Method Article

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

DOI:

10.3791/58711

⸱

January 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, AnSteel Group General Hospital, 2Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 3Department of Pathology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 4Department of Haematology-Oncology, National University Health System

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody immunohistochemiczne (IHC) do analizy in-situ ekspresji białek za pomocą mikroskopii świetlnej są potężnym narzędziem zarówno do celów badawczych, jak i diagnostycznych. Jednak wizualizacja i kwantyfikacja wielu antygenów w jednym wycinku tkanki przy użyciu konwencjonalnego chromogennego IHC jest wyzwaniem. Obrazowanie multipleksowe jest szczególnie istotne w badaniach i diagnostyce chłoniaków, gdzie markery muszą być interpretowane w kontekście złożonego mikrośrodowiska guza. W tym miejscu opisujemy protokół multipleksowanego barwienia fluorescencyjnego IHC, aby umożliwić ilościową ocenę wielu celów w określonych typach komórek będących przedmiotem zainteresowania w chłoniaku. Metoda obejmuje aspekty walidacji przeciwciał, optymalizacji przeciwciał, optymalizacji multipleksu z markerami podtypów chłoniaka, barwienia szkiełek z mikromacierzy tkankowej (TMA) oraz skanowania szkiełek, a następnie analizy danych, ze szczególnym odniesieniem do chłoniaka. Za pomocą tej metody generowane są wyniki zarówno dla średniej intensywności markera zainteresowania, jak i procentowej pozytywności, aby ułatwić dalszą analizę ilościową. Multipleksowanie minimalizuje wykorzystanie próbki i dostarcza informacji przestrzennych dla każdego markera będącego przedmiotem zainteresowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowotwory limfoidalne są spowodowane niekontrolowaną złośliwą proliferacją limfocytów. Komórki te są istotnymi składnikami układu odpornościowego i lokalizują się w pierwotnych i wtórnych narządach odpornościowych, takich jak szpik kostny, węzły chłonne, śledziona i inny układ limfatyczny związany z błoną śluzową. Nowotwory układu chłonnego to niejednorodna grupa zaburzeń, które są klasyfikowane na podstawie konstelacji cech, w tym morfologii, immunofenotypu, cech genetycznych i obrazu klinicznego. Chociaż każdy parametr odgrywa pewną rolę, pochodzenie pozostaje cechą definiującą i stanowi podstawę systemu klasyfikacji WHO, który rozpoznaje nowotwory pochodzące z limfocytów B, limfocytów T i komórek NK (natural killer)1.

Kluczem do klasyfikacji chłoniaka była charakterystyka przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym leukocytów różnych podtypów limfocytów2. Immunohistochemia (IHC) jest tradycyjnie stosowana do analizy takich markerów i opiera się na zasadzie specyficznego rozpoznawania przeciwciał antygenowych w celu wykrywania cząsteczek komórkowych i tkankowych, które można zwizualizować za pomocą mikroskopu świetlnego3. Jednak identyfikacja wielu celów na jednym szkiełku za pomocą konwencjonalnego multipleksu chromogenicznego IHC w jasnym polu ma ograniczenia, ponieważ często trudno jest niezawodnie rozróżnić wiele sygnałów kolorów na jednym fragmencie tkanki - szczególnie w przypadku antygenów o bardzo niskiej ekspresji4. Wizualna ocena i kwantyfikacja barwienia może być również subiektywna, powodując zmienność w analizie i interpretacji danych5.

Dlatego konwencjonalne IHC na próbkach z zatopioną parafiną (FFPE) nie jest możliwe do jednoczesnego wykrywania wielu celów w chorobach immunologicznie zróżnicowanych, takich jak chłoniak. Ponadto odróżnienie limfocytów nowotworowych od otaczających je komórek odpornościowych jest często nieprecyzyjne. Utrudnia to badania nad znaczeniem nowych biomarkerów w chłoniaku. W tym kontekście, multipleksowy fluorescencyjny IHC (mf-IHC) stanowi obiecującą alternatywę, ponieważ umożliwia ilościową ocenę koekspresji antygenu i zależności przestrzennej z większą precyzją przy jednoczesnym zachowaniu ograniczonych próbek6,7. Gdy ta technologia obrazowania jest połączona z oprogramowaniem do cyfrowej analizy obrazu, interpretacja danych jest bardziej wydajna i ułatwia badanie niejednorodności guza i mikrośrodowiska8,9. W tym protokole w celu wzmocnienia sygnału stosuje się metodę multipleksowania immunofluorescencji opartej na tyramidzie (IF), która jest kompatybilna z dowolnym przeciwciałem zatwierdzonym przez IHC od dowolnego gatunku gospodarza, nawet tych opracowanych u tego samego gatunku5,7,10. Protokół oparty na tyramidzie pozwala na bezpośrednie sprzężenie fluoroforu z tkanką będącą przedmiotem zainteresowania, tak aby przeciwciało pierwszorzędowe i drugorzędowe mogło zostać usunięte po każdym etapie, co pozwala na sekwencyjne stosowanie wielu barwień bez reaktywności krzyżowej przeciwciał.

Strategia multipleksowania będzie przydatna do przewidywania rokowania i wyników leczenia poprzez identyfikację celów i ich wariantów immunologicznych w chłoniakach. Multipleksowy fluorescencyjny IHC został zastosowany w naszym laboratorium do badania panelu markerów limfocytów T i B oraz markerów pomocniczych pęcherzyków T w angioimmunoblastycznym chłoniaku z komórek T (AITL), podtypie obwodowego chłoniaka z komórek T, charakteryzującego się agresywnym zachowaniem klinicznym i niejednorodnością guza11. Użyteczność tej metody jest również zilustrowana w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL), gdzie zwiększona sygnalizacja receptora komórek B z jednoczesną ekspresją C-MYC i BCL-2 sugeruje potencjalne zastosowanie terapeutyczne hamowania kinazy tyrozynowej Brutona12.

Tutaj opisujemy cały protokół, od walidacji przeciwciał do wyboru odpowiednich tkanek kontrolnych i multipleksowania za pomocą tkanek chłoniaka FFPE, z ostateczną analizą wybarwionych preparatów za pomocą skaningowego automatycznego systemu obrazowania ilościowego patologii.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie tkanki użyte w tym protokole zostały uzyskane w ramach badania Singapore NHG Domain Specific Review Board B 2014/00693.

1. Selekcja i walidacja przeciwciał

UWAGA: Zanim przystąpisz do tworzenia jakiegokolwiek panelu multipleksowego, upewnij się, że wszystkie przeciwciała są mocno wybarwione, identyfikując tylko docelowy antygen będący przedmiotem zainteresowania. Celem jest wyselekcjonowanie przeciwciał, które specyficznie rozpoznają interesujący nas antygen w skrawkach tkanki.

  1. W przypadku przeciwciała o ugruntowanym zastosowaniu badawczym lub rutynowym zastosowaniu klinicznym w IHC, potwierdź warunki, takie jak pobieranie epitopu i rozcieńczanie przeciwciał, wykonując konwencjonalne IHC5,13 na pozytywnych i ujemnych skrawkach tkanek kontrolnych. W przypadku wycinków tkanek pochodzenia ludzkiego, przed rozpoczęciem eksperymentów należy upewnić się, że istnieją odpowiednie poświadczenia etyczne.
    UWAGA: Kontrole pozytywne to tkanki, od których oczekuje się, że będą wyrażać antygen będący przedmiotem zainteresowania, a kontrole ujemne to te, które tego nie robią. Łagodna tkanka migdałków jest wybierana jako dobra kontrola tkanek dla antygenów chłoniaka, ponieważ zawiera mieszaninę komórek odpornościowych, w tym limfocytów B, limfocytów T i komórek prezentujących antygen, a także komórek zrębu i nabłonka. Te ostatnie służą jako użyteczne negatywne kontrole wewnętrzne.
  2. W przypadku nieznanych celów lub komercyjnych przeciwciał z niewystarczającymi opublikowanymi danymi, przeprowadź walidację przeciwciał, tworząc dopasowane bloki komórkowe FFPE kontroli dodatniej i ujemnej14, używając nokautu CRISPR lub nokautu siRNA antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w odpowiedniej linii komórkowej za pomocą standardowych technik biologii molekularnej. Użyj tych bloków komórkowych FFPE zamiast tkanek kontroli dodatniej i ujemnej dla konwencjonalnego IHC zgodnie z krokiem 1.1.
    UWAGA: Limfocyty HeLa lub 293T są powszechnie stosowane w antygenach, które nie są specyficzne dla typu komórki, ponieważ linie komórkowe chłoniaka są trudne do transfekcji. W przypadku antygenów, które są specyficzne dla limfocytów, linie komórkowe chłoniaka mogą być używane z transdukcją wirusa lub elektroporacją jako sposobem dostarczania genów (choć z niską skutecznością).

2. Planowanie sekwencji przeciwciał i fluoroforów dla panelu multipleksu

  1. Zaplanuj sekwencję odczynników do końcowego barwienia multipleksowego. Na przykład w tym przypadku sekwencja dla protokołu multipleksu była początkowo planowana jako pierwsza, Bcl-6; drugi, Bcl-2; po trzecie, C-Myc; czwarty, CD20; piąty, Ki67.
    UWAGA: Aby zdecydować o sekwencji, przeciwciała o słabym powinowactwie wymagającym wyższych stężeń powinny być najpierw wybarwione w końcowym barwieniu multipleksowym. Przeciwciała o wysokim powinowactwie, które prawdopodobnie będą odporne na wielokrotne rundy usuwania mikrofalowego, są stosowane jako ostatnie w protokole multipleksowym, aby uniknąć niespecyficznego barwienia.
  2. Zaplanuj partnera fluoroforowego dla każdego przeciwciała w panelu. Zobacz Tabelę 1 i Tabelę materiałów, aby zapoznać się z opcjami w tym przykładzie.
    UWAGA: Aby zdecydować o partnerze fluoroforowym dla każdego przeciwciała, wybierz spektralnie odrębne fluorofory dla przeciwciał o podobnych wzorcach lokalizacji w komórce i tkance. Zminimalizuje to nakładanie się widm i trudności z rozmieszaniem.

3. Monoplex IF oparty na tyramidzie w symulowanym panelu multipleksowym 5-plex

UWAGA: W tym przykładzie omawiany jest protokół dla CD20, który jest planowany jako czwarte przeciwciało w sekwencji multipleksowej opisanej powyżej. Liczba dodatkowych etapów usuwania będzie różna w zależności od pozycji przeciwciała w sekwencji.

  1. Wyciąć cienkie odcinki tkanki kontroli dodatniej i ujemnej o grubości 3 μm za pomocą mikrotomu i umieścić skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną.
  2. Odwoskować skrawki za pomocą odpowiedniego roztworu czyszczącego 3x po 4 minuty każda. Nawodnij zjeżdżalnie w 100% alkoholu, 90% alkoholu i 70% alkoholu każda, 4 minuty każda. Umieść szkiełka w wodzie destylowanej na 2 - 3 minuty.
  3. Umieść szkiełka w szklanym słoiku nadającym się do kuchenki mikrofalowej w standardowym buforze do odzyskiwania antygenu (dostępnym w handlu), aby zanurzyć szkiełka. Przeprowadzić pobieranie epitopów indukowanych ciepłem (HIER) za pomocą odpowiedniej kuchenki mikrofalowej, w roztworze do pobierania antygenu o pH 9 w temperaturze 98 °C przez 25 min.
    UWAGA: Można użyć dowolnej kuchenki mikrofalowej o ciśnieniu w zakresie 800 - 1,100 watów, a HIER można odpowiednio zoptymalizować. W tym przypadku użyto wielofunkcyjnego mikrofalowego procesora tkanek (otwartego na powietrze) do HIER i strippingu. Początkowe ustawienia pobierania określonego epitopu opierają się na wcześniejszej wiedzy z konwencjonalnego IHC.
  4. Wykonaj dodatkowe rundy oddzielania mikrofalowego (trzy w tym przypadku dla czwartego przeciwciała w panelu), każda runda ze 100% mocą do 98 °C i 20% mocą przez 10 minut, aby utrzymać tę samą temperaturę. Schłodzić szkiełka w wodzie destylowanej przez co najmniej 10 min.
    UWAGA: Wykonaj wiele rund usuwania mikrofalowego podczas kroku IF monopleksu, aby wystawić docelowy antygen na taką samą liczbę etapów ogrzewania, jak w proponowanym multipleksie. Ponieważ CD20 jest planowany jako czwarte przeciwciało, wykonaj usuwanie mikrofalowe 3 razy przed i jeden raz po wykonaniu inkubacji przeciwciała pierwotnego.
  5. Sprawdzaj i uzupełniaj bufor co 5 minut podczas dodatkowego usuwania mikrofalowego. Co ważne, nie pozwól, aby szkiełka wyschły podczas wielu procedur zdejmowania. Wyjmując szkiełka z kuchenki mikrofalowej, użyj kleszczyków i żaroodpornych rękawiczek, aby umieścić je w osobnym słoiku z wodą destylowaną. Poczekaj, aż roztwór do pobierania antygenu ostygnie w sposób naturalny.
  6. Zablokuj aktywność peroksydazy tkankowej za pomocą dostępnego w handlu bloku peroksydazy przez 10 minut (jako alternatywny odczynnik można użyć 3% nadtlenku wodoru). Myć solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) i niejonowym detergentem przez 5 min.
    UWAGA: TBS składa się z 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 i 150 mM NaCl.TBS do produkcji TBS-D.
  7. Blokować rozcieńczalnikiem przeciwciał lub albuminą surowicy bydlęcej przez 15 minut, a następnie inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania (np. CD20, rozcieńczenie 1:2 000 w rozcieńczalniku przeciwciał, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemywać 3x buforem TBS-D przez 5 minut za każdym razem. Powinien być wystarczający bufor TBS-D, aby całkowicie zanurzyć szkiełko we wszystkich etapach mycia.
    UWAGA: Albumina surowicy bydlęcej może być stosowana jako alternatywny rozcieńczalnik przeciwciał. Objętość rozcieńczalnika przeciwciał zależy od wielkości tkanki i wynosi od 50 μl (w przypadku próbek biopsyjnych) do 400 μl (w przypadku próbek wycinanych lub próbek mikromacierzy tkankowych).
  8. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym peroksydazą chrzanową (HRP), wybranym na podstawie gatunku pochodzenia przeciwciała pierwszorzędowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myć 3x buforem TBS-D przez 5 min za każdym razem.
  9. Zastosować odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu (1:100 w rozcieńczalniku do amplifikacji) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić koniugację fluoroforu z próbką tkanki w miejscach wiązania przeciwciał pierwotnych. Myć 3x buforem TBS-D przez 5 min za każdym razem.
  10. Wykonaj dodatkowe usuwanie na bazie mikrofal w celu usunięcia przeciwciała pierwszorzędowego i wtórnego. Powtórzyć w razie potrzeby w zależności od pozycji przeciwciała w sekwencji.
  11. Umieścić szkiełko w wodzie destylowanej, aby ostygło. Inkubować z DAPI (rozcieńczenie 1:100 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 10 minut, a następnie przemywać 3x buforem TBS-D przez 5 minut za każdym razem. Osusz obszar na szkiełku bez chusteczki chusteczkami i zamontuj szkiełko za pomocą odpowiednich nośników montażowych.
  12. Należy zobrazować szkiełko (patrz sekcje 6 i 7 niniejszego protokołu) i określić stosowność barwienia (zgodnie z definicją wyraźnego rozróżnienia pozytywnej i negatywnej tkanki kontrolnej).
    UWAGA: Jeśli wzór barwienia jest nieprawidłowy, powtórz barwienie monoplex po dostosowaniu jednego lub więcej z następujących parametrów: liczba etapów odzyskiwania ciepła, ilość odzyskiwanego ciepła, okres inkubacji/stężenie przeciwciał (pierwotnych i wtórnych), pozycja przeciwciała w sekwencji oraz wybór fluoroforu. Etap barwienia monopleksowego zazwyczaj wymaga wielu rund optymalizacji w celu uzyskania odpowiedniego zestawu parametrów dla odpowiedniego barwienia. Zaleca się testowanie szeregu fluoroforów z każdym przeciwciałem pierwszorzędowym, ponieważ zapewni to elastyczność w podejmowaniu decyzji o ostatecznym zestawie multipleksów.

4. Powtórzenie monopleksu dla każdego przeciwciała w protokole multipleksu

  1. Powtórzyć barwienie monopleksowe dla innych przeciwciał w podobny sposób, dostosowując liczbę etapów usuwania mikrofalowego w oparciu o pozycję przeciwciała w sekwencji. Na przykład, wykonując barwienie monopleksowe dla trzeciego przeciwciała w sześciokrotnym panelu multipleksowym, należy wykonać dwa etapy usuwania mikrofalowego przed i trzy etapy usuwania mikrofalowego po inkubacji przeciwciał pierwotnych.
    UWAGA: Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że usuwanie przeciwciał za pomocą mikrofal również wystawia próbkę na działanie HIER. Jeśli określone przeciwciało wymaga innej strategii pobierania epitopów, należy to wziąć pod uwagę przy planowaniu sekwencji multipleksowej. W tym przykładzie pobieranie epitopu Ki67 wymaga pH 9 przez 30 minut. Ponieważ 25 minut HIER zostanie wykonane przed barwieniem KI67 w protokole sekwencyjnym, potrzebne jest tylko dodatkowe 5 minut HIER.

5. Protokół barwienia multipleksowego

UWAGA: Kontynuuj protokół barwienia multipleksowego dopiero po zoptymalizowaniu wszystkich komponentów za pomocą barwienia monoplex IF. Przejrzyj wyniki barwienia monopleksem i zaprojektuj tabelę przedstawiającą ostateczny układ kolejności multipleksu i wybór fluoroforu dla każdego przeciwciała. Szczegółowe informacje na temat stężenia przeciwciał, czasu trwania barwienia oraz sekwencji i charakteru odzyskiwania ciepła dla każdego zastosowanego tutaj przeciwciała przedstawiono w Tabeli 1.

  1. Wyciąć cienkie odcinki o grubości 3 μm tkanki kontroli dodatniej i ujemnej, a także tkankę docelową będącą przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku próbki chłoniaka FFPE) za pomocą mikrotomu i umieścić skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Wskazane jest włączenie kontroli dodatnich i ujemnych dla każdego przeciwciała w panelu, wraz z rzeczywistymi próbkami do multipleksu. Pozwala to na potwierdzenie, że protokół barwienia został wykonany prawidłowo.
  2. Odwoskować, przeprowadzić indukowane ciepłem odzyskiwanie epitopów (HIER) i zablokować aktywność peroksydazy tkankowej, jak w krokach protokołu monoplex 3.3 - 3.5.
  3. Inkubować z pierwszym przeciwciałem pierwszorzędowym zoptymalizowanej sekwencji multipleksowej, jak wcześniej określono za pomocą kroku IF monopleksu. W tym przykładzie BCL-6, w rozcieńczeniu 1:30 w rozcieńczalniku przeciwciał w temperaturze pokojowej przez 60 minut (patrz Tabela materiałów), był pierwszym krokiem protokołu multipleksu. Myć buforem TBS-D przez 5 min.
  4. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP w oparciu o gatunek przeciwciała pierwszorzędowego użytego w poprzednim etapie (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przemywać buforem TBS-D przez 5 minut.
  5. Zastosować zoptymalizowany odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu (w tym przykładzie Cy5, 1:100 w rozcieńczalniku do amplifikacji, patrz Tabela Materiałów) z inkubacją w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po inkubacji przemywać buforem TBS-D przez 5 min.
    UWAGA: Wybór odczynnika fluorescencyjnego na bazie tyramidu opiera się na zoptymalizowanym monoplex IF.
  6. Sprawdzić skuteczność barwienia pierwszego przeciwciała za pomocą odpowiedniego mikroskopu (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Tymczasowe kontrole obrazowania można łatwo przeprowadzić, jeśli próbka jest TMA lub pojedynczym szkiełkiem. Jeśli jednak barwienie jest wykonywane na wielu szkiełkach, może to być niepraktyczne i ten krok można pominąć.
  7. Wykonaj usuwanie mikrofalowe dla drugiego przeciwciała w protokole, używając warunków zoptymalizowanych na etapie monopleksu. Następnie przystąp do barwienia drugiego przeciwciała pierwszorzędowego (tutaj BCL2) przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP i odczynnikiem fluorescencyjnym na bazie tyramidu (tutaj, 520, patrz Tabela materiałów). Sprawdź skuteczność barwienia pod mikroskopem fluorescencyjnym po zakończeniu drugiej rundy barwienia.
  8. Podobnie powtórz procedurę, używając trzeciego, czwartego i piątego przeciwciała w sekwencji (tutaj odpowiednio c-Myc, CD20 i ki67 z fluoroforami odpowiednio 570, 540 i 620). Jeśli to możliwe, wykonuj kontrole obrazowe między każdym krokiem.
  9. Dodać barwnik jądrowy (DAPI, rozcieńczenie 1:100 w rozcieńczalniku przeciwciał) na 10 minut, a następnie przemyć 2x w TBS-D przez 5 minut każdy.
  10. Zamontuj szkiełka za pomocą odpowiedniego odczynnika montażowego.

6. Przygotowanie slajdów z biblioteki spektralnej

UWAGA: Sekcje 6 - 8 tego protokołu są unikalne dla eksperymentów multipleksowanych, które są obrazowane za pomocą kamery spektralnej.

  1. Utwórz slajdy biblioteczne (obrazy referencyjne z pojedynczym barwieniem) dla każdego fluoroforu, DAPI i autofluorescencji na tej samej tkance kontrolnej, które mają być wykorzystane do analizy obrazu wielospektralnego.
    1. Wyciąć 2 x 3 μm cienkie odcinki tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku próbkę chłoniaka lub migdałek jako kontrolę) za pomocą mikrotomu i umieścić skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną.
    2. Przetwarzaj oba szkiełka przy użyciu protokołu monoplex (ze wszystkimi etapami strippingu i mycia), ale bez dodatku przeciwciał lub fluoroforów.
    3. Wybarwić jedno szkiełko preparatem DAPI zgodnie z krokiem 5.9 i pozostawić jedno szkiełko niezabarwione (w celu wytworzenia widma autofluorescencji tkankowej).
      UWAGA: Zoptymalizowane szkiełka monopleksowe (z pojedynczym barwnikiem fluorescencyjnym, bez DAPI) mogą być używane jako szkiełka biblioteki spektralnej do generowania widm każdego barwnika fluorescencyjnego.
  2. Zeskanuj ten zestaw slajdów za pomocą odpowiednich filtrów i prześlij je do biblioteki analizy obrazów.

7. Obrazowanie spektralne

  1. Skanowanie slajdów monopleksowych
    1. Wybierz filtry spośród dostępnych standardowych filtrów epi-fluorescencyjnych (DAPI, FITC, CY3, Texas Red i CY5) odpowiednie dla zastosowanego fluoroforu.
      UWAGA: Zalecane kostki filtracyjne dla konkretnych fluoroforów użytych w tym przykładzie są pokazane w Tabeli 215.
    2. Zbadaj każdy marker w odpowiadającym mu kanale fluorescencyjnym, aby określić odpowiedni czas ekspozycji, aby uzyskać czysty sygnał. Skoncentruj się na składniku tkanki, który ma mieć najsilniejszy sygnał dla markera.
    3. Określ stały czas ekspozycji dla każdego analitu (kombinacja przeciwciała i fluoroforu), aby umożliwić porównanie intensywności pikseli między próbkami (chociaż niektóre platformy komercyjne mają strategie normalizacji w celu uwzględnienia różnic w ekspozycji).
      1. Aby zdecydować o stałym czasie ekspozycji dla danego kanału, użyj ustawień kamery na żywo, aby dostosować czas ekspozycji, aż w obrazie z kamery na żywo nie będzie prześwietlonych obszarów, a następnie powtórz to dla wszystkich kanałów.
    4. Po zeskanowaniu slajdów monopleksowych wygeneruj symulowane obrazy w jasnym polu (jeśli funkcja jest dostępna w używanym oprogramowaniu), aby wizualnie porównać z normalnym wzorem IHC i określić, czy wzór barwienia jest prawidłowy (Rysunek 1 i Rysunek 2).
  2. Skanowanie próbek multipleksowych (szkiełka TMA/próbki wielokrotne)
    1. Ustaw parametry optyczne zgodnie z opisem dla skanowania obrazów monopleksowych (krok 6.1). Najpierw wyreguluj ostrość ręcznie lub automatycznie (postępuj zgodnie z instrukcjami konkretnego urządzenia do skanowania obrazu). Po drugie, dostosuj czas ekspozycji dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby upewnić się, że wszystkie rdzenie TMA lub wszystkie obszary na szkiełku są odpowiednio naświetlone.
      UWAGA: Obszar wybrany do regulacji czasu ekspozycji jest ważny. Użytkownicy muszą wybrać najsilniejszy region sygnału dla każdego filtra (tj. sygnał Ki67 jest silniejszy w regionie centrum zarodkowego migdałka niż w regionie centrum niegerminalnego; dlatego użytkownicy powinni używać regionu centrum zarodkowego ustawionego na odpowiedni czas ekspozycji). Użytkownicy mogą również zastosować funkcję korekcji przesycenia systemu obrazowania, jeśli jest dostępna.
    2. Skanowanie slajdów TMA w trybie skanowania TMA, jeśli jest dostępny w systemie obrazowania, z odpowiednim algorytmem autofokusa.
    3. W przypadku preparatów z przekrojem całej tkanki należy je przejrzeć wykwalifikowanemu patologowi, aby wybrać optymalne obrazy z najbardziej reprezentatywnych obszarów guza.
      UWAGA: Opisany tutaj protokół opiera się na zdefiniowanym mikroskopie/systemie analizy obrazu (patrz Tabela materiałów). Istnieją inne maszyny i programy do analizy obrazu, które mogą skanować i analizować multipleksowe slajdy IHC7.

8. Analiza danych

  1. Wstępna analiza, ocena i planowanie
    1. Użyj slajdu referencyjnego dla autofluorescencji, aby odjąć autofluorescencję od obrazów zeskanowanych do analizy.
    2. Przejrzyj obrazy przed analizą, aby upewnić się, że są ostre i nie mają artefaktów plam.
    3. Użyj markera nowotworowego (np. CD20 w tym przykładzie), aby zidentyfikować komórki będące przedmiotem zainteresowania i przystąpić do segmentacji komórek, oceny i analizy wsadowej. Wybierz komórki CD20-dodatnie do analizy.
      UWAGA: Na przykład w analizowanych tutaj próbkach DLBCL ustawienia i parametry, które są zdefiniowane dla segmentacji komórek, są oparte na wielkości i intensywności jądra, ale są specyficzne dla używanego oprogramowania do analizy obrazu (np. średnia intensywność pikseli DAPI wynosi co najmniej 0,05; rozmiar między 80 a 320 pikseli, z czułością rozszczepienia na poziomie 2 [jest to parametr specyficzny dla oprogramowania, który w dużej mierze zależy od morfologii guza: w przypadku małych komórek nowotworowych odpowiednie jest rozszczepienie 0,7 - 1; W przypadku dużych komórek nowotworowych podział można dostosować do 4]).
    4. Poproś wykwalifikowanego patologa, aby przejrzał poszczególne obrazy i zdecydował, czy segmentacja tkanek jest wymagana w celu wybrania regionów wzbogaconych w komórki nowotworowe i wykluczenia regionów z obszarem martwicy lub licznymi komórkami reaktywnymi. Jeśli wymagana jest dodatkowa segmentacja tkanek, wybierz odpowiednie regiony kontrolne (takie jak komórki nowotworowe/zrąb/martwica) i sprawdź, czy oprogramowanie do analizy obrazu może prawidłowo zidentyfikować takie obszary
    5. Kontynuuj segmentację komórek po segmentacji tkanek (jeśli występuje), poproś wykwalifikowanego patologa o przejrzenie mapy segmentacji komórek, aby zapewnić wierność zamierzonego podejścia do segmentacji5.
    6. Określ najbardziej biologicznie/klinicznie odpowiednią metodę analizy dla danego biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania (np. procentową dodatniość lub średnią intensywność na komórkę).
    7. Wybierz wartość odcięcia dla każdego markera (dla procentu pozytywności).
    8. Określ dodatnią wartość odcięcia intensywności optycznej dla każdego markera we współpracy z patologiem. Wygeneruj histogramy, analizując rozkład częstotliwości intensywności markera/komórki w odpowiednim oprogramowaniu statystycznym (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Histogram wartości intensywności może przedstawiać ogólny obraz rozkładu intensywności sygnału.
    9. Określ przybliżoną wartość odcięcia na podstawie histogramu i zweryfikuj ją z przeglądem patologa, aby skorelować z ręcznie wyznaczonymi punktami odcięcia na wybranych obrazach. W niektórych sytuacjach jednolita wartość odcięcia nie będzie możliwa ze względu na zmienność barwienia i wymagana będzie ręczna wartość odcięcia dla każdej próbki.
      UWAGA: Sekcję 8.1 należy wykonać w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Spis materiałów), chyba że określono inaczej.
  2. Oznaczanie komórek dodatnich i ujemnych
    1. Dla każdego interesującego markera, zgodnie z liczbą odcięcia wyznaczoną (za pomocą histogramów lub ręcznie), użyj "JEŻELI" lub podobnej formuły logicznej, aby oznaczyć komórki dodatnie i ujemne zaznaczoną wartością: numer 1 dla komórek dodatnich, numer 0 dla komórek ujemnych.
    2. Aby uzyskać pozytywność wszystkich markerów, pomnóż oznaczoną wartość każdego znacznika (1 lub 0) przez produkty w osobnych kolumnach. Jeśli iloczyn jest równy 1, oznacza to, że komórka jest dodatnia dla wszystkich markerów. Aby uzyskać pozytywność i negatywność określonego markera, użyj algorytmu logicznego IF.
      UWAGA: Sekcję 8.2 należy wykonać w oprogramowaniu statystycznym (patrz Spis materiałów).
  3. Generowanie danych procentowych i liczbowych za pomocą tabeli przestawnej
    1. Wygeneruj dane procentowe dla określonych markerów zainteresowania w zdefiniowanych komórkach (np. komórkach CD20-dodatnich lub komórkach CD20-ujemnych) (Rysunek 6).
    2. Wstaw tabelę przestawną do arkusza danych.
    3. Aby obliczyć procent dodatniości pojedynczego markera, takiego jak CD20, wybierz funkcję SUMA w części Wartość tabeli przestawnej, aby policzyć całkowitą liczbę komórek CD20-dodatnich przy użyciu sumy komórek CD20+ podzielonej przez całkowitą liczbę komórek. Wynikiem jest procent komórek CD20 + w jednym rdzeniu lub jednej liczbie badania (w zależności od wyboru wiersza tabeli przestawnej).
    4. Oblicz procent dodatniości wielu markerów przy użyciu tej samej metody (Rysunek 3)".
    5. Generowanie danych liczbowych. Wyodrębnij medianę znormalizowanej liczby dla każdego markera każdego rdzenia lub każdego numeru badania, uzyskując średnią intensywność każdego markera będącego przedmiotem zainteresowania we wszystkich badanych komórkach w próbie (Rysunek 4).
      UWAGA: Wartości mediany nie można wyprowadzić bezpośrednio w tabeli przestawnej. Można go wyprowadzić za pomocą następującego wzoru: MEDIANA (IF (kolumna numeru badania = konkretny numer badania, kolumna wartości znormalizowanej)).
  4. Wykreślanie danych na odpowiednim wykresie
    1. Wykreślić wyniki procentowej dodatniości lub mediany intensywności na marker w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania w odpowiedni sposób do dalszych badań statystycznych i prezentacji.
    2. Utwórz wykresy punktowe, aby zapewnić wizualizację liczb i rozkładu.
      UWAGA: Przedstawianie danych za pomocą wykresów słupkowych nie przekazuje informacji o rozkładzie. Wykresy estymacji są również zalecane jako dobra metoda reprezentacji danych, z naciskiem na wielkość różnicy między próbkami16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mf-IHC obrazy dla próbki DLBCL z rearanżacją genu C-MYC i BCL2 (chłoniak z podwójnym uderzeniem) są pokazane w Rysunek 1. Rysunek 2 ilustruje symulowane obrazy immunohistochemiczne jasnego pola. Rysunek 3 pokazuje generowanie danych procentowych. Rysunek 4 wyświetla szczegóły formuły mediany do generowania danych numerycznych. Rysunek 5 poka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mf-IHC ma potencjał, aby umożliwić patologom udoskonalenie kryteriów diagnostycznych w patologii limfoidalnej i analizę roli biomarkerów w określonych typach komórek w celu przewidywania wyników klinicznych. Jako nowa metoda badawcza, mf-IHC jest coraz częściej stosowana do ilościowej i przestrzennej identyfikacji wielu parametrów immunologicznych komórek nowotworowych17. Wykazano, że wykrywanie mf-IHC dla koekspresji biomarkerów nowotworowych jest powtarzalne i wiarygodne5...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.D.J. otrzymał dofinansowanie od PerkinElmer na podróże na spotkania grup użytkowników. Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego innego konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.-B.N. i A.D.J. są wspierane przez Narodową Radę ds. Badań Medycznych Singapuru (NMRC/TA/0020/2013 i NMRC/TA/0052/2016). Autorzy potwierdzają przyznanie grantu badawczego Yong Siew Yoon dla A.D.J. z National University Cancer Institute of Singapore na zakup mikroskopu do obrazowania spektralnego Vectra. To badanie zostało zatwierdzone przez Singapore NHG Domain Specific Review Board B (2014/00693).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rozcieńczalnik przeciwciałDAKOREF S3022Blokujący
roztwór blokujący peroksydazęDAKOS2023Do blokowania nadtlenków
Wielospektralny mikroskop automatyczny VectraPerkin ElmerVectra2.0.8Obrazowanie spektralne
absolutnego etanoluEMSURE1.00983.2500Alkohol etylowy do ponownego nawodnienia
Rozcieńczalnik wzmacniającyPERKIN ELMERFP1135Bufor rozcieńczalnika fluoroforowego
Anty-mysie IgG [Koza] Znakowane HRPPERKIN ELMERNEF822001EAPrzeciwciało drugorzędowe
Anty-królicze IgG [Koza] Znakowane HRPPERKIN ELMERNEF812001EAPrzeciwciało drugorzędowe
BCL2DAKOklon 124 (nr partii 20031561)(RRID-AB578693)pierwszorzędowe
BCL6LEICANCL-L-Bcl6-564 (nr partii 6050438) (RRID-AB563429)przeciwciało pierwszorzędowe
CD20DAKOklon L26 (nr partii 20028627) (RRID-AB442055)przeciwciało pierwszorzędowe
c-MYCABCAMY 69 klon ab32072 (nr partii GR29511133)(RRID-AB731658)przeciwciałopierwszorzędowe
Cy 5PERKIN ELMERFP1171Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Graphpad Prism 7Graph padOprogramowanie statystyczne
HistoClear Clearing AgentSIGMAH2779-1LHistoclear do odparafinowania i czyszczenia
inForm Advanced
Oprogramowanie do analizy obrazu		Perkin ElmerInform Software 2.2.1Oprogramowanie do analizy danych
KI67DAKOClone MIB-1 (nr partii 20040401) (RRID-AB2314699)przeciwciałopierwotne
KOS MILESTONE wielofunkcyjny procesor tkankowyMikrofalówka do indukowanego ciepłem pobierania epitopówMikrofalówka
PANASONICNN-ST651MUsuwanie mikrofalowe
MowiolSIGMA ALDRICH81381 Aldrich Mowiol® 4-88Nośnik montażowy
Opal 570PERKIN ELMERFP1488Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Opal520PERKIN ELMERFP1487B21Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Opal540PERKIN ELMERFP1494Odpowiedni odczynnik fluorescencyjny na bazie tyramidu
Opal620PERKIN ELMERFP1495Odpowiedni tyramid odczynnik fluorescencyjny
Szkiełko pokryte poli-L-lizynąFISHER SCIENTIFIC120-550-15Szkiełko do adhezji przekrojów tkanek w rutynowym zastosowaniu histologicznym
Spectral DAPIPERKIN ELMERFP1490barwienie kwasem nukleinowym
Roztwór do odzyskiwania celu, pH9,0 (10x)DAKOS2367Do HIER
Tris Bufor sól fizjologiczna (TBS)1. BAZABUF3030 20X4Ldo buforu wash
Tween 20SIGMA ALDRICHP1379-1LTween
Milestone

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
  4. Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364(2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Fluorescent ImmunohistochemistryLymphoma Tissue AnalysisAntibody Validation ProtocolMicrowave Antigen RetrievalTyramide Signal AmplificationTissue Microarray StainingSpectral Imaging AnalysisCell Segmentation MethodMarker Co expression AnalysisQuantitative Immunohistochemistry

Related Articles