Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).
Artykuł metodologiczny
Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisany tutaj protokół jest niezawodną metodą pozyskiwania pierwotnych keratynocytów od dorosłych samic myszy (54 ± 2 dni), co daje około 30 x 106 żywotnych komórek na mysz. Pierwotne keratynocyty dorosłych myszy są zbierane ze skóry grzbietowej samic myszy. Samce myszy (w wieku ~6 tygodni) mogą być wykorzystywane do zbierania keratynocytów w zależności od wymagań eksperymentu. Myszy poddane eutanazji są golone i sterylizowane seryjnym płukaniem w roztworach jodu powidonu i etanolu (70% alkoholu). Po zdezynfekowaniu myszy skóra grzbietowa jest usuwana, a podskórny tłuszcz i mięśnie są usuwane skalpelem i wyrzucane. Skórki są cięte na małe kawałki i poddawane łagodnej trypsynizacji w niskiej temperaturze, aby oderwać dolną część skóry właściwej od naskórka. Zeskrobane naskórki są mieszane z niską prędkością, filtrowane w celu usunięcia włosów, liczone i ponownie zawieszane w pożywce hodowlanej. Metoda ta zapewnia doskonałą jednokomórkową zawiesinę komórek o wysokiej zdolności do hodowli w wielu dalszych zastosowaniach.
Wprowadzenie
Skóra ssaków pokrywa całe ciało i pełni wiele funkcji (np. główną barierę fizyczną, regulację temperatury i zatrzymywanie wilgoci). W ciągu ostatnich pięciu dekad podstawowe badania nad skórą myszy przyniosły nowe informacje na temat struktury i funkcji skóry. Model skóry myszy znacznie pomógł w zrozumieniu podstawowej biologii stojącej za złożonymi mechanizmami molekularnymi kancerogenezy wywołanej promieniowaniem ultrafioletowym. Te modele skóry myszy wniosły znaczący wkład w zrozumienie chorób skóry u ludzi i ich łagodzenia. Aby zbadać dalszą molekularną sekcję pierwotnych keratynocytów w biologii rozwoju mieszków włosowych, badaniach nad komórkami macierzystymi, kancerogenezie i genetycznej eksploracji naskórka, często pożądane jest wyizolowanie i hodowla pierwotnych keratynocytów nabłonkowych ze skóry myszy w celu wykorzystania równolegle z eksperymentami in vivo. Czynnikiem motywującym do opracowania tej metody była potrzeba przeprowadzenia testu in vitro na klonogenne komórki macierzyste naskórka i mieszków włosowych1,2. Istniała również pilna potrzeba jednokomórkowych zawiesin komórek naskórka nadających się do testów klonogennych3, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i cytometria przepływowa3,4. Zaletami tej metody są znaczne zwiększenie zbiorów o rząd wielkości w porównaniu z innymi metodami5,6, włączenie nabłonkowej części mieszków włosowych oraz wysoka zdolność do hodowli pobranych komórek. W latach osiemdziesiątych XX wieku nie były znane żadne metody, które mogłyby spełnić te wymagania. W kolejnych latach metoda ta była udoskonalana w celu zwiększenia wydajności komórek. Głównym ograniczeniem tej metody byłoby maskowanie niektórych przeciwciał wrażliwych na trypsynę, które upośledzałyby immunoreaktywność6.
Myszy były hodowane zgodnie z wytycznymi Specific Pathogen Free. Uzyskano od jednej do pięciu samic myszy w wieku 54 ± 2 dni. U starszych myszy żywotność keratynocytów będzie zmniejszona z powodu fazy anagenu (wzrostu) cyklu włosa. Ponadto proces trypsynizacji jest trudniejszy w porównaniu z młodymi myszami. Procedura zbioru została z powodzeniem zoptymalizowana pod kątem cieńszej skóry samic myszy w porównaniu z samcami. Samce myszy na ogół nie są wykorzystywane do zbioru keratynocytów, ponieważ mają tendencję do walki ze sobą podczas trzymania i dlatego mogą pozostawiać zadrapania lub rany na skórze.
Protokół
Wszystkie protokoły wykorzystania kręgowców zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Minnesoty zgodnie z zalecanymi wytycznymi NIH i rządu.
1. Inicjalizacja i subkulturowanie warstwy zasilającej
- Rozmrozić jedną fiolkę z komórkami zawierającą zamrożoną mysz szwajcarską 3T3 ze zbiornika z ciekłym azotem, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-2 minuty. Liczba komórek w fiolce wynosi około 1 x 106.
- Wyjąć fiolkę z komórkami 3T3, gdy stopi się ostatni odłamek lodu. Przetrzyj probówkę wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Następnie należy przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
- Powoli przenieść komórki do kolby T-150 i przepłukać fiolkę 3T3 1 ml pożywki CGM. Powoli dodawaj do komórek 30 ml wstępnie podgrzanej pożywki 3T3 Complete Growth Medium (CGM). Delikatnie kołysz kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki fibroblastów 3T3. Oznacz kolbę odpowiednio szczegółami linii komórkowej, datą i numerem przejścia.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%.
nuta: Według ATCC czas podwojenia szwajcarskiej myszy 3T3 wynosi 18 godzin; W przypadku zlewania się (zahamowania kontaktu) gęstość wynosi około 40 000 komórek na cm2. Używamy konkretnej linii 3T3 w ciągu 10-15 pasaży po inicjalizacji. Szybszy wzrost lub obecność komórek w kształcie wrzeciona może wystąpić przy wyższych pasażach i zwykle jest to znak, że 3T3 nie będzie działać tak dobrze, jak komórki zasilające dla dorosłych keratynocytów myszy. Jeśli nastąpi szybki wzrost, lepiej zainicjować nową linię z komórek dolnego pasażu. - Zmień pożywkę po 24 godzinach, aby usunąć martwe komórki i pozostały DMSO (środek krioprezerwacyjny), a następnie dwa razy w tygodniu. Pozwól komórkom namnażać się około 80% konfluencji i użyj kolb T-150 do inicjacji hodowli. Użyj kolb T-225 do subkultury po inicjalizacji.
- Aby przeprowadzić subhodowlę komórek fibroblastów 3T3, należy wyjąć kolbę z inkubatora do hodowli komórkowych i dwukrotnie przemyć zimnym sterylnym PBS (1x) gentamycyną. Odmierzyć pipetą 10 ml wstępnie ogrzanego (37 °C łaźni wodnej) roztworu trypsyny (0,25%) do każdej kolby T-225.
- Umieścić kolbę na płycie grzewczej na 3-8 minut. Wyjąć kolbę i delikatnie dotknąć dłońmi ścianek kolby, aby odłączyć komórki i potwierdzić odłączenie komórek pod odwróconym mikroskopem. Roztwór trypsyny może wydawać się mętny z oderwanymi komórkami 3T3.
- Odpipetować roztwór trypsyny 3-4 razy, aby przemyć powierzchnię wzrostu komórek kolby i przenieść trypsynizowaną komórkę do 30 ml CGM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ponownie przemyć kolbę 3–5 razy 10 ml mieszaniny CGM-trypsyna-komórka z probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
nuta: Zawartość dwóch butelek można dodać do probówki o pojemności 50 ml; jeśli używana jest tylko jedna kolba, należy umieścić 10 ml trypsyny/komórek w 20 ml CGM w probówce o pojemności 50 ml. - Odwirować probówkę stożkową o pojemności 50 ml o masie 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
- Teraz odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml CGM, delikatnie pipetując ~10x, aby całkowicie rozbić osad komórkowy. Dodać 10 ml CGM, aby całkowita objętość stożkowej probówki o pojemności 50 ml wynosiła 15 ml.
- Wymieszaj ponownie ~10x i umieść 5 ml zawiesiny komórek w 3 oddzielnych kolbach T-150. Stosunek subkultur wynosi 1:3 w kolbach T-225 lub 1:4 w kolbach T-150. Dodać 30 ml wstępnie ogrzanego 3T3 CGM do każdej z kolb.
- Oznacz kolbę nazwą linii komórkowej, datą wysiewu komórki i numerem pasażu.
- Aby zamrozić komórki 3T3 po odwirowaniu na etapie subkultury, wyjmij probówkę o pojemności 50 ml z wirówki i umieść ją w wiadrze z lodem. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml 5% mieszaniny DMSO-DMEM (patrz Tabela 1) dla każdej zebranej kolby.
- Umieścić 1 ml mieszaniny DMSO-DMEM z zawiesiną komórek w każdym kriowiale (jeden kriowial na zebraną kolbę 3T3). Oznacz fiolkę numerem pasażu, nazwą linii komórkowej (3T3) i datą zamrożenia komórek.
- Umieść te fiolki z komórkami 3T3 w słoiku zamrażarki komórkowej (patrz Tabela materiałów) i przenieś do zamrażarki o temperaturze -70 °C na >5 godziny. Ostrożnie wyjmij i przenieś fiolki ze słoika zamrażarki komórkowej i umieść w zbiorniku z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania do następnego użycia. Wprowadź informacje o nazwie linii komórkowej, lokalizacji w zbiorniku i dacie w laboratoryjnym arkuszu inwentaryzacyjnym ciekłego azotu.
2. Przygotowanie warstwy zasilającej 3T3 do naświetlania promieniowaniem rentgenowskim i wysiewu
- Przygotuj komórki 3T3 na tydzień przed ich napromieniowaniem i pozwól im rosnąć ~100% konfluencji. Komórki 3T3 znajdują się zwykle w pasażach od 120 do 130.
- W celu uzyskania udanych testów klonogennych pierwotnych keratynocytów, przed wysiewem komórek 3T3 należy pokryć powierzchniowo 60-milimetrowe szalki Petriego kolagenem.
- Odpipetować około 2–3 ml roztworu powlekającego kolagen na szalki Petriego o średnicy 60 mm, aby pokryć dolną powierzchnię i usunąć nadmiar płynu powlekającego kolagen (patrz Tabela 1). Przenieść szalki Petriego do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Nie pozwól, aby naczynia wyschły w inkubatorze.
- Etap naświetlania promieniowaniem rentgenowskim: Wykonaj kroki 1.4–1.6. Użyj 50 ml świeżego CGM, aby ponownie zawiesić osad komórkowy, zamknij stożkową rurkę i uszczelnij folią uszczelniającą parafinę. Aby uniknąć zanieczyszczenia, użyj plastikowych torebek, aby dwukrotnie zapakować rurkę zawierającą parafinę i umieścić na lodzie. Alternatywna warstwa zasilająca oparta na mitomycynie może być użyta do hodowli keratynocytów7.
- Napromienij komórki fibroblastów 3T3 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml dawką 5 000 radów (50 Cgy) za pomocą biologicznego aparatu rentgenowskiego. Napromieniować te komórki wraz z pożywką CGM.
- Po napromieniowaniu promieniowaniem rentgenowskim odwirować komórki o masie 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę supernatantową i delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml CGM, delikatnie rozcierając ~10x. Teraz doprowadź końcową objętość do 30 ml z dodatkowymi 25 ml pożywki i rozcieraj 10x. Te etapy rozcierania mają kluczowe znaczenie dla jednolitej warstwy fibroblastów 3T3 do oznaczania klonogenności.
- Żywotne liczenie komórek: Policz keratynocyty za pomocą zwykłego szklanego hemocytometru. Weź około 0,5 ml komórek i umieść je w probówce o pojemności 1,5 ml. Usuń 200 μl mieszaniny komórek i dodaj równą objętość 0,4% roztworu błękitu trypanowego i mieszaniny 3–4 razy. Przenieś komórki za pomocą hemocytometru i policz wszystkie komórki jądrzaste (małe złote i różowe komórki) jako komórki żywotne. Oblicz końcowe stężenie żywotnych złotych ogniw.
- Odpipetować 1 x 106 komórek 3T3 (można użyć co najmniej 7 x 105) komórek) do pokrytych kolagenem płytek Petriego o średnicy 60 mm (krok 2.2) i delikatnie dodać 4 ml zmodyfikowanej pożywki Williamsa E o wysokiej zawartości wapnia (patrz Tabela 1). Pozwól świeżo zasianym komórkom 3T3 przyczepić się przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz świeże pierwotne keratynocyty i wysiew je na wierzchu dołączonej warstwy fibroblastów 3T3 do testu klonogennego, jak wskazano poniżej.
3. Pierwotny zbiór i siew keratynocytów
- Poddać eutanazji cztery do pięciu dorosłych samic myszy poprzez wdychanie CO2 zgodnie z zatwierdzonymi standardami dla zwierząt/IACUC. Jednak protokół ten może być również stosowany w przypadku pojedynczych samic / samców myszy.
- Przytnij około 9cm2 sierści grzbietowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia zwierząt i umieść wszystkie strzyżone myszy w słoiku o pojemności 500 ml z wystarczającą ilością roztworu antyseptycznego jodu powidonu (nie peelingu), aby przykryć je na 1-2 minuty. Dobrze wstrząśnij słoikiem, aby równomiernie pokryć myszy roztworem antyseptycznym.
- Odlej roztwór i spłucz czystą wodą, aż płyn będzie klarowny. Powtórz to samo mycie antyseptyczne, a następnie spłucz wodą. Po antyseptycznym przemyciu roztworem jodu namocz wszystkie myszy w 70% etanolu przez 5–10 min.
nuta: Myszy o jasnym futrze (np. BALB/c) zachowają lekko żółtawy kolor po antyseptycznym płukaniu jodem, podczas gdy ciemniejsze myszy (np. C57BL/6) nie. Warto zauważyć, że żółty kolor nie ma wpływu na żywotność komórek ani wzrost kultur.
- Ostrożnie usuń przyciętą skórę grzbietową za pomocą kleszczy do kciuków i nożyczek w kapturze z przepływem laminarnym. Umieść wyciętą skórę grzbietową w stożkowej probówce wypełnionej PBS/2x gentamycyną. Unikaj stosowania brzusznej skóry bocznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek sutka w hodowli.
- Używając autoklawowanych kleszczy i skalpela, umieść jedną skórę grzbietową na raz owłosioną stroną do dołu na cienkiej szalce Petriego. Zacznij zeskrobywać całą tkankę podskórną, w tym tłuszcz, z brzusznej strony tkanki skórnej, aż stanie się półprzezroczysta. Staraj się usunąć maksymalne ślady tkanki podskórnej bez rozrywania skóry (części mieszków włosowych). Nie skrobać również przez długi czas i unikać wysuszenia skóry.
- Utrzymuj zeskrobaną skórę w roztworze PBS, dopóki wszystkie inne pozostałe skórki nie zostaną przetworzone. Za pomocą skalpela pokrój skórki w paski o wymiarach 0,5 cm x 1–1,5 cm i połóż owłosioną stroną do góry na sterylnej szalce Petriego.
- Ostrożnie odpipetować 20 ml PBS/2x roztworu gentamycyny zmieszanego z trypsyną (0,25%) na plastikową szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś skórki i unieś je owłosioną stroną do góry na powierzchni roztworu trypsyny przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 32 °C.
UWAGA: Czas i temperatura trypsynizacji mają kluczowe znaczenie dla dobrego plonowania wysoce kulturowych keratynocytów pierwotnych. Chociaż inne metody mogą zapewnić dobre plony żywotnych komórek, zdolność do hodowli keratynocytów była mniej zadowalająca.- Podczas tego 2-godzinnego czasu inkubacji pokryć naczynia powłoką kolagenową i umieścić je w temperaturze 37 °C na 1 godzinę (patrz etap 3.1.2). W przypadku testów klonogennych szalki Petriego o średnicy 60 mm zostały już pokryte 24 godziny przed zbiorem keratynocytów, aby umożliwić napromieniowaną warstwę zasilającą 3T3 przyczepienie się do dna i równomierne rozprowadzenie.
nuta: Powlekanie naczyń hodowlanych do hodowli klonogennej jest bardzo ważne dla prawidłowego przyczepiania, tworzenia kolonii i ostatecznego wzrostu/proliferacji keratynocytów naskórka myszy.
- Podczas tego 2-godzinnego czasu inkubacji pokryć naczynia powłoką kolagenową i umieścić je w temperaturze 37 °C na 1 godzinę (patrz etap 3.1.2). W przypadku testów klonogennych szalki Petriego o średnicy 60 mm zostały już pokryte 24 godziny przed zbiorem keratynocytów, aby umożliwić napromieniowaną warstwę zasilającą 3T3 przyczepienie się do dna i równomierne rozprowadzenie.
- Etap skrobania naskórka: Ułóż sterylną plastikową kwadratową szalkę Petriego i utwórz powierzchnię pod kątem 30° w celu prawidłowego skrobania naskórka za pomocą 15 ml pożywki do zbierania (patrz Tabela 1). Ostrożnie usuń pływający pasek skóry z roztworu trypsyny za pomocą zakrzywionych kleszczyków. Za pomocą nowego ostrza skalpela zeskrob naskórek i włosy do podłoża.
- Nie używaj nadmiernej siły, ale użyj wystarczającej siły, aby zeskrobać naskórek, w przeciwnym razie wpłynie to na żywotność komórek.
- Podczas skrobania naskórka trzymaj ostrze prostopadle do kawałka skóry. Jeśli ostrze jest ustawione pod kątem w kierunku ruchu ostrza, istnieje większe ryzyko rozdarcia skóry. Jeśli ostrze jest odchylone od ruchu ostrza, istnieje większe ryzyko niewystarczającego usunięcia naskórka.
- Ostrożnie wlej pożywkę zawierającą zeskrobane komórki naskórka do sterylnego słoika o pojemności 60 ml (autoklawowalnego i wielokrotnego użytku) z 1,5-calowym mieszadłem magnetycznym. Opłucz szalkę Petriego dodatkowym podłożem do zbierania, aby zebrać pozostałe komórki naskórka i doprowadzić ostateczną objętość do 30 ml. Użyj mieszadła magnetycznego i mieszaj z prędkością 100 obr./min przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Proces ten usunie uwięzione komórki naskórka z włosów.
- Umieść sterylne sitko do komórek o pojemności 70 μm na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Sitko do komórek pasuje do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.
- Umieść słoik w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wyjmij mieszadło i wlej zawartość do filtra siatkowego podłączonego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odcedź niepożądane włosy i arkusze warstwy rogowej naskórka.
- Ściśnij włosy wraz z materiałami warstwy rogowej naskórka w sitku i manipuluj nimi, aby uwolnić uwięzione komórki rzęsate. Użyj 5 ml pożywki do zbierania, aby pozostałe uwięzione komórki mogły się uwolnić i spłynąć do probówki. Doprowadzić całkowitą objętość do 50 ml w stożkowej probówce.
- Zakryć stożkową probówkę o pojemności 50 ml filtratem komórkowym i odwirować przy 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odessać supernatant i dodać 5 ml pożywki do zbioru. Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie rozcierając ~20x pipetą o pojemności 5 ml.
- Na tym etapie trzymaj komórki w zamrażalniku, aby uniknąć agregacji. Dodać 25 ml podłoża do zbioru i ponownie rozcierać (20–25x).
- Aby zapewnić dokładną liczbę keratynocytów na tym etapie, weź 1 ml zawiesiny komórek i dodaj 19 ml pożywki do zbierania. Teraz rozcieńczenie komórek wynosi 1:20 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Jeśli keratynocyty są pobierane od jednej myszy, dostosuj objętość zawiesiny komórek. Zamiast 30 ml użyj 15 ml i rozcieńcz 1:10 do policzenia komórek.
- Odmierzyć pipetą 0,5 ml rozcieńczonych komórek z probówki stożkowej o pojemności 50 ml (rozcieńczenie 1:20) i przenieść do 1,5 ml autoklawizowanej probówki do mikrowirówki. Usunąć 0,2 ml (200 μl) mieszanki komórek do innej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać równą objętość (200 μl) 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj ten roztwór 3x i przenieś komórki do hemocytometru w celu zliczenia jądrzastych keratynocytów.
- Oceń wszystkie ciemnoniebieskie komórki dodatnie dla błękitu trypanowego jako martwe komórki niezdolne do życia i oceń małe złote i różowawe komórki jako żywe komórki. Ostateczna wydajność keratynocytów na mysz powinna wynosić około 30 milionów żywotnych komórek.
- Odwirować oryginalną probówkę stożkową o pojemności 50 ml (od kroku 3.8) przez 7 minut przy 160 x g w temperaturze 4 °C. Na tym etapie ponownie zawieś komórki w żądanym podłożu i wykonaj wymagane rozcieńczenie do wysiewu komórek.
- W przypadku hodowli masowej należy zasiać od 2 do 4 milionów żywotnych złotych komórek na każdej szalce Petriego o średnicy 35 mm w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka typu KGM + suplementy do kultur jednowarstwowych) (patrz Tabela 1). Do testu klonogennego (tworzenie kolonii) wysiewaj 1000 komórek na 60 mm szalkę Petriego na napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim warstwach podajnika 3T3 szwajcarskiej myszy z powłoką kolagenową i zmodyfikowaną pożywką E Williama z suplementami i surowicą.
- Użyj łącznie od 2 do 4 ml pożywki dla szalek Petriego o średnicy 35 mm i 60 mm. Również sformułować DMEM i pożywkę Williams E pozyskaną z ATCC o obniżonym poziomie wodorowęglanu sodu do stosowania w stężeniu 5% CO2 .
- Hodować komórki hodowlane (masowo lub klonogennie) w temperaturze 32 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę jeden dzień po początkowym zasiewie dla kultury masowej, a następnie 3 razy w tygodniu. Jednak w przypadku testów klonalnych pierwsza zmiana pożywki następuje 2 dni po wysiewie komórek, a następnie 3 razy w tygodniu.
- W przypadku hodowli klonalnej hoduj komórki w odstępach dwu- i czterotygodniowych. Po zakończeniu hodowli klonalnych (2 lub 4 tygodnie) odessać pożywkę. Utrwal kolonie w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej i zabarwiaj 0,5% rodaminą B w wodzie autoklawu przez 1 godzinę. Następnie usuń plamę z rodaminy B za pomocą pipety z krawędzi naczyń.
- Opłucz naczynia w zimnej wodzie z autoklawem, aż naczynia będą czyste. Umieść naczynia pochylone na pokrywie naczyń i pozwól im wyschnąć do ostatecznego liczenia kolonii. Warto zauważyć, że podczas wykonywania testu hodowli klonogennej nigdy nie pipetuj <1 ml komórek. Jeśli komórki są skoncentrowane, należy je stopniowo rozcieńczyć.
Wyniki
Zazwyczaj uzyskuje się wydajność keratynocytów naskórkowych na poziomie od 20 x 106 do 30 x 106 komórek wykluczających błękit trypanu na jedną mysz8,9. Żywotność wynosi od 80% do 90%. Typowa wydajność siewu to około 30% przytwierdzenia po 24 h. Formowanie kolonii na napromieniowanych warstwach feederowych 3T3 wynosi około 60 kolonii na 1 0 wysianych żywych komórek dla myszy C57BL/6 i około 30 kolonii na 1 00 komórek dla myszy typu szwajcarskiego10,1. Typowe wyniki testów formowania kolonii przedstawiono na Rysunku 1. Liczba komórek macierzystych mieszków włosowych wynosi około 9% komórek macierzystych CD34+/CD49f+ dla myszy C57BL/612. Typowe wyniki cytometrii przepływowej przedstawiono na Rysunku 2.
Charakterystyka wzrostu na czterech różnych pożywkach została przedstawiona na Rysunku 3. Przetestowane pożywki obejmują KGM-gold, SFM, pożywkę Williams E oraz Morris-2 (pożywkę o obniżonej zawartości wapnia, opracowaną w laboratorium Morrisa na podstawie pożywki Williams E).
Rysunek 1: Reprezentatywne przykłady z testu na klonogenne keratynocyty myszy dorosłych. Na tej fotografii przedstawiono tworzenie kolonii keratynocytów z samic myszy CD-1 w wieku 54 dni, poddanych następującym zabiegom miejscowym: 1) brak opracowania, 2) aceton, a tydzień później aceton dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie, 3) DMBA, a tydzień później aceton dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie, 4) aceton, a tydzień później TPA dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie oraz 5) DMBA, a tydzień później TPA dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie. Po opracowaniu in vivo keratynocyty pobrano i wysiano w zagęszczeniu 1 0 komórek na płytkę na warstwy wspomagające z napromieniowanych komórek 3T3, a następnie hodowano przez dwa tygodnie, po czym płytki utrwalono buforowaną formaliną i zabarwiono rhodaminą B. Płytki w każdej kolumnie stanowią powtórzenia z każdej grupy badawczej myszy. Należy zauważyć, że liczba większych kolonii wzrosła po podaniu DMBA, a całkowita liczba kolonii wzrosła po podaniu TPA myszom przed pobraniem keratynocytów. Skróty: DMBA: 7,12-dimetylbenzo[a]antracen; TPA: 12-O-tetradekanoyloforbol-13-octan. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywny przykład cytometrii przepływowej komórek macierzystych mieszków włosowych u dorosłych myszy. Krótko mówiąc, pierwotne keratynocyty wyizolowano ze skóry grzbietowej myszy, a następnie przefiltrowano przez filtr komórkowy w celu usunięcia resztek komórkowych. Izolowaną zawiesinę keratynocytów znakowano przeciwciałami przeciwko CD49f lub integrynie α6 (PE) oraz CD34 (FITC), wraz z barwnikiem do różnicowania komórek żywych i martwych oraz pozostałymi kontrolami. W celu kompensacji zastosowano przeciwciała kontrolne izotypowe FITC i PE (Rat IgG2akappa) (patrz Tabela materiałów). Komórki macierzyste wyselekcjonowano za pomocą CD49f (kanał PE), który rozpoznaje zewnętrzny składnik hemidesmosomów znajdujących się w podstawowych komórkach naskórka i mieszków włosowych, oraz CD34 (kanał FITC), który rozpoznaje komórki macierzyste mieszków włosowych (tj. CD34-FITC+ oraz a6-PE+ (prawa górna kolumna, łącznie 5%)). Kolumna po prawej stronie przedstawia różne populacje keratynocytów, mianowicie komórki tylko CD34-FITC, komórki CD34-FITC i a6-PE (podwójnie dodatnia populacja komórek macierzystych), komórki tylko a6-PE oraz komórki niebarwione. Należy zauważyć, że istnieją dwie populacje CD34+ populacje komórek macierzystych, o których raportowano6,14. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Porównanie czterech różnych pożywek w hodowlach pierwotnych komórek naskórka od dorosłych samic myszy. Pierwotne keratynocyty wyizolowano z grzbietowej skóry myszy i policzono przed wysianiem, stosując cztery różne pożywki (KGM, SFM, Williams E oraz Morris-2). Wysiano równą liczbę keratynocytów, a następnie monitorowano ich ogólną morfologię oraz wzorzec wzrostu. Należy zauważyć, że proliferujące keratynocyty wykazują nieco różną morfologię. Po czternastu dniach najintensywniejszy wzrost odnotowano w pożywkach KGM, SFM oraz Morris-2, z których wszystkie są pożywkami o obniżonej zawartości wapnia. W przeciwieństwie do nich, komórki nie przeżyły w hodowli w pożywce Williams E, która zawiera 1,4 mM wapnia i wysoki stosunek potasu do sodu. Co zaskakujące, pożywka Williams E z dodatkami i dwudziestoprocentową płodową surowicą bydlęcą znacznie lepiej wspiera hodowle klonalne keratynocytów niż jakakolwiek inna przetestowana pożywka, prawdopodobnie dlatego, że wzbogacona pożywka Williams E pomaga komórkom zasilającym 3T3 w skuteczniejszym „karmieniu” komórek. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| Roztwory i pożywki | Komentarze |
| Rozwiązania do pozyskiwania | |
| 2,5% trypsyna (5 ml) | |
| PBS Dulbecco (500 ml) | |
| Gentamycyna (2 ml) | |
| PBS z 2x gentamycyną (45 ml) | |
| bufor z soli fosforanowych (PBS) z 2x gentamicyną | |
| Roztwór trypsyny | |
| Roztwory do hodowli komórkowych | |
| roztwór do powlekania płytek Purecol-fibronectin: | |
| 1 M HEPES (1 ml) | |
| 16 mM CaCl2 (1 ml) | |
| Albumina surowicy bydlęcej 1,0 mg/ml (10 ml) | |
| Pożywka do hodowli komórkowej (100 ml) | |
| Fibronektyna (1 mg) | |
| Kolagen Purecol (1 ml) | |
| Roztwór do mrożenia komórek | |
| DMSO (2 ml) | |
| DMEM z 10% BCS i pen-strepem | |
| Medium do zbioru | Musi być pozbawione wapnia |
| 2x gentamycyna (1 ml) | |
| FBS (50 ml) | |
| SMEM (50 ml) | |
| Pożywka Williams' E z wysoką zawartością wapnia z dodatkiem: | |
| EGF (5 µg/mL) 1 ml | |
| Glutamina 14,5 ml | |
| Hydrokortyzon (1 mg/ml) 0,5 ml | |
| Insulina 1 ml | |
| LinoAcid-BSA (0,1 mg/ml) 0,5 ml | |
| MEM Ess AminoAcids 4 ml | |
| Witaminy MEM 5 ml | |
| Penicylina-streptomycyna 5 ml | |
| Transferryna (5 mg/ml) 1 ml | |
| Wit A (1 mg/1,000 µL) 57.5 µL | |
| Wit. E 1 mg/mL (4°C) 3.5 µL | |
| Wit. D2 (10 mg/ml) 50 µL | |
| pełna pożywka wzrostowa (CGM) dla fibroblastów 3T3 | |
| BCS (10 ml) | |
| DMEM (90 ml) | |
| Penicylina-streptomycyna (10 ml) | |
| KGM | Medium stosowane do hodowli masowej to medium o obniżonej zawartości wapnia. |
| pożywka Morris 2 z takimi samymi dodatkami jak w pożywce Williams' E | Wariant medium Williams E o obniżonej zawartości wapnia z dodatkami |
Tabela 1: Składy roztworów i pożywek.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda pozyskiwania keratynocytów została opracowana w celu uzyskania wysokich plonów wysoce kulturowych pierwotnych keratynocytów naskórka z grzbietu dorosłych samic myszy. Te keratynocyty nadają się do cytometrii przepływowej, zastosowań w biologii molekularnej i pierwotnej hodowli komórek, w tym do opisanego tutaj testu klonogennego. Ta metoda pozyskiwania keratynocytów była również przydatna do badania innych dalszych aspektów chemicznej kancerogenezy skóry i promocji nowotworu 1,13.
W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, dla rygoru i odtwarzalności, wykorzystano samice myszy w wieku 54 ± 2 dni. Umożliwiło nam to przeprowadzenie czułych i ilościowych testów kolonii z wielu szczepów myszy i wykorzystanie ich jako fenotypu w analizie sprzężeń prowadzących do identyfikacji co najmniej jednego nowego genu regulatorowego komórek macierzystych10,11. Po drugie, pomocne jest pokrojenie skórek na mniejsze kawałki, ponieważ trypsynizacja jest bardziej skuteczna niż próba utrzymania skóry w całości. Po trzecie, czas i temperatura flotacji trypsyny są bardzo ważne dla późniejszej hodowli. Co więcej, należy "mocno szturchnąć" włoski pozostałe na filtrze, aby usunąć przyczepione komórki. Ten krok jest ważny, aby uzyskać wysoką wydajność komórek. Ponadto temperatura 32 °C w inkubatorze jest ważna dla długoterminowej hodowli keratynocytów od dorosłych myszy. Wreszcie, w niniejszym protokole, równoległe odczytyeksperymentów in vitro i in vivo1 opierają się na kulturach pierwotnych, a nie na subkulturach lub liniach komórkowych. Warto zauważyć, że w przypadku pobierania pierwotnych keratynocytów po raz pierwszy przy użyciu tego protokołu, należy zachować pozostałą skórę właściwą po zeskrobaniu, aby potwierdzić pełne usunięcie mieszków włosowych wraz z naskórkiem przez obserwację histopatologiczną.
Główną zaletą tego protokołu do zbierania keratynocytów dorosłych myszy jest to, że daje on wysokie plony komórek hodowlanych, które nadają się do wielu dalszych zastosowań. Głównym ograniczeniem jest to, że niektóre epitopy na powierzchni komórek mogą być wrażliwe na trypsynizację, co może upośledzać barwienie immunologiczne. Dlatego podczas testowania nowego przeciwciała na powierzchni komórki rozsądne może być zastosowanie metody opartej na dispazie6 lub termolizynie5 do zbioru dla porównania. Znaczenie tego protokołu polega na tym, że został on rygorystycznie przetestowany, określony ilościowo i zastosowany do tak różnorodnych zastosowań, jak testy klonogennych komórek macierzystych 1,9,10,11, hodowle masowe w biochemii8, sortowanie FACS w analizie komórek macierzystych 3,4, biologia molekularna 3,12 oraz trwające sekwencjonowanie RNA i DNA.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,4% błękit trypanowy 1x w 0,9% soli fizjologicznej | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| M bufor HEPES | Sigma | H0887 | Sterylny |
| 1,5-calowy magnetyczny pręt mieszający z pierścieniem obrotowym | Bel-Art, Wayne | 371101128 | w 2 uncjach Słoik Nalgene |
| 10 ml jednorazowe pipety | BD Falcon | 357551 | |
| 15 ml sterylna stożkowa probówka | BD Falcon | ||
| 150 cm2 (T-150) kolba | hodowlana Corning | 430825 | |
| 2 mL Zakrętka Micro Probówka Stożkowa | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 uncje słoik Nalgene | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 ml |
| 2,5% roztwór trypsyny 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) Kolba | hodowlana Corning | 431082 | |
| 32 uncje Nalgene Kwadratowe butelki do przechowywania: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 ml |
| 35 mm sterylne naczynie do hodowli | Corning | 430165 | |
| 5 ml pipety jednorazowe | BD Falcon | 357543 | |
| 50 ml sterylna probówka stożkowa | BD Falcon | 352098 | |
| sterylna hodowla 60 mm miska | Corning | 430166 | |
| 70% etanolu | |||
| Filtr Spectra Mesh o średnicy 90 mm, 74 i mikro; m wielkość porów | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antybiotyki (penicylina-streptomycyna) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Surowica cielęca bydlęca (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 Przeciwciało sprzężone FITC | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alfa6-integryna, GOH3) Przeciwciało sprzężone z PE | BD Pharmingen | 555736 | |
| Sitko do komórek, 70 i mikro; m sterylne | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Kolagen, bydlęcy, typ I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Ekonomiczny pojemnik do zamrażania komórek na 1 lub 2 ml kriowiale | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 ml polipropylenowa fiolka kriogeniczna, wolnostojąca z okrągłym dnem | Corning | 430659 | |
| dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Destylowana woda | na świeżo; dwukrotnie destylowana woda z odwróconej osmozy | ||
| Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x, Ca2+ i Mg2+ wolne | od Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterylne |
| zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronektyna | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 uncje Sterylny pojemnik na próbki | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamycyna 50 mg / ml 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Zamrażarka | CC-3103 | |
| Nalgene "Mr. Frosty" | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Słoiki z szerokimi ustami prostymi, 16 uncji | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterylne ostrza ze stali nierdzewnej | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 rękojeści skalpela Instrumenty | do badań biomedycznych | 26-1200 | W filiżance z 70% etanolem |
| Jedna para kleszczyków do opatrunków obierniczych o pełnej krzywiźnie | Militex | 18-784 | W kubku z 70% |
| etanolem Jedna para nożyczek | Instrumenty | do badań biomedycznych25-1050 | W filiżance z 70% etanolem |
| Jedna para kleszczyków opatrunkowych do kciuka | Militex | 6-4 | W filiżance z 70% etanolem |
| Oster Pro-cord/Trymer akumulatorowy nr 40 ostrze | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastikowa szalka Petriego 100 mm x 20 mm sterylna | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Zwykły lejek szklany bez nóżki | Corning | 6240-75 | |
| Szczur IgG2akappa Przeciwciało kontrolujące izotyp FITC | BD Pharmingen | 553929 | |
| Szczur IgG2akappa Przeciwciało kontrolujące izotyp PE | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ i Mg2+ wolne minimalne niezbędne podłoże do hodowli zawiesiny | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Kwadratowe sterylne plastikowe szalki Petriego | BD Falcon | 351112 | |
| Szwajcarskie fibroblasty myszy 3T3 | ATCC | CCL-92 | stosowane w 10 przejściach |
| Triadyna; 10% roztwór do stosowania miejscowego z powidonem i jodem, 16 uncji | grupy triady | 10-8216 | |
| VWR Plastikowe szalki Petriego, sterylne Oszczędzanie miejsca 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Torba |
Bibliografia
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
Przedruki i uprawnienia
