J., Pohl, E. Protein-ligand interactions investigated by thermal shift assays (TSA) and dual polarization interferometry (DPI). Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 71, 36-44 (2015).
  12. Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. SYPRO Orange and SYPRO Red Protein Gel Stains: One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detection of Nanogram Levels of Protein. Analytical biochemistry. 239, 223-237 (1996).
  13. Burstein, E. A., Vedenkina, N. S., Ivkova, M. N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochemistry and Photobiology. 18 (4), 263-279 (1973).
  14. Haffke, M., Rummel, G., Boivineau, J., Münch, A., Jaakola, V. -P. nanoDSF: label-free thermal unfolding assay of G-protein-coupled receptors for compound screening and buffer composition optimization. Application Note NT-PR-008. , (2016).
  15. Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparsematrix screening of chemical space. Nature Methods. 12 (9), 859-865 (2015).
  16. Laskowski, R. A. PDBsum: summaries and analyses of PDB structures. Nucleic Acids Research. 29 (1), 221-222 (2001).
  17. Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S., Singh, R. M. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
  18. Good, N. E., Izawa, S. Hydrogen ion buffers. Methods in enzymology. 24, 53-68 (1972).
  19. Ferguson, W. J., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Analytical biochemistry. 104 (2), 300-310 (1980).
  20. Welch, W. J., Brown, C. R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell stress & chaperones. 1 (2), 109-115 (1996).
  21. Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., Goloubinoff, P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. The Journal of biological chemistry. 276 (43), 39586-39591 (2001).
  22. Yancey, P. H. Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses. Journal of Experimental Biology. 208 (15), 2819-2830 (2005).
  23. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 32-47 (2006).
  24. de Marco, A., Vigh, L., Diamant, S., Goloubinoff, P. Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol- overexpressed molecular chaperones. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 329(2005).
  25. Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic acids research. 28 (1), 235-242 (2000).
  26. Bougouffa, S., Radovanovic, A., Essack, M., Bajic, V. B. DEOP: A database on osmoprotectants and associated pathways. Database. 2014 (0), 1-13 (2014).
  27. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  28. Kung, C. E., Reed, J. K. Fluorescent molecular rotors: a new class of probes for tubulin structure and assembly. Biochemistry. 28 (16), 6678(1989).
  29. Iio, T., Itakura, M., Takahashi, S., Sawada, S. 9-(Dicyanovinyl)julolidine binding to bovine brain calmodulin. Journal of biochemistry. 109 (4), 499-502 (1991).
  30. Veros, C. T., Oldham, N. J. Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (21), 3505-3510 (2007).
  31. Kean, J., Cleverley, R. M., O'Ryan, L., Ford, R. C., Prince, S. M., Derrick, J. P. Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay. Molecular membrane biology. 25 (8), 653-661 (2008).
  32. Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallographica Section F. 68 (5), 596-600 (2012).
  33. Morgan, H. P., Zhong, W., McNae, I. W., Michels, P. A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies. Royal Society open science. 1 (140120), (2014).
  34. Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid. Scientific reports. 6 (35710), (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza przesuni cia termicznegoprzesiew stabilno ciprzesiew osmolit wprzesiew pHprzesiew soliSYPRO Orangedetekcja fluorescencyjnauchwyt do kapilar
Jak ustabilizować białko: badania przesiewowe stabilności do testów przesunięcia termicznego i nanoróżnicowej fluorymetrii skaningowej w projekcie Virus-X
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.