Artykuł metodologiczny

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

DOI:

10.3791/58709

⸱

10 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary, 4Department of Clinical Neurosciences, Cumming School of Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ekspresji genów pojedynczej komórki w tysiącach pojedynczych komórek w tkance lub mikrośrodowisku jest cennym narzędziem do identyfikacji składu komórki, dyskryminacji stanów funkcjonalnych i szlaków molekularnych leżących u podstaw obserwowanych funkcji tkanek i zachowań zwierząt. Jednak izolacja nienaruszonych, zdrowych pojedynczych komórek z tkanek dorosłych ssaków w celu późniejszej analizy molekularnej pojedynczych komórek może być wyzwaniem. Protokół ten opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do uzyskania wysokiej jakości preparatów dorosłych pojedynczych komórek z układu nerwowego lub skóry, które umożliwiły późniejsze bezstronne sekwencjonowanie i analizę RNA pojedynczej komórki. Zapewniono również wytyczne dotyczące dalszej analizy bioinformatycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rozwojem technologii pojedynczych komórek o wysokiej przepustowości1,2 oraz postępom w przyjaznych dla użytkownika narzędziach bioinformatycznych w ciągu ostatniej dekady3, pojawiła się nowa dziedzina analizy ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości - sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq). Badanie ekspresji genów w pojedynczej komórce zostało po raz pierwszy opracowane w celu zidentyfikowania heterogeniczności w określonych populacjach komórek, takich jak komórki macierzyste lub komórki rakowe, lub w celu zidentyfikowania rzadkich populacji komórek4,5, które były nieosiągalne przy użyciu tradycyjnych technik sekwencjonowania masowego RNA. Narzędzia bioinformatyczne umożliwiły identyfikację nowych subpopulacji (Seurat)2, wizualizację kolejności komórek w przestrzeni psuedotime (Monocle)6, definicję aktywnych sieci sygnalizacyjnych w obrębie lub między populacjami (SCENIC)7, przewidywanie montażu pojedynczych komórek w sztucznej przestrzeni 3D (Seurat i inne)8. Dzięki tym nowym i ekscytującym analizom dostępnym dla społeczności naukowej, scRNA-Seq szybko staje się nowym standardowym podejściem do analizy ekspresji genów.

Pomimo ogromnego potencjału scRNA-Seq, umiejętności techniczne wymagane do stworzenia czystego zbioru danych i dokładnej interpretacji wyników mogą stanowić wyzwanie dla nowicjuszy. W tym miejscu przedstawiono podstawowy, ale kompleksowy protokół, począwszy od izolacji pojedynczych komórek z całych tkanek pierwotnych, a skończywszy na wizualizacji i prezentacji danych do publikacji (Rysunek 1). Po pierwsze, izolacja zdrowych pojedynczych komórek może być uznana za trudną, ponieważ różne tkanki różnią się stopniem wrażliwości na trawienie enzymatyczne i późniejszą dysocjację mechaniczną. Protokół ten zawiera wskazówki dotyczące tych etapów izolacji i identyfikuje ważne punkty kontrolne kontroli jakości w całym procesie. Po drugie, zrozumienie kompatybilności i wymagań między technologią pojedynczych komórek a sekwencjonowaniem nowej generacji może być mylące. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące wdrożenia przyjaznej dla użytkownika, opartej na kropelkach platformy kodów kreskowych z pojedynczymi komórkami i wykonywania sekwencjonowania. Wreszcie, programowanie komputerowe jest ważnym warunkiem wstępnym do analizy zbiorów danych transkryptomicznych pojedynczych komórek. Ten protokół zawiera zasoby umożliwiające rozpoczęcie pracy z językiem programowania R i zawiera wskazówki dotyczące implementowania dwóch popularnych pakietów języka R specyficznych dla scRNA-Seq. Razem protokół ten może pomóc nowicjuszom w przeprowadzaniu analizy scRNA-Seq w celu uzyskania jasnych, możliwych do zinterpretowania wyników. Protokół ten można dostosować do większości tkanek myszy i, co ważne, można go zmodyfikować do stosowania z innymi organizmami, w tym z tkankami ludzkimi. Wymagane będą korekty w zależności od tkanki i użytkownika.

Jest kilka kwestii, o których należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu; w tym, 1) Zaleca się przestrzeganie wszystkich wytycznych dotyczących kontroli jakości w krokach 1 i 2 niniejszego protokołu, aby zapewnić żywotną zawiesinę wszystkich komórek w badanej próbie, zapewniając jednocześnie dokładną całkowitą liczbę komórek (podsumowane w Rysunek 2). Gdy zostanie to osiągnięte i jeśli wszystkie zoptymalizowane warunki zostaną spełnione, etapy kontroli jakości mogą zostać porzucone (w celu zaoszczędzenia czasu - zachowania jakości RNA i zmniejszenia utraty komórek). Potwierdzenie pomyślnej izolacji pojedynczych komórek o wysokiej żywotności z tkanki będącej przedmiotem zainteresowania jest wysoce zalecane przed jakimkolwiek dalszym przetwarzaniem. 2) Ponieważ niektóre typy komórek są bardziej wrażliwe na stres niż inne, nadmierne techniki dysocjacji mogą nieumyślnie zniekształcić populację, zakłócając w ten sposób dalszą analizę. Delikatna dysocjacja bez zbędnego ścinania i trawienia komórek ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności komórkowej i dokładnego odwzorowania składu tkankowego. Siły ścinające występują podczas etapów rozcierania, FACS i ponownego zawieszenia. 3) Podobnie jak w przypadku każdej pracy z RNA, najlepiej jest wprowadzić jak najmniej dodatkowej RNazy do próbki podczas przygotowania. Pomoże to utrzymać wysoką jakość RNA. Używaj roztworów inhibitorów rybonukleazy z płukaniem do czyszczenia narzędzi i wszelkiego sprzętu, który nie jest wolny od RNazy, ale unikaj produktów poddanych działaniu DEPC. 4) Wykonaj przygotowania tak szybko, jak to możliwe. Pomoże to utrzymać wysokiej jakości RNA i zmniejszyć śmierć komórki. W zależności od długości sekcji tkanek i liczby zwierząt, rozważ rozpoczęcie wielu sekcji/przygotowań w tym samym czasie. 5) Przygotuj komórki na lodzie, jeśli to możliwe, aby utrzymać wysoką jakość RNA, zmniejszyć śmierć komórki oraz spowolnić sygnalizację komórkową i aktywność transkrypcyjną. Chociaż przetwarzanie na zimno jest idealne dla większości typów komórek, niektóre typy komórek (np. neutrofile) działają lepiej, gdy są przetwarzane w temperaturze pokojowej. 6) Unikaj produktów poddanych działaniu wapnia, magnezu, EDTA i DEPC podczas przygotowywania komórek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj protokoły są zgodne i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Calgary.

1. Tkanka dysocjująca (Dzień 1)

  1. Poddaj myszy eutanazji z przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (i.p., 50 mg / kg) lub, w stosownych przypadkach, zgodnie z protokołem etyki zwierząt. Następnie usuń niechciane włosy z grzbietu i nóg myszy i wysterylizuj obszar rozwarstwienia
    2. etanolem.
  2. Przeanalizuj interesującą Cię tkankę lub mikrośrodowisko. W tym protokole wykorzystujemy tkanki skóry i nerwowe, aby zademonstrować możliwość uogólnienia transkryptomiki pojedynczej komórki opartej na kropelkowym kodowaniu kreskowym po dysocjacji tkanek dorosłych.
    1. W przypadku nerwu kulszowego użyj szczegółowego protokołu znalezionego w Stratton i wsp.9. Krótko mówiąc, odetnij skórę od tylnej części grzbietu/nóg myszy. Wykonaj nacięcie wzdłuż uda za pomocą sterylnego ostrza skalpela. Użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby odsłonić i usunąć nerw kulszowy.
    2. W przypadku skóry pleców skorzystaj ze szczegółowego protokołu znalezionego w Biernaskie i wsp.10. Pokrótce przeanalizuj skórę grzbietu, wykonując nacięcia od ramienia do ramienia, w poprzek zadu i w dół grzbietu, używając cienkich kleszczy i nożyczek. Skórę pokroić w cienkie plastry (o grubości 0,5 cm) za pomocą sterylnego ostrza skalpela.
  3. Umyj tkankę 2 razy lodowatym HBSS i usuń niechcianą tkankę łączną, złogi tłuszczu lub zanieczyszczenia pod mikroskopem preparacyjnym.
    1. Tylko w przypadku skóry właściwej należy umieścić plastry w dyspazie (5 mg/ml, 5 U/ml) w HBSS przez 30 - 40 minut w temperaturze 37 °C. Chirurgicznie oddzielić naskórek od skóry właściwej. Odrzuć naskórek lub dalej dysocjuj za pomocą trypsyny, jeśli jesteś zainteresowany.
  4. Zmielić próbkę na kawałki o średnicy 1-2 mm za pomocą sterylnych ostrzy skalpela i umieścić w świeżo rozmrożonym 2 mg/ml zimnego enzymu kolagenazy-IV (2 mg/ml, 125 CDU/mg, w pożywce F12).
    1. Na nerw użyj ~500 μL na 2x nerwy kulszowe. Na skórę użyj ~8 ml na 1x skórkę pleców myszy.
      UWAGA: Tkanki powinny być całkowicie zanurzone w roztworze kolagenazy dożylnej. Bardzo ważne jest, aby wszelkie enzymy trawienne były odpowiednio traktowane, przechowywane i przygotowywane. Jeśli enzymy są pozostawione w temperaturze pokojowej przez długi czas, izolacja pojedynczej komórki będzie wymagała nadmiernego mechanicznego rozcierania i zmniejszy żywotność komórek. Kolagenaza IV może być również wytwarzana w pożywkach do hodowli komórkowych, gdzie żywotność komórek jest najbardziej optymalna. Może to jednak zmienić aktywność enzymu lub sygnaturę transkrypcyjną, więc powinien być zoptymalizowany przez użytkownika.
  5. Inkubować próbkę w enzymie w łaźni o temperaturze 37 °C przez 30 minut, delikatnie wstrząsając co 10 minut. Odpowiednią alternatywą jest również wytrząsarka umieszczona w temperaturze 37 °C.
  6. Rozcierać pipetorem P1000 20-30 razy po 30 minutach dodawania enzymu.
  7. Powtarzaj rozcieranie co 30 minut, aż roztwór stanie się mętny, a kawałki tkanki w dużej mierze zdysocjowane.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są w pełni uwolnione (Rysunek 2b, 2c). Aby potwierdzić pełne uwolnienie, umieść komórki na płytce z Nuc Blue (2 krople na 1 ml), a po 20 minutach sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie jądra są związane z pojedynczymi komórkami, a nie z gruzami. Bardzo ważne jest sprawdzenie stopnia uwolnienia komórek w danym eksperymencie dla każdego typu tkanki lub stanu. W tkance zwłóknieniowej (tj. Urazie przewlekłym) lub nieuszkodzonej tkance dorosłej uwalnianie komórek będzie się znacznie różnić od ostrego urazu lub tkanki embrionalnej. Jest to szczególnie ważne, ponieważ niektóre typy komórek są mniej podatne na uwolnienie z tkanki niż inne, co preferencyjnie wyklucza te komórki z dalszej analizy.
    1. W przypadku nerwu oddziel tkankę na łącznie 0,5-1,5 godziny. W przypadku skóry należy zdysocjować tkankę na łącznie 2 godziny (w ostatniej godzinie inkubacji dodać DNazę (1 mg/ml) do próbki skóry).
  8. Przefiltruj dwukrotnie za pomocą filtra 40 μm. Wypłucz filtr lodowatym 1% BSA/HBSS.
  9. Wirować przy 260 x g przez 8 min. Następnie usuń supernatant.
    1. Ponownie zawiesić osad komórkowy w HBSS zawierającym 1% BSA za pomocą końcówki o szerokim otworze i umieścić na lodzie. Objętość zawiesiny opiera się na objętości tkanki (800 mg mokrej masy dla skóry = 800 μl objętości; 10 mg mokrej masy dla nerwów = 100 μl objętości).
    2. Opcjonalnie zacznij od małej objętości zawiesiny, a następnie dostosuj w razie potrzeby w oparciu o natężenie przepływu (zdarzenia na sekundę) w sortowniku FACS. Najbardziej efektywna gęstość sortowania (maksymalizacja liczby zebranych komórek przy minimalizacji czasu) dla kolekcji wynosi 3 000–7 000 zdarzeń na sekundę.
  10. Jeśli używasz barwnika żywotności, wyjmij podwielokrotność, aby uzyskać niebarwioną kontrolę. Następnie dodaj barwnik o żywotności 1:15 000 (zapas: 20 000 nM/μL) do próbki (stężenie końcowe 1,3 nM/μL) za pomocą końcówki o szerokim otworze, aby zmniejszyć ścinanie.
    UWAGA: Bardzo ważne jest sprawdzenie stopnia śmierci komórki w danym eksperymencie dla każdego typu tkanki lub stanu. Niektóre typy komórek w próbce są bardziej narażone na śmierć niż inne, dlatego są preferencyjnie wykluczone z dalszej analizy.
    1. Inkubować próbkę z barwnikiem żywotności przez 5-10 minut na lodzie w ciemności. Następnie dodać 4 ml lodowatego 1% BSA/HBSS do próbki. Wirować przy 260 x g przez 8 minut, aby usunąć nadmiar barwnika żywotności. W ten sam sposób należy traktować podwielokrotność bez żywotności, barwnik niebarwioną.

2. Izolowanie żywotnych i zdrowych komórek (Dzień 1)

  1. Upewnij się, że obiekt FACS spełnia odpowiednie parametry sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
    1. Przygotuj maszynę FACS z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że jest gotowa po zakończeniu ostatniej wirówki w kroku 1 i upewnij się, że komora zbiorcza jest utrzymywana w niskiej temperaturze za pomocą bloków lodu.
    2. Użyj następujących parametrów: Natężenie przepływu: 1,0 (odpowiada w przybliżeniu 10 μl/min); Filtr: 1,5 ND; Rozmiar dyszy: 100 μm; Rozproszenie do przodu: 80 - 180 V (zmiana w razie potrzeby w celu rozróżnienia wielkości zdarzeń); Rozproszenie boczne: 150 - 220 V (zmiana w razie potrzeby w celu rozróżnienia ziarnistości/kształtu zdarzeń); Laser: 100 - 400 V (zmień w razie potrzeby, aby odróżnić pozytywne i negatywne zdarzenia barwnika żywotności i sprawdzić to z kontrolą barwnika bez żywotności); Bramki: Zmień w razie potrzeby, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. Zobacz Rysunek 2d-2g.
      UWAGA: Parametry FACS są w dużym stopniu zależne od typów komórek i zastosowanego sortera i dlatego muszą być zoptymalizowane przez użytkownika.
  2. Przygotuj 15 ml probówek z wąskim dnem z 8 ml lodowatego 1% BSA/HBSS do pobierania próbek. Ładunki elektrostatyczne wewnątrz rurki i napięcie powierzchniowe mogą wpływać na skuteczność zbierania. Odwróć probówki przed pobraniem, aby upewnić się, że powierzchnia cieczy a wnętrze probówki jest wilgotna.
    UWAGA: Jeśli pracujesz z bardzo małą liczbą komórek, dostosuj do potrzeb małego naczynia zbiorczego.
  3. Po zebraniu wszystkich komórek odwirować próbkę o masie 260 x g przez 8 min.
    UWAGA: Przed odwirowaniem dodaj 1% BSA/HBSS, aby umyć/zepchnąć komórki z bocznej powierzchni i odwrócić/wymieszać probówkę natychmiast po FACS.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 1% BSA/HBSS i trzymać na lodzie. Maksymalna objętość na próbkę, która jest zgodna z procesem Kroku 3, wynosi 33,8 μl, dlatego upewnij się, że końcowa objętość rozcieńczenia/ponownego zawieszenia komórek jest odpowiednia, aby uzyskać idealną liczbę komórek w 33,8 μl. Inne opcje pożywek rozcieńczających na tym etapie (i wszystkie poprzednie rozcieńczenia w 1% BSA/HBSS) obejmują DMEM i do 40% surowicy, ale należy unikać odczynników zawierających wapń, magnez lub EDTA.
    1. Pozostaw komórki na lodzie na minimalny czas. Idealnie byłoby, gdyby współpracownik przygotował cały sprzęt i odczynniki do następnego kroku (Krok 3) podczas końcowych kroków Kroku 2.
  5. Krytyczne kontrole przygotowania komórek
    1. Potwierdź oszacowanie liczby komórek uzyskanych z FACS. W zależności od rodzaju tkanki i długości dysocjacji, szczątki i komórki mogą być bardzo podobne pod względem wielkości i kształtu. W związku z tym, o ile nie zostanie użyty reporter fluorescencyjny, FACS nie może wykluczyć wszystkich zanieczyszczeń. Zaleca się, aby po pobraniu FACS przeprowadzono końcowe zliczanie komórek, aby zrozumieć, jaki procent zdarzeń (zgodnie z FACS) to w rzeczywistości komórki dla danego preparatu (Rysunek 2g). Przeprowadź zliczanie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (powtórz dwukrotnie) i oblicz procent żywych komórek, który jest reprezentowany przez całkowitą liczbę zdarzeń zebranych zgodnie z maszyną FACS.
    2. Zweryfikuj przygotowanie komórek. Sprawdź, czy nie ma dużych cząstek (>100 μm), ponieważ mogą one zatkać sprzęt w dalszych etapach. Nieodpowiednie usuwanie zanieczyszczeń może grozić zatkaniem jednokomórkowego chipa mikroprzepływowego. Pozostałe komórki należy pokryć kolorem Nuc Blue (jak powyżej), aby upewnić się, że nie ma dużych fragmentów zanieczyszczeń. Pozwoli to również na potwierdzenie, że komórki są pojedyncze (tj. nie sklejają się ze sobą), co da pewność, że dalsza analiza genetyczna pojedynczych komórek reprezentuje pojedyncze komórki, a nie wiele komórek.
    3. Zdecyduj o liczbie komórek do sekwencjonowania: Istnieje duży zakres liczb komórek pochodzących z tkanek dorosłych na próbkę, które można załadować do systemu z maksymalnie 8 próbkami, które można uruchomić jednocześnie. Autorzy załadowali od 500 do 50 000 komórek na próbkę i uzyskali dobrej jakości zestawy danych scRNA-Seq. Więcej dyskusji na temat najbardziej odpowiednich numerów komórek do załadowania można znaleźć w sekcji Dyskusja. Ostateczny wynik sekwencjonowanej liczby komórek zależy w dużym stopniu od jakości izolowanych pojedynczych komórek. Załadowanie 10 000 dorosłych komórek pochodzących z tkanek może zwrócić od 1 000 do 4 000 zsekwencjonowanych komórek (10 - 40% zwrotu). Jeśli interesuje Cię sekwencjonowanie dużej liczby komórek (~10 000 komórek, maksymalna liczba zalecana dla tego systemu), wymagane będzie załadowanie 25 000 - 100 000 komórek.

3. Generowanie GEM (kulka żelowa w emulsji) i kodowanie kreskowe (dzień 1)

UWAGA: Kroki 3-6 tego protokołu są przeznaczone do użycia w połączeniu z najpopularniejszą platformą jednokomórkową opartą na mikrokropelkach, wyprodukowaną przez 10X Genomics. Szczegółowe wytyczne dotyczące kroków 3 i 4 są przedstawione w protokole producenta (patrz protokół Chromium Single Cell 3')11,12 i muszą być przestrzegane w połączeniu z tym protokołem. Aby uzyskać najlepsze wyniki, Krok 3 musi zostać zakończony natychmiast po etapach dysocjacji (Krok 1) i izolacji komórek (Krok 2) w dniu 1 tego protokołu.

  1. Przygotuj chip zgodnie z protokołem producenta 11,12. Ta oparta na mikrokropelkach platforma jednokomórkowa wykorzystuje technologię, która próbkuje ~ 750 000 kodów kreskowych w celu oddzielnego indeksowania transkryptomu każdej komórki. Osiąga się to poprzez podzielenie komórek na kulki żelowe w EMulsions (GEMs), w których wygenerowane cDNA ma wspólny kod kreskowy. Podczas generowania GEM komórki są dostarczane w taki sposób, że większość (90 - 99%) wygenerowanych GEM nie zawiera żadnych komórek, podczas gdy pozostała część w większości zawiera pojedynczą komórkę.
    1. Umieść chip w uchwycie na wióry.
    2. Przygotować główną mieszankę komórkową na lodzie.
    3. Dodać 50% glicerolu do nieużywanych studzienek i dodać 90 μl głównej mieszanki komórkowej do studzienki 1, 90 μl kulek żelowych do studzienki 2 i 270 μl oleju rozdzielającego do studzienki 3.
    4. Przykryj chip uszczelką.
  2. Załaduj chip i uruchom w kontrolerze jednokomórkowym.
    1. Wysuń tacę, umieść chip w tacy, wsuń tacę i naciśnij przycisk Odtwórz. Pojedyncza komórka 3' żelowa kulka w GEM zawiera startery zawierające częściową sekwencję Illumina R1 (czytaj 1 starter sekwencjonowania), 16 nukleotydów (nt) 10x kod kreskowy, 10 nt Unikalny identyfikator molekularny (UMI) i sekwencję startera poly-dT. Podczas pracy kulki żelu w sterowniku są uwalniane i mieszane z lizatem komórkowym i mieszanką główną.
    2. Zebrać 100 μl próbki i umieścić w probówce do PCR.
    3. Umieść probówki PCR w wstępnie ustawionej maszynie do PCR i uruchom PCR zgodnie z zestawem. Po inkubacji, GEM-y będą zawierały pełnowymiarowe, oznaczone kodem kreskowym cDNA z poli-adenylowanego mRNA.
  3. Po zakończeniu biegu umieść w temperaturze -20 °C na noc przez okres do 1 tygodnia przed przejściem do następnego etapu.

4. Sprzątanie, wzmacnianie, budowa biblioteki i kwantyfikacja biblioteki (od dnia 2)

UWAGA: Szczegółowe wytyczne dla Kroków 4 są przedstawione w protokole producenta 11,12 i muszą być przestrzegane w połączeniu z tym protokołem.

  1. Użyj silanowych kulek magnetycznych, aby usunąć resztki odczynników/starterów biochemicznych z mieszaniny reakcyjnej GEM.
  2. Amplifikacja pełnowymiarowego, oznaczonego kodem kreskowym cDNA w celu wygenerowania masy wystarczającej do budowy biblioteki.
  3. Oceń wydajność DNA. Przed budową biblioteki należy ocenić wydajność DNA próbki. Pozwoli to określić, ile cykli należy użyć w dalszym kroku PCR (Sample Index PCR podczas budowy biblioteki). W zależności od zawartości RNA w danej próbce, która może się różnić w zależności od stanów aktywacji (np. kontrolny vs uszkodzony itp.), typu komórki i wydajności komórki, zalecana liczba cyklu może ulec zmianie.
    1. W przypadku sekwencjonowania ~ 3,000 komórek pochodzących z tkanek (nieistotnych dla stanów aktywacji), autorzy odkryli, że 14 cykli (próbki: ~10 - 100 ng DNA) jest standardem.
    2. Użyj bioanalizatora do analizy DNA. Zapoznaj się z Podręcznikiem użytkownika13.
  4. Fragmentuj próbkę i wybierz rozmiar DNA. Przed budową biblioteki należy zastosować protokoły fragmentacji enzymatycznej i wyboru wielkości, aby uzyskać odpowiedni rozmiar amplikonu cDNA.
  5. Przygotuj próbkę do budowy biblioteki. Podczas gdy R1 (czytaj 1 sekwencja startera) jest dodawany do cząsteczek podczas inkubacji GEM; P5, P7 (indeks próbki) i R2 (odczyt sekwencji starterów 2) są dodawane podczas budowy biblioteki.
  6. Oceń wydajność DNA. Większość urządzeń do sekwencjonowania wymaga przedłożenia ostatecznych bibliotek, które zawierają informacje o wydajności i jakości DNA. W związku z tym należy uruchomić bioanalizator po zakończeniu całego protokołu i przed transportem do zakładu sekwencjonowania.
  7. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 2 miesięcy.
  8. Przed sekwencjonowaniem należy określić ilościowo próbki za pomocą zestawu do kwantyfikacji DNA. Można to zrobić w zakładzie sekwencjonowania.

5. Sekwencjonowanie biblioteki (od dnia 3)

UWAGA: Platforma kodowania kreskowego transkryptomu pojedynczej komórki używana w tym protokole generuje kompatybilne z Illumina biblioteki parowanych końców, zaczynające się i kończące sekwencjami P5 i P7. Chociaż minimalna głębokość potrzebna do rozpoznania tożsamości typu komórki może wynosić zaledwie 10 000–50 000 odczytów/komórka15,16, zaleca się ~100 000 odczytów/komórkę jako optymalny kompromis w zakresie kosztów dla dorosłych komórek in vivo (pamiętając, że niektóre typy komórek lub minimalnie aktywowane stany komórek osiągną nasycenie przy 30 000-50 000 odczytów/komórkę).

  1. Transport bibliotek cDNA na suchym lodzie do zakładu sekwencjonowania wyposażonego w odpowiedni sekwenator Illumina.
  2. Do zakładu sekwencjonowania należy dostarczyć następujące informacje:
    1. Podaj szczegółowe informacje o próbce: identyfikatory indeksu próbki odpowiadające każdej bibliotece; gatunek; genomiczna baza danych dla pierwotnego zestawu (tj. GRCm38 dla myszy); elektroferogram pokazujący rozmiary fragmentów z bioanalizatora (od 200 do 9 000 pz); stężenie cDNA (ng/μL) i całkowite stężenie w bibliotece (całkowita wydajność mieści się w zakresie 200 – 1400 ng); objętość (μL) próbki.
    2. Poproś o sekwencjonowanie: Określ ilościowo próbki za pomocą zestawu do kwantyfikacji DNA; typ adaptera/indeksu (TruSeq DNA); typ płytki (Eppendorf twin.tec, Full Skirt - zalecany dla DNA); technologia sekwencjonowania/typ biblioteki (10x, pełne instrukcje sekwencjonowania i zalecenia dotyczące cyklu)17.
  3. Uruchom płytkie sekwencjonowanie (opcjonalnie): Badania analizujące wiele próbek biologicznych skorzystają z łączenia próbek (agregacji) w celu wygenerowania pojedynczej macierzy kodu kreskowego genu zawierającej dane ze wszystkich próbek. Aby zminimalizować efekty wsadowe między próbkami podczas łączenia, głębokość odczytu między różnymi bibliotekami powinna być ustandaryzowana. Aby to zrobić, konieczne jest dokładne przybliżenie liczby pojedynczych komórek. Sekwencer MiSeq pozwoli na płytkie sekwencjonowanie i jest opłacalnym, praktycznym sposobem na uzyskanie dokładnych szacunków komórek.
    UWAGA: Jeden przebieg przy użyciu sekwensera MiSeq SR50 zapewnia wystarczające pokrycie, aby dokładnie oszacować około 20 000 komórek. Ten przebieg pozwoli w przybliżeniu określić liczbę odzyskanych UMI dla każdego unikalnego kodu kreskowego. W Rysunek 3a, pokazany jest nagłówek przykładowego (Próbka 1.6) wyjścia (.csv), z listą kodów kreskowych i odpowiadających im liczb UMI zgodnie z pewnie zmapowanymi odczytami.
    1. Skonsultuj się z bioinformatykiem, aby zapoznać się z językiem programowania R. Więcej informacji można znaleźć w samouczkach DataCamp18.
    2. Oceń surowe dane uzyskane z sekwencera przy użyciu dostarczonego skryptu języka R jako szablonu19. Surowe dane odnoszą się do liczby UMI zmapowanych do każdego unikalnego kodu kreskowego komórki. Skrypt odczytuje plik .csv, w którym pierwsza kolumna to lista kodów kreskowych, a druga kolumna to odpowiadające jej liczby UMI. Ten skrypt dostarczy wykres (Rysunek 3b), a także szacunkową liczbę komórek z kodami kreskowymi w każdej próbce. Dostosuj skrypt, aby upewnić się, że wprowadzona liczba zliczeń UMI dla danej próbki znajduje się w jednej trzeciej punktu pierwszego stromego spadku. W Rysunek 3b, ten łokieć przypada na około 225 UMI, co odpowiada 3,480 komórkom z kodami kreskowymi.
    3. Porównywalne z sekwencjonowaniem o pełnej głębokości przy użyciu HiSeq (gdzie pomyślnie zsekwencjonowano 3 516 komórek, Rysunek 3c), płytkie szacunki sekwencjonowania przewidywały 3 480 komórek.
  4. Użyj przybliżeń odzyskiwania komórek (z kroku 5.3) lub skorzystaj z wykresu odzyskiwania znajdującego się w protokole producenta20, aby zaplanować rozkład pasów ruchu w celu głębszego sekwencjonowania. Każda próbka powinna mieć porównywalne pokrycie, więc jeśli płytkie sekwencjonowanie wykaże, że w każdej próbce znajdują się różne liczby komórek (co często ma miejsce), należy odpowiednio obliczyć rozkład pasów ruchu. Jedna komórka przepływowa HiSeq (która składa się z 8 linii) może sekwencjonować do 2,4 miliarda niestandardowych odczytów sparowanych końcówek. Przykładowa konfiguracja komórki przepływowej jest przedstawiona w Rysunek 3d.

6. Przetwarzanie odczytanych plików

UWAGA: Sekwencjonowanie pojedynczej komórki 3' Biblioteka przy użyciu tego protokołu generuje surowe dane w formacie binarnego wywołania podstawowego (BCL). Pakiet Cell Ranger służy do generowania tekstowych plików FASTQ z plików BCL, wykonywania dopasowań genomicznych i transkryptomicznych, zliczania genów, demultipleksowania i agregacji próbek. W tej sekcji przedstawiono kluczowe kroki, które umożliwiają użytkownikom pobieranie surowych danych BCL z zakładu sekwencjonowania i generowanie filtrowanych matryc genów i kodów kreskowych gotowych do dalszej bioinformatyki.

  1. Użyj scentralizowanego serwera do uruchomienia programu. Pliki BCL, pliki FASTQ i większość dalszych procesów bioinformatycznych wymaga znacznej mocy obliczeniowej.
  2. Pobierz wszystkie surowe pliki odczytu na serwer (lub pliki FASTQ, jeśli są dostępne).
    1. Skonsultuj się z administratorem serwera, aby skonfigurować konto na scentralizowanym serwerze lub klastrze i zapoznać się z Unix21.
    2. Użyj polecenia pobierania odpowiedniego dla systemu operacyjnego serwera, aby pobrać wszystkie pliki z serwera narzędzia sekwencjonowania.
      1. Większość funkcji sekwencjonowania udostępnia polecenie pobrania plików z bezpiecznej ścieżki, którą można uruchomić z wiersza poleceń (patrz przykład poniżej).
      2. Zastąp symbole zastępcze "" i "" w wierszu poleceń podanymi danymi uwierzytelniającymi.
        wget -O - "https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/ --no-cookies --no-check-certificate --post-data 'j_username=nazwa_użytkownika&j_password=hasło' | wget --no-cookies --no-check-certificate --post-data 'j_username=nazwa_użytkownika&j_password=hasło' -ci -
    3. Jeśli podana jest tylko bezwzględna ścieżka do plików (np. https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/), wstaw tę ścieżkę do polecenia pobierania.
  3. Rozpakuj pliki: Jeśli pobrane pliki kończą się rozszerzeniem ".gz", oznacza to, że zostały skompresowane za pomocą polecenia "gzip". Aby rozpakować, uruchom polecenie rozpakuj w wierszu poleceń (patrz przykład poniżej).
    Zamek błyskawiczny raw_read_files.gz
  4. Pobierz najnowszą wersję Cell Ranger na serwer jako samodzielną .tar22.
    1. Krytyczne: Przed pobraniem upewnij się, że system Linux spełnia minimalne wymagania23. Upewnij się, że masz co najmniej 8-rdzeniowy procesor Intel z 64 GB pamięci RAM i 1 TB wolnego miejsca na dysku.
      UWAGA: Cell Ranger zapewnia gotowe transkryptomy referencyjne dla ludzi i gryzoni. Można je modyfikować za pomocą komendy mkref cellranger do wykrywania genów takich jak GFP24.
  5. Generuj pliki FASTQ z podstawowych plików wywołań (BCL) sekwencera za pomocą komendy cellranger mkfastq.
    UWAGA: Program dostosuje surowe odczyty (z plików FASTQ) do genomu referencyjnego i wygeneruje matryce genowo-komórkowe do dalszej analizy. Wykorzystuje wyrównywacz STAR, który wykonuje wyrównanie odczytów z uwzględnieniem splicingu do genomu referencyjnego. Do zliczania UMI używane są tylko pewnie zmapowane odczyty (tj. odczyty zgodne z pojedynczą adnotacją genu).
    1. Na przykład, użyj komendy cellranger mkfastq:
      cellranger mkfastq --id=sample_name \
      --run=/ścieżka/do/próbki \
      --csv=csv_file_containing_lane_sample_index.csv
  6. Uruchom liczenie cellranger na plikach FASTQ wygenerowanych za pomocą mkfastq, aby wygenerować liczbę genów w pojedynczej komórce.
    1. Na przykład, użyj polecenia cellranger count:
      cellranger count --id=sample_name \
      --transcriptome=refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
      --fastqs=/absolute/ścieżka/do/fastq/files \
      --próbka=same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
      --localcores=30
  7. Agregacja wielu bibliotek (opcjonalnie): Aby połączyć próbki, połącz dane wyjściowe z cellranger za pomocą cellranger aggr. W ten sposób powstaje pojedyncza macierz kodu kreskowego genu zawierająca dane zebrane z wielu bibliotek. Przykładowe polecenie cellranger aggr:
    cellranger aggr --id=sample_name \
    --csv=csv_with_libraryID_&_path_to_molecule_h5.csv \
    --normalize=mapped
    UWAGA: Biblioteki mogą być agregowane przy użyciu trzech trybów normalizacji (mapowany, nieprzetworzony, brak). Mapowanie jest zalecane, ponieważ powoduje podpróbkowanie bibliotek o większej głębokości, dopóki wszystkie biblioteki nie będą miały równej głębokości sekwencjonowania25.
  8. W celu natychmiastowej wizualizacji/analizy danych, zaimportuj plik wyjściowy .cloupe (wygenerowany przy użyciu cellranger count lub cellranger aggr) do 10x Loupe Cell Browser26.

7. Zaawansowana analiza zestawów danych scRNA-Seq

UWAGA: Kompletną bazę narzędzi scRNA-Seq można znaleźć pod adresem scRNA-tools3,27. Poniżej znajduje się struktura grupowania komórek bez nadzoru przy użyciu Seurat2 i porządkowania pseudoczasowego za pomocą Monocle6. Mimo że większość tej pracy można wykonać na komputerze lokalnym, w poniższych krokach założono, że obliczenia zostaną wykonane przy użyciu serwera instytucjonalnego.

  1. Pobierz najnowszą wersję Minicondy na konto serwera za pomocą platformy Linux28.
  2. Zainstaluj najnowszą wersję języka R przy użyciu polecenia conda29.
  3. Wykreśl dane przy użyciu dostarczonego skryptu Seurat R jako szablonu30.
    UWAGA: Seurat to zestaw narzędzi oparty na R, który umożliwia kontrolę jakości, grupowanie, różnicową analizę ekspresji genów, identyfikację genów markerowych, redukcję wymiarowości i wizualizację danych scRNA-Seq. Obszerny opis kodowania Seurat i samouczki można znaleźć na stronie internetowej Satija Lab31.
  4. Wykreśl dane za pomocą dostarczonego skryptu Monocle R jako szablonu32.
    UWAGA: Monokl to kolejny zestaw narzędzi oparty na R, który umożliwia wizualizację zmian ekspresji w pseudoczasie i identyfikuje geny leżące u podstaw decyzji dotyczących losu komórki. Obszerny opis kodowania Monocle i samouczki można znaleźć na stronie internetowej Monocle33.
  5. Pakiety R, takie jak kBET, mogą być wykorzystywane do testowania i korygowania efektów wsadowych w wyniku łączenia zestawów danych34.

8. Zgłoszenia NCBI GEO i

UWAGA: Ponieważ łatwy dostęp do surowych plików sekwencjonowania zapewnia odtwarzalność i ponowną analizę, przed złożeniem manuskryptu zaleca się lub wymaga zgłoszenia do publicznie dostępnych repozytoriów online. National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) i Sequence Read Archive () są publicznie dostępnymi repozytoriami danych do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości35,36.

  1. Zarejestruj się, aby uzyskać dostęp do konta GEO submissioner NCBI37.
  2. Kompletne zgłoszenie GEO, które zawiera trzy komponenty skompilowane w katalogu/folderze (zatytułowanym jako nazwa użytkownika osoby przesyłającej GEO): 1) Rekord metadanych (jeden arkusz kalkulacyjny na zgłoszenie projektu); 2) Pliki danych surowych; 3) Przetwarzane pliki danych.
    1. Pobierz i wypełnij arkusz kalkulacyjny metadanych38. Poniższe publiczne zgłoszenie GEO może być używane jako przewodnik (GSE100320)39. Umieść arkusz kalkulacyjny w katalogu.
    2. Umieść w katalogu pliki danych surowych wygenerowane ze skryptu zliczającego cellranger dla wszystkich bibliotek
      3. .
    3. Umieść w katalogu przetworzone pliki danych (filtrowane pliki barcodes.tsv, genes.tsv i matrix.mtx) wygenerowane ze skryptu zliczającego cellranger dla wszystkich bibliotek.
  3. Użyj danych uwierzytelniających serwera FTP przesyłającego GEO, aby przesłać katalog zawierający wszystkie trzy komponenty. Dla użytkowników Linux/Unix: można użyć ncftp, lftp, ftp, sftp i ncftpput.
  4. Powiadom GEO o wszystkich transferach38.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Repertuar pakietów open source przeznaczonych do analizy zbiorów danych scRNA-Seq znacznie wzrósł40 przy czym większość tych pakietów korzysta z języków opartych na R3. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu dwóch z tych pakietów: oceny nienadzorowanego grupowania pojedynczych komórek na podstawie ekspresji genów oraz uporządkowania pojedynczych komórek wzdłuż trajektorii w celu rozwiązania problemu heterogeniczności komórek i dekonstrukcji procesów biologicznych.

Rysunek 4 ilustruje użycie Seurat do wstępnych kontroli jakości przetwarzania i dalszych analiz bioinformatycznych. Po pierwsze, filtracja i usunięcie komórek dewiacyjnych z analizy jest niezbędne do kontroli jakości. Dokonano tego za pomocą skrzypiec (Rysunek 4a) i wykresów punktowych (Rysunek 4b) w celu wizualizacji procentu genów mitochondrialnych, liczby genów (nGene) i liczby UMI (nUMI) w celu identyfikacji dubletów komórkowych i wartości odstających. Każda komórka z wyraźną liczbą odstających genów, UMI lub procentem genów mitochondrialnych została usunięta za pomocą funkcji FilterCells firmy Seurat. Ponieważ Seurat wykorzystuje wyniki analizy głównych składowych (PC) do grupowania komórek, określenie statystycznie istotnych PC do uwzględnienia jest krytycznym krokiem. Wykresy łokciowe (Rysunek 4c) zostały użyte do wyboru PC, w których wykluczono PC znajdujące się poza plateau osi "odchylenia standardowego PC". Rozdzielczość grupowania została również zmodyfikowana, wykazując, że liczba klastrów może być zmieniana, w zakresie od 0,4 (niska rozdzielczość prowadząca do mniejszej liczby klastrów komórek, Rysunek 4d) do 4 (wysoka rozdzielczość prowadząca do wyższych klastrów komórek, Rysunek 4e). W niskiej rozdzielczości jest prawdopodobne, że każdy klaster reprezentuje zdefiniowany typ komórki, podczas gdy w wysokiej rozdzielczości może to również reprezentować podtypy lub stany przejściowe populacji komórek. W tym przypadku ustawienia klastrów o niskiej rozdzielczości zostały wykorzystane do dalszej analizy map cieplnych wyrażeń (przy użyciu funkcji DoHeatmap Seurata) w celu zidentyfikowania najbardziej ekspresyjnych genów w danym klastrze (Rysunek 4f). W tym przypadku geny o najwyższej ekspresji zostały zidentyfikowane poprzez ocenę zróżnicowanej ekspresji w danym klastrze w porównaniu ze wszystkimi innymi klastrami łącznie, wykazując, że każdy klaster był jednoznacznie reprezentowany przez zdefiniowane geny. Dodatkowo, poszczególne geny kandydujące mogą być wizualizowane na wykresach tSNE za pomocą funkcji FeaturePlot Seurata (Rysunek 4g). Pozwoliło to na rozszyfrowanie, czy istnieją klastry reprezentujące makrofagi. Korzystając z FeaturePlot, odkryliśmy, że zarówno klaster 2, jak i 4 wyrażały Cd68 - marker panmakrofagów.

Pakiet Monocle został użyty do potwierdzenia klastrów komórkowych zidentyfikowanych w Seuracie oraz do budowy trajektorii komórek, czyli porządkowania pseudoczasowego, w celu podsumowania procesów biologicznych (Rysunek 5). Porządkowanie pseudoczasowe można zastosować do próbek, w przypadku których oczekuje się, że profile ekspresji pojedynczej komórki będą zgodne z biologicznym przebiegiem czasu. Komórki można uporządkować wzdłuż kontinuum pseudotemporalnego, aby rozwiązać stany pośrednie, punkty bifurkacji dwóch alternatywnych losów komórek i zidentyfikować sygnatury genów leżące u podstaw nabycia każdego losu. Po pierwsze, podobnie jak w przypadku filtracji Seurata, komórki niskiej jakości zostały usunięte tak, że dystrybucja mRNA we wszystkich komórkach była logarytmicznie normalna i mieściła się między górną a dolną granicą, jak określono w Rysunek 5a. Następnie, korzystając z nowej funkcji CellTypeHierarchy firmy Monocle, pojedyncze komórki zostały sklasyfikowane i policzone przy użyciu znanych genów markerów linii (Rysunek 5b, 5c). Na przykład komórki wykazujące ekspresję receptora PDGF alfa lub białka specyficznego dla fibroblastów 1 przypisano do typu komórki #1, aby stworzyć kryterium definiowania fibroblastów. Następnie ta populacja (typ komórki #1) została oceniona w celu rozszyfrowania trajektorii fibroblastów. W tym celu wykorzystano różnicową funkcję GeneTest firmy Monocle, która porównała komórki reprezentujące skrajne stany w populacji i znalazła geny różnicowe do uporządkowania pozostałych komórek w populacji (Rysunek 5d). Stosując różnorodne metody uczenia się (rodzaj nieliniowej redukcji wymiarowości) we wszystkich komórkach, przypisano współrzędną wzdłuż ścieżki pseudoczasowej. Trajektoria ta została następnie zwizualizowana przez stan komórki (Rysunek 5e) i pseudoczas (Rysunek 5f).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy. Etapy od przygotowania całego zwierzęcia, przez analizę zestawów danych RNA-Seq pojedynczej komórki, po przesłanie końcowych zestawów danych do publicznie dostępnego repozytorium. Kulki żelowe w emulsji (GEM) odnoszą się do kulek z oligonukleotydami z kodami kreskowymi, które otaczają tysiące pojedynczych komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Tworzenie żywotnej zawiesiny pojedynczej komórki z tkanki nerwowej. a) Rysunkowy przegląd kontroli jakości. (b) Komórki i szczątki z komórkami nadal wtopionymi w szczątki (czerwone strzałki). (c) Komórki uwolnione z gruzu (czerwone strzałki). d) Izolacja komórek za pomocą FACS. P0: frakcja gruzu; P1: frakcja komórkowa; P3: wyłączenie dupletów; P4: barwnik żywotności (Sytox Orange) frakcja ujemna. (e) Brak kontroli żywotności barwnika. (f) Obraz frakcji P0 reprezentującej izolowane szczątki. (g) Obraz frakcji P4 reprezentującej izolowane żywe komórki (czerwone strzałki). (b)(c)(f) i (g) miały barwnik jądrowy dodany 20 minut przed obrazowaniem. Podziałka skali: 80 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Płytkie sekwencjonowanie przewiduje liczbę odzyskanych komórek w próbkach przetwarzanych 10X. (a) Przykład (próbka 1.6) wygenerowanego przez MiSeq pliku csv z listą kodów kreskowych komórek i odpowiadających im liczb UMI określonych przez pewnie zmapowane odczyty. (b) Wykres rangi kodu kreskowego dla próbki 1.6 pokazuje jeden znaczący spadek liczby UMI w funkcji kodów kreskowych komórek. Linie przerywane i ciągłe reprezentują granicę między komórkami a tłem, zgodnie z oględzinami. (c) Kody kreskowe komórek zaobserwowane przy użyciu rurociągu Cell Ranger po HiSeq ujawniają, że płytkie sekwencjonowanie dokładnie przybliżyło liczbę komórek dla próbki 1.6. (d) Przykład konfiguracji komory przepływowej opartej na płytkim sekwencjonowaniu na podstawie oszacowań komórek. W przypadku próbki 1.6, ponieważ płytkie sekwencjonowanie przewidywało 3480 komórek, przypisano 1,17 linii, aby zapewnić pokrycie sekwencjonowania >100 000 odczytów na komórkę w HiSeq. Uwaga: Wszystkie pasy ruchu muszą sumować się do 100%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Kontrola jakości i bioinformatyka zestawu danych RNA-Seq dla pojedynczej komórki przy użyciu pakietu Seurat R. a) Wykresy wskaźników kontroli jakości, które obejmują liczbę genów, liczbę unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) oraz odsetek transkryptów odwzorowanych na genom mitochondrialny. (b) Przykładowe wykresy genowe wykrywające komórki z odchylonymi poziomami transkryptów mitochondrialnych i UMI. c) Wykres kolanka próbki stosowany do doraźnego wyznaczania statystycznie istotnych PC. Linie przerywane i przerywane reprezentują punkt odcięcia, w którym na wykresie pojawia się wyraźny "łokieć". Wymiary PC przed tym kolankiem są uwzględniane w dalszej analizie. d, e) Klastry komórek oparte na grafach wizualizowane w dwóch różnych rozdzielczościach w przestrzeni niskowymiarowej przy użyciu wykresu tSNE. (f) Najważniejsze geny markerowe (żółte) dla każdego klastra wizualizowanego na mapie cieplnej wyrażeń przy użyciu funkcji DoHeatmap firmy Seurat. (g) Wizualizacja ekspresji markera, na przykład, genu Cd68 reprezentującego makrofagi (fioletowy) za pomocą funkcji FeaturePlot Seurata. Sugeruje to, że klaster 2 i 4 (w panelu d) tego zestawu danych reprezentują makrofagi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Kategoryzacja i porządkowanie komórek wzdłuż trajektorii udo-czasowej przy użyciu zestawu narzędzi Monocle. (a) Sprawdzenie rozkładu mRNA (wywnioskowanego z liczby UMI) we wszystkich komórkach w próbce. Tylko komórki z mRNA w zakresie od 0 do ~ 20 000 zostały użyte do dalszej analizy. lit. b), c) Przypisywanie i zliczanie typów komórek na podstawie znanych markerów pochodzenia komórek. Na przykład komórki wykazujące ekspresję receptora PDGF alfa lub białka specyficznego dla fibroblastów 1 przypisano do typu komórki #1 reprezentującego panfibroblasty za pomocą nowej funkcji CellTypeHierarchy firmy Monocle. Wiele różnych typów komórek można wizualizować jako wykres kołowy (b) i jako tabelę (c). (d) Używając typu komórki #1 (fibroblasty) jako przykładu, geny używane do porządkowania komórek można wizualizować za pomocą wykresu punktowego, który pokazuje dyspersję genów w funkcji średniej ekspresji. Czerwona krzywa pokazuje punkt odcięcia dla genów używanych do porządkowania, obliczony przez model średniej wariancji przy użyciu funkcji oszacowania Monocle. Geny, które spełniają ten punkt odcięcia, zostały wykorzystane do dalszego porządkowania pseudoczasu. e, f) Wizualizacja trajektorii komórek w zredukowanej dwuwymiarowej przestrzeni pokolorowanej przez "Stan" komórki (e) i przypisany przez monokl "Pseudoczas" (f). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób odpowiednie przygotowanie pojedynczych komórek może odkryć niejednorodność transkrypcyjną tysięcy pojedynczych komórek i rozróżnić stany funkcjonalne lub unikalne tożsamości komórkowe w tkance. Protokół nie wymaga fluorescencyjnych białek reporterowych ani narzędzi transgenicznych i może być stosowany do izolacji pojedynczych komórek z różnych tkanek będących przedmiotem zainteresowania, w tym tkanek ludzkich; Należy pamiętać, że każda tkanka jest wyjątkowa i ten protokół będzie wymagał pewnego stopnia dostosowania/modyfikacji.

Zróżnicowane i wysoce dynamiczne programy transkrypcyjne w komórkach podkreśliły wartość genomiki pojedynczej komórki. Oprócz wyizolowania wysokiej jakości RNA, krytycznym etapem przygotowania próbki niezbędnym do uzyskania wysokiej jakości zestawów danych jest upewnienie się, że komórki są całkowicie uwolnione z tkanki oraz że komórki są zdrowe i nienaruszone. Jest to stosunkowo proste w przypadku zbierania komórek, które są łatwo uwalniane, takich jak komórki krążące lub w tkankach, w których komórki są luźno zatrzymane, takie jak tkanki limfoidalne. Może to jednak stanowić wyzwanie dla innych dorosłych tkanek ze względu na wysoko rozwiniętą architekturę komórkową obejmującą duże odległości, otaczającą macierz zewnątrzkomórkową i często sztywne białka cytoszkieletu zaangażowane w utrzymanie struktury komórki. Nawet przy zastosowaniu odpowiednich technik dysocjacji w celu pełnego uwolnienia komórek, istnieje możliwość, że rygorystyczne i często długotrwałe przetwarzanie zmieni jakość mRNA i integralność komórki. Ponadto wysokie temperatury stosowane do dysocjacji wspomaganej enzymatycznie wpływają również na sygnatury transkrypcyjne29,30. Celem protokołu jest przedstawienie kontroli jakości przy użyciu tkanek takich jak mielinizowany nerw dorosłego człowieka i bogata w macierz zewnątrzkomórkową skóra osoby dorosłej, aby pokazać, w jaki sposób optymalizacja może pomóc w pokonaniu tych przeszkód.

Główną kwestią braną pod uwagę przy projektowaniu każdego eksperymentu scRNA-Seq jest wybór głębokości sekwencjonowania. Sekwencjonowanie może być wysoce multipleksowane, a głębokość odczytu może wahać się od bardzo niskiej przy użyciu Drop-Seq2 do do 5 milionów odczytów na komórkę14 przy użyciu metody sekwencjonowania RNA o pełnej długości, takiej jak Smart-Seq. Większość eksperymentów scRNA-Seq może wykryć transkrypty o umiarkowanej lub wysokiej ekspresji przy sekwencjonowaniu tak niskim, jak 10 000 odczytów / komórkę, co zwykle wystarcza do klasyfikacji typu komórki 41,42. Niewielka głębokość sekwencjonowania jest cenna, aby zaoszczędzić na kosztach sekwencjonowania podczas próby wykrycia rzadkich populacji komórek w złożonych tkankach, gdzie tysiące komórek mogą być potrzebne do pewnego przypisania rzadkich populacji. Jednak sekwencjonowanie na płytkiej głębokości nie jest wystarczające, gdy niezbędne są szczegółowe informacje na temat ekspresji genów i procesów związanych z subtelnymi sygnaturami transkrypcyjnymi. Obecnie szacuje się, że zdecydowana większość genów w komórce jest wykrywana przy 500 000 odczytów na komórkę, ale może się to różnić w zależności od protokołu i typu tkanki43,44. Podczas gdy sekwencjonowanie transkryptu o pełnej długości omija potrzebę składania i dlatego może wykrywać nowe lub rzadkie warianty splicingu, koszty sekwencjonowania często ograniczają skalowanie takich podejść w celu zbadania tysięcy komórek składających się na złożony system tkankowy. W przeciwieństwie do tego, biblioteki jednokomórkowe oznaczone 3', takie jak te opisane w tym protokole, mają zazwyczaj mniejszą złożoność i wymagają płytszego sekwencjonowania. Należy zauważyć, że biblioteki wygenerowane przy użyciu opisanego protokołu mogą być sekwencjonowane na jednym z pięciu obsługiwanych sekwencerów: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 Rapid Run and High Output, 4) NextSeq 500/550 i 5) MiSeq.

Alternatywnym podejściem do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, które zmniejsza potrzebę delikatnego obchodzenia się z tkankami i komórkami, a jednocześnie zachowuje niektóre korzyści płynące z sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, jest analiza RNA z pojedynczych jąder45. Takie podejście pozwala na szybsze przetwarzanie zmniejszające degradację RNA i bardziej ekstremalne środki w celu zapewnienia odpowiedniego uwalniania jąder, a tym samym prawdopodobnie pozwala na pewniejsze uchwycenie profili transkrypcyjnych reprezentujących wszystkie komórki w danej tkance. To oczywiście zapewniłoby tylko część aktywności transkrypcyjnej obecnej w danej komórce, więc w zależności od tego, jakie cele eksperymentalne są przedmiotem zainteresowania, takie podejście może, ale nie musi być odpowiednie.

Oprócz pełnej charakterystyki tożsamości komórkowych w danej tkance, jedną z najcenniejszych analiz zestawów danych scRNA-Seq jest ocena pośrednich stanów transkrypcyjnych w "zdefiniowanych" populacjach komórek. Te stany pośrednie mogą dostarczyć wglądu w relacje liniowe między komórkami w zidentyfikowanych populacjach, co nie było możliwe w przypadku tradycyjnych podejść do masowego sekwencjonowania RNA. Aby to wyjaśnić, opracowano kilka narzędzi bioinformatycznych scRNA-Seq. Takie narzędzia mogą oceniać procesy związane na przykład z przejściem komórek nowotworowych w stan onkogenny/przerzutowy, dojrzewaniem komórek macierzystych do różnych terminalnych losów lub przemieszczaniem się komórek odpornościowych między stanem aktywnym i spoczynkowym. Subtelne różnice w transkryptomie w komórkach mogą również wskazywać na odchylenia rodowe, które, jak niedawno opracowane narzędzia bioinformatyczne, takie jak FateID, mogą wywnioskować47. Ponieważ różnice między komórkami przejściowymi mogą być trudne do ustalenia, biorąc pod uwagę, że różnice transkrypcyjne mogą być subtelne, konieczne może być głębsze sekwencjonowanie46. Na szczęście pokrycie płytko zsekwencjonowanej biblioteki można zwiększyć, jeśli jest zainteresowany dalszym badaniem zestawu danych przez ponowne uruchomienie biblioteki w innej komórce przepływu.

Podsumowując, protokół ten zapewnia łatwy do dostosowania przepływ pracy, który umożliwia użytkownikom transkrypcyjne profilowanie setek lub tysięcy pojedynczych komórek w jednym eksperymencie. Ostateczna jakość zestawu danych scRNA-Seq zależy od zoptymalizowanej izolacji komórek, cytometrii przepływowej, generowania biblioteki cDNA i interpretacji surowych matryc genów i kodów kreskowych. W tym celu protokół ten zapewnia kompleksowy przegląd wszystkich kluczowych kroków, które można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić badania różnych typów tkanek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak ujawniania informacji

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy personelowi pomocniczemu w Ośrodku Usług UCDNA, jak również personelowi placówki opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Calgary. Dziękujemy Mattowi Workentine'owi za wsparcie bioinformatyczne i Jensowi Durruthy'emu za wsparcie techniczne. Praca ta została sfinansowana z grantu CIHR (R.M. i J.B.), nagrody CIHR New Investigator Award dla J.B. oraz stypendium Alberta Children's Health Research Institute (J.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Products
RNAse outBiosciences786-70
Pentobarbital soduEutanyl50mg/kg
HBSSGibco14175-095
Dispase 5U/mlStemCell Technologies79135 mg/ml
Kolagenaza-4 125 CDU/mgSigma-AldrichC51382 mg/ml
DNAseSigma-AldrichDN2510mg/ml
BSASigma-AldrichA7906
15 ml Wąska rurka denna VWR® Wysokowydajne probówki wirówkoweVWR89039-666
Sondy molekularneSytox Orange Viability Dye113209721,3 nM / & mikro; l
Nuc Blue Live ReadyProbesInvitrogenR37605
Agilent 2100 Bioanalyzer Odczynniki DNA o wysokiej wrażliwościAgilent5067-4626
Zestaw do kwantyfikacji DNA Kapa KapaBiosystemsKK4844
Chromium Single Cell 310x Genomics
Equipment
BD FACSAria IIIBD Biosciences
Agilent 2100Agilent
Illumina® HiSeq 4000Illumina
Illumina® Kontroler MiSeq SR50Illumina
10X + akcesoria10x Genomics
Software
The Cell Ranger10x GENOMICSsupport.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome
przeglądarka komórek lupy10x GENOMIKA
Rhttps://anaconda.org/r/r
' Platforma bioanalizatora support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation. Nature. 510, 363-369 (2014).
  2. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015).
  3. Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database. bioRxiv:206573. , (2018).
  4. Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage. Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).
  5. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
  6. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).
  7. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).
  8. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  9. Stratton, J. A., et al. Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
  10. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).
  11. 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
  12. 10X Genomics. Chromium Single Cell 3' Training Module. , Available from: http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression (2018).
  13. Agilent. , Available from: https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135 (2018).
  14. Kolodziejczyk, A. A. Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation. Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).
  15. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, 776-779 (2014).
  16. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).
  17. 10X Genomics. Sequencing Requirements for Single Cell 3'. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3 (2018).
  18. Datacamp. Introduction to R. , Available from: https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r (2018).
  19. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  20. 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
  21. UNIX Tutorial for Beginners. , Available from: http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/ (2018).
  22. 10X Genomics. Creating a Reference Package with cellranger mkref. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references (2018).
  23. 10X Genomics. System Requirements. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements (2018).
  24. 10X Genomics. Software Downloads. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest (2018).
  25. 10X Genomics. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization (2018).
  26. 10X Genomics. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial (2018).
  27. scRNA-tools. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data. , Available from: https://www.scrna-tools.org/ (2018).
  28. Conda. Downloading conda. , Available from: https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html (2018).
  29. Anaconda. r / packages / r 3.5.1. , Available from: https://anaconda.org/r/r (2018).
  30. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  31. Satija Lab. Seurat - Guided Clustering Tutorial. , https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html (2018).
  32. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  33. Monocle. , Available from: http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories (2018).
  34. Github. An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).
  35. Edgar, R. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).
  36. Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. The sequence read archive. Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).
  37. NIH. GenBank Submission Portal Wizards. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/ (2018).
  38. NIH. Submitting data. , Available from: https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/ (2018).
  39. Shah, P. T., et al. Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function. Cell. 173, 1045-1057 (2018).
  40. Anon, Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, 1(2013).
  41. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144, 3625-3632 (2017).
  42. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96, 313-329 (2017).
  43. Zeigenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  44. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
  45. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  46. Janes, K. A. Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method. Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).
  47. Herman, J. S., Sagar,, Grün, D. FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data. Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Cell TranscriptomicsAdult Mammalian TissuesDroplet BarcodingTissue DissociationFACS SortingGEM GenerationLibrary ConstructionBioinformatics AnalysisSeurat R PackageCell Ranger

Powiązane artykuły