Artykuł metodologiczny

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58687

⸱

26 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Stem Cell Biobank and Disease Modeling Core, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Streszczenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) okazały się cennym narzędziem do badania rozwoju i chorób człowieka. Dalszy rozwój iPSC jako terapii regeneracyjnej wymaga bezpiecznego, solidnego i celowego protokołu przeprogramowania. W tym miejscu przedstawiamy klinicznie istotny protokół krok po kroku do niezwykle skutecznego przeprogramowania ludzkich fibroblastów skóry na iPSC przy użyciu podejścia nieintegrującego. Rdzeń protokołu składa się z ekspresji czynników pluripotencji (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, fuzja OCT4-MyoD) z transkrybowanych in vitro informacyjnych RNA syntetyzowanych ze zmodyfikowanymi nukleotydami (zmodyfikowanymi mRNA). Przeprogramowane zmodyfikowane mRNA są transfekowane do pierwotnych fibroblastów co 48 godzin wraz z dojrzałymi embrionalnymi mikroRNA-367/302 specyficznymi dla embrionalnych komórek macierzystych przez dwa tygodnie. Powstałe w ten sposób kolonie iPSC można następnie wyizolować i bezpośrednio rozprowadzać w warunkach wolnych od karmienia. Aby zmaksymalizować wydajność i spójność naszego protokołu przeprogramowania próbek fibroblastów, zoptymalizowaliśmy różne parametry, w tym schemat transfekcji RNA, czas transfekcji, warunki hodowli i gęstość wysiewu. Co ważne, nasza metoda pozwala na uzyskanie wysokiej jakości iPSC z większości źródeł fibroblastów, w tym trudnych do przeprogramowania próbek chorych, starszych i/lub starczych.

Wprowadzenie

Przeprogramowanie komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) wymaga rozszerzonej ekspresji podstawowego zestawu czynników transkrypcyjnych, które są ważne dla utrzymania pluripotencji1,2. Podczas wytwarzania iPSC do zastosowań klinicznych ważne jest, aby obciążenie mutacyjne w komórkach wejściowych zostało zminimalizowane podczas przetwarzania, a wydajność wytwarzania iPSC była utrzymywana na stosunkowo wysokim poziomie we wszystkich próbkach pacjentów. Jednak większość metod przeprogramowywania, w tym protokoły bez integracji, cierpi z powodu bardzo niskiej wydajności przeprogramowywania, co ogranicza kliniczną użyteczność tych podejść3. Niska wydajność przeprogramowania może również sprzyjać selektywnemu przeprogramowywaniu komórek zawierających wcześniej istniejące mutacje, zwiększając obciążenie mutacyjne w powstałych iPSC. Ponadto wszystkie metody przeprogramowania oparte na DNA, takie jak podejścia oparte na lentiwirusie i episomalnych, cierpią z powodu obaw dotyczących bezpieczeństwa, że DNA może losowo zintegrować się z genomem i stworzyć okazję do szkodliwej mutagenezy insercyjnej i niepożądanej (potencjalnie onkogennej) ekspresji genów pluripotencji w dalszych pochodnych tkankowych4.

Obiecującym podejściem do osiągnięcia efektywnej indukcji pluripotencji w komórkach somatycznych i zmniejszenia obciążenia mutacjami w powstałych iPSC jest użycie syntetycznych RNA przekaźnikowych zawierających zmodyfikowane zasady nukleotydowe (zmodyfikowane mRNA) do przeprogramowania5. Skuteczność zmodyfikowanych podejść do przeprogramowania opartych na mRNA można dodatkowo zwiększyć poprzez dodanie mikroRNA (miRNA) specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ESC)-367/302s3, które, jak wykazano, przeprogramowują komórki somatyczne ze zwiększoną wydajnością6,7. Jednak nawet po dodaniu miRNAs-367/302, zmodyfikowane podejście do przeprogramowania oparte na mRNA często zawodzi podczas aplikacji do świeżo wyizolowanych komórek pacjenta3. Aby rozwiązać niespójności tego zmodyfikowanego podejścia opartego na mRNA, niedawno opisaliśmy zoptymalizowaną, wolną od integracji strategię, która indukuje pluripotencję w ludzkich pierwotnych fibroblastach z wysokim wskaźnikiem sukcesu i wykorzystuje zarówno zmodyfikowane mRNA kodujące czynniki przeprogramowujące, jak i dojrzałe mimiki miRNA-367/3028. W naszej metodzie zmodyfikowany koktajl mRNA reprogramowania obejmuje zmodyfikowaną wersję OCT4 połączoną z domeną transaktywacji MyoD (zwaną M3O) 9 i pięcioma innymi czynnikami przeprogramowania (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A i NANOG). Połączenie zmodyfikowanego mRNA kodującego czynniki pluripotencji z mimikami miRNA wydaje się mieć synergiczny wpływ na wydajność przeprogramowania w tym protokole. Dodatkowe optymalizacje schematu transfekcji RNA, wysiewu komórek i warunków hodowli były również konieczne, aby zwiększyć efektywność przeprogramowania podejścia do ultra-wysokiego poziomu8.

W przeciwieństwie do wielu innych protokołów, nasze podejście do przeprogramowania zazwyczaj wymaga tylko kilku tysięcy fibroblastów wejściowych. Ponadto wiele powszechnych strategii nieintegrujących wykorzystujących plazmidy episomalne, wirusa Sendai lub samoreplikujące się RNA obejmuje rozległe pasażowanie w celu rozcieńczenia wektora przeprogramowania w wygenerowanych iPSC. I odwrotnie, zmodyfikowane mRNA i dojrzałe mimiki miRNA mają krótki okres półtrwania i są szybko eliminowane z komórek. Podsumowując, łączny czas hodowli komórkowej między pobraniem próbek od pacjenta a wytworzeniem użytecznych iPSC jest w tym podejściu minimalny, co skutecznie ogranicza akumulację mutacji w powstałych iPSC i poprawia opłacalność.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół krok po kroku, który pozwala osiągnąć wysoką skuteczność przeprogramowania dorosłych ludzkich fibroblastów na iPSC przy użyciu naszego kombinatorycznego zmodyfikowanego podejścia opartego na mRNA/miRNA8. Ten protokół przeprogramowania oparty na RNA zapewnia prostą, opłacalną i solidną metodę generowania niewymagających integracji iPSC do badań i potencjalnych zastosowań klinicznych. Ponadto ma zastosowanie do przeprogramowywania różnych linii fibroblastów, w tym trudnych do przeprogramowania, związanych z chorobą, starzejących się i starzejących się fibroblastów. Schemat protokołu przeprogramowania ludzkich fibroblastów pokazano na rysunku 1. Protokół szczegółowo opisuje metodę przeprogramowania trzech dołków dorosłych dorosłych fibroblastów pierwotnych na płytce o formacie 6-dołkowym. Dwie studzienki zazwyczaj dają wystarczającą liczbę wysokiej jakości kolonii iPSC. W wielu przypadkach potrzebna jest tylko jedna studnia, a trzecia studnia może być wykorzystana do analizy wydajności przeprogramowania. W razie potrzeby liczbę odwiertów można zwiększyć.

Protokół

Pracuj w warunkach wolnych od RNaz i stosuj techniki aseptyki, jeśli to możliwe. Wszystkie manipulacje związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu technik aseptycznych. Przestrzegaj instytucjonalnych norm bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z komórkami ludzkimi.

1. Odczynniki i sprzęt do przygotowania inicjacji przeprogramowania

  1. Przygotuj zmodyfikowany koktajl mRNA kodujący czynniki przeprogramowujące.
    1. Postępuj zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem10, aby przeprowadzić procedury transkrypcji, cappingu i defosforylacji in vitro dla każdego zmodyfikowanego mRNA kodującego indywidualny czynnik przeprogramowywania. Po ostatnim etapie oczyszczania wymyj zmodyfikowane mRNA wodą wolną od nukleaz, uzupełnij oczyszczony zmodyfikowany roztwór mRNA 1 U/μL inhibitorem RNazy, oznacz ilościowo zmodyfikowane mRNA za pomocą spektrofotometru i przechowuj w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy. Przygotuj wiele porcji każdego zmodyfikowanego mRNA, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA: Podobne protokoły dla zmodyfikowanej produkcji mRNA zostały zgłoszone gdzie indziej5,8,11. Matryce do transkrypcji in vitro mogą być generowane przez amplifikację PCR z odpowiednich matryc plazmidowych przy użyciu starterów wymienionych w Tabeli Materiałów zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem10. Szablony plazmidów dla każdego czynnika przeprogramowania (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) i mWasabi (kontrola transfekcji) są dostępne w Addgene, repozytorium plazmidów non-profit.
    2. Wymieszaj ze sobą wszystkie zmodyfikowane mRNA w stosunku molowym 3:1:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2 : KLF4 : cMYC : NANOG : LIN28A) i włącz 10% mRNA zmodyfikowanego mWasabi jako kontrolę wydajności transfekcji. Dostosuj stężenie kompletnej zmodyfikowanej mieszaniny reprogramującej mRNA do końcowego stężenia 100 ng / μl, dodając wodę wolną od nukleaz uzupełnioną 1 U/μl inhibitorem RNazy. Przygotuj siedem 33 μl podwielokrotności kompletnego zmodyfikowanego koktajlu mRNA. Przechowywać mieszane podwielokrotności do przeprogramowania w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Do każdej transfekcji dodaje się 1,000 ng zmodyfikowanego koktajlu mRNA na studzienkę (tj. w sumie 3,000 ng na 3 dołki). Każda porcja o pojemności 33 μl jest dobrana tak, aby transfekować 3 dołki płytki o formacie 6-dołkowym i zawiera 3 μl nadmiaru objętości w celu uwzględnienia błędów pipetowania. Przygotowanie siedmiu podwielokrotności o pojemności 33 μl wystarcza do przeprowadzenia pełnego przeprogramowania fibroblastów z 3 dołków na płytce o formacie 6-dołkowym.
  2. Przygotuj koktajl przeprogramowania mimimiki miRNA.
    1. Rozpuścić liofilizowane mimimiki (Syn-has-miR-302a-3p, Syn-has-miR-302b-3p, Syn-has-miR-302c-3p, Syn-has-miR-302d-3p, Syn-has-miR-367-3p) do końcowego stężenia 5 pmol/μL (5 μM) w wodzie wolnej od nukleaz uzupełnionej 1 U/μL inhibitora RNazy. Przygotować wiele porcji każdego mimiku miRNA i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
    2. Wymieszaj wszystkie mimiki miRNA w stosunku molowym 1:1:1:1:1 do końcowego stężenia 5 pmol/μL (5 μM). Przygotuj siedem 14 μl podwielokrotności mieszaniny miRNA naśladowczej. Przechowywać zmieszane porcje w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Do każdej transfekcji dodaje się 20 pmol mieszanki miRNA naśladującej na studzienkę (tj. w sumie 60 pmol na 3 dołki). Każda podwielokrotność 14 μl jest dobrana tak, aby transfekować 3 dołki płytki o formacie 6-dołkowym i zawiera 2 μl nadmiaru objętości w celu uwzględnienia błędów pipetowania. Przygotowanie siedmiu podwielokrotności o pojemności 14 μl wystarcza do przeprowadzenia pełnego przeprogramowania fibroblastów z 3 dołków na płytce o formacie 6-dołkowym.
  3. Przygotować bufor do transfekcji.
    1. Podgrzewaj jedną butelkę o pojemności 500 ml i jedną butelkę o pojemności 100 ml świeżej surowicy o obniżonej temperaturze do temperatury pokojowej (RT) przez około 2 godziny. Nie używaj kąpieli wodnej.
    2. Przenieś pH-metr do komory bezpieczeństwa biologicznego. Umyj szklaną elektrodę miernika wodą wolną od nukleaz. Skalibruj pH-metr zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie umyj elektrodę wodą wolną od nukleaz.
    3. Przenieść obie butelki z pożywką o obniżonej surowicy do komory bezpieczeństwa biologicznego. Użyj butelki RT o pojemności 500 ml, aby wyregulować pH.
    4. Zmierzyć pH podstawowe pożywki o obniżonej surowicy, wkładając szklaną elektrodę pH-metru do buforu. Odczekaj do 1 minuty przed odczytaniem pH na mierniku.
    5. Dodać 3-4 ml 1 M NaOH do 500 ml pożywki o zredukowanej surowicy, zamknąć butelkę i dobrze wymieszać. Odczekaj do 5 minut przed otwarciem butelki w celu pomiaru pH. Włóż elektrodę pH-metru do buforu i poczekaj, aż odczyt na pH-metrze ustabilizuje się.
    6. Kontynuować dodawanie małych objętości 1 M NaOH do momentu, gdy pH pożywki o obniżonej surowicy osiągnie 8,15–8,17. Podczas procesu kilkakrotnie skalibruj pH-metr. Jeśli w którymkolwiek momencie pH stanie się wyższe niż 8,18, zmniejsz je, dodając świeżą pożywkę o obniżonej surowicy z podgrzanej butelki o pojemności 100 ml (krok 1.3.1).
      UWAGA: pH buforu do transfekcji na bazie pożywki o obniżonej surowicy ma kluczowe znaczenie. Przeprogramowanie zakończy się sukcesem, jeśli pH buforu transfekcyjnego wynosi około 8,2 ± 0,05, ale może się nie powieść, jeśli pH będzie wyższe niż 8,25. Dlatego zaleca się zaprzestanie dodawania NaOH, gdy pH buforu osiągnie 8,15–8,17. Zapewni to, że końcowe pH buforu do transfekcji wyniesie około 8,2–8,22 po sterylizacji.
    7. Filtr wysterylizuj bufor transfekcyjny za pomocą systemu filtracji próżniowej 0,22 μm. Podzielić wysterylizowany bufor na probówki o pojemności 5 lub 15 ml z minimalną przestrzenią powietrzną.
    8. Podwielokrotności buforu do transfekcji przechowywać przez okres do 3 miesięcy w temperaturze 4 °C. Okresowo mierzyć pH podwielokrotności. Odrzucić podwielokrotności, jeśli pH jest wyższe niż 8,25. Ograniczyć użycie podwielokrotności tylko do 2 transfekcji, ponieważ wystawienie buforu transfekcyjnego na działanie powietrza atmosferycznego zwiększa pH buforu.
  4. Przygotuj pożywkę ekspandującą fibroblasty (MES): minimalna niezbędna pożywka uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1x aminokwasy endogenne, 1x suplement glutaminy, 55 μM 2-merkaptoetanol, 1x długopis/paciorkowiec/fungizone. Przechowywać MES w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj pożywkę przeprogramowującą: DMEM/F12 (bez HEPES) uzupełniony o 20% zamiennik surowicy nokautującej (KOSR), 0,5x aminokwasy endogenne, 0,5x suplement glutaminy, 55 μM 2-merkaptoetanol, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 1x długopis/paciorkowiec/fungizone, 100 ng/ml bFGF i 200 ng/ml B18R. Przygotować pożywkę na początku przeprogramowania bez bFGF i B18R i przechowywać ją w temperaturze 4 °C. Nie należy go stosować dłużej niż 1 miesiąc po przygotowaniu. Dodać bFGF i B18R bezpośrednio przed każdym użyciem do podwielokrotności o wielkości potrzebnej do spożycia w danym dniu.
  6. Przygotować pożywkę galwaniczną, dodając 5% inaktywowanego termicznie (HI) FBS do pożywki przeprogramowującej zawierającej 20% KOSR bez bFGF i B18R z kroku 1.5. Pożywkę należy przygotować na świeżo w dniu zamierzonego użycia. Dodaj bFGF i B18R bezpośrednio przed użyciem w 0 dniu przeprogramowania.
  7. Skalibruj inkubatory do hodowli tkankowych przed rozpoczęciem przeprogramowywania zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą ręcznego cyfrowego analizatora CO2 . Użyj inkubatora o niskiej zawartościO2 do etapów przeprogramowywania, aby zapewnić pomyślne wytwarzanie iPSC.

2. Hodowla fibroblastów do przeprogramowania

  1. Przygotuj fibroblasty przed rozpoczęciem przeprogramowania (dzień -2).
    1. Pokryj nową 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej 5 ml 0,1% żelatyny. Postukaj lub obracaj płytką, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Odessać żelatynę i dodać 10 ml MES. Odstawić. Nie dopuścić do wyschnięcia pokrytej powierzchni płytki przed dodaniem MES.
    2. Ostrożnie odessać zużytą pożywkę z fibroblastów. Przepłucz komórki raz 5 ml DPBS, aby usunąć resztki surowicy. Dodaj 3 ml trypsyny-EDTA. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić całkowite pokrycie komórek.
    3. Odessać nadmiar płynu, pozostawiając ~500 μL trypsyny. Nie przesadzaj, ponieważ może to wysuszyć i zabić fibroblasty. Inkubować fibroblasty z trypsyną-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    4. Wyjąć płytkę z inkubatora i mocno, ale delikatnie postukać w bok płytki, aby usunąć komórki. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Jeśli komórki są odłączone i pływające, kontynuuj. Jeśli komórki są nadal połączone, inkubować przez kolejne 3 minuty.
    5. Szybko przepłucz/zbierz oderwane komórki za pomocą 5 ml MES, aby zneutralizować trypsynę-EDTA. Przenieść zawiesinę fibroblastów do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Upewnij się, że komórki są dobrze wymieszane.
    6. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby rozbić duże skupiska komórek, a następnie policz je na hemocytometrze. Przenieść 2,5 x 105 komórek do pokrytego żelatyną 10-centymetrowego naczynia przygotowanego w kroku 2.1.1. Inkubować komórki przez noc w regularnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 nawilżonym.
      UWAGA: Gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności przeprogramowywania, ponieważ ważne jest, aby fibroblasty były zdrowe i szybko się dzieliły. Posiew 2,5 x 105 komórek daje 40-60% konfluencji 2 dni później dla większości próbek fibroblastów. Dostosuj ilość odpowiednio do chorych lub starczych komórek, aby osiągnąć pożądaną konfluencję 40-60% 48 godzin później.
    7. Zastąp pożywkę 10 ml świeżego MES następnego dnia (dzień -1).
  2. Umieść płytki w fibroblastach, aby zainicjować przeprogramowanie (dzień 0).
    1. Sprawdź, czy fibroblasty, które mają zostać przeprogramowane, mają 40–60% konfluencji (Rysunek 2, dzień 0). Jeśli komórki są nadmiernie lub niedostatecznie zlewające się, należy przejść przez fibroblasty zgodnie z opisem w kroku 2.1 i odpowiednio dostosować gęstość posiewu. Kultura przez kolejne 2 dni.
    2. Przenieść 4 ml DPBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 100 μl rekombinowanej ludzkiej (rh) lamininy-521. Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.
    3. Dodać 1 ml rozcieńczonej rhLaminin-521 do 3 dołków na płytce 6-dołkowej. Inkubować powlekaną płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    4. Podgrzać 6 ml MES i 4 ml pożywki galwanicznej do temperatury 37 °C. Uzupełnić pożywkę galwaniczną bFGF do końcowego stężenia 100 ng/ml i B18R do końcowego stężenia 200 ng/ml.
    5. Ostrożnie odessać zużytą pożywkę z fibroblastów (krok 2.2.1). Przepłucz komórki 5 ml DPBS i dodaj 3 ml trypsyny-EDTA. Delikatnie kołysz płytką, aby pokryć komórki trypsyną-EDTA.
    6. Odessać nadmiar płynu, pozostawiając ~500 μl trypsyny, jak to zrobiono w kroku 2.1.3. Inkubować fibroblasty z trypsyną-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Wyjąć płytkę z inkubatora i mocno, ale delikatnie postukać w bok płytki, aby usunąć komórki. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Jeśli komórki są odłączone i pływające, kontynuuj. Jeśli komórki są nadal połączone, inkubować przez kolejne 3 minuty.
    7. Przepłucz/zbierz oderwane komórki za pomocą 5 ml MES w celu zneutralizowania trypsyny-EDTA. Przenieść zawiesinę fibroblastów do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Upewnij się, że komórki są dobrze wymieszane i policz je na hemocytometrze. Odpipetować 12 000 komórek do 4 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego z kroku 2.2.4.
      UWAGA: W żadnym momencie nie odwirowuj komórek. Liczbę platerowanych komórek można regulować w górę lub w dół w zależności od potrzeb odpowiednio dla wolno lub szybko rosnących linii.
    8. Wyjąć pokrytą płytkę z inkubatora i odessać rozcieńczoną rhLaminin-521 z powlekanych studzienek. Nie pozwól, aby powierzchnia studzienek wyschła. Delikatnie zawiesić komórki w podłożu galwanicznym. Odpipetować 1 ml zawiesiny komórek do każdego powlekanego dołka (tj. 3 000 komórek na studzienkę).
    9. Umieść posiane komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych składającym się z trzech gazów o O2 ustawionym na 5% (niski poziomO2 2). Po odłożeniu płytki delikatnie, ale dokładnie rozproszyj komórki, naprzemiennie wykonując ruch góra/dół, a następnie w lewo/w prawo. Powtórz ruchy jeszcze 2 razy. Inkubuj komórki przez noc. Nie obracaj płytką w celu wymieszania.
    10. Odpipetować 4 ml pożywki do przeprogramowywania do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umieścić ją w inkubatorze o niskiej zawartościO2 z poluzowaną nasadką w celu zrównoważenia przez noc. Nie należy dodawać bFGF i B18R do następnego dnia.

3. Rozpoczęcie przeprogramowania (dzień 1)

UWAGA: Po rozpoczęciu przeprogramowania, wymagana jest codzienna konserwacja przez około 1 miesiąc. Pamiętaj, aby odpowiednio zaplanować. Wszystkie kolejne inkubacje komórek muszą być przeprowadzone w warunkach niskiej zawartościO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych w trzech gazach o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2

.
  1. Podłoże galwaniczne należy wymienić co najmniej 1 godzinę przed transfekcją.
    1. Usunąć zrównoważoną pożywkę przeprogramowującą z inkubatora o niskiej zawartościO2. Dodać bFGF do końcowego stężenia 100 ng/ml i B18R do końcowego stężenia 200 ng/ml. Dobrze wymieszaj.
    2. Postępując z 1 dołkiem na raz, użyj pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć zużyte podłoże i zastąp je 1 ml pożywki do przeprogramowania uzupełnionej bFGF i B18R. Powtórz to dla każdej studzienki. Nie używaj aspiracji próżniowej, która nadmiernie wysusza ogniwa, powoduje stres i zmniejsza wydajność przeprogramowywania. Przenieść płytkę z komórkami z powrotem do inkubatora o niskiej zawartościO2
      3. .
  2. Transfekcja fibroblastów z 5 μl odczynnika do transfekcji RNAiMax na 1 μg zmodyfikowanego mRNA i 1 μl odczynnika do transfekcji na 6 pmol miRNA na transfekcję.
    UWAGA: Optymalne wyniki uzyskuje się, gdy transfekcja trwa 16–20 godzin. Odczynnik do transfekcji rozcieńcza się 10x; zmodyfikowany koktajl mRNA o stężeniu 100 ng/μl rozcieńcza się 5x; a mieszanina miRNA 5 pmol/μL naśladuje się rozcieńcza 8,33x buforem transfekcji przed kompleksowaniem. Patrz Tabela 1 w celu podsumowania konfiguracji transfekcji.
    1. Przygotowując mieszaniny do transfekcji, zminimalizuj potencjalne narażenie odczynników na RNazę, postępując zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną.
    2. Równoważyć podwielokrotność buforu do transfekcji (etap 1.3) przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Nie używać łaźni wodnej ani inkubatora o temperaturze 37 °C do rozgrzania buforu transfekcyjnego.
    3. Usuń pojedynczą porcję zmodyfikowanych mRNA (33 μl) i mimikrów miRNA (14 μl) z -80 °C i podgrzej je do temperatury RT przez około 3-5 minut, aż do rozmrożenia. Nie rozmrażać porcji w temperaturze 37 °C. Odwirować je krótko w mikrofudze.
    4. Podgrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej przez około 3-5 minut. Nie używać łaźni wodnej ani inkubatora o temperaturze 37 °C. Odwróć zamkniętą probówkę 2-3 razy, aby wymieszać odczynnik. Odkręć go krótko w mikrofuge.
    5. Przenieść 279 μl buforu do transfekcji RT do probówki mikrowirówkowej wolnej od RNaz. Dodać 31 μl odczynnika do transfekcji, aby uzyskać końcową objętość 310 μl. Dokładnie wymieszać pipetując. Nie wirować. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 1 min.
      UWAGA: Ta objętość rozcieńczonego odczynnika do transfekcji jest wystarczająca do kompleksowania zarówno zmodyfikowanego mRNA, jak i miRNA naśladuje podwielokrotności z kroku 3.2.3.
    6. Dodać 132 μl buforu transfekcji RT do 33 μl podwielokrotności zmodyfikowanego mRNA. Delikatnie odpipetować do wymieszania: końcowa objętość wynosi 165 μl.
    7. Dodać 102,6 μl buforu transfekcyjnego RT do 14 μl podwielokrotności mimików miRNA. Delikatnie odpipetować do wymieszania: końcowa objętość wynosi 116,6 μl.
    8. Dodać 165 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji z kroku 3.2.5 do rozcieńczonego zmodyfikowanego mRNA z kroku 3.2.6. Pipeta do mieszania: końcowa objętość wynosi 330 μL.
    9. Dodać 116,6 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji z kroku 3.2.5 do rozcieńczonej mieszaniny miRNA naśladującej z kroku 3.2.7. Dobrze wymieszaj (końcowa objętość to 233,2 μl). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić połączenie buforu transfekcji ze zmodyfikowanymi mRNA i mimikami miRNA.
    10. Wyjąć płytkę z komórkami z inkubatora o niskiej zawartościO2. Dodać 100 μl (1 μg) skompleksowanej zmodyfikowanej mieszanki transfekcji mRNA do każdego dołka, kroplami w poprzek dołka. Rozprowadzić kompleksy transfekcji, delikatnie, ale dokładnie mieszając płytkę ruchem góra/dół, a następnie w lewo/w prawo. Nie obracaj płytką w celu wymieszania.
    11. Dodaj 66,7 μl (20 pmol) skompleksowanej mieszaniny miRNA naśladującej transfekcję do każdego dołka, kroplami w poprzek dołka. Rozproszyć kompleksy transfekcyjne poprzez delikatne, ale dokładne mieszanie płytki ruchem góra/dół, a następnie lewo/prawo. Nie obracaj płytką w celu wymieszania.
    12. Umieść transfekowane komórki w inkubatorze trójgazowym zO2 ustawionym na 5% (low-O22). Po odłożeniu płytki ponownie rozproszyć kompleksy transfekcyjne, delikatnie, ale dokładnie mieszając płytkę ruchem góra/dół, a następnie w lewo/w prawo.
    13. Odpipetować 4 ml pożywki do przeprogramowywania do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umieścić ją w inkubatorze o niskiej zawartościO2 z poluzowaną nasadką, aby zrównoważyć stan wody przez noc. Nie należy dodawać bFGF i B18R do następnego dnia.
Probówka 1 - Rozcieńczenie RNAiMax (1. mieszanka)
Odczynnikkoncentracjagłośność
Bufor transfekcyjny279 μL
RNAiMax (dodać 2.)10x31 μL
Razem: 310 μL
(inkubować 1 minutę w temperaturze pokojowej)
Probówka 2 - zmodyfikowana mieszanka mRNA (2nd mix)
Odczynnikkoncentracjagłośność
zmodyfikowana mieszanina mRNA100 ng/μL (5x)33 μL
Bufor transfekcyjny132 μL
Razem: 165 μL
(dodać równą objętość rozcieńczonego RNAiMax z probówki 1)
Rurka 3 - miRNA naśladuje mix (3. mieszanka)
Odczynnikkoncentracjagłośność
Mieszanka miRNA naśladuje5 pmol/μL (8,33x)14 μL
Bufor transfekcyjny102,6 μL
Razem: 116,6 μL
(dodać równą objętość rozcieńczonego RNAiMax z probówki 1)

Tabela 1: Przygotowanie mieszanki transfekcyjnej.

4. Wymiana medium przeprogramowującego między transfekcjami (dni 2, 4, 6, 8, 10 i 12)

  1. Wymienić pożywkę 16–20 godzin po transfekcji, jak opisano w ppkt 3.1.1–3.1.2. Dodać bFGF do końcowego stężenia 100 ng/ml i B18R do końcowego stężenia 200 ng/ml do podwielokrotności pożywki przeprogramowującej.
  2. Codziennie monitoruj ekspresję mWasabi, aby potwierdzić jakość transfekcji za pomocą mikroskopu skonfigurowanego do wizualizacji EGFP.
    UWAGA: Ekspresja mWasabi powinna być minimalnie widoczna w 2 dniu i zwiększać jasność z każdą dodatkową transfekcją.

5. Codzienne transfekcje (dni 3, 5, 7, 9, 11 i 13)

  1. Wykonaj transfekcję zgodnie z opisem w kroku 3.2. Nie zmieniaj podłoża w dniach transfekcji.
  2. Przygotować 4 ml podwielokrotności pożywki do przeprogramowania i umieścić ją w inkubatorze o niskiej zawartościO2 w celu zrównoważenia do zmiany pożywki następnego dnia. Nie należy dodawać bFGF i B18R do następnego dnia.

6. Procedury, które należy wykonać po końcowej transfekcji

  1. Wykonuj codzienne zmiany pożywki od 14 dnia do około 17 dnia. Podgrzej 7 ml pożywki do przeprogramowania do temperatury 37 °C. Dodaj bFGF do końcowego stężenia 100 ng/mL.
    UWAGA: B18R nie jest już potrzebny po końcowej transfekcji. Po 14 dniu nie jest już konieczne równoważenie pożywki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartościO2.
  2. Usunąć pożywkę ze wszystkich studzienek za pomocą pipety serologicznej. Nadal unikaj używania aspiracji. Dodać 2 ml pożywki do przeprogramowywania uzupełnionej bFGF na studzienkę.
  3. W dniach 17 i 18 przeanalizuj przeprogramowane studzienki pod mikroskopem odwróconym lub preparacyjnym. Jeśli kolonie powstają w bliskiej odległości od siebie ze względu na wysoką skuteczność przeprogramowania i nie można ich ręcznie wyizolować, należy rozdzielić kolonie, wykonując opcjonalne pasażowanie przeprogramowanych studzienek opisanych w kroku 7 poniżej. Jeśli kolonie są rzadkie i dobrze oddzielone, ręcznie wybierz klony bezpośrednio z przeprogramowanej studni, jak opisano w kroku 8 i subkultur iPSC zgodnie ze standardowymi protokołami.

7. Opcjonalna procedura: Przekazywanie komórek z przeprogramowanych studni za pomocą EDTA

  1. Przygotować 0,5 mM EDTA w DPBS (EDTA), rozcieńczając roztwór podstawowy 0,5 M EDTA. Filtr sterylizuje EDTA za pomocą systemu filtracji próżniowej 0,22 μm.
  2. Przygotuj pożywkę z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) (np. mTeSR1) bez podawania pokarmu zgodnie z instrukcjami producenta. Podgrzej 32 ml pożywki PSC do temperatury 37 °C.
  3. Pokryj wszystkie studzienki dwóch płytek o formacie 6-dołkowym macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) z kwalifikacją hESC zgodnie z instrukcjami producenta. Uszczelnić płytki folią parafinową i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Odessać roztwór ECM ze wstępnie podgrzanych płytek i zastąpić go 2 ml pożywki PSC na studzienkę. Nie pozwól, aby powierzchnia studzienek wyschła. Odłóż je na bok.
  5. Odessać pożywkę przeprogramowującą z 2 przeprogramowanych studzienek w dniu, w którym kolonie są duże i wyraźnie uformowane (zwykle 18 dzień). Spłukać raz 1 ml EDTA i aspirat.
  6. Dodaj 1 ml EDTA na studzienkę. Inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C.
  7. Delikatnie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: W tym momencie komórki mogą być bardzo luźno przylegające i łatwo się przemieszczać.
  8. Ostrożnie odessać EDTA z obu studzienek. Dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki PSC do każdej dobrze potraktowanej EDTA. Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie, ale dokładnie usunąć komórki z obu studzienek.
  9. Za pomocą pipety serologicznej delikatnie odpipetować zawiesinę komórek i rozbić duże grudki. Nie pipetować, dopóki nie znikną wszystkie grudki komórek. Zachowaj klastry iPSC.
    UWAGA: Poszycie dużych kęp nie wpłynie na przerost kolonii iPSC. Jeśli są zbyt duże grudki komórek, po prostu unikaj przenoszenia ich do następnego naczynia.
  10. Za pomocą pipety serologicznej równomiernie rozprowadź komórki z każdej studzienki poddanej działaniu EDTA, pipetując 0,5 ml do każdego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej ECM.
    UWAGA: Nie łącz komórek z przeprogramowanych dołków (tj. przeprogramowana studnia 1 powinna być równomiernie rozłożona na pierwszej 6-dołkowej płytce, a przeprogramowana studnia 2 powinna być równomiernie rozprowadzona na drugiej 6-dołkowej płytce).
  11. Przenieś posiane komórki z powrotem do inkubatora o niskiej zawartościO2. Aby równomiernie rozprowadzić komórki, potrząśnij każdą płytką w przód iw tył oraz na boki. Nie wiruj. Wymieniaj pożywkę PSC codziennie.

8. Wybieranie kolonii iPSC

  1. Podgrzać 15 ml pożywki PSC do temperatury 37 °C. Pokryć wszystkie dołki pojedynczej płytki 6-dołkowej ECM z kwalifikacją hESC, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uszczelnić płytki folią parafinową i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną ze studzienek używanych do zbierania iPSC. Spłukać raz 1 ml EDTA i aspirat. Dodaj 1 ml EDTA na studzienkę. Inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37°C. Podczas inkubacji komórek odessać roztwór ECM ze wstępnie podgrzanych płytek i zastąpić 2 ml pożywki PSC na dołek. Odłóż talerze na bok.
  3. Delikatnie wyjąć płytkę z iPSC do pobrania z inkubatora i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: W tym momencie komórki mogą być bardzo luźno przylegające i łatwo się przemieszczać.
  4. Ostrożnie odessać EDTA. Bardzo delikatnie dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki PSC, uważając, aby nie usunąć kolonii iPSC.
  5. Przenieś płytkę do odwróconej lub preparującej lunety, aby lepiej uwidocznić kolonie. Przygotuj pipetę o pojemności 1 ml ze sterylną końcówką. Całkowicie wciśnij tłok, a następnie użyj końcówki pipety, aby delikatnie zeskrobać kolonię, powoli wciągając płyn do końcówki, aby zebrać kolonię. Narysuj jak najmniej podłoża podczas wybierania kolonii iPSC.
  6. Aby przenieść kolonię, należy pipetować w górę i w dół 3–4 razy w jednym dołku płytki pokrytej ECM, począwszy od kroku 8.2. Powtarzaj, aż 6 kolonii zostanie zebranych i przeniesionych do poszczególnych studzienek. Zbierz nie więcej niż 2 kolonie z dowolnej pojedynczej studzienki, jeśli przeprowadzono opcjonalne pasażowanie opisane w kroku 7.
  7. Użyj standardowego protokołu ludzkich komórek macierzystych, aby zamrozić wszystkie pozostałe studzienki. Rozmrozić i ponownie pokryć zamrożone zapasy, jeśli później trzeba będzie zebrać więcej kolonii.

9. Charakterystyka iPSC

  1. Wykonaj barwienie TRA-1-60 w celu analizy wydajności przeprogramowania (dzień 18).
    UWAGA: 2 z 3 przeprogramowanych studni są przepuszczane w celu przyszłego zbierania kolonii. Pozostałą studzienkę można wykorzystać do barwienia TRA-1-60. Zabieg ten można wykonać na blacie stołu laboratoryjnego.
    1. Umyj dobrze przeprogramowany 1 ml PBS. Utrwalić komórki lodowatym metanolem w temperaturze -20 °C przez 5 minut.
    2. Aspirat metanolu. Suszyć studzienkę przez około 2 minuty. Uważaj, aby nie przesuszyć. Komórki wyschły wystarczająco, gdy staną się półprzezroczyste/matowe kolor.
    3. Umyj studzienkę 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Podczas prania przygotuj 3 ml 3% nadtlenku wodoru w PBS.
    4. Zassać PBS. Dodać 2 ml rozcieńczonego roztworu nadtlenku. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Przygotować 4 ml roztworu blokującego: 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
    5. Zassać roztwór nadtlenku. Umyj studzienkę 2 razy 1 ml PBS przez 5 minut.
    6. Odessać PBS i dodać 2 ml roztworu blokującego do studzienki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Umyj studzienkę 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
    8. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-TRA-1-60 w stosunku 1:100 w roztworze blokującym uzupełnionym 0,05% azydkiem sodu. Przygotować 1 ml rozcieńczenia przeciwciał na 1 dołek naczynia o formacie 6-dołkowym. Dodaj rozcieńczenie przeciwciała do studzienki i owiń płytkę parafilmem, aby uniknąć parowania. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
      UWAGA: W razie potrzeby inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym można przeprowadzać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego można użyć ponownie do 5 razy.
    9. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przemyć studzienkę 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
    10. Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało sprzężone z HRP przeciwko mysim HRP w stosunku 1:200 w roztworze blokującym. Inkubować studzienkę z drugorzędowym rozcieńczeniem przeciwciał przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    11. Odessać rozcieńczenie przeciwciała wtórnego i przemyć studzienkę 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
    12. Podczas trzeciego mycia przygotuj roztwór podłoża zgodnie z instrukcją producenta. Po ostatnim praniu odessać PBS. Dodać 1 ml roztworu substratu i inkubować, aż pojawi się pożądany kolor (około 10 min).
    13. Zassać roztwór substratu. Płucz studzienkę wodą przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
    14. W razie potrzeby policz kolonie. Wydajność przeprogramowania = (liczba kolonii) / (liczba posianych fibroblastów) x 100%.
    15. W przypadku długotrwałego przechowywania należy odessać wodę z poplamionej płytki i wyschnąć na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej. Uszczelnić wysuszoną płytkę parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 lat, aby później ocenić skuteczność przeprogramowania.

Wyniki

Zazwyczaj mija około 5–6 tygodni od rozpoczęcia reprogramowania fibroblastów do zamrożenia pierwszych fiolek iPSC (Rysunek 1). Protokół reprogramowania można ogólnie podzielić na dwie fazy. Faza 1 obejmuje hodowlę fibroblastów oraz siedem transfekcji, przy czym koktajl RNA do reprogramowania podaje się co 48 h. Faza 2 obejmuje izolację, ekspansję i charakterystykę kolonii iPSC.

Przed rozpoczęciem protokołu należy upewnić się, że fibroblasty przeznaczone do przeprogramowania są dobrej jakości. Zdrowe fibroblasty powinny mieć kształt wrzecionowaty, być bipolarne i refrakcyjne, a ich czas podwojenia powinien wynosić około 24 h. Do dnia 0 250 000 komórek wysianych w dniu -2 do szalki 10 cm powinny osiągnąć 40–60% konfluencji (Rycina 1, dzień 0) i dać około 6–10 x 105 komórek. W przypadku komórek proliferujących wolniej można zastosować rekompensację poprzez wysianie ich z większą gęstością w dniu -2 oraz w dniu 0 przed przeprogramowaniem.

Fibroblasty po wysianiu do dołka płytki 6-dołkowej w celu reprogramowania powinny być bardzo rzadkie (Rycina 2, dzień 1). Dwadzieścia cztery godziny po pierwszej transfekcji fibroblasty utracą swój wrzecionowaty kształt i przyjmą bardziej zaokrągloną morfologię (Rycina 2, dzień 2), która zostanie utrzymana przez pozostały czas reprogramowania. Zielona fluorescencja z mRNA mWasabi powinna być minimalnie zauważalna w dniu 2. i stopniowo zwiększać swoją jasność, stając się wyraźnie widoczną do dnia 4. Możliwość wykrycia fluorescencji mWasabi może zależeć od czułości mikroskopu i konfiguracji sprzętu. Gęstość komórek będzie stopniowo i konsekwentnie wzrastać podczas pierwszych trzech transfekcji (dni 1–6), z wyraźnym gwałtownym wzrostem proliferacji między dniem 7. a 8. Komórki powinny być w znacznym stopniu konfluentne do 10. dnia (Rycina 2, dzień 10). Pierwsze kolonie iPSC mogą pojawić się już w dniu 11. (Rycina 2, dzień 11); jednak kolonie mogą nie być zauważalne aż do 18. dnia. Zazwyczaj między 15. a 18. dniem pojawią się duże i wyraźne kolonie iPSC, które są wyraźnie odróżnialne od otaczających je, niepełnie reprogramowanych fibroblastów (Rycina 2, dzień 15 oraz Rycina 3, dzień 17). W celu oceny wydajności reprogramowania można przeprowadzić immunobarwienie na marker pluripotencji TRA-1-60 (Rycina 3, dzień 17, TRA-1-60). W naszym doświadczeniu większość linii fibroblastów daje setki kolonii na reprogramowany dołek (Rycina 3, wstawka B).

Nieoptymalna gęstość wysiewu jest najczęstszą przyczyną obniżonej wydajności reprogramowania w naszym protokole i często wiąże się z fibroblastami, które są chorobowe, senescencyjne i/lub pochodzą z wysokich pasaży. Jeśli gęstość wysiewu jest zbyt niska, pod koniec reprogramowania wystąpią duże acelularne, puste obszary (Rycina 4C), a kolonie iPSC mogą nie powstać (Rycina 4D). Przeprogramowane komórki powinny być bardzo konfluentne do 14. dnia (porównaj Rycina 4A i 4B z Rycina 2, dzień 14). Podobnie, jeśli komórki zostaną wysiane zbyt gęsto lub będą namnażać się zbyt szybko, wydajność reprogramowania drastycznie spada.

Aby zachować homogeniczność iPSC pochodzących od pacjentów, ważne jest namnażanie linii komórkowych z pojedynczej kolonii. Ponieważ wydajność reprogramowania w naszym protokole jest bardzo wysoka, sąsiednie kolonie iPSC mogą formować się w bliskim sąsiedztwie i wrastać w siebie (Rycina 3, dni 15–17). Utrudnia to czasem mechaniczne oddzielenie pojedynczej kolonii w celu ekspansji klonalnej. Stwierdziliśmy, że pomocne jest najpierw pasażowanie przeprogramowanej studni i rozcieńczenie zawiesiny na większej powierzchni hodowli. Dobrym stosunkiem pasażowania jest równomierne rozdzielenie zawartości jednej studni z płytki 6-dołkowej na całą płytkę 6-dołkową.

Po pasażu z rozcieńczeniem iPSC rosną w postaci kolonii, które są łatwo odróżnialne od fibroblastów (Rycina 5, dzień 18). Początkowo kolonie iPSC mogą być luźno upakowane, a poszczególne komórki mają stosunkowo duży obszar cytoplazmy. W ciągu 4–7 dni iPSC proliferują i tworzą charakterystyczne, gęsto upakowane kolonie o wyraźnych krawędziach. Poszczególne komórki wewnątrz kolonii mają dużą frakcję jądrową z wyraźnymi jąderkami (Rycina 5, dzień 22). W każdym dołku powinno powstać wiele kolonii, a do dalszej ekspansji należy wybierać wyłącznie te o klasycznej morfologii iPSC.

Harmonogram reprogramowania fibroblastów; schemat procesu hodowli iPSC; fazy ekspansji komórek macierzystych.
Rysunek 1: Reprogramowanie ludzkich fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs). Przedstawiono schematyczny protokół reprogramowania ludzkich fibroblastów. Fibroblasty są najpierw pasażowane przy niskiej gęstości do dołka płytki 6-dołkowej, po czym wykonuje się siedem transfekcji w odstępach 48 h. Po każdej transfekcji, po upływie 16–20 h, następuje wymiana pożywki. Reprogramowane iPSCs są pasażowane po raz pierwszy około 18 dnia, a klonalne kolonie są pobierane do 26 dnia. Zazwyczaj linie iPSC pochodzące z fibroblastów mogą zostać zamrożone do długoterminowego przechowywania do 38 dnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wzrost hodowli komórkowej, oś czasu; zmiany morfologiczne; obrazy mikroskopowe; codzienna progresja, różnicowanie.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy codzienne z każdego dnia reprogramowania. Fibroblasty powinny osiągnąć konfluencję na poziomie około 40–60% w momencie pasażowania w celu rozpoczęcia reprogramowania (dzień 0, komórki wysiewane są do szalki 10 cm). Pierwsza transfekcja (T1) odbywa się w dniu 1., a w tym momencie komórki powinny być rozmieszczone bardzo rzadko. Następnego dnia (dzień 2) powinna stać się widoczna bardziej zaokrąglona morfologia. Gęstość komórek będzie nadal wzrastać w trakcie całego protokołu, a skupiska iPSC zaczną pojawiać się już w dniu 11 (obwiedzione czerwonym okręgiem). Do 15. dnia kolonie iPSC będą duże i posiadać wyraźne granice. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces różnicowania komórek na obrazach mikroskopowych w dniach 15-17; wyniki barwienia TRA-1-60.
Rysunek 3: Tworzenie kolonii po transfekcjach zmodyfikowanymi mRNA reprogramującymi i mimetykami miRNA. Zdjęcia przy małym powiększeniu reprezentatywnego procesu reprogramowania wykonano w dniach 15–17. Po ostatniej transfekcji reprogramowane iPSC tworzą wyraźne kolonie o zdefiniowanych granicach, które zwiększają swój rozmiar i zagęszczają się, stając się wyraźnie odróżnialnymi od otaczających je niepełnie reprogramowanych fibroblastów. Immunobarwienie markerem pluripotencji TRA-1-60 wskazuje na obecność iPSC (wstawka A) i może być wykorzystane do obliczenia wydajności reprogramowania poprzez zliczenie wszystkich kolonii w jednej studzience (wstawka B, przykłady kolonii możliwych do policzenia zakreślone na zielono). Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces różnicowania komórek; obrazy mikroskopowe, analiza z 14. i 17. dnia, wynik barwienia TRA-1-60.
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy suboptymalnej gęstości wysiewu dla reprogramowania. (A, B) Przykłady fibroblastów o zbyt niskiej gęstości w 14. dniu reprogramowania (por. Rycina 2, dzień 14). (C) Obraz przy niskim powiększeniu w 17. dniu reprogramowania z zaznaczonym na czerwono dużym, pustym obszarem. (D) Ten sam otwór płytki został utrwalony i zabarwiony pod kątem TRA-1-60, aby potwierdzić ogólnie niską wydajność reprogramowania wynikającą z niskiej gęstości komórek. Paski skali = 200 µm (A, B) oraz 1 mm (C, D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Postęp wzrostu komórek; obrazy mikroskopowe z dni 18-22; badanie różnicowania komórek; zawiera pasek skali.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy iPSC po pierwszym pasażowaniu. Po zakończeniu transfekcji zmodyfikowanymi mRNA reprogramującymi i mimetykami miRNA, przeprogramowane komórki poddaje się pasażowaniu między 17. a 20. dniem. iPSC wykazują przewagę wzrostu w pożywce dla PSC i szybko wypierają fibroblasty, które zostały niepełnie przeprogramowane. Początkowo iPSC tworzą kolonie, które mogą wydawać się luźne i mieć słabo zdefiniowane brzegi. W ciągu kilku dni komórki gwałtownie proliferują i przyjmują charakterystyczną morfologię gęsto upakowanych komórek o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy, tworząc zwarte kolonie o wyraźnych granicach. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten opisuje klinicznie istotną, nieintegrującą metodę opartą na RNA, która pozwala na przeprogramowanie normalnych i związanych z chorobą ludzkich linii fibroblastów w iPSC z bardzo wysoką wydajnością. Do tej pory każda ludzka linia fibroblastów, którą próbowaliśmy przeprogramować za pomocą opisanego protokołu, przyniosła zadowalającą liczbę wysokiej jakości iPSC do dalszych zastosowań. Powstałe w ten sposób iPSC mogą być natychmiast przenoszone i namnażane w warunkach hodowli bez karmienia.

Jakość fibroblastów do przeprogramowania:

Powodzenie przeprogramowania jest w dużym stopniu uzależnione od jakości początkowych fibroblastów. Idealnie byłoby, gdyby przeprogramowanie zostało zainicjowane przy użyciu fibroblastów o najniższym dostępnym pasażu, aby osiągnąć najwyższą wydajność. Skuteczność przeprogramowania jest najlepsza w przypadku fibroblastów pasażujących 2–4. Przeprogramowanie może nadal działać w przypadku fibroblastów o wysokim pasażu (pasaż 5-8), nawet starczych, choć ze zmniejszoną wydajnością. Czasami fibroblasty o niskim pasażu są niedostępne lub próbki pacjentów mają mutację genetyczną, która uniemożliwia zdrowy wzrost. W takim przypadku może być wymagana optymalizacja początkowej gęstości poszycia. Przeprogramowanie uszkodzonych linii fibroblastów jest zwykle związane ze zwiększoną śmiercią komórek podczas transfekcji RNA. W rezultacie, komórki w studni przeprogramowywania będą wydawać się rzadkie w ciągu 10-14 dni przeprogramowania. W studni widoczne będą również duże obszary bezkomórkowe. W takim przypadku protokół przeprogramowania będzie musiał zostać ponownie zainicjowany z wyższą początkową liczbą początkową fibroblastów. Posiewanie 3,000 komórek wejściowych na dołek naczynia o formacie 6-dołkowym działa konsekwentnie dla większości linii fibroblastów dla dorosłych. Jednak zwiększenie liczby posiewów do 5 000–10 000 (50 000 dla linii starczych) może pomóc w poprawie przeprogramowania próbek związanych z chorobą, jak opisano w naszej poprzedniej publikacji8. I odwrotnie, komórki, które zbyt wcześnie osiągają konfluencję, mogą być również odporne na przeprogramowanie. Jeśli komórki poddawane transfekcjom z przeprogramowaniem RNA proliferują zbyt szybko (jak to czasami ma miejsce w przypadku pierwotnych fibroblastów noworodków), zainicjuj przeprogramowanie za pomocą 500 fibroblastów na studzienkę 6-dołkowej płytkio formacie 8.

Postępowanie z buforem transfekcyjnym:

pH buforu transfekcyjnego (pożywka o obniżonej surowicy dostosowana do pH 8,2) ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia optymalnej wydajności transfekcji wymaganej dla tego protokołu przeprogramowania. Z tego powodu zaleca się podjęcie kilku środków ostrożności dotyczących obchodzenia się z buforem do transfekcji. Odkryliśmy, że nawet krótka ekspozycja buforu transfekcyjnego na powietrze atmosferyczne wpływa na pH buforu. Dlatego bufor transfekcyjny powinien być podzielony na porcje do pojemnika z zakrętką z minimalną przestrzenią powietrzną (używamy probówek stożkowych z nakrętką o pojemności 5 lub 15 ml). Aby jeszcze bardziej zminimalizować narażenie na działanie powietrza, należy użyć każdej podwielokrotności bufora transfekcyjnego na maksymalnie dwie transfekcje. Wreszcie, ponieważ temperatura wpływa na pH, bardzo ważne jest, aby bufor transfekcyjny był zrównoważony z RT w celu złożenia kompleksów transfekcyjnych. Zaleca się, aby nie podgrzewać buforu do transfekcji do temperatury 37 °C.

Pasażowanie iPSC:

Podczas gdy wiele wcześniej opublikowanych protokołów zaleca wybór pojedynczych kolonii iPSC pod koniec przeprogramowania, może to być trudne do osiągnięcia, gdy wydajność przeprogramowania jest bardzo wysoka lub jeśli kolonie grupują się razem, jak to często ma miejsce w naszym protokole. Dlatego, jeśli kolonie iPSC znajdują się w bliskiej odległości od siebie, zalecamy najpierw przejście komórek w celu rozprowadzenia przeprogramowanych iPSC przed ręcznym pobraniem kolonii. Wykonanie tego wczesnego kroku przejścia ma kilka zalet. Rozproszenie kolonii daje im więcej miejsca do wzrostu, dając znacznie większe kolonie do zbierania, niż można było osiągnąć w oryginalnej studni. To znacznie poprawia wskaźnik sukcesu w ustanowieniu linii iPSC z wybranego klonu. Odkryliśmy również, że dodatkowy czas hodowli z fibroblastami, choć w rozcieńczonym stosunku, wydaje się poprawiać średnią jakość pobranych kolonii iPSC. Nie w pełni przeprogramowane fibroblasty mogą dostarczać wspierających czynników parakrynnych, które nadal pomagają w tworzeniu iPSC i ułatwiają bezpośrednie przejście do warunków hodowli komórkowych bez karmienia. Fibroblasty mają na szczęście niekorzystny wzrost selektywny w porównaniu z iPSC, gdy są hodowane w mTeSR1. Dlatego zanieczyszczająca populacja komórek fibroblastów jest szybko rozcieńczana do znikomych ilości w ciągu 3-4 pasaży.

Inhibitory ROCK, takie jak Y-27632, są często stosowane do rutynowych hodowli ludzkich iPSC. Odkryliśmy, że częste i/lub przedłużone hodowle niektórych linii iPSC z Y-27632 mogą mieć szkodliwy wpływ na ogólną jakość. W przypadku stosowania metody pasażowania brył, takiej jak EDTA, Y-27632 nie jest konieczny do utrzymania żywotności iPSC po rozszczepieniu. Całkowicie wyeliminowaliśmy uzupełnianie pożywek Y-27632 dla wszystkich izolacji, ekspansji lub rutynowych hodowli iPSC.

Ograniczenia protokołu:

Jednym z ograniczeń opisanego podejścia do przeprogramowania opartego na RNA jest początkowy koszt i złożoność związana z przygotowaniem odczynników do przeprogramowywania. Chociaż procedury przygotowawcze do generowania odczynników mRNA są rutynowe i zostały już wcześniej opisane (PCR, transkrypcja in vitro , leczenie DNazą, capping, defosforylacja, oczyszczanie), łącznie produkcja odczynników mRNA jest stosunkowo długim i nietrywialnym procesem. Innym poważnym wyzwaniem dla tego protokołu jest konieczność transfekcji komórek co 48 godzin, co zwiększa pracochłonność protokołu przeprogramowywania. Względy te mogą być zaporowe, jeśli pożądane jest przeprogramowanie tylko kilku próbek pacjentów. Jeśli jednak głównym czynnikiem branym pod uwagę jest generowanie klinicznie istotnych iPSC lub osiągnięcie bardzo wysokiej wydajności przeprogramowywania, opisane podejście do przeprogramowania oparte na RNA jest idealne.

Podsumowując, opisana metoda przeprogramowania opartego na RNA o wysokiej wydajności opiera się na zoptymalizowanej wydajności transfekcji typu komórki somatycznej, która ma zostać przeprogramowana, jak opisano w naszej poprzedniej publikacji8. Protokół transfekcji RNA przedstawiony w tym badaniu jest wysoce dostosowany do ludzkich pierwotnych fibroblastów, ale potencjalnie może być dostosowany do innych typów komórek w celu poprawy wydajności przeprogramowania różnych komórek somatycznych.

Oświadczenia

I.K. i G.B. są współtwórcami zgłoszenia patentowego pt. "Metody i kompozycje do przeprogramowania komórek", nr zgłoszenia PCT. PCT/US2016/063258.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od National Institutes of Health (T32AR007411-33) oraz University of Colorado Skin Diseases Research Core Center (P30AR057212). Dziękujemy również Partnerstwu Badawczemu Epidermolysis Bullosa (EB), Fundacji Badań Medycznych EB, Cure EB Charity, Dystroficznemu Stowarzyszeniu Badawczemu Epidermolizy Pęcherzowego Oddzielania Serca (DEBRA) International, Funduszowi Vlinderkindje Fundacji Króla Baudouina oraz Funduszowi Gates Frontiers.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmid templates for PCR
pcDNA3.3_KLF4Addgene26815
pcDNA3.3_SOX2Addgene26817
pcDNA3.3_c-MYCAddgene26818
pcDNA3.3_LIN28AAddgene26819
pCR-Blunt_hM3OAddgene112638
pCR-Blunt_hNANOGAddgene112639
pCR-Blunt_mWasabiAddgene112640
Zmodyfikowana transkrypcja mRNA in vitro i mimimika miRNA
Forward PrimerZintegrowane technologie DNATTGGACCCTCGTACAGAAGC
TAATACG
Reverse Podkład (zamawiany jako ultramer, skala 4nmol)Zintegrowane technologie DNATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA
AAGACCA(
ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G New England BiolabsS1411S
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master MixAgilent600850-51
5-metylocytydyno-5'-trifosforanTrilink BiotechnologiesN-1014
Fosfataza antarktycznaNew England BiolabsM0289L
DNase INEBM0303S
MEGAscript T7 Zestawdo transkrypcjiThermoFisher ScientificAM1334
Pseudourydyno-5'-trifosforanTrilink BiotechnologiesN-1019
Inhibitor RNazy RiboguardLucigenRG90910K
RNA Clean & KoncentratorZymoResearchR1019
Syn-has-miR-302a-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000684
Syn-has-miR-302b-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000715
Syn-has-miR-302c-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000717
Syn-has-miR-302d-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000718
Syn-has-miR-367-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000719
Woda (bez nukleaz, nie traktowana DEPC)FisherAM9937Służy do rozcieńczania zmodyfikowanych mRNA i miRNA naśladuje
Hodowla i przeprogramowanie fibroblastów
0,1% Żelatyna w technologiach H2OStemCell technologies#07903
Stericup-GV Sterylny system filtracji próżniowejEMD Millipore SCGVU05RESłuży do sterylizacji buforu transfekcyjnego i 0,5 mM EDTA w DPBS
2-merkaptoetanolThermoFisher Scientific21985023
6-dołkowe płytki (poddane działaniu kultur tkankowych)Corning3516
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
Bydło płodowe SerumFisher26-140-079
FGF BasicThermoFisher Scientificphg0263
Suplement GlutaMaxThermoFisher Scientific35050061Suplement glutaminy stosowany do przygotowania pożywek
Inaktywowany termicznie FBSGibco Technologies10438026
Zamiennik serum KnockOutThermoFisher Scientific10828010
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine RNAiMAXThermoFisher Scientific13778500Protokół jest zoptymalizowany pod kątem odczynnika do transfekcji Lipofectamine RNAiMax
MEM ThermoFisherScientific11095080
MEM Aminokwasy endogenneThermoFisher Scientific11140050
Opti-MEM I Medium o zredukowanej surowicyThermoFisher Scientific31985070Pożywkę o obniżonej surowicy, użyj do wytworzenia buforu transfekcyjnego, dostosowując pH do 8,2, 500 ml
Pożywki o obniżonej surowicy Opti-MEM IThermoFisher Scientific31985062Pożywki o obniżonej surowicy, użyj do przygotowania buforu transfekcyjnego poprzez dostosowanie pH do 8,2, 100 ml
10 M NaOHSigma-Aldrich72068Przygotuj 1 M roztwór, rozcieńczając w wodzie wolnej od nukleaz i użyj do regulacji pH
Woda (bez nukleaz, nie poddawana działaniu DEPC)FisherAM9932 Służy do rozcieńczania NaOH i mycia pH-metru
Pióro/Paciorkowiec/GrzybobójGE HealthcareSV30079.01
rhLaminin-521ThermoFisher ScientificA29248Dostarczany w stężeniu 100 &mikro; g/ml, użyj jako matrycy do procedury przeprogramowania
Sulbecco's phosphate-buffered sol (DPBS)Life Technologies14190144
Trypsin-EDTA 0,25% Phenol RedLife Technologies2520056
Wirus krowianki B18R (CF)ThermoFisher Scientific34-8185-86
kultura iPSC
Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESCCorning354277Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) do hodowli iPSC
EDTA, 0,5 M roztwór podstawowyK& D Medyczny RGF-3130Rozcieńczyć do 0,5 mM w DPBS, filtrować sterylizować i stosować do pasażowania iPSC
mTeSR1StemCell Technologies85850Pożywka z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), zapewnia przewagę wzrostu iPSC nad fibroblastami
przeciwciałami i wykrywaniem
Królik anty mysz (sprzężony z HRP)Abcamab97046
Tra-1-60 (mysz anty człowiek)Stemgent09-0010
Nadtlenek wodoru (30%)LabChemLC154301Rozcieńczyć do 3% albuminą
surowicy bydlęcej PBS (BSA)FisherBP9703100
Salin buforowany fosforanem (PBS) HycloneSH30258.02Dostarczany jako 10x, rozcieńczony do 1x
VECTOR Zestaw substratów peroksydazy NovaREDVector LaboratoriesSK-4800
Special Equipment
OpisUwagi
Komora
Regularny inkubatorwilgotnością Kalibruj CO2 za pomocą miernika cyfrowego, fyrytu lub odpowiednika. Wyrównać inkubator do 5% CO2, 37 stopni C.
Trójgazowy nawilżany inkubatorSkalibruj CO2 za pomocą miernika cyfrowego, fyrytu lub odpowiednika. Wyrównać inkubator do 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Stosować do procedury przeprogramowywania.
pH-metrMusi mieć rozdzielczość do dwóch miejsc po przecinku. Jeśli to możliwe, wyznacz do pracy z RNA.
odwróconyMikroskop skonfigurowany do wizualizacji EGFP w celu monitorowania wydajności transfekcji.
bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowych z nawilżaną do hodowli tkankowych Mikroskop

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  4. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
  5. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  6. Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
  7. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  8. Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  9. Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
  10. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  11. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie fibroblasty sk rnetransfekcja zmodyfikowanego mRNAmimiki mikroRNA 367 302warunki bez u ycia kom rek feederprotok regulacji pHinkubacja w warunkach niskiego poziomu tlenuimmunobarwienie TRA 1 60optymalizacja wydajno ci reprogramowania

Powiązane artykuły