Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

DOI:

10.3791/58670

⸱

29 listopada 2018

 ,  , 
1Chemical Biology Consortium Sweden, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Solna, 2Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, Solna, 3Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowe określenie interakcji małych cząsteczek z ich zamierzonym celem białkowym jest kluczowe dla rozwoju leków, walidacji celów i walidacji sond chemicznych. Metody, które mierzą to zjawisko bez modyfikacji docelowego białka lub małej cząsteczki, są szczególnie cenne, choć stanowią wyzwanie techniczne. Test przesunięcia termicznego komórkowego (CETSA) jest jedną z technik monitorowania zaangażowania celu w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy adaptację oryginalnego protokołu CETSA, która pozwala na pomiary o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zachowaniu lokalizacji subkomórkowej na poziomie pojedynczej komórki. Uważamy, że protokół ten oferuje ważne postępy w zastosowaniu CETSA do dogłębnej charakterystyki interakcji związek-cel, szczególnie w heterogenicznych populacjach komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas opracowywania nowych leków lub sond chemicznych konieczne jest powiązanie obserwowanego efektu farmakologicznego lub odczytu funkcjonalnego z pomiarami zajętości lub zaangażowania celu w żywych komórkach1,2,3. Dane te są niezbędne zarówno do zapewnienia, że mała cząsteczka rzeczywiście osiągnie pożądany cel, jak i do walidacji biologicznej hipotezy stojącej za wyborem celu białka4,5. Ponadto podczas opracowywania leków wykorzystuje się systemy modelowe o coraz większej złożoności do wyboru i potwierdzenia związku wiodącego przed badaniami klinicznymi. Aby potwierdzić translację biologii w tych systemach przedklinicznych, kluczowe znaczenie mają metody śledzenia zaangażowania leku w cel i towarzysząca biologii w całym procesie rozwoju.

Tradycyjnie monitorowanie interakcji leku z celem było tradycyjnie trudne do monitorowania w żywych komórkach z niefunkcjonalizowanymi małymi cząsteczkami i białkami, zwłaszcza na poziomie pojedynczej komórki z rozdzielczością przestrzenną6,7. Jedną z najnowszych metod obserwacji interakcji między niezmodyfikowanymi lekami a białkami w żywych komórkach jest komórkowy test przesunięcia termicznego (CETSA), w którym określa się ilościowo indukowaną ligandem stabilizację natywnego białka w odpowiedzi na wyzwanie cieplne8,9,10. Osiąga się to poprzez ilościowe określenie pozostałego rozpuszczalnego białka po ekspozycji na wyzwanie cieplne. We wstępnym ujawnieniu CETSA, western blot został użyty do wykrywania. Aby umożliwić kampanie przesiewowe i klasyfikację większych zbiorów związków, wysiłki mające na celu zwiększenie przepustowości eksperymentów CETSA doprowadziły do opracowania kilku jednorodnych testów opartych na mikropłytkach10,11. Jednak jednym z ograniczeń tych metod jest to, że obecnie najlepiej nadają się one do leczenia związkami w zawiesinach komórkowych, a wykrywanie wymaga lizy komórek, co prowadzi do utraty informacji przestrzennych. CETSA może być stosowana eksperymentalnie jako indukowane przez ligand przesunięcie temperatury agregacji termicznej (Tagg) przy pojedynczym stężeniu małej cząsteczki lub stężeniu liganda niezbędnym do ustabilizowania białka w jednej temperaturze. To ostatnie określa się mianem izotermicznych odcisków palców odpowiedzi na dawkę (ITDRF), aby podkreślić zależność tych pomiarów od konkretnych warunków doświadczalnych.

Celem tego protokołu jest pomiar zaangażowania celu za pomocą CETSA w przylegających komórkach poprzez wykrywanie przeciwciał immunofluorescencyjnych (IF) za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości12. Procedura ta rozszerza oryginalną platformę CETSA, aby umożliwić jednokomórkową kwantyfikację zaangażowania docelowego z zachowaniem lokalizacji subkomórkowej. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do wielu poprzednich doniesień, w tej procedurze obróbka złożona jest przeprowadzana w żywych przylegających komórkach bez odrywania powierzchni lub mycia przed wyzwaniem cieplnym, zachowując w ten sposób ustaloną równowagę wiązania, którą zamierzamy zmierzyć13. Obecnie metoda jest zwalidowana dla jednego docelowego białka p38α (MAPK14) w kilku liniach komórkowych i mamy nadzieję, że dzieląc się tą procedurą, technika może być szeroko stosowana w całym topniejącym proteomie. Przewidujemy, że protokół ten będzie można dostosować na całym etapie opracowywania leków, począwszy od badań przesiewowych, poprzez klasyfikację trafień, aż po monitorowanie zaangażowania celu in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zasiewanie komórek

UWAGA: Aby uzyskać ogólny przegląd przepływu pracy, zobacz Rysunek 1. Szczegółowa lista materiałów i odczynników dostępna jest w Tabeli Materiałów.

  1. Przed wysiewem komórek należy wywiercić otwory standardowym wiertłem w ramie czarnych 384-dołkowych płytek do obrazowania, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod płytką w późniejszym etapie ogrzewania. Aby uniknąć przedostania się cząstek plastiku do studzienek na tym etapie i utrzymać sterylne warunki, należy uszczelnić płytki samoprzylepną folią aluminiową lub przykryć płytkę przed wierceniem w kapturze do hodowli tkankowych. Zazwyczaj wystarczą 3 otwory o średnicy 3,5 mm z każdej strony płytki (krótka krawędź).
  2. Przygotuj ławkę z przepływem laminarnym, czyszcząc ją 70% etanolem. Postępując zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznej hodowli tkankowej, usuń pożywkę z kolby komórkowej lub naczynia. Przemyć komórki 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodać 2 ml trypsyny do kolby. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek A-431. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 50 000 komórek/ml w pożywce hodowlanej.
  3. Dozować 40 μl zawiesiny komórek (uzyskując końcową gęstość komórek 2 000 komórek na studzienkę) do każdej studzienki płytki testowej za pomocą dozownika odczynników luzem lub pipety wielokanałowej, w zależności od skali eksperymentu. Na krótko przesuwaj płytkę z boku na bok, aby równomiernie rozproszyć komórki na dnie płytki.
  4. Aby zminimalizować wpływ na krawędź płytki, pozwól komórkom osiąść na dnie płytki testowej przez 20 minut w temperaturze pokojowej z tyłu okapu z przepływem laminarnym. Następnie umieść talerz w plastikowym pojemniku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi, aby zapewnić wilgotną atmosferę. Przed użyciem przetrzyj plastikowy pojemnik 70% etanolem.
  5. Inkubować pudełko z płytką do oznaczania przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w konwencjonalnym inkubatorze nawilżanym. Monitoruj zbieganie się komórek do 50-75%, co ocenia się na podstawie oględzin pod mikroskopem świetlnym.

2. Leczenie złożone

  1. W dniu eksperymentu odessać pożywkę z każdej studzienki za pomocą podkładki do płytek. Umieść płytkę na podkładce do płyt i wybierz program aspiracji. Jeśli myjka do talerzy nie jest dostępna, płyn można usunąć, odwracając płytkę szybkim przekręceniem ręką nad tacą na śmieci lub zlewem. Całkowite usunięcie płynu jest niezbędne dla dobrej wydajności. Nadmiar płynu jest następnie usuwany przez przetarcie ręcznikami papierowymi.
  2. Dodać 30 μl związków rozcieńczonych do odpowiedniego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych za pomocą automatycznego dozowania lub pipety wielokanałowej, w zależności od skali eksperymentu. Upewnij się, że dodano ujemną (DMSO) i dodatnią (znaną ligand) kontrolę do kilku studzienek na każdej płytce testowej. Ponieważ jest to test przesunięcia termicznego, konieczne jest, aby stężenie związku przekroczyło stałą dysocjacji, aby zaobserwować stabilizację białka. Tak więc przybliżone wytyczne dotyczące stężenia związków są 50-100 razy większe niż IC50, ale bardziej szczegółowe opisy stężeń związków można znaleźć w sekcji Dyskusja.
    UWAGA: Tolerancja DMSO linii komórkowych powinna zostać przetestowana przed eksperymentem.
  3. Uszczelnić płytkę testową poddaną działaniu związków chemicznych z oddychającą płytką i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 30 minut.

3. Wyzwanie upału

  1. Najpierw ustaw łaźnię wodną na żądaną temperaturę. Należy pamiętać, że temperatura końcowa, która jest osiągana wewnątrz studzienek płytki testowej, może różnić się od temperatury końcowej w łaźni wodnej. Zbadaj wcześniej przesunięcie za pomocą atrapy płytki i termometru termoparowego. Zazwyczaj potrzeba 30 minut, aby kąpiel ustabilizowała się w żądanej temperaturze.
  2. W celu sprawdzenia, czy żądana temperatura została osiągnięta w studzienkach płytki testowej podczas etapu ogrzewania, należy przygotować nieuszczelnioną atrapę płytki zawierającą taką samą objętość pożywki jak płytka do oznaczania.
  3. Wyjąć płytki testowe z inkubatora. Zdjąć oddychającą uszczelkę i ponownie uszczelnić płytkę testową zawierającą komórki poddane działaniu związku szczelnie przylegającą folią aluminiową, aby upewnić się, że woda nie przedostanie się do studzienek podczas późniejszego ogrzewania w łaźni wodnej. Upewnij się, że wywiercone otwory w ramie płyty są dostępne.
  4. Umieścić płytkę do oznaczania i atrapę płytki w łaźni wodnej z dnem płytki skierowanym pod kątem w kierunku powierzchni wody, aby wypchnąć pozostałe powietrze spod płytek.
  5. Monitoruj temperaturę wewnątrz studzienek nowej atrapy płytki za pomocą termometru termoparowego.
  6. Podgrzewać płytkę do oznaczania w łaźni wodnej przez 3 minuty. Natychmiast przenieś test i atrapę płytki do innej łaźni wodnej z wodą o temperaturze pokojowej, aby ostygły przez 5 minut. Płytka testowa jest teraz gotowa do dalszej obróbki.

4. Fiksacja

  1. Dozować 10 μl 16% (w/v) paraformaldehydu (PFA) bezpośrednio na płytkę testową za pomocą dozownika odczynników luzem lub pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    Uwaga: Niektóre utrwalacze są klasyfikowane jako rakotwórcze i należy przestrzegać instytucjonalnych przepisów bezpieczeństwa.
  2. Odessać roztwór PFA i przemyć komórki 300 μl PBS za pomocą myjki do płytek. Umieść płytkę na podkładce do płyt i wybierz program aspiracji.
    UWAGA: Ta procedura została zoptymalizowana przy użyciu protokołu przelewu na myjce płyt, w którym płyn jest jednocześnie dozowany i usuwany. Jeśli myjka do płyt lub podobna procedura nie jest dostępna, etap mycia można alternatywnie wykonać ręcznie.
  3. Procedura mycia ręcznego: Usuń płyn ze studzienek, odwracając płytkę szybkim ręcznym przekręceniem nad tacą na odpady lub zlewem. Całkowite usunięcie płynu jest niezbędne dla dobrej wydajności. Dodać 80 μl PBS za pomocą pipety wielokanałowej i ponownie odwrócić płytkę, jak opisano powyżej, powtórzyć procedurę mycia dwa razy. Po ostatnim umyciu osusz talerz o czyste ręczniki papierowe, aby usunąć nadmiar płynu.

5. Przepuszczalność

  1. Dodać 20 μl 0,1% (v/v) NP-40 do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umyj komórki, stosując tę samą procedurę, jak opisaną powyżej (krok 4.2).
  2. Alternatywnie, w stosownych przypadkach, należy zastosować protokół odzyskiwania antygenu, np.:
    1. Dodać 20 μl 1% SDS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i myć zgodnie z tą samą procedurą opisaną powyżej (krok 4.2).
    2. Dodać 80 μl 10 mM glicyny o pH 7,2 i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór glicyny za pomocą myjki do płytek, umieszczając go na podkładce do płytek i wybierając protokół aspiracji. Patrz uwagi w ppkt 2.1 i 4.2, jeżeli podkładka do blach nie jest dostępna.

6. Blokowanie

  1. Dodać 15 μl 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do studzienek za pomocą dozownika odczynników zbiorczych lub pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C z uszczelką z folii aluminiowej.

7. Przeciwciało pierwotne

  1. Zassać roztwór blokujący za pomocą podkładki do płytek, umieszczając ją na podkładce płytki i wybierając protokół aspiracji. Patrz uwagi w ppkt 2.1 i 4.2, jeżeli podkładka do blach nie jest dostępna.
  2. Dodać 10 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego odpowiednio w 1% (w/v) BSA w PBS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C z uszczelką z folii aluminiowej.

8. Przeciwciało drugorzędowe

  1. Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i umyć studzienki zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano powyżej (krok 4.2).
  2. Dodać 10 μl przeciwciała drugorzędowego Alexa 488 rozcieńczonego odpowiednio w 1% (w/v) BSA w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Uszczelnij płytę samoprzylepną uszczelką z folii aluminiowej, aby chronić ją przed światłem.
    UWAGA: Chroń płytkę przed światłem podczas tego i kolejnych kroków.

9. Barwienie jądrowe i maska komórkowa

  1. Dodać 10 μl barwnika jądrowego rozcieńczonego do 0,05 mg/ml w PBS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut.
  2. Odessać przeciwciało drugorzędowe i roztwór Hoechsta i umyć studzienki, stosując tę samą procedurę, jak opisano powyżej (krok 4.2).
  3. Dodać 10 μl maski komórkowej rozcieńczonej do 200 ng/ml w PBS do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Zassać roztwór maski komórkowej i umyć studzienki, stosując tę samą procedurę, jak opisano powyżej (krok 4.2).
  5. Dozować 60 μl PBS do wszystkich studzienek za pomocą myjki do płytek, dozownika odczynników luzem lub pipety wielokanałowej i uszczelnić płytki samoprzylepną folią aluminiową.

10. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Rejestruj obrazy na imagerze o wysokiej zawartości przy użyciu 3 kanałów fluorescencyjnych: DAPI (387/447), GFP (472/520) i TexasRed (562/624). Zrób 4 zdjęcia na studnię za pomocą obiektywu 10X. Użyj automatycznego laserowego autofokusa i zastosuj binning 2 podczas akwizycji. Przechowuj obrazy jako 16-bitowe pliki tiff w skali szarości wraz z metadanymi.
  2. Analizuj obrazy za pomocą dostępnego oprogramowania. Zidentyfikuj granice komórek za pomocą algorytmu punktacji komórki z DAPI (jądro) i TexasRed (cytoplazma).
  3. Wyodrębnij średnią intensywność dla wszystkich uzyskanych długości fal w celu dalszej analizy danych.
  4. Oblicz współczynnik Z, aby zapewnić solidność testu.
  5. Obliczyć stabilizację procentową, stosując następujący wzór: 100*(1-(intensywność odwiertu – kontrola ujemna o średniej intensywności odwiertu)/(kontrola dodatnia o średniej intensywności – kontrola ujemna o średniej intensywności)). W tym przypadku kontrolą ujemną jest DMSO, a kontrolą pozytywną jest substancja odniesienia. Ponieważ maksymalna stabilizacja między związkami może się różnić i w rzeczywistości być większa niż kontrola pozytywna dla krzywych ITDRF, maksymalne i minimalne intensywności stabilizacji dla każdego związku są czasami stosowane zamiast wartości intensywności studzienek kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w Rysunek 1 opisuje podstawowy przebieg procesu przeprowadzania testów CETSA na przylegających komórkach z wykrywaniem pozostałego rozpuszczalnego białka za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości. Ten przepływ pracy można łatwo dostosować do wszystkich etapów opracowywania testu, modyfikując układ płytek związków lub odczynników14. Poniżej szczegółowo opisujemy oczekiwane wyniki dla kilku przewidywanych przypadków uż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak omówiono w sekcji wyników, procedura składa się z kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby zidentyfikować wysokiej jakości odczynnik powinowactwa. Zalecamy przeprowadzenie badań przesiewowych małej biblioteki przeciwciał dla każdego pożądanego celu. Po wybraniu przeciwciała pierwszorzędowego ważne jest również, aby w razie potrzeby zweryfikować system pod kątem wielu różnych miejsc wiązania docelowego białka. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie badań przesiewowych pod kątem związków, które zakłócają ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie infrastrukturalne ze strony Science for Life Laboratory i Karolinska Institutet. Autorzy doceniają również wkład i dyskusje z Michaelą Vallin, Magdaleną Otrocką i Thomasem Lundbäckiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Medicago09-9400-100
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013do odłączania komórek i subkulturowania
16% paraformaldehydu (PFA)ThermoFisher Scientific28908utrwalacz
Kozia anty-królicza IgG (H+L), Alexa Fluor 488 przeciwciało sprzężoneThermoFisher ScientificA11008przeciwciało wtórne
HCS CellMask Czerwone barwienieThermoFisher ScientificH32712Barwienie cytoplazmy
NP-40Sigma-Aldrich56741do przepuszczalności
Barwienie Hoechst 33342Barwienie jądroweSigma-AldrichB2261
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka (DMEM) - składnikpożywki do hodowli komórkowychSigma-Aldrich6429
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)Składnik pożywki do hodowli komórkowychSigma-AldrichF9665
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333składnik pożywki do hodowli komórkowych
Corning, oddychająca uszczelka płytkowaSigma-AldrichCLS3345do etapu inkubacji copound
Królicze przeciwciało anty-p38 [E229]Abcamab170099przeciwciało pierwszorzędowe, LOT:GR305364-16
Falcon, czarne 384-dołkowe przezroczyste płytki obrazowe z dnem Płytki obrazoweVWR736-2044
Greiner, 384-dołkowe płytki polipropylenowe o małej objętościVWR784201
Samoprzylepna folia aluminiowaVWR30127790
Zrywalna uszczelka aluminiowaAgilent24210-001dla PlateLoc
LY2228820SelleckchemS1494p38 i alfa inhibitor
PH797804SelleckchemPH797804inhibitor p38 i alfa
BIRB796SelleckchemS1574p38 i alfa
inhibitor SB203580Tocris1202p38 i alfa
AMG 548Tocris3920p38 i alfa inhibitor
RWJ 67657Tocris2999p38 i alfa; inhibitor
L-skepinonuCBCS kolekcjap38 i alfa
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7030środek blokujący
SDS (dodecylosiarczan sodu)BDH44244stosowany w pobieraniu antygenu
GlicynaSigma-AldrichG8898stosowana w komórkach
A-431doATCC ATC-CRL-1555
Echo 550LabcyteDo przygotowania płytek złożonych
Uszczelniacz do płytAgilentPlateLoc
Dozownik odczynników luzemThermo Scientific5840300Multidrop Combi
Automated liquid obsługaAgilentBravo; służy do przygotowania płytek złożonych
Myjka do płytTecanHydrospeed Łaźnia
wodnaJulaboTW12
TermoparaVWRTermopara Termometr laboratoryjny
o wysokiej zawartości UrządzeniamolekularneImageXpress Micro XLS Widefield High-Content System analizy
o wysokiej zawartości glukozy odzyskiwania antygenu Platforma do obsługi cieczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091(2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040(2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

High Content ImagingTarget EngagementCellular Thermal Shift AssayAdherent CellsCompound Target InteractionSubcellular LocalizationIsothermal Dose ResponseThermal Aggregation CurveAntibody RecognitionPlate Washer

Powiązane artykuły