Tutaj opisujemy szczegółowy protokół opisujący nową technikę barwienia fluorescencyjnego do całkowitego wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych. Protokół wykorzystuje specyficzną dla jonów srebra sondę fluorescencyjną, która wykrywa kompleksy białkowe Ag + i eliminuje pewne ograniczenia tradycyjnych chromogennych barwników srebra.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Barwienie srebrem jest techniką kolorymetryczną szeroko stosowaną do wizualizacji pasm białkowych w żelach poliakrylamidowych po elektroforezie w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Klasyczne barwienie srebrem ma pewne wady, takie jak wysokie barwienie tła, słaby odzysk białka, niska odtwarzalność, wąski liniowy zakres dynamiki do oznaczania ilościowego i ograniczona kompatybilność ze spektrometrią mas (MS). Teraz, przy użyciu fluorogenicznej sondy Ag+, TPE-4TA, opracowaliśmy metodę fluorescencyjnego barwienia srebrem do wizualizacji całkowitego białka w żelach poliakrylamidowych. Ta nowa bejca pozwala uniknąć kłopotliwego etapu redukcji srebra w tradycyjnych srebrnych plamach. Co więcej, fluorescencyjne barwienie srebra wykazuje dobrą odtwarzalność, czułość i liniową kwantyfikację w wykrywaniu białek, co czyni ją użytecznym i praktycznym barwnikiem w żelu białkowym.
Wprowadzenie
Wiele metod barwienia zostało wykorzystanych do wizualizacji białek po elektroforezie żelowej, na przykład przy użyciu barwników kolorymetrycznych, takich jak Coomassie Brilliant Blue, srebrnego barwienia, fluorescencji lub radioaktywnego znakowania1,2,3,4. Barwienie srebrem jest uważane za jedną z najbardziej czułych technik wykrywania białek, wymagającą prostych i tanich odczynników. Można go podzielić na dwie główne rodziny: amoniakalny barwnik srebra i barwnik azotanu srebra5,6. W metodzie alkalicznego srebra amoniakologicznego kompleks srebro-diamina jest wytwarzany z amoniakiem i wodorotlenkiem sodu i redukowany do srebra metalicznego podczas rozwoju przy użyciu kwaśnego roztworu formaldehydu. Barwnik skutecznie akomoduje się do białek zasadowych, ale wykazuje obniżoną wydajność dla białek kwaśnych i obojętnych, a ponadto jest ograniczony do klasycznych systemów elektroforetycznych glicyny i tauryny. Dla porównania, barwienie azotanem srebra wykorzystuje wysokie biopowinowactwo jonów srebra do białek, głównie grup sulfhydrylowych i karboksylowych z łańcuchów bocznych, i ma tendencję do bardziej efektywnego barwienia kwaśnych białek7. Po związaniu jonów srebra stosuje się roztwór rozwijający (zwykle wykonany z roztworu węglanu metalu zawierającego formaldehyd i tiosiarczan sodu) w celu redukcji jonów srebra do metalicznych ziaren srebra, które tworzą kolor od brązowego do ciemnego, aby uwidocznić prążki białkowe.
Chociaż barwienie srebrem jest dobrze znane ze swojej wszechstronności i wysokiej czułości od czasu jego rozwoju w latach siedemdziesiątych8, metoda ta jest często uważana za trudną. Metody barwienia srebrzem mają ograniczone czasowo etapy i wykazują niską powtarzalność. Ponieważ kolor plamy srebra zwykle nie jest jednorodny i zależy od etapu redukcji, który jest trudny do kontrolowania, barwienie srebra nie jest metodą ilościową, a zatem nie jest zalecane do badania porównawczego żelu i kwantyfikacji białka9. Metody zoptymalizowane pod względem czułości mogą wykorzystywać aldehydy, które mogą również zapewnić bardziej jednolite barwienie10. Odbywa się to jednak kosztem dalszej analizy ze względu na sieciowanie białek przez aldehydy. Szybkie protokoły najczęściej łączą lub skracają kroki w celu skrócenia czasu, co negatywnie wpływa na odtwarzalność i jednolitość stain5. W rezultacie istnieje wiele wariantów barwienia srebrem w barwieniu żelem białkowym, z których każdy jest zoptymalizowany pod kątem określonych wymagań; Na przykład prostota, czułość lub szybkość odzysku peptydów do dalszej analizy. Atrybuty te mogą również mieć na siebie wpływ, a spełnienie wszystkich wymagań w jednym protokole może być trudne.
W tej pracy wprowadzamy nową metodę barwienia srebrem fluorescencyjnym do wykrywania białek w żelu poliakrylamidowym. W tej metodzie używamy sondy fluorogenicznej do jonów srebra, TPE-4TA (Rysunek 1), do wizualizacji białek impregnowanych srebrem11. TPE-4TA został zaprojektowany zgodnie z zasadą emisji indukowanej agregacją (AIE). Jest nieemisyjny po rozpuszczeniu w roztworze wodnym, ale jest wysoce emisyjny w obecności jonów srebra. Zastępując rozwój chromogeniczny w tradycyjnych barwiech srebra etapem wywoływania fluorescencyjnego, metoda fluorescencyjnego srebra umożliwia solidne barwienie białek ogółem o zredukowanym tle.
Ponadto, fluorescencyjne zabarwienie srebra wykazało dobry dynamiczny zakres liniowy do kwantyfikacji białek, który jest porównywalny z powszechnie stosowanym barwnikiem rubinowym SYPRO i nieosiągalny z tradycyjnymi srebrnymi plamami. Żel może być obrazowany na powszechnie stosowanych systemach dokumentacji żelu za pomocą lampy ultrafioletowej (długość fali wzbudzenia: kanał 302/365 nm; emisja: ~490 - 530 nm) w wielu laboratoriach biologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie żelu
Uwaga: Demonstracja odbywa się zgodnie ze standardowym protokołem, aby przygotować żel do barwienia krótko po SDS-PAGE12. W skrócie poniższe kroki opisują przygotowanie próbek i elektroforezę żelową.
- Wykonaj SDS-PAGE z 4% - 12% żelami białkowymi Bis-Tris (1 mm, 15-dołkowymi) przy użyciu mini zbiornika żelowego wypełnionego buforem kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES).
- Rozcieńczyć próbki mieszaniną wody destylowanej, buforu dodecylosiarczanu litu (LDS) i środka redukującego próbkę.
- Załaduj pierwszą linię podwójną ilością bulionu (10 μl), a następnie normalną ilością bulionu (5 μl), a następnie serią dwukrotnych rozcieńczeń wywaru (13 rozcieńczeń, od 2x do 8192x).
- Uruchom żel przy stałym napięciu 200 V przez 30 minut.
2. Utrwalenie żelu
- Po elektroforezie zanurzyć żele w 100 ml roztworu 40% etanolu/10% kwasu octowego na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej 2x (każdy przez 30 min) lub na noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj żele po 3 x 10 min w ultraczystej wodzie w czystym pojemniku. Etap mycia ma kluczowe znaczenie. Jeśli kwas z roztworu utrwalającego nie zostanie prawidłowo usunięty na etapie wywoływania fluorogenicznego, nadmiar TPE-4TA zostanie aktywowany przez kwas i doprowadzi do silnej fluorescencji tła w żelu.
3. Przygotowanie roztworu AgNO3 i impregnacja żelu srebrem
- Aby przygotować roztwór AgNO3 (0,0001%) do impregnacji, najpierw rozpuść 0,01 g AgNO3 w 10 ml ultraczystej wody, aby przygotować 0,1% roztwór podstawowy AgNO3. Następnie dodaj 100 μl 0,1% roztworu podstawowego AgNO3 do 100 ml ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór roboczy.
Uwaga: Roztwór AgNO3 należy przechowywać w ciemności przed użyciem. - Zaimpregnować żel 100 ml roztworu roboczego srebra przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku. Bardzo ważne jest, aby impregnację srebrem wykonać pod wyciągiem, chronionym przed światłem folią aluminiową.
- Umyj żel ultraczystą wodą (około 100 ml) w czystym pojemniku przez 2 x 60 s.
4. Fluorogenny rozwój żelu
- Aby przygotować roztwór podstawowy barwnika (0,1 mM), dodaj 3,0 mg barwnika TPE-4TA w 50 ml ultraczystej wody. Sonikować roztwór przez kilka minut i dodać trochę roztworu NaOH (na przykład 1 M), aby pomóc rozpuścić barwnik.
- Sprawdź fluorescencję roztworu pod lampą UV 365 nm, aby upewnić się, że cząsteczka barwnika jest całkowicie rozpuszczona. Tylko roztwory słabe lub nieemisyjne wskazują na pełne rozpuszczenie.
Uwaga: Barwnik TPE-4TA został zsyntetyzowany zgodnie z protokołem niedawno zgłoszonym przez Xie i wsp.10 Rozwiązanie TPE-4TA jest bardzo stabilne i może być trzymane w ciemności przez wiele miesięcy. - Aby przygotować 100 ml fluorogenicznego roztworu rozwijającego (10 μM), dodaj 10 ml roztworu podstawowego TPE-4TA do 90 ml ultraczystej wody. Sprawdzić pH roztworu za pomocą pH-metru i dostroić je do 7-9 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (1 μM).
- Przenieść żel do czystego i zamykanego pojemnika ze 100 ml fluorogenicznego roztworu rozwijającego. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w roztworze. Zamknij pojemnik. Przykryj go przed światłem i potrząśnij przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, etap inkubacji można również skrócić do około ~2 godzin, podgrzewając roztwór do wywoływania AIE do 80 °C w celu barwienia, a następnie pozostawiając go w temperaturze pokojowej.
5. Odbarwienie i obrazowanie
- Przenieść żel do czystego pojemnika i odbarwić go w 100 ml 10% etanolu przez 30 min.
Uwaga: Do mycia żelu można użyć samej wody. Jednak bardziej efektywne czasowo jest użycie 10% roztworu etanolu do odbarwiania. Pomoże to skrócić proces odbarwiania z godzin do 30 minut. - Płucz żel w ultraczystej wodzie przez 5 minut.
- Zobrazuj żel w kanale 365 nm lub kanale 302 nm za pomocą maszyny do dokumentacji żelu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prążki białkowe wybarwione fluorescencyjnym barwnikiem srebrowym wykazują intensywną zieloną fluorescencję pod wpływem lampy UV o długości fali 365 nm. Wszystkie 14 prążków białkowych (10 - 20 kDa), od góry dołu, było wyraźnie widocznych, co dobrze korelowało z 14 czerwonymi prążkami wybarwionymi barwnikiem SYPRO Ruby (Rycina 2)10.
W odniesieniu do ilościowego wykrywania biał...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiono nowatorską metodę barwienia srebrem fluorescencyjnym białek w żelach poliakrylamidowych. Ta strategia integruje konwencjonalne plamy srebrne i plamy fluorescencyjne. Barwienie wykorzystuje selektywne wiązanie jonów srebra z białkami, tak jak w przypadku innych barwień srebrem, ale wykorzystuje bardzo czułą fluorogenną sondę srebra TPE-4TA do oświetlenia białek związanych ze srebrem. Ponieważ sonda fluorogeniczna TPE-4TA może wykrywać jony srebra o dość niskim stężeniu w zak...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Złożono wniosek patentowy na to fluorescencyjne barwienie srebra.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Patrickowi Chanowi z Ming Wai Lau Centre for Reparative Medicine, Karolinska Institutet, za jego wsparcie techniczne. S. X. jest wdzięczny za wsparcie ze strony Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr 2017-06344).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Bufor do próbek LDS (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Odczynnik |
4-12% żele białkowe Bis-Tris, 1,0 mm, 15-dołkowe | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Prefabrykowany żelowy |
| środek redukujący próbki (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Odczynnik |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Odczynnik |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Sprzęt |
| Zasilacz 300 W (230 VAC) | Sprzęt Thermo Fisher Scientific | PS0301 | |
| Niebarwiona drabinka białkowa | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Próbka |
| Azotan srebra | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Odczynnik |
| Etanol | Bragg i spółka | 42520J | |
| Odczynnik Kwas octowy | J.T. Baker | 103201A | Odczynnik |
| Synteza Milli-Q A10 | Merk-Provides | 18,2 MΩ. | |
| System dokumentacji żelu wodnego cm (model c600) | Azure biosystems-Equipment |
Bibliografia
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
