Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58704

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Streszczenie

Wyjście leukocytów z tkanek obwodowych do drenujących węzłów chłonnych jest nie tylko kluczowe dla nadzoru i inicjacji immunologicznej, ale także przyczynia się do rozwiązania odpowiedzi tkanek obwodowych. Chociaż do ilościowego określania wyjścia leukocytów z tkanek obwodowych nielimfatycznych stosuje się różne metody, mechanizmy komórkowe i molekularne, które rządzą wyjściem zależnym od kontekstu, pozostają słabo poznane. W tym miejscu opisujemy zastosowanie fotokonwersji in situ do analizy ilościowej wyjścia leukocytów ze skóry myszy i guzów. Fotokonwersja pozwala na bezpośrednie znakowanie leukocytów znajdujących się w tkance skórnej. Chociaż ekspozycja skóry na światło fioletowe indukuje miejscowe reakcje zapalne charakteryzujące się naciekami leukocytów i nieszczelnością naczyń krwionośnych, w bezpośrednim porównaniu z transdermalnym stosowaniem znaczników fluorescencyjnych, fotokonwersja specyficznie znakowała migrujące populacje komórek dendrytycznych i jednocześnie umożliwiła ilościowe określenie wyjścia szpiku i limfoidów z mikrośrodowisk skórnych i guzów. Mechanizmy wychodzenia leukocytów pozostają brakującym elementem w naszym zrozumieniu złożoności leukocytów wewnątrznowotworowych, a zatem zastosowanie opisanych w niniejszym dokumencie narzędzi zapewni unikalny wgląd w dynamikę mikrośrodowisk immunologicznych nowotworu zarówno w stanie stacjonarnym, jak i w odpowiedzi na terapię.

Wprowadzenie

Odpowiedzi immunologiczne tkanek obwodowych są kształtowane nie tylko przez rekrutację leukocytów do miejsc zapalenia, ale także przez mechanizmy regulujące ich późniejsze zachowanie. Tak więc odporność ochronna jest podyktowana kumulatywnymi mechanizmami komórkowymi i molekularnymi, które decydują o tym, czy leukocyt wchodzi, pozostaje w środku, czy raczej migruje z tkanki obwodowej przez naczynia limfatyczne. Co ważne, skłonność leukocytów do wychodzenia z tkanek przez naczynia limfatyczne (określana jako wyjście) jest związana z ich wyspecjalizowanymi funkcjami. Komórki dendrytyczne (DC) nabywają zachowania migracyjne w odpowiedzi na sygnały dojrzewania prowadzące do transportu antygenu i prezentacji w drenujących węzłach chłonnych (dLN), procesu, który jest niezbędny dla odporności adaptacyjnej1. Wymiatacze komórek szpikowych, takich jak makrofagi i neutrofile, służą do usuwania zanieczyszczeń apoptotycznych poprzez fagocytozę. Podczas infekcji bakteryjnej neutrofile opuszczają tkankę i ostatecznie ulegają apoptozie w dLNs2 oraz w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS, dane potwierdzają hipotezę, że wydostanie się makrofagów jest niezbędne do rozwiązania miejscowego stanu zapalnego3. Nie wiadomo jednak, czy wydostanie się neutrofili i makrofagów występuje we wszystkich kontekstach zapalnych. Dowody na wyjście limfocytów T ze stanu ustalonego4,5,6,7, infected8, and inflamed4,9,10,11,12 obwodowe, nielimfoidalne tkanki wskazują, że limfocyty T aktywnie recyrkulują, chociaż sygnały tkankowe, które napędzają to wyjście, pozostają słabo poznane. W kilku badaniach zidentyfikowano sygnały niezbędne do kierunkowej migracji w kierunku drenujących naczyń włosowatych limfatycznych i późniejszego wyjścia, w tym ligand 21 chemokiny (motyw C-C) (CCL21) i jego receptor CCR74,11,13, ligand 12 chemokiny (motyw C-X-C) (CXCL12) i jego receptor CXCR42,14 i sfingozyno-1-fosforan (S1P)10,15,16. Mechanizmy te nie są jednak aktywne we wszystkich kontekstach, a to, czy determinują wyjście wszystkich typów komórek, pozostaje kwestią otwartą. Co ważne, dalsze poznanie mechanizmów rządzących wyjściem i jego funkcjonalnego znaczenia w chorobie wymaga ilościowych metod analizy in vivo.

Do ilościowego określenia wyjścia w wielu modelach zwierzęcych in vivo użyto kilku metod, w tym bezpośredniej kaniulacji naczyń limfatycznych, adoptywnego transferu leukocytów znakowanych ex vivo, transdermalnego stosowania znaczników fluorescencyjnych, wstrzykiwania znakowanych cząstek oraz fotokonwersji in vivo17,18. Bezpośrednia kaniulacja naczyń limfatycznych myszy doprowadzających jest trudna i ograniczona u małych zwierząt objętościami płynu, które można zebrać. Tak więc kaniulacja była w dużej mierze wykonywana u dużych zwierząt (np. owiec), gdzie takie manipulacje chirurgiczne są praktyczne. Badania te dostarczają bezpośrednich dowodów na obecność zarówno komórek limfoidalnych, jak i szpikowych w limfie10,19,20. Co więcej, modele owcze ujawniają, że ostre i przewlekłe zapalenie zwiększyło obecność limfocytów w limfie prawie 100-krotnie10,21.

Adoptywny transfer znakowanych i genetycznie modyfikowanych limfocytów ujawnił, że CCR7 jest niezbędny do wyjścia limfocytów T CD4+ z ostrego stanu zapalnego skóry5,11, podczas gdy wstępne traktowanie limfocytów małocząsteczkowym agonistą receptora S1P, FTY720, tylko częściowo hamuje ich wychodzenie10. Co ciekawe, wyjście przenoszonych limfocytów z przewlekle zapalnej skóry jest niezależne od CCR710, ale może częściowo wymagać CXCR49. Eksperymenty z transferem adoptywnym dostarczają jednak niefizjologiczną liczbę limfocytów aktywowanych i znakowanych ex vivo do tkanki poprzez wstrzyknięcie, co zmienia środowisko biomechaniczne tkanek i zwiększa ciśnienie płynu śródmiąższowego, które otwiera początkowe naczynia włosowate limfatyczne i zmienia ich właściwości transportowe22. Alternatywnie, transdermalne stosowanie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w obecności lub braku substancji drażniących skórę (np. ftalanu dibutylu, DBP) lub infekcji23,24 pozwala na śledzenie komórek fagocytarnych, które gromadzą znacznik i migrują do dLN. Podobnie, guzy znakowane fluorescencyjnie zapewniają środki do śledzenia komórek fagocytarnych, które pochłonęły materiał nowotworowy25. Metody te dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów, które rządzą wyjściem DC13,14,17,26,27, ale nie są w stanie śledzić limfocytów niefagocytarnych, a interpretacja może być skomplikowana przez swobodny drenaż limfatyczny rozpuszczalnego FITC, oznaczając w ten sposób niemigrujące, rezydentne LN DC.

Alternatywnie, mikroskopia przyżyciowa jest potężnym narzędziem, które pozwala na śledzenie in vivo fizjologicznie istotnych populacji leukocytów w czasie rzeczywistym28,29. Mikroskopia przyżyciowa, stosowana w połączeniu z myszami reporterowymi i immunofluorescencyjnym znakowaniem in vivo opartym na przeciwciałach, ujawniła złożoną przestrzenną i czasową dynamikę transportu komórek odpornościowych, w tym migrację śródmiąższową30, transmigrację przez śródbłonek limfatyczny, przejście w świetle limfy i migrację po wejściu do LN28,31. Szerokie zastosowanie technik obrazowania przyżyciowego jest ograniczone ze względu na koszty, niezbędną wiedzę specjalistyczną do konfiguracji i ograniczoną przepustowość w zakresie ilościowego oznaczania wielu typów komórek. Mimo to, sprzężenie metod ilościowych, które analizują dynamikę tkanek populacji, z obrazowaniem przyżyciowym dostarczy dodatkowych i ważnych mechanistycznych informacji w odniesieniu do mechanizmów ruchliwości i migracji w kierunku i w obrębie naczyń włosowatych limfatycznych18,31,32.

W związku z tym, fotokonwersja in vivo pojawiła się jako metoda, która pozwala na znakowanie in situ, niezależnie od aktywności fagocytarnej, oraz na ilościowe określenie fizjologicznego wyjścia leukocytów (w połączeniu z cytometrią przepływową) w przypadku braku lub obecności prowokacji. Myszy Kaede-Tg konstytutywnie wyrażają białko wyizolowane z koralowca kamiennego, które wykazuje zieloną fluorescencję (zieleń Kaede) do momentu wystawienia na działanie światła fioletowego, po czym nieodwracalnie przekształca się w czerwoną fluorescencję (czerwień Kaede)33. Fotokonwertowane komórki mogą być śledzone, gdy wychodzą z obwodowych miejsc tkankowych i gromadzą się w dLN. Ten i inne podobne modele myszy konwertowalnych na zdjęcia34,35 ujawniły ważne biologie, w tym konstytutywne wyjście regulatorowych komórek T ze skóry36, zależne od CXCR4 wyjście komórek B z łat Peyera37, mobilizacja rezydentnych komórek T pamięci po ponownym wywołaniu peptydu38, oraz szerokie wyjście leukocytów z mikrośrodowisk nowotworowych39. W niniejszym artykule przeprowadzamy bezpośrednie porównanie fotokonwersji z transdermalną aplikacją FITC w kontekście zapalenia i infekcji skóry, aby umożliwić bezpośrednie porównanie istniejących danych z metodą fotokonwertowalną. Ponadto wykazujemy fotokonwersję w implantowanych nowotworach oraz opisujemy skuteczność konwersji i selektywne wyjście z mikrośrodowisk guza. W związku z tym twierdzimy, że potrzebne jest dalsze stosowanie tych metod, aby wyjaśnić krytyczną biologię wychodzenia leukocytów z guzów, co będzie miało znaczące implikacje dla interpretacji złożoności leukocytów wewnątrznowotworowych, odporności przeciwnowotworowej i odpowiedzi na terapię.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Zdrowia i Nauki w Oregonie.

1. Indukcja stanu zapalnego i malowanie FITC małżowiny usznej myszy

  1. W okapie z przepływem laminarnym znieczulij mysz C57Bl/6 za pomocą odparowanego izofluoranu (indukować 3-5% izofluoranu i utrzymywać na poziomie 1-3% izofluoranu; natężenie przepływu tlenu na poziomie 0,5-1,0 l/min). Zapewnij odpowiednie znieczulenie, monitorując utratę odruchu pedałowania, mimowolne ruchy i zmniejszoną częstość oddechów.
  2. Połóż ucho płasko z brzuszną stroną ucha skierowaną do góry. Odmierzyć pipetą 20 μl 5% roztworu FITC rozpuszczonego w ftalanu dibutylu (DBP) w stosunku 1:1 do brzusznej strony małżowiny usznej. Pozostaw ucho do wyschnięcia na kilka sekund.
  3. 24 godziny po zastosowaniu FITC należy poddać myszy eutanazji poprzez ekspozycję na dwutlenek węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz małżowiny uszne do PBS, oddzielając uszy od głowy za pomocą nożyczek. Zbierz dLN szyjki macicy i pachwinowe niedrenujące LN do PBS za pomocą pęsety, aby oddzielić LN od otaczających tkanek. Pachwinowe, niedrenujące LN będą służyć jako ujemna kontrola obecności leukocytów FITC+/Kaede red+. Utylizacja zwłok zgodnie z protokołem instytucjonalnym.
    Uwaga: Optymalny czas po fotokonwersji do analizy będzie zależał od typu komórki i znanych zachowań migracyjnych. Na przykład komórki dendrytyczne można wykryć w dLN już po 6 godzinach od aplikacji DBP.

2. Indukcja stanu zapalnego i fotokonwersja małżowiny usznej myszy

  1. W okapie z przepływem laminarnym znieczulić mysz Kaede-Tg (tło C57Bl/6) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny rozpuszczonej w soli fizjologicznej. Zapewnić odpowiednie znieczulenie zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  2. Połóż ucho płasko z brzuszną stroną ucha skierowaną do góry. Odmierzyć 20 μl acetonu w stosunku 1:1:DBP do brzusznej strony małżowiny usznej. Pozostaw ucho do wyschnięcia na kilka sekund.
  3. Po aplikacji DBP wytnij szczelinę w kawałku folii aluminiowej i przeciągnij ucho przez szczelinę, aby wystawić ucho na działanie fioletowego źródła światła. Połóż ucho płasko stroną grzbietową skierowaną do góry za pomocą taśmy dwustronnej, aby przymocować ucho do folii.
  4. Umieść ucho bezpośrednio pod źródłem światła i fotokonwertuj przez 3 minuty za pomocą źródła światła o długości fali 405 nm i mocy 100 mW.
  5. 24 godziny po fotokonwersji poddaj myszy eutanazji Kaede-Tg i zbierz małżowiny uszne, LN szyjki macicy i LN pachwinowe, jak opisano w kroku 1.3.
    Uwaga: Oprócz rozważań przytoczonych w kroku 1.3, tempo proliferacji określi czas analizy, ponieważ utrata czerwieni Kaede nastąpi w szybko dzielących się komórkach.

3. Zakażenie krowianką małżowiny usznej myszy i aplikacja FITC

  1. Znieczulij mysz C57Bl/6 odparowanym izofluoranem zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  2. Połóż brzuszną stronę ucha płasko. Odpipetować 5 x 106 jednostek tworzących blaszkę miażdżycową (PFU) wirusa krowianki (VacV) rozcieńczonych w 10 μl PBS na małżowinę uszną. Używając igły o rozmiarze 29, wbij małżowinę uszną 25 razy40.
  3. 24 godziny po zakażeniu znieczulić myszy zakażone VacV izofluoranem, jak opisano w kroku 1.1, a następnie odpipetować 20 μl 5% FITC rozpuszczonego w acetonie na brzuszną stronę małżowiny usznej. Pozostaw ucho do wyschnięcia na kilka sekund.
  4. 24 godziny po zastosowaniu FITC należy poddać myszy eutanazji i pobrać małżowiny uszne, LN szyjki macicy i pachwinowe LN, jak opisano w kroku 1.3.
    Uwaga: FITC może być stosowany w dowolnym momencie po infekcji w celu określenia handlu prądem stałym w różnych odstępach 24 godzin. Wcześniej informowaliśmy, że migracja DC do dLN utrzymuje się na podobnym poziomie od 1 do 3 dnia po infekcji41.

4. Zakażenie krowianką małżowiny usznej myszy i fotokonwersja.

  1. Znieczulij mysz Kaede-Tg odparowanym izofluoranem zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  2. Zainfekuj małżowinę uszną ucha VacV zgodnie z opisem w kroku 3.2.
  3. 24 godziny po zakażeniu znieczulij myszy Kaede zakażone VacV, jak opisano w kroku 2.1 i wykonaj fotokonwersję, jak opisano w krokach 2.3-2.4.
  4. 24 godziny po fotokonwersji poddać myszy eutanazji i pobrać małżowiny uszne, LN szyjki macicy i pachwinowe LN, jak opisano w kroku 1.3.
    Uwaga: Jak wspomniano powyżej w kroku 3.4, fotokonwersję można przeprowadzić w dowolnym momencie po infekcji.

5. Przetwarzanie węzłów chłonnych i usznych w cytometrii przepływowej

  1. Utwórz jednokomórkowe zawiesiny małżowiny usznej: oderwij brzuszną i grzbietową stronę małżowiny usznej za pomocą dwóch par pęsety i umieść wnętrze ucha skierowaną w dół do dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mg / ml kolagenazy D i 80 U / ml DNazy rozcieńczonej w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) (zawierającym Ca2+ i Mg2+). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przeciśnij strawioną tkankę przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 70 μm.
  2. Utwórz zawiesiny pojedynczych komórek z LN: umieść LN w studzienkach 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mg / ml kolagenazy D i 80 U / ml DNazy rozcieńczonej w HBSS. Otworzyć torebkę węzłów chłonnych za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 29G, a następnie inkubować węzły chłonne w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przeciśnij strawioną tkankę przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 70 μm.

6. Śródskórna implantacja guza czerniaka i fotokonwersja.

  1. Ogol futro od środka grzbietu myszy Kaede-Tg za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
  2. Umieść igłę o rozmiarze 29 G na środku pleców między lewą i prawą górną łopatką i śródskórnie wstrzyknij 5 x 105 komórek nowotworowych (rozcieńczonych w 50 μl soli fizjologicznej) w skórę myszy Kaede-Tg. Guzy muszą być starannie ustawione, aby zapewnić drenaż limfatyczny do określonych węzłów chłonnych (tj. LN lewej i prawej ramienia w przypadku guzów umieszczonych pośrodku górnej części pleców). Unikaj umieszczania guza powyżej dLN, ponieważ może to spowodować bezpośrednią fotokonwersję LN przez skórę/guz
    3. .
  3. Pozwól guzom urosnąć do pożądanego rozmiaru (100-650 mm3).
  4. Na jeden dzień przed pobraniem tkanek znieczulić mysz Kaede-Tg zgodnie z opisem w ppkt 2.1 i ogolić nowo odrastającą sierść wokół guza.
  5. Wytnij okrągły otwór w folii aluminiowej i przeciągnij guz, aby wystawić guz na działanie źródła światła. Wytnij otwór nieco mniejszy niż guz, aby zapobiec cofaniu się guza przez otwór i zminimalizować konwersję sąsiedniej, nienowotworowej skóry.
  6. Umieść guz bezpośrednio pod źródłem światła i fotokonwertuj przez 5 minut przy użyciu źródła światła 405 nm o mocy 200 mW.
  7. 24 godziny po fotokonwersji poddać myszy eutanazji zgodnie z opisem w kroku 1.3. Zbierz guzy, dLN ramienne i pachwinowe niedrenujące LN do PBS. Odetnij guzy od otaczającej skóry za pomocą nożyczek i usuń LN zgodnie z opisem w kroku 1.3.

7. Przetwarzanie guza i węzłów chłonnych w cytometrii przepływowej

  1. Stwórz zawiesiny pojedynczych komórek z guzów: zmiel guzy nożyczkami do studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mg / ml kolagenazy D i 80 U / ml DNazy rozcieńczonej w HBSS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przeciśnij strawioną tkankę przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm.
  2. Utwórz jednokomórkową zawiesinę węzłów chłonnych zgodnie z opisem w kroku 5.2.

8. Barwienie przeciwciał w cytometrii przepływowej

  1. Po strawieniu tkanek do zawiesin pojedynczych komórek należy wykonać standardowe techniki barwienia cytometrią przepływową, aby oznaczyć komórki interesującymi je markerami. Krótko odpipetować 2 x 106 komórek do płytki 96-dołkowej. Inkubować próbki z blokiem Fc (1 μg/ml) przez 20 minut na lodzie; przemyć dwukrotnie buforem FAC (1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS). Dodać żywą/martwą plamę (rozcieńczoną w PBS) do próbek i inkubować przez 15 minut na lodzie; przemyć dwukrotnie buforem FAC. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) rozcieńczonymi w buforze FAC przez 30 minut na lodzie; przemyć dwukrotnie buforem FAC.
    Uwaga: Fluorescencja zielona Kaede i czerwona Kaede nakłada się na fluorofory FITC i PE; w związku z tym przeciwciała sprzężone z FITC i PE nie mogą być stosowane w połączeniu z białkami Kaede.
  2. Po barwieniu należy uruchomić próbki na cytometrze przepływowym. Alternatywnie, utrwal komórki za pomocą 2% PFA.

9. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Ustaw napięcia PMT kanału FITC (zielony Kaede) i PE (czerwony Kaede) na 70-80% całkowitego zakresu (populacja środkowa na około 104) za pomocą jednokolorowych splenocytów w kolorze zielonym Kaede ex vivo lub jednokolorowych splenocytów Kaede lub krwi.
    Uwaga: Nie należy kompensować kanałów zielonego Kaede (FITC) i czerwonego Kaede (PE), ponieważ spowoduje to większe rozproszenie sygnału.
    1. Aby utworzyć jednokolorowe kontrolki Kaede, pobierz śledzionę lub krew od myszy Kaede-Tg. Lizować czerwone krwinki za pomocą buforu ACK, a następnie podzielić komórki na dwie grupy: nieprzekształconą zieloną Kaede i przekształconą czerwoną Kaede.
    2. W przypadku jednokolorowych czerwonych kontrolek Kaede zawieś komórki w 1 ml PBS i fotokonwertuj na 24-dołkowej płytce na 5 minut przy użyciu źródeł światła o długości fali 405 nm o mocy 100 mW. Użyj tych komórek, aby ustawić zielone napięcia PMT Kaede (FITC) i czerwone Kaede na cytometrze przepływowym (krok 9.1).
  2. Po ustawieniu napięć dla białek Kaede, skompensuj wszystkie inne pierwotne barwienia przeciwciał za pomocą kulek kompensacyjnych znakowanych pojedynczym fluoroforem zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym, aby zebrać dane.
    Uwaga: Białko Kaede jest stale wytwarzane przez komórki. Oznacza to, że 24 godziny po fotokonwersji przekształcone komórki będą podwójnie dodatnie dla zieleni Kaede i czerwieni Kaede, ponieważ nowo zsyntetyzowane białko Kaede (zielone) zgromadziło się w komórce.
  4. Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo lub podobnego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszej kolejności podjęto próbę powtórzenia wyników fotokonwersji opublikowanych w literaturze, aby ocenić wydajność procesu i określić towarzyszący mu stan zapalny w skórze myszy. Małżowinę uszną eksponowano na fioletowe światło o mocy 100 mW (405 nm) przez 3 min, zgodnie z wcześniejszym opisem33. Zawiesiny pojedynczych komórek uzyskane ze skóry ucha lub szyjnych dLN bezpośrednio po ekspozycji wykazały 78% wydajność konwersji wszystkich leukocytów CD45+<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż wydostawanie się leukocytów z obwodowych, nielimfatycznych tkanek ma kluczowe znaczenie dla inicjacji i ustąpienia odpowiedzi immunologicznej, mechanizmy molekularne rządzące wyjściem są słabo poznane. Ta luka w wiedzy wynika w dużej mierze z łatwej dostępności narzędzi do oznaczania ilościowego in vivo. W tym miejscu opisujemy zastosowanie myszy fotokonwertowalnych (Kaede-Tg) do ilościowego określenia endogennego wydostania się leukocytów ze skóry i guzów oraz zapewniamy bezpośrednie porównanie head-to-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Marcusowi Bosenbergowi za dostarczenie linii YUMM 1.1 i YUMM 1.7 mysiego czerniaka oraz dr Deborah J. Fowell za dostarczenie witaminy B6. Myszy Cg-Tg(CAG-tdKaede)15Utr w porozumieniu z RIKEN BRC za pośrednictwem National Bio-Resource of MEXT, Japonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B źródło światła ze światłowodem i kolimtoremPrizmatix LtdV8144
Izomer izotiocyjanianu fluoresceiny ISigma-AldrichF4274
ftalan dibutyluSigma-Aldrich524980
acetonMacron Fine Chemicals2440-02
29-częściowe strzykawkiExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um sitka komórkoweVWR732-2758
paraformaldehydSigma-AldrichP6148
HBSS KesonHBL06
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy Aqua Dead Cell StainKit InvitrogenL34966
Oczyszczony anty-mysz CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (klon N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (klon M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (klon 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (klon 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (klon 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (klon 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (klon HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (klon BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (klon 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (klon M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (klon 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (klon RM4-5)BD Biosciences563726
Albumina surowicy bydlęcej (frakcja V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat i anty-chomik Igk / Zestaw cząstek kompensacji kontroli negatywnejBD Biosciences552845
Cytometr przepływowy FortessaBD Biosciences
FlowJo v10 OprogramowanieFlowJo

Bibliografia

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139(2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626(2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433(2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613(2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135(2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253(2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030(2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika fotokonwersjianaliza cytometrycznatransgeniczna mysz Kaedemysie guzy skórytrawienie kolagenazą Dświatło o długości fali 405 nanometrówzawiesiny pojedynczych komórekdrenujące węzły chłonne
Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.