Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu unieważnienia genów związanych z degustacją na odpowiedzi immunologiczne w mysim modelu IBD wywołanym siarczanem dekstranu sodu (DSS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) jest jednym z zaburzeń żołądkowo-jelitowych związanych z układem odpornościowym, w tym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniowskiego-Crohna, która wpływa na jakość życia milionów ludzi na całym świecie. Objawy IBD obejmują ból brzucha, biegunkę i krwawienie z odbytu, które mogą wynikać z interakcji między mikrobiotą jelitową, składnikami żywności, komórkami nabłonka jelitowego i komórkami odpornościowymi. Szczególnie ważna jest ocena, w jaki sposób każdy kluczowy gen ulegający ekspresji w nabłonku jelitowym i komórkach odpornościowych wpływa na stan zapalny w okrężnicy. W jelitach znaleziono receptory smaku sprzężone z białkiem G, w tym podjednostkę białka G α-gustducynę i inne białka sygnałowe. Tutaj używamy α-gustducyny jako przedstawiciela i opisujemy model IBD indukowany siarczanem sodu dekstranu (DSS) w celu oceny wpływu mutacji genów smakowych na odporność błony śluzowej jelit i stan zapalny. Metoda ta łączy technologię nokautu genów z chemicznie indukowanym modelem IBD, a zatem może być stosowana do oceny wyniku smakowego niwelacji genów, a także innych genów, które mogą wylewać się lub tłumić indukowaną przez DSS odpowiedź immunologiczną w okrężnicy. Zmutowanym myszom podaje się DSS przez pewien czas, podczas którego ich masa ciała, stolec i krwawienie z odbytu są monitorowane i rejestrowane. W różnych punktach czasowych podczas podawania niektóre myszy są poddawane eutanazji, następnie mierzy się rozmiary i wagę ich śledzion i okrężnicy, a tkanki jelitowe są zbierane i przetwarzane do analiz histologicznych i ekspresji genów. Dane pokazują, że nokaut α-gustducin powoduje nadmierną utratę wagi, biegunkę, krwawienie z jelit, uszkodzenie tkanek i stan zapalny w porównaniu z myszami typu dzikiego. Ponieważ na nasilenie indukowanego stanu zapalnego mają wpływ szczepy myszy, środowisko hodowlane i dieta, optymalizacja stężenia DSS i czasu podawania w eksperymencie pilotażowym jest szczególnie ważna. Dostosowując te czynniki, metoda ta może być stosowana do oceny zarówno działania przeciw-, jak i prozapalnego.
Wprowadzenie
Dwie główne formy nieswoistego zapalenia jelit (IBD), choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) charakteryzują się przewlekłymi, remisyjnymi lub postępującymi stanami zapalnymi jelita o wieloczynnikowej etiologii1,2. Rozwój IBD zależy od czynników genetycznych, a także niektórych czynników środowiskowych, takich jak dieta, stosowanie antybiotyków i co ważne, infekcje chorobotwórcze. Jednak etiologia i regulacyjne mechanizmy molekularne leżące u podstaw IBD są nadal niejasne. W związku z tym skonstruowano i zastosowano liczne chemicznie indukowane modele zwierzęce IBD w celu nakreślenia patogenezy i mechanizmów regulacyjnych oraz oceny skuteczności terapii stosowanych u ludzi3.
Receptory smaku są receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) i są klasyfikowane jako dwa główne typy: typ I (T1Rs) i typ II (T2Rs), które wykrywają słodkie, umami i gorzkie związki. Kaskady sygnalizacji smaku są inicjowane przez degustacyjne wiązanie z T1Rs lub T2R, aktywując heterotrimeryczne białka G składające się z α-gustducyny i dimeru Gβγ i prowadząc do uwolnienia podjednostek Gβγ. Ugrupowanie Gβγ z kolei stymuluje znajdujący się za nim enzym efektorowy fosfolipazę C-β2 (PLC-β2). Aktywowany PLC-β2 następnie hydrolizuje fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan do dwóch wewnątrzkomórkowych wtórnych przekaźników [inozytolo-1,4,5-trifosforan (IP3) i diacyloglicerol], a IP3 wiąże się i otwiera swój kanał-receptor IP3R3, uwalniając jony wapnia z retikulum endoplazmatycznego. To ostatecznie prowadzi do otwarcia kanału jonowego Trpm5 o potencjale przejściowego receptora i uwolnienia neuroprzekaźnika ATP do nerwów smakowych4,5,6,7. Jednak szlaki sygnałowe smaków słonych i kwaśnych są różne i niezależne od smaków słodkich, umami i gorzkich8. Ponadto składniki GPCR smaku i białka znajdujące się w dalszej części układu występują w różnych tkankach pozaustnych. Ostatnie badania wykazały, że α-gustducyna, główny składnik sygnalizacji smaku, ulega ekspresji w błonie śluzowej jelit. Potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć funkcje tych składników sygnalizacji smaku w tkankach pozaustnych9,10.
Opisana tutaj metoda służy do scharakteryzowania funkcji białek sygnalizacji smakowej wyrażanych w tkankach pozaustnych. Łączymy transgeniczną linię myszy opracowaną do wyznaczania kaskad sygnałowych w kubkach smakowych z chemicznie indukowanym modelem zapalenia jelita grubego. W dużej mierze ze względu na prostotę procedury i patologiczne podobieństwa do ludzkiego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, model IBD indukowany siarczanem dekstranu sodu (DSS) jest najczęściej stosowany spośród różnych chemicznie indukowanych modeli zapalenia jelita grubego11. W tym badaniu wykorzystaliśmy myszy z niedoborem α-gustducyny jako reprezentatywną linię myszy, aby ujawnić nowe funkcje α-gustducyny w odporności i zapaleniu błony śluzowej jelit poprzez 1) analizę zmian morfologicznych w tkance i 2) oznaczanie różnic w ekspresji cytokin związanych ze stanem zapalnym w okrężnicy. Metoda ta może być wykorzystana do ilościowego i jakościowego określenia udziału białek sygnalizacji smakowej (i innych białek ulegających ekspresji w jelitach) do uszkodzenia tkanek i zapalenia jelit, gdy dostępne są genetycznie zmodyfikowane linie myszy dla genów będących przedmiotem zainteresowania. Zaletą tej metody jest umożliwienie użytkownikom uzyskania zintegrowanych danych wynikających zarówno z działania substancji chemicznej DSS, jak i niedoboru interesującego nas genu. Metodę tę można jeszcze udoskonalić, aby zwiększyć jej czułość i ujawnić subtelne zmiany jelitowe na poziomie komórkowym i molekularnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Zhejiang. Zaleca się noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej przed wykonaniem tego protokołu.
1. Przygotowanie myszy i DSS
- Myszy z nokautem (α-gustducin-/-) i myszy C57BL/6 α C57BL/6 z dopasowanym wiekiem, płcią i masą ciała należy przechowywać indywidualnie w czystych klatkach.
UWAGA: Myszy z nokautem były krzyżowane wstecznie z myszami C57BL / 6 przez ponad 20 pokoleń i mają prawie 100% tła genetycznego C57BL / 6. - Rozpuścić 30 g sproszkowanego siarczanu dekstranu (DSS) w 1 l wody w autoklawie. Mieszać, aż roztwór stanie się klarowny, aby upewnić się, że końcowe stężenie robocze wynosi 3% (w/v).
UWAGA: Roztwór DSS można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 tygodnia lub w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Indukcja i ocena zapalenia jelita grubego DSS u myszy
- Zważ i zapisz początkową masę ciała każdej myszy. Umieść myszy pojedynczo w standardowych plastikowych klatkach i oznacz klatki.
- Zastąp zwykłą wodę pitną 3% roztworem DSS na łącznie 7 dni, do których obie grupy myszy mają dostęp ad libitum.
- Zmierz masę ciała myszy, rejestruj spożycie roztworu DSS oraz zbieraj i badaj stolec każdej myszy codziennie podczas podawania DSS. Obserwuj nasilenie biegunki i krwawienia z odbytu i przelicz je na indeks chorób wywołanych przez DSS12.
- Podczas eksperymentu oblicza się procentową utratę masy ciała w porównaniu z masą początkową oraz wskaźnik choroby w celu oceny objawów zapalenia jelita grubego.
UWAGA: Indeks choroby jest oceniany przez połączenie obserwacji biegunki i krwawienia z odbytu i jest zdefiniowany w następujący sposób: 0 (normalny stolec, brak krwi), 1 (miękki stolec, brak krwi), 2 (miękki stolec, mała ilość krwi), 3 (bardzo miękki stolec, umiarkowane krwawienie) i 4 (wodnisty stolec, znaczne krwawienie)12. Indeks chorób jest analizowany codziennie dla każdej myszy. - Pod koniec 7-dniowej kuracji DSS należy złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy i kontynuować pozostałe eksperymenty.
3. Przygotowanie próbek tkanek
- Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i oczyść skórę brzucha 70% etanolem. Wykonaj nacięcie linii środkowej w jamie brzusznej o długości 3 cm za pomocą małych nożyczek, aby odsłonić jamę brzuszną.
- Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić śledzionę od innych tkanek, a następnie usuń śledzionę i zmierz jej rozmiar.
- Zidentyfikuj i podnieś okrężnicę za pomocą kleszczy i oddziel ją od otaczającej krezki. Wyciągnij całą okrężnicę, aż będzie widoczne jelito ślepe i odbytnica.
- Odizoluj okrężnicę, przecinając ją na brzegu okrężnicy i głęboko w miednicy, aby uwolnić odpowiednio okrężnicę proksymalną i dystalną. Następnie zmierz i zapisz długość izolowanej okrężnicy. Należy uważać, aby nie uszkodzić tkanki okrężnicy podczas zabiegu preparowania.
- Przepłukać okrężnicę 10 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłębnik w celu usunięcia kału i krwi, aż eluat będzie całkowicie czysty.
- W celu identyfikacji histologicznej podziel próbki tkanek równo na trzy części: proksymalną, środkową i dystalną. Następnie utrwalić tkankę 4% paraformaldehydem (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.
- W celu analizy ekspresji cytokin należy szybko zamrozić całą okrężnicę ciekłym azotem i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
4. Histologiczna ocena nasilenia zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS
- Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
- Po utrwaleniu zanurz tkankę w roztworze 30% sacharozy w 1x PBS na noc w probówce o pojemności 15 ml w celu krioochrony próbek.
- Osadź tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i umieść ją w temperaturze -20 °C, aż OCT stwardnieje.
- Przenieś blok OCT zawierający tkankę do kriostatu, ustaw pokrętło grubości w kriostacie na 12 μm, a następnie pokrój i zbierz zamrożone skrawki o grubości 12 μm.
- Podgrzewać pobrane skrawki tkanek z kriostatu w temperaturze 65 °C przez 20 minut na gorącej płycie.
- Umyj krótko sekcje w wodzie destylowanej. Zabarwić je roztworem barwiącym hematoksylinę przez 5 minut, a następnie spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
- Dymuflować skrawki 0,5% kwasem solnym-etanolem przez 30 s i płukać je pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min. Następnie wykonuj pranie w 1x PBS przez 1 min, a następnie spłukuj pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
- Wykonać mycie skrawków tkanek w alkoholu 70%, 75%, 80% i 95%, każdy przez 10 s. Barwienie przeciwstawne w roztworze barwiącym eozynę przez 2 min.
- Wykonuj odwadnianie za pomocą 95% alkoholu i 2 podmian alkoholu bezwodnego przez 5 minut za każdym razem. Klarowne w 2 przemianach ksylenu przez 5 min.
- Oceń uszkodzenie tkanek proksymalnej, środkowej i dystalnej okrężnicy każdej myszy zarówno dla grupy z nokautem genu, jak i grupy typu dzikiego na podstawie wyników powyższego barwienia H&E.
UWAGA: Indeks choroby to łączny wynik uszkodzenia nabłonka i stanu zapalnego w błonie śluzowej, błonie podśluzowej, mięśniach i obszarach surowiczych, który definiuje się w następujący sposób: 0 (brak uszkodzenia tkanek i stanu zapalnego), 1 (ogniskowe uszkodzenie tkanki i stan zapalny), 2 (niejednolite uszkodzenie tkanek i stan zapalny) i 3 (rozproszone uszkodzenie tkanek i stan zapalny)12,13. Następnie sumuje się trzy wyniki na mysz dla bliższej, środkowej i dalszej części okrężnicy, aby uzyskać łączny wynik dla każdego zwierzęcia. Następnie obliczane są średnie wyniki dla każdej grupy.
- Immunohistochemia14
- Podgrzewać pobrane skrawki tkanek z kriostatu w temperaturze 65 °C przez 20 minut na gorącej płycie. Umyj sekcje w 1x PBS 3 razy, po 10 minut każda. Inkubuj skrawki tkanki w 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut, aby wyeliminować endogenną peroksydazę. Umyj sekcje jeszcze 3 razy. Zablokuj tkanki buforem blokującym (3% BSA, 0,3% detergentu niejonowego, 2% surowicy koziej, 0,1% azydku sodu w 1x PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub dłużej.
- Zastąp bufor blokujący roztworem zawierającym następujące podstawowe przeciwciała specyficzne dla typu komórek odpornościowych: CD45 dla leukocytów, CD3 dla limfocytów T, B220 dla komórek B, CD11b dla makrofagów i Ly6G dla neutrofili. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Usunąć pierwotne przeciwciała z wycinków tkanki przez aspirację. Umyj sekcje 1x PBS 3 razy, po 10 minut każda. Inkubować skrawki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym, a następnie inkubować z kompleksem streptawidyna-HRP w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki roztworem 3,3'-diaminobenzydu (DAB), aby uzyskać jasno- lub ciemnobrązowy kolor i uwidocznić komórki immunoreaktywne.
- Przeciwbarwić skrawki hematoksyliną i rozcieńczonym 0,3% (v/v) amoniakiem. Rób zdjęcia w jasnym polu przy 10-krotnym powiększeniu pod mikroskopem.
- Użyj programu do przetwarzania obrazu, aby zidentyfikować i określić ilościowo populację oznaczonych komórek odpornościowych zarówno w nabłonku, jak i blaszce właściwej (pod nabłonkiem), ustawiając 2 maski: użyj pierwszej maski w funkcji opartej na kostce kolorów, aby ustawić próg wykrywania koloru i zmierz kolorowe obszary reagujące na DAB; użyj drugiej maski, aby określić całkowite obszary nabłonka i laminarnej właściwości w badanym przekroju. Wyraź populację komórek immunoreaktywnych jako stosunek powierzchni barwienia naciekanych komórek do całkowitej powierzchni badanej tkanki.
5. Ocena ekspresji genów w zapaleniu jelita grubego wywołanym przez DSS
- Pobrać tkanki jelita grubego od myszy z nokautem genu i myszy typu dzikiego leczonych DSS z zamrażarki o temperaturze -80 °C i dodać 0,6 ml buforu do lizy do 25 mg tkanki, a następnie homogenizować w homogenizatorze.
- Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do ekstrakcji RNA, aby wyekstrahować całkowite RNA, a DNaza I służy do eliminacji wszelkich zanieczyszczających genomowych DNA.
- Uruchom żel agarozowy, aby sprawdzić jakość wyekstrahowanego RNA. Jeśli jego pasmo RNA 28S jest jaśniejsze niż pasmo 18S, nadaje się do użytku. Pobrać 1 μl próbki RNA, aby określić stężenie RNA na mikrospektrofotometrze.
- Wymieszaj 1 μg całkowitego RNA z 2,5 μl 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 starterów i 1 μl odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki mysiej Moloneya (MMLV). Inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut w celu przygotowania cDNA.
- Skonfiguruj reakcje PCR w czasie rzeczywistym, mieszając 1 μl cDNA z 0,5 μl starterów qPCR do przodu i do tyłu dla TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 i β-aktyny jako kontrolę oprócz 2x fluorescencyjnego zielonego barwnika.
- Uruchom qPCR z następującymi parametrami: 95 °C przez 10 minut, a następnie 45 cykli po 95 °C przez 10 s, 50 °C przez 25 s i 72 °C przez 20 s.
- Oblicz względną kwantyfikację ekspresji genów za pomocą metody 2-ΔΔCt="xref">15. Porównawczo przeanalizuj poziomy ekspresji genów w nokautach vs. myszy typu dzikiego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Procedurę indukcji IBD za pomocą DSS ustanowiono poprzez podawanie 3% DSS w wodzie pitnej myszom z nokautem (KO) α-gustducyny oraz myszom typu dzikiego (WT). W porównaniu z myszami WT, myszy z nokautem wykazywały cięższy przebieg zapalenia jelita grubego z nadmierną utratą masy ciała, biegunką i krwawieniem z jelit (Rycina 1). Po 7-dniowym podawaniu DSS przeanalizowano różnice w integralności tkanek, stosując barwienie H&E jako metodę histologiczną; w bli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta może być zastosowana do ilościowego określenia wpływu mutacji określonych genów smakowych na stan zapalny w mysim modelu IBD wywołanym przez DSS. Aby w pełni wykorzystać tę potrzebę, kluczowym krokiem jest optymalna indukcja IBD. Na rozwój zapalenia jelita grubego wpływa kilka czynników, w tym szczep myszy, środowisko utrzymania, mikroflora jelitowa, a także interesujące geny. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego na niewielkiej liczbie myszy w celu przetestowania różnych dawek i czasu podawania ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81671016, 31471008 i 31661143030) oraz Narodowych Instytutów Zdrowia (DC010012, DC015819) oraz przez Fundację Siyuan.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| < strong>Reagent | |||
| Dextran Siarczan Sól sodowa (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Kompleks Streptawidyna-HRP | BD Pharmingen | 551011 | |
| H& Zestaw do barwienia E | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| Odwrotna transkryptaza MMLV, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| Uniwersalny zestaw do ekstrakcji RNA TaKaRa MiniBEST | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Strzykawka | BD Biosciences | 309604 | |
| Instrumenty i sprzęt | |||
| balance | |||
| nożyczki | |||
| kleszcze | |||
| wirówka | |||
| qPCR maszyna | |||
| barwienia słoiki | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
Bibliografia
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678(2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652(2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
