Artykuł metodologiczny

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

19.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58701

⸱

10 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Streszczenie

Opisany tutaj protokół jest niezawodną metodą pozyskiwania pierwotnych keratynocytów od dorosłych samic myszy (54 ± 2 dni), co daje około 30 x 106 żywotnych komórek na mysz. Pierwotne keratynocyty dorosłych myszy są zbierane ze skóry grzbietowej samic myszy. Samce myszy (w wieku ~6 tygodni) mogą być wykorzystywane do zbierania keratynocytów w zależności od wymagań eksperymentu. Myszy poddane eutanazji są golone i sterylizowane seryjnym płukaniem w roztworach jodu powidonu i etanolu (70% alkoholu). Po zdezynfekowaniu myszy skóra grzbietowa jest usuwana, a podskórny tłuszcz i mięśnie są usuwane skalpelem i wyrzucane. Skórki są cięte na małe kawałki i poddawane łagodnej trypsynizacji w niskiej temperaturze, aby oderwać dolną część skóry właściwej od naskórka. Zeskrobane naskórki są mieszane z niską prędkością, filtrowane w celu usunięcia włosów, liczone i ponownie zawieszane w pożywce hodowlanej. Metoda ta zapewnia doskonałą jednokomórkową zawiesinę komórek o wysokiej zdolności do hodowli w wielu dalszych zastosowaniach.

Wprowadzenie

Skóra ssaków pokrywa całe ciało i pełni wiele funkcji (np. główną barierę fizyczną, regulację temperatury i zatrzymywanie wilgoci). W ciągu ostatnich pięciu dekad podstawowe badania nad skórą myszy przyniosły nowe informacje na temat struktury i funkcji skóry. Model skóry myszy znacznie pomógł w zrozumieniu podstawowej biologii stojącej za złożonymi mechanizmami molekularnymi kancerogenezy wywołanej promieniowaniem ultrafioletowym. Te modele skóry myszy wniosły znaczący wkład w zrozumienie chorób skóry u ludzi i ich łagodzenia. Aby zbadać dalszą molekularną sekcję pierwotnych keratynocytów w biologii rozwoju mieszków włosowych, badaniach nad komórkami macierzystymi, kancerogenezie i genetycznej eksploracji naskórka, często pożądane jest wyizolowanie i hodowla pierwotnych keratynocytów nabłonkowych ze skóry myszy w celu wykorzystania równolegle z eksperymentami in vivo. Czynnikiem motywującym do opracowania tej metody była potrzeba przeprowadzenia testu in vitro na klonogenne komórki macierzyste naskórka i mieszków włosowych1,2. Istniała również pilna potrzeba jednokomórkowych zawiesin komórek naskórka nadających się do testów klonogennych3, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i cytometria przepływowa3,4. Zaletami tej metody są znaczne zwiększenie zbiorów o rząd wielkości w porównaniu z innymi metodami5,6, włączenie nabłonkowej części mieszków włosowych oraz wysoka zdolność do hodowli pobranych komórek. W latach osiemdziesiątych XX wieku nie były znane żadne metody, które mogłyby spełnić te wymagania. W kolejnych latach metoda ta była udoskonalana w celu zwiększenia wydajności komórek. Głównym ograniczeniem tej metody byłoby maskowanie niektórych przeciwciał wrażliwych na trypsynę, które upośledzałyby immunoreaktywność6.

Myszy były hodowane zgodnie z wytycznymi Specific Pathogen Free. Uzyskano od jednej do pięciu samic myszy w wieku 54 ± 2 dni. U starszych myszy żywotność keratynocytów będzie zmniejszona z powodu fazy anagenu (wzrostu) cyklu włosa. Ponadto proces trypsynizacji jest trudniejszy w porównaniu z młodymi myszami. Procedura zbioru została z powodzeniem zoptymalizowana pod kątem cieńszej skóry samic myszy w porównaniu z samcami. Samce myszy na ogół nie są wykorzystywane do zbioru keratynocytów, ponieważ mają tendencję do walki ze sobą podczas trzymania i dlatego mogą pozostawiać zadrapania lub rany na skórze.

Protokół

Wszystkie protokoły wykorzystania kręgowców zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Minnesoty zgodnie z zalecanymi wytycznymi NIH i rządu.

1. Inicjalizacja i subkulturowanie warstwy zasilającej

  1. Rozmrozić jedną fiolkę z komórkami zawierającą zamrożoną mysz szwajcarską 3T3 ze zbiornika z ciekłym azotem, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-2 minuty. Liczba komórek w fiolce wynosi około 1 x 106.
  2. Wyjąć fiolkę z komórkami 3T3, gdy stopi się ostatni odłamek lodu. Przetrzyj probówkę wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Następnie należy przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Powoli przenieść komórki do kolby T-150 i przepłukać fiolkę 3T3 1 ml pożywki CGM. Powoli dodawaj do komórek 30 ml wstępnie podgrzanej pożywki 3T3 Complete Growth Medium (CGM). Delikatnie kołysz kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki fibroblastów 3T3. Oznacz kolbę odpowiednio szczegółami linii komórkowej, datą i numerem przejścia.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%.
    nuta: Według ATCC czas podwojenia szwajcarskiej myszy 3T3 wynosi 18 godzin; W przypadku zlewania się (zahamowania kontaktu) gęstość wynosi około 40 000 komórek na cm2. Używamy konkretnej linii 3T3 w ciągu 10-15 pasaży po inicjalizacji. Szybszy wzrost lub obecność komórek w kształcie wrzeciona może wystąpić przy wyższych pasażach i zwykle jest to znak, że 3T3 nie będzie działać tak dobrze, jak komórki zasilające dla dorosłych keratynocytów myszy. Jeśli nastąpi szybki wzrost, lepiej zainicjować nową linię z komórek dolnego pasażu.
  5. Zmień pożywkę po 24 godzinach, aby usunąć martwe komórki i pozostały DMSO (środek krioprezerwacyjny), a następnie dwa razy w tygodniu. Pozwól komórkom namnażać się około 80% konfluencji i użyj kolb T-150 do inicjacji hodowli. Użyj kolb T-225 do subkultury po inicjalizacji.
  6. Aby przeprowadzić subhodowlę komórek fibroblastów 3T3, należy wyjąć kolbę z inkubatora do hodowli komórkowych i dwukrotnie przemyć zimnym sterylnym PBS (1x) gentamycyną. Odmierzyć pipetą 10 ml wstępnie ogrzanego (37 °C łaźni wodnej) roztworu trypsyny (0,25%) do każdej kolby T-225.
    1. Umieścić kolbę na płycie grzewczej na 3-8 minut. Wyjąć kolbę i delikatnie dotknąć dłońmi ścianek kolby, aby odłączyć komórki i potwierdzić odłączenie komórek pod odwróconym mikroskopem. Roztwór trypsyny może wydawać się mętny z oderwanymi komórkami 3T3.
  7. Odpipetować roztwór trypsyny 3-4 razy, aby przemyć powierzchnię wzrostu komórek kolby i przenieść trypsynizowaną komórkę do 30 ml CGM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ponownie przemyć kolbę 3–5 razy 10 ml mieszaniny CGM-trypsyna-komórka z probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    nuta: Zawartość dwóch butelek można dodać do probówki o pojemności 50 ml; jeśli używana jest tylko jedna kolba, należy umieścić 10 ml trypsyny/komórek w 20 ml CGM w probówce o pojemności 50 ml.
  8. Odwirować probówkę stożkową o pojemności 50 ml o masie 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Teraz odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml CGM, delikatnie pipetując ~10x, aby całkowicie rozbić osad komórkowy. Dodać 10 ml CGM, aby całkowita objętość stożkowej probówki o pojemności 50 ml wynosiła 15 ml.
    1. Wymieszaj ponownie ~10x i umieść 5 ml zawiesiny komórek w 3 oddzielnych kolbach T-150. Stosunek subkultur wynosi 1:3 w kolbach T-225 lub 1:4 w kolbach T-150. Dodać 30 ml wstępnie ogrzanego 3T3 CGM do każdej z kolb.
  10. Oznacz kolbę nazwą linii komórkowej, datą wysiewu komórki i numerem pasażu.
  11. Aby zamrozić komórki 3T3 po odwirowaniu na etapie subkultury, wyjmij probówkę o pojemności 50 ml z wirówki i umieść ją w wiadrze z lodem. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml 5% mieszaniny DMSO-DMEM (patrz Tabela 1) dla każdej zebranej kolby.
  12. Umieścić 1 ml mieszaniny DMSO-DMEM z zawiesiną komórek w każdym kriowiale (jeden kriowial na zebraną kolbę 3T3). Oznacz fiolkę numerem pasażu, nazwą linii komórkowej (3T3) i datą zamrożenia komórek.
  13. Umieść te fiolki z komórkami 3T3 w słoiku zamrażarki komórkowej (patrz Tabela materiałów) i przenieś do zamrażarki o temperaturze -70 °C na >5 godziny. Ostrożnie wyjmij i przenieś fiolki ze słoika zamrażarki komórkowej i umieść w zbiorniku z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania do następnego użycia. Wprowadź informacje o nazwie linii komórkowej, lokalizacji w zbiorniku i dacie w laboratoryjnym arkuszu inwentaryzacyjnym ciekłego azotu.

2. Przygotowanie warstwy zasilającej 3T3 do naświetlania promieniowaniem rentgenowskim i wysiewu

  1. Przygotuj komórki 3T3 na tydzień przed ich napromieniowaniem i pozwól im rosnąć ~100% konfluencji. Komórki 3T3 znajdują się zwykle w pasażach od 120 do 130.
  2. W celu uzyskania udanych testów klonogennych pierwotnych keratynocytów, przed wysiewem komórek 3T3 należy pokryć powierzchniowo 60-milimetrowe szalki Petriego kolagenem.
    1. Odpipetować około 2–3 ml roztworu powlekającego kolagen na szalki Petriego o średnicy 60 mm, aby pokryć dolną powierzchnię i usunąć nadmiar płynu powlekającego kolagen (patrz Tabela 1). Przenieść szalki Petriego do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Nie pozwól, aby naczynia wyschły w inkubatorze.
  3. Etap naświetlania promieniowaniem rentgenowskim: Wykonaj kroki 1.4–1.6. Użyj 50 ml świeżego CGM, aby ponownie zawiesić osad komórkowy, zamknij stożkową rurkę i uszczelnij folią uszczelniającą parafinę. Aby uniknąć zanieczyszczenia, użyj plastikowych torebek, aby dwukrotnie zapakować rurkę zawierającą parafinę i umieścić na lodzie. Alternatywna warstwa zasilająca oparta na mitomycynie może być użyta do hodowli keratynocytów7.
  4. Napromienij komórki fibroblastów 3T3 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml dawką 5 000 radów (50 Cgy) za pomocą biologicznego aparatu rentgenowskiego. Napromieniować te komórki wraz z pożywką CGM.
    1. Po napromieniowaniu promieniowaniem rentgenowskim odwirować komórki o masie 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę supernatantową i delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml CGM, delikatnie rozcierając ~10x. Teraz doprowadź końcową objętość do 30 ml z dodatkowymi 25 ml pożywki i rozcieraj 10x. Te etapy rozcierania mają kluczowe znaczenie dla jednolitej warstwy fibroblastów 3T3 do oznaczania klonogenności.
  5. Żywotne liczenie komórek: Policz keratynocyty za pomocą zwykłego szklanego hemocytometru. Weź około 0,5 ml komórek i umieść je w probówce o pojemności 1,5 ml. Usuń 200 μl mieszaniny komórek i dodaj równą objętość 0,4% roztworu błękitu trypanowego i mieszaniny 3–4 razy. Przenieś komórki za pomocą hemocytometru i policz wszystkie komórki jądrzaste (małe złote i różowe komórki) jako komórki żywotne. Oblicz końcowe stężenie żywotnych złotych ogniw.
  6. Odpipetować 1 x 106 komórek 3T3 (można użyć co najmniej 7 x 105) komórek) do pokrytych kolagenem płytek Petriego o średnicy 60 mm (krok 2.2) i delikatnie dodać 4 ml zmodyfikowanej pożywki Williamsa E o wysokiej zawartości wapnia (patrz Tabela 1). Pozwól świeżo zasianym komórkom 3T3 przyczepić się przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz świeże pierwotne keratynocyty i wysiew je na wierzchu dołączonej warstwy fibroblastów 3T3 do testu klonogennego, jak wskazano poniżej.

3. Pierwotny zbiór i siew keratynocytów

  1. Poddać eutanazji cztery do pięciu dorosłych samic myszy poprzez wdychanie CO2 zgodnie z zatwierdzonymi standardami dla zwierząt/IACUC. Jednak protokół ten może być również stosowany w przypadku pojedynczych samic / samców myszy.
    1. Przytnij około 9cm2 sierści grzbietowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia zwierząt i umieść wszystkie strzyżone myszy w słoiku o pojemności 500 ml z wystarczającą ilością roztworu antyseptycznego jodu powidonu (nie peelingu), aby przykryć je na 1-2 minuty. Dobrze wstrząśnij słoikiem, aby równomiernie pokryć myszy roztworem antyseptycznym.
    2. Odlej roztwór i spłucz czystą wodą, aż płyn będzie klarowny. Powtórz to samo mycie antyseptyczne, a następnie spłucz wodą. Po antyseptycznym przemyciu roztworem jodu namocz wszystkie myszy w 70% etanolu przez 5–10 min.
      nuta: Myszy o jasnym futrze (np. BALB/c) zachowają lekko żółtawy kolor po antyseptycznym płukaniu jodem, podczas gdy ciemniejsze myszy (np. C57BL/6) nie. Warto zauważyć, że żółty kolor nie ma wpływu na żywotność komórek ani wzrost kultur.
  2. Ostrożnie usuń przyciętą skórę grzbietową za pomocą kleszczy do kciuków i nożyczek w kapturze z przepływem laminarnym. Umieść wyciętą skórę grzbietową w stożkowej probówce wypełnionej PBS/2x gentamycyną. Unikaj stosowania brzusznej skóry bocznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek sutka w hodowli.
  3. Używając autoklawowanych kleszczy i skalpela, umieść jedną skórę grzbietową na raz owłosioną stroną do dołu na cienkiej szalce Petriego. Zacznij zeskrobywać całą tkankę podskórną, w tym tłuszcz, z brzusznej strony tkanki skórnej, aż stanie się półprzezroczysta. Staraj się usunąć maksymalne ślady tkanki podskórnej bez rozrywania skóry (części mieszków włosowych). Nie skrobać również przez długi czas i unikać wysuszenia skóry.
    1. Utrzymuj zeskrobaną skórę w roztworze PBS, dopóki wszystkie inne pozostałe skórki nie zostaną przetworzone. Za pomocą skalpela pokrój skórki w paski o wymiarach 0,5 cm x 1–1,5 cm i połóż owłosioną stroną do góry na sterylnej szalce Petriego.
  4. Ostrożnie odpipetować 20 ml PBS/2x roztworu gentamycyny zmieszanego z trypsyną (0,25%) na plastikową szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś skórki i unieś je owłosioną stroną do góry na powierzchni roztworu trypsyny przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 32 °C.
    UWAGA:     Czas i temperatura trypsynizacji mają kluczowe znaczenie dla dobrego plonowania wysoce kulturowych keratynocytów pierwotnych. Chociaż inne metody mogą zapewnić dobre plony żywotnych komórek, zdolność do hodowli keratynocytów była mniej zadowalająca.
    1. Podczas tego 2-godzinnego czasu inkubacji pokryć naczynia powłoką kolagenową i umieścić je w temperaturze 37 °C na 1 godzinę (patrz etap 3.1.2). W przypadku testów klonogennych szalki Petriego o średnicy 60 mm zostały już pokryte 24 godziny przed zbiorem keratynocytów, aby umożliwić napromieniowaną warstwę zasilającą 3T3 przyczepienie się do dna i równomierne rozprowadzenie.
      nuta: Powlekanie naczyń hodowlanych do hodowli klonogennej jest bardzo ważne dla prawidłowego przyczepiania, tworzenia kolonii i ostatecznego wzrostu/proliferacji keratynocytów naskórka myszy.
  5. Etap skrobania naskórka: Ułóż sterylną plastikową kwadratową szalkę Petriego i utwórz powierzchnię pod kątem 30° w celu prawidłowego skrobania naskórka za pomocą 15 ml pożywki do zbierania (patrz Tabela 1). Ostrożnie usuń pływający pasek skóry z roztworu trypsyny za pomocą zakrzywionych kleszczyków. Za pomocą nowego ostrza skalpela zeskrob naskórek i włosy do podłoża.
    1. Nie używaj nadmiernej siły, ale użyj wystarczającej siły, aby zeskrobać naskórek, w przeciwnym razie wpłynie to na żywotność komórek.
    2. Podczas skrobania naskórka trzymaj ostrze prostopadle do kawałka skóry. Jeśli ostrze jest ustawione pod kątem w kierunku ruchu ostrza, istnieje większe ryzyko rozdarcia skóry. Jeśli ostrze jest odchylone od ruchu ostrza, istnieje większe ryzyko niewystarczającego usunięcia naskórka.
  6. Ostrożnie wlej pożywkę zawierającą zeskrobane komórki naskórka do sterylnego słoika o pojemności 60 ml (autoklawowalnego i wielokrotnego użytku) z 1,5-calowym mieszadłem magnetycznym. Opłucz szalkę Petriego dodatkowym podłożem do zbierania, aby zebrać pozostałe komórki naskórka i doprowadzić ostateczną objętość do 30 ml. Użyj mieszadła magnetycznego i mieszaj z prędkością 100 obr./min przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Proces ten usunie uwięzione komórki naskórka z włosów.
  7. Umieść sterylne sitko do komórek o pojemności 70 μm na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Sitko do komórek pasuje do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.
    1. Umieść słoik w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wyjmij mieszadło i wlej zawartość do filtra siatkowego podłączonego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odcedź niepożądane włosy i arkusze warstwy rogowej naskórka.
    2. Ściśnij włosy wraz z materiałami warstwy rogowej naskórka w sitku i manipuluj nimi, aby uwolnić uwięzione komórki rzęsate. Użyj 5 ml pożywki do zbierania, aby pozostałe uwięzione komórki mogły się uwolnić i spłynąć do probówki. Doprowadzić całkowitą objętość do 50 ml w stożkowej probówce.
  8. Zakryć stożkową probówkę o pojemności 50 ml filtratem komórkowym i odwirować przy 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odessać supernatant i dodać 5 ml pożywki do zbioru. Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie rozcierając ~20x pipetą o pojemności 5 ml.
    1. Na tym etapie trzymaj komórki w zamrażalniku, aby uniknąć agregacji. Dodać 25 ml podłoża do zbioru i ponownie rozcierać (20–25x).
    2. Aby zapewnić dokładną liczbę keratynocytów na tym etapie, weź 1 ml zawiesiny komórek i dodaj 19 ml pożywki do zbierania. Teraz rozcieńczenie komórek wynosi 1:20 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Jeśli keratynocyty są pobierane od jednej myszy, dostosuj objętość zawiesiny komórek. Zamiast 30 ml użyj 15 ml i rozcieńcz 1:10 do policzenia komórek.
  9. Odmierzyć pipetą 0,5 ml rozcieńczonych komórek z probówki stożkowej o pojemności 50 ml (rozcieńczenie 1:20) i przenieść do 1,5 ml autoklawizowanej probówki do mikrowirówki. Usunąć 0,2 ml (200 μl) mieszanki komórek do innej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać równą objętość (200 μl) 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj ten roztwór 3x i przenieś komórki do hemocytometru w celu zliczenia jądrzastych keratynocytów.
    1. Oceń wszystkie ciemnoniebieskie komórki dodatnie dla błękitu trypanowego jako martwe komórki niezdolne do życia i oceń małe złote i różowawe komórki jako żywe komórki. Ostateczna wydajność keratynocytów na mysz powinna wynosić około 30 milionów żywotnych komórek.
  10. Odwirować oryginalną probówkę stożkową o pojemności 50 ml (od kroku 3.8) przez 7 minut przy 160 x g w temperaturze 4 °C. Na tym etapie ponownie zawieś komórki w żądanym podłożu i wykonaj wymagane rozcieńczenie do wysiewu komórek.
    1. W przypadku hodowli masowej należy zasiać od 2 do 4 milionów żywotnych złotych komórek na każdej szalce Petriego o średnicy 35 mm w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka typu KGM + suplementy do kultur jednowarstwowych) (patrz Tabela 1). Do testu klonogennego (tworzenie kolonii) wysiewaj 1000 komórek na 60 mm szalkę Petriego na napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim warstwach podajnika 3T3 szwajcarskiej myszy z powłoką kolagenową i zmodyfikowaną pożywką E Williama z suplementami i surowicą.
    2. Użyj łącznie od 2 do 4 ml pożywki dla szalek Petriego o średnicy 35 mm i 60 mm. Również sformułować DMEM i pożywkę Williams E pozyskaną z ATCC o obniżonym poziomie wodorowęglanu sodu do stosowania w stężeniu 5% CO2 .
  11. Hodować komórki hodowlane (masowo lub klonogennie) w temperaturze 32 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę jeden dzień po początkowym zasiewie dla kultury masowej, a następnie 3 razy w tygodniu. Jednak w przypadku testów klonalnych pierwsza zmiana pożywki następuje 2 dni po wysiewie komórek, a następnie 3 razy w tygodniu.
  12. W przypadku hodowli klonalnej hoduj komórki w odstępach dwu- i czterotygodniowych. Po zakończeniu hodowli klonalnych (2 lub 4 tygodnie) odessać pożywkę. Utrwal kolonie w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej i zabarwiaj 0,5% rodaminą B w wodzie autoklawu przez 1 godzinę. Następnie usuń plamę z rodaminy B za pomocą pipety z krawędzi naczyń.
    1. Opłucz naczynia w zimnej wodzie z autoklawem, aż naczynia będą czyste. Umieść naczynia pochylone na pokrywie naczyń i pozwól im wyschnąć do ostatecznego liczenia kolonii. Warto zauważyć, że podczas wykonywania testu hodowli klonogennej nigdy nie pipetuj <1 ml komórek. Jeśli komórki są skoncentrowane, należy je stopniowo rozcieńczyć.

Wyniki

Zazwyczaj uzyskuje się od 20 x 106 do 30 x 106 komórek wykluczających błękit trypanu (keratynocytów naskórkowych) z jednej myszy8,9. Żywotność wynosi od 80% do 90%. Typowa wydajność wysiewu to około 30% przytwierdzenia po 24 h. Tworzenie kolonii na napromieniowanych warstwach pokarmowych komórek 3T3 wynosi około 60 kolonii na 1000 wysianych żywotnych komórek dla myszy C57BL/6 i około 30 kolonii na 1000 komórek dla myszy typu Swiss10,11. Typowe wyniki testów tworzenia kolonii przedstawiono na Rysunku 1. Liczba komórek macierzystych mieszków włosowych wynosi około 9% komórek macierzystych CD34+/CD49f+ dla myszy C57BL/612. Typowe wyniki cytometrii przepływowej przedstawiono na Rysunku 2.

Charakterystyka wzrostu na czterech różnych pożywkach została przedstawiona na Ryc. 3. Przebadane pożywki obejmują KGM-gold, SFM, pożywkę Williams E oraz Morris-2 (pożywkę o obniżonej zawartości wapnia, opracowaną w laboratorium Morrisa na podstawie pożywki Williams E).

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne przykłady z testu klonogenności keratynocytów od dorosłych myszy. Fotografia przedstawia tworzenie kolonii keratynocytów od samic myszy CD-1 w wieku 54 dni, które były poddawane miejscowemu traktowaniu: 1) brak traktowania, 2) acetonem, a następnie po tygodniu acetonem dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie, 3) DMBA, a następnie po tygodniu acetonem dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie, 4) acetonem, a następnie po tygodniu TPA dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie oraz 5) DMBA, a następnie po tygodniu TPA dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie. Po traktowaniu in vivo keratynocyty zostały pobrane i wysiane w zagęszczeniu 1 000 komórek na płytkę na warstwy wspierające z napromieniowanych komórek 3T3, a następnie hodowane przez dwa tygodnie, po czym płytki utrwalono w buforowanej formalinie i barwiono rhodaminą B. Płytki w każdej kolumnie są powtórzeniami z każdej grupy traktowania myszy. Zauważalny jest wzrost liczby większych kolonii po traktowaniu DMBA oraz wzrost całkowitej liczby kolonii po traktowaniu myszy TPA przed pobraniem keratynocytów. Skróty: DMBA: 7,12-dimetylbenzo[a]antracen; TPA: 12-O-tetradekanoiloforbol-13-estryfikacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywny przykład cytometrii przepływowej komórek macierzystych mieszków włosowych myszy dorosłych. W skrócie, pierwotne keratynocyty wyizolowano ze skóry grzbietowej myszy, a następnie przefiltrowano za pomocą sitka komórkowego w celu usunięcia debris komórkowego. Wyizolowaną zawiesinę keratynocytów znakowano CD49f lub αprzeciwciała przeciwko integrynie 6 (PE) i CD34 (FITC) wraz z barwnikiem live/dead oraz innymi kontrolami. Przeciwciała kontrolne izotypowe FITC i PE ( szczur IgG2akappa) zostały użyte do kompensacji (patrz Tabela materiałów). Komórki macierzyste wyselekcjonowano za pomocą CD49f (kanał PE), który rozpoznaje zewnętrzny składnik hemidesmosomów występujących w podstawnych komórkach naskórka i mieszków włosowych, oraz CD34 (kanał FITC), który rozpoznaje komórki macierzyste mieszków włosowych (tj. CD34-FITC+ or a6-PE+ (górna prawa kolumna, łącznie 5%)). Kolumna po prawej stronie przedstawia różne populacje keratynocytów, mianowicie komórki wyłącznie CD34-FITC, komórki CD34-FITC i $\alpha$6-PE (podwójnie dodatnia populacja komórek macierzystych), komórki wyłącznie $\alpha$6-PE oraz komórki niebarwione. Należy zwrócić uwagę, że istnieją dwie populacje CD34+ populacje komórek macierzystych, o których informowano w doniesieniach6,14. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie czterech różnych pośrodków dla kultur pierwotnych komórek naskórka od dorosłych samic myszy. Pierwotne keratynocyty wyizolowano ze skóry grzbietowej myszy i policzono w celu wysiania z użyciem czterech różnych pośrodków (KGM, SFM, Williams-E i Morris-2). Wysiano równą liczbę keratynocytów, a następnie monitorowano ich ogólną morfologię i wzorzec wzrostu. Należy zauważyć, że proliferujące keratynocyty wykazują nieco różne morfologie. Pośrodki KGM, SFM i Morris-2, które są pośrodkami o obniżonej zawartości wapnia, wykazują najsilniejszy wzrost po czternastu dniach. W przeciwieństwie do nich, komórki nie utrzymują się w hodowli w pośrodku Williams E, który zawiera 1,4 mM wapnia i ma wysoki stosunek potasu do sodu. Co zaskakujące, pośrodek Williams E z dodatkami i 20% płodowej surowicy bydlęcej znacznie lepiej wspiera hodowle klonalne keratynocytów niż jakikolwiek inny przetestowany pośrodek, prawdopodobnie dlatego, że wzbogacony pośrodek Williams E pomaga komórkom zasilającym 3T3 lepiej „karmić”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Roztwory i pożywkiKomentarze
Roztwory do zbioru
2,5% trypsyna (5 ml)
PBS Dulbecco (500 ml)
Gentamicyna (2 ml)
PBS z 2x gentamycyną (45 ml)
Bufor fosforanowo-solny (PBS) z 2x gentamycyną
Roztwór trypsyny
Roztwory do hodowli komórkowych
roztwór Purecol do powlekania naczyń fibronektyną:
1 M HEPES (1 ml)
116 mM CaCl2 (1 ml)
Albuminy surowicy bydlęcej 1,0 mg/ml (10 ml)
Pożywka do hodowli komórkowej (100 ml)
Fibronektyna (1 mg)
kolagen Purecol (1 ml)
Roztwór do mrożenia komórek
DMSO (2 ml)
DMEM z dodatkiem 10% BCS oraz pen-strep
Poziomka do zbioruMusi być pozbawione wapnia
2x gentamycyna (1 ml)
FBS (50 ml)
SMEM (500 ml)
Pośrodka Williams' E z wysoką zawartością wapnia z:
EGF (5 µg/mL) 1 ml
Glutamina 14,5 ml
Hydrokortyzon (1 mg/ml) 0,5 ml
Insulina 1 ml
LinoAcid-BSA (0,1 mg/ml) 0,5 ml
MEM Ess AminoAcids 4 mL
Witaminy MEM 5 ml
Penicylina-Streptomycyna 5 ml
Transferryna (5 mg/ml) 1 ml
Wit. A (1 mg/1,000 µL) 57.5 µL
Wit. E 1 mg/mL (4°C)  3.5 µL
Wit. D2 (10 mg/ml) 50 µL
pełna pożywka wzrostowa (CGM) dla fibroblastów 3T3
BCS (100 ml)
DMEM (900 ml)
Penicylina-streptomycyna (10 ml)
KGMPożywka stosowana do hodowli masowej jest pożywką o obniżonej zawartości wapnia.
pożywka Morris 2 z takimi samymi dodatkami jak pożywka Williams' EWariant Williams E o zredukowanej zawartości wapnia z dodatkami

Tabela 1: Składy roztworów i pożywek.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda pozyskiwania keratynocytów została opracowana w celu uzyskania wysokich plonów wysoce kulturowych pierwotnych keratynocytów naskórka z grzbietu dorosłych samic myszy. Te keratynocyty nadają się do cytometrii przepływowej, zastosowań w biologii molekularnej i pierwotnej hodowli komórek, w tym do opisanego tutaj testu klonogennego. Ta metoda pozyskiwania keratynocytów była również przydatna do badania innych dalszych aspektów chemicznej kancerogenezy skóry i promocji nowotworu 1,13.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, dla rygoru i odtwarzalności, wykorzystano samice myszy w wieku 54 ± 2 dni. Umożliwiło nam to przeprowadzenie czułych i ilościowych testów kolonii z wielu szczepów myszy i wykorzystanie ich jako fenotypu w analizie sprzężeń prowadzących do identyfikacji co najmniej jednego nowego genu regulatorowego komórek macierzystych10,11. Po drugie, pomocne jest pokrojenie skórek na mniejsze kawałki, ponieważ trypsynizacja jest bardziej skuteczna niż próba utrzymania skóry w całości. Po trzecie, czas i temperatura flotacji trypsyny są bardzo ważne dla późniejszej hodowli. Co więcej, należy "mocno szturchnąć" włoski pozostałe na filtrze, aby usunąć przyczepione komórki. Ten krok jest ważny, aby uzyskać wysoką wydajność komórek. Ponadto temperatura 32 °C w inkubatorze jest ważna dla długoterminowej hodowli keratynocytów od dorosłych myszy. Wreszcie, w niniejszym protokole, równoległe odczytyeksperymentów in vitro i in vivo1 opierają się na kulturach pierwotnych, a nie na subkulturach lub liniach komórkowych. Warto zauważyć, że w przypadku pobierania pierwotnych keratynocytów po raz pierwszy przy użyciu tego protokołu, należy zachować pozostałą skórę właściwą po zeskrobaniu, aby potwierdzić pełne usunięcie mieszków włosowych wraz z naskórkiem przez obserwację histopatologiczną.

Główną zaletą tego protokołu do zbierania keratynocytów dorosłych myszy jest to, że daje on wysokie plony komórek hodowlanych, które nadają się do wielu dalszych zastosowań. Głównym ograniczeniem jest to, że niektóre epitopy na powierzchni komórek mogą być wrażliwe na trypsynizację, co może upośledzać barwienie immunologiczne. Dlatego podczas testowania nowego przeciwciała na powierzchni komórki rozsądne może być zastosowanie metody opartej na dispazie6 lub termolizynie5 do zbioru dla porównania. Znaczenie tego protokołu polega na tym, że został on rygorystycznie przetestowany, określony ilościowo i zastosowany do tak różnorodnych zastosowań, jak testy klonogennych komórek macierzystych 1,9,10,11, hodowle masowe w biochemii8, sortowanie FACS w analizie komórek macierzystych 3,4, biologia molekularna 3,12 oraz trwające sekwencjonowanie RNA i DNA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% błękit trypanowy 1x w 0,9% soli fizjologicznejLife Technologies Gibco15250-061
M bufor HEPESSigmaH0887Sterylny
1,5-calowy magnetyczny pręt mieszający z pierścieniem obrotowymBel-Art, Wayne371101128w 2 uncjach Słoik Nalgene
10 ml jednorazowe pipetyBD Falcon357551
15 ml sterylna stożkowa probówkaBD Falcon
150 cm2 (T-150) kolbahodowlana Corning430825
2 mL Zakrętka Micro Probówka StożkowaSarstedt72.608
2 uncje słoik NalgeneThermo Fisher Scientific2118-000260 ml
2,5% roztwór trypsyny 10xLife Technologies Gibco15090-046
225 cm2 (T-225) Kolbahodowlana Corning431082
32 uncje Nalgene Kwadratowe butelki do przechowywania: PETGThermo Fisher Scientific2019-10001000 ml
35 mm sterylne naczynie do hodowliCorning430165
5 ml pipety jednorazoweBD Falcon357543
50 ml sterylna probówka stożkowaBD Falcon352098
sterylna hodowla 60 mm miskaCorning430166
70% etanolu
Filtr Spectra Mesh o średnicy 90 mm, 74 i mikro; m wielkość porówSpectrum Laboratories145956
Antybiotyki (penicylina-streptomycyna)Life Technologies Gibco15140-122
Surowica cielęca bydlęca (BCS)Thermo Fisher Scientific HycloneSH30073.03
Albumina surowicy bydlęcejBD Biosciences354331
CD34 Ram34 Przeciwciało sprzężone FITCBD Pharmingen553733
CD49f (alfa6-integryna, GOH3) Przeciwciało sprzężone z PEBD Pharmingen555736
Sitko do komórek, 70 i mikro; m sterylneBD Discovery Labware352350
Kolagen, bydlęcy, typ I, 30 mgBD Biosciences354231
CoolCell Ekonomiczny pojemnik do zamrażania komórek na 1 lub 2 ml kriowialeBiocisonBCS-136PK
Corning 2 ml polipropylenowa fiolka kriogeniczna, wolnostojąca z okrągłym dnemCorning430659
dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Destylowana wodana świeżo; dwukrotnie destylowana woda z odwróconej osmozy
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x, Ca2+ i Mg2+ wolneod Life Technologies Gibco14190-144Sterylne
zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)ATCC30-2002
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific HycloneSH 300070.03
FibronektynaSigmaF1141-5MG
Fisherbrand 4 uncje Sterylny pojemnik na próbkiFisher Scientific16-320-730
Gentamycyna 50 mg / ml 10Life Technologies Gibco15750-060
KGMZamrażarkaCC-3103
Nalgene "Mr. Frosty"Thermo Fisher Scientific5100-0001
Nalgene PC Słoiki z szerokimi ustami prostymi, 16 uncjiThermo Fisher Scientific2116-0500
No. 22 sterylne ostrza ze stali nierdzewnejBD Bard-Parker371222
No. 4 rękojeści skalpela Instrumentydo badań biomedycznych26-1200W filiżance z 70% etanolem
Jedna para kleszczyków do opatrunków obierniczych o pełnej krzywiźnieMilitex18-784W kubku z 70%
etanolem Jedna para nożyczekInstrumentydo badań biomedycznych25-1050W filiżance z 70% etanolem
Jedna para kleszczyków opatrunkowych do kciukaMilitex6-4W filiżance z 70% etanolem
Oster Pro-cord/Trymer akumulatorowy nr 40 ostrzeJarden Consumer Solutions/Oster78997-010
Plastikowa szalka Petriego 100 mm x 20 mm sterylnaCorning430167
Pyrex Brand Zwykły lejek szklany bez nóżkiCorning6240-75
Szczur IgG2akappa Przeciwciało kontrolujące izotyp FITCBD Pharmingen553929
Szczur IgG2akappa Przeciwciało kontrolujące izotyp PEBD Pharmingen555844
SFMLife Technologies Gibco10725-018
SMEMLife Technologies Gibco11380-037
SMEM: Ca2+ i Mg2+ wolne minimalne niezbędne podłoże do hodowli zawiesinyLife Technologies Gibco11380-037
Kwadratowe sterylne plastikowe szalki PetriegoBD Falcon351112
Szwajcarskie fibroblasty myszy 3T3ATCCCCL-92stosowane w 10 przejściach
Triadyna; 10% roztwór do stosowania miejscowego z powidonem i jodem, 16 uncjigrupy triady10-8216
VWR Plastikowe szalki Petriego, sterylne Oszczędzanie miejsca 100 x 10VWR25384-324
Williams E MediumLife Technologies Gibco12551-032
Torba
1 352097 Milli-Q komórkowa Lonza strunowa

Bibliografia

  1. Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
  2. Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
  3. Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
  4. Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
  5. Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
  6. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  7. Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
  8. Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
  9. Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
  10. Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
  11. Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
  12. Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
  13. Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
  14. Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja keratynocyt wpozyskiwanie kom rek nask rkacytometria przep ywowaliczenie kom rektrypsynizacjanaczynia pokryte kolagenemwarstwy karmienne kom rek Swiss Mouse 3T3test tworzenia kolonii

Powiązane artykuły