Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Streszczenie

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe zaangażowane w szereg funkcji fizjologicznych, począwszy od reakcji na zakaźne patogeny, a skończywszy na homeostazie tkanek. Różne funkcje tych komórek są związane z ich stanami aktywacji, co nazywa się również polaryzacją. Dokładny opis molekularny tych różnych polaryzacji jest priorytetem w dziedzinie biologii makrofagów. Obecnie uznaje się, że konieczne jest wielowymiarowe podejście do opisania, w jaki sposób polaryzacja jest kontrolowana przez sygnały środowiskowe. W tym raporcie opisujemy protokół mający na celu uzyskanie proteomicznej sygnatury różnych polaryzacji w ludzkich makrofagach. Protokół ten opiera się na bezznacznikowej kwantyfikacji ekspresji białka makrofagów uzyskanej z frakcjonowanej w żelu i trawionej Lys C/trypsyny zawartości lizy komórkowej. Udostępniamy również protokół oparty na trawieniu w roztworze i frakcjonowaniu izoelektrycznym do wykorzystania jako alternatywa. Ponieważ stężenie tlenu jest istotnym parametrem środowiskowym w tkankach, używamy tego protokołu do zbadania, w jaki sposób skład atmosfery lub środowisko o niskim poziomie tlenu wpływa na klasyfikację polaryzacji makrofagów.

Wprowadzenie

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe zaangażowane w szereg funkcji fizjologicznych, począwszy od reakcji na zakaźne patogeny, a skończywszy na homeostazie tkanek, w tym usuwaniu komórek apoptotycznych i przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej¹. Komórki te charakteryzują się silną plastycznością fenotypową², co przekłada się na wiele możliwych stanów aktywacji, które nazywane są również polaryzacjami. Dokładny molekularny opis tych różnych polaryzacji jest priorytetem w dziedzinie biologii makrofagów³. Zaproponowano klasyfikację tych polaryzacji za pomocą tzw. dychotomii M1/M2, w której M1 reprezentuje makrofagi prozapalne, a M2 przeciwzapalne. Ten model dobrze pasuje do różnych sytuacji patologicznych, takich jak ostre infekcje, alergie i otyłość⁴. Jednak w przypadku tkanek z przewlekłym stanem zapalnym i nowotworami wykazano, że ta klasyfikacja nie jest w stanie uchwycić szerokiego repertuaru fenotypowego, który makrofagi występują w określonych środowiskach komórkowych^5,6,7. Obecny konsensus jest taki, że polaryzacja makrofagów jest lepiej opisana za pomocą wielowymiarowego modelu do integracji określonych sygnałów mikrośrodowiskowych⁸. Wniosek ten został potwierdzony przez analizę transkryptomiczną ludzkich makrofagów, która wykazała, że model M1/M2 jest nieefektywny w opisywaniu uzyskanych polaryzacji⁹.

Przedstawione badanie ma na celu dostarczenie protokołu do uzyskania proteomicznych sygnatur różnych polaryzacji u ludzkich makrofagów. Opisujemy, jak różnicować ludzkie makrofagi w środowiskach o różnych poziomach tlenu i uzyskiwać peptydy z całego proteomu makrofagów w celu przeprowadzenia kwantyfikacji bez znaczników. Ta kwantyfikacja pozwala na porównanie poziomów ekspresji różnych białek. Ponieważ badania nad komórkami macierzystymi ujawniły znaczenie tlenu jako kluczowego parametru środowiskowego¹⁰, staramy się zrozumieć, w jaki sposób ten parametr tkankowy może wpływać na polaryzację makrofagów u ludzi. Stwierdzono, że ciśnienie parcjalne tlenu waha się od 3 do 20% (całkowitego ciśnienia atmosferycznego) w ludzkim ciele, gdzie 20% odpowiada mniej więcej temu, co jest powszechnie stosowane w inkubatorze do hodowli komórkowych (dokładna wartość wynosi około 18,6%, biorąc pod uwagę obecność wody).

Poprzednie prace wykazały, że pęcherzyki płucne różnią się od makrofagów śródmiąższowych z funkcjonalnego i morfologicznego punktu widzenia¹¹ i że te różnice są prawdopodobnie częściowo spowodowane różnymi poziomami tlenu, na które są narażone¹². Co więcej, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego wykazują zwiększoną zdolność do fagocytyzacji bakterii po wystawieniu na działanie środowiska o niskiej zawartości tlenu¹². Odwrotny efekt stwierdzono w przypadku ludzkich makrofagów zróżnicowanych pod kątem THP1¹³, ale wyniki te wspierają ideę, że tlen jest regulatorem biologii makrofagów i że konieczne jest wyjaśnienie tej roli na poziomie molekularnym w ludzkich makrofagach. W poprzednim badaniu zastosowaliśmy podejście proteomiczne, aby rozwiązać te problemy. Mierząc poziomy ekspresji tysięcy białek jednocześnie, podkreśliliśmy wpływ tlenu na polaryzację i dostarczyliśmy listę nowych markerów molekularnych. Udało nam się również odnieść te odkrycia do niektórych funkcji makrofagów. Warto zauważyć, że szybkość fagocytozy komórek apoptotycznych była zwiększona w makrofagach spolaryzowanych IL4 / IL13, co było związane z regulacją w górę ALOX15, jak ujawniono w analizie proteomicznej¹⁴. W niniejszym opracowaniu opisujemy, w jaki sposób przeprowadzić taką analizę.

Protokół

Próbki krwi ludzkiej (LRSC) od zdrowych, anonimowych dawców zostały pobrane z EFS (Francuska Narodowa Służba Krwi) w ramach autoryzowanego protokołu (CODECOH DC-2018–3114). Dawcy wyrazili podpisaną zgodę na wykorzystanie krwi.

1. Przygotowanie podłoża i bufora

1. Przygotuj pożywkę makrofagową [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1x endogenne aminokwasy (NEAA)] i podgrzej ją do 37 °C.
2. Przygotować pożywkę makrofagową + 10% surowicy ludzkiej z osocza AB (SAB), przefiltrować (filtr 0,22 μm), a następnie ogrzać do 37 °C (zwanej dalej pożywką makrofagową + 10% SAB).
3. Przygotować bufor sortujący [1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)], przefiltrować go (filtr 0,22 μm) i utrzymywać w temperaturze 4 °C.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z komory systemu leukoredukcji (LRSC)

1. Umieścić 15 ml roztworu do separacji komórek z gradientem gęstości (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, aby mogła ogrzać się do temperatury pokojowej (RT) przed otrzymaniem LRSC.
   UWAGA: Gęstość zależy od temperatury. Ponieważ produkt ten jest przechowywany w temperaturze 4 °C, ten krok należy wykonać z wyprzedzeniem, aby mógł zrównoważyć się z RT.
2. Opróżnij LRSC do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodaj do 50 ml 1x PBS i wymieszaj. Bardzo powoli dodać 25 ml mieszanki przygotowanej w kroku 2.2 na 15 ml roztworu gradientu gęstości podgrzanego w kroku 2.1.
   UWAGA: Uważaj, aby nie mieszać faz na tym etapie. Krew musi być dodana do roztworu gradientu gęstości bez jakiegokolwiek zakłócenia tej fazy.
3. Odwirować obie probówki wirówkowe przez 25 minut przy 700 x g bez przerw.
   UWAGA: Pod koniec wirowania w gradiacji gęstości warstwy od dołu do góry to: erytrocyty i granulocyty tworzące osad, faza roztworu gradientu gęstości, warstwa PBMC i osocze.
4. Za pomocą pipety przepuścić przez fazę plazmową bez jej zasysania i zebrać warstwę PBMC do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj do 50 ml 1x PBS do PBMC jako etap płukania i wiruj przez 10 minut przy 300 x g.
5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 ml pożywki makrofagowej.

3. Magnetyczne znakowanie i izolacja komórek CD14⁺ (monocytów)

1. Policz PBMC w komorze Malasseza. Pobrać ilość PBMC niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu (zwykle 100 do 300 x 10⁶ komórek), umieścić je w probówce wirówkowej i wirować przez 10 minut przy 300 x g.
2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 μl buforu sortującego przygotowanego w kroku 1.3 na 10-7 PBMCs. Dodać 20 μl mikrogranulek CD14 na 10-7 PBMCs. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu.
3. Dodać 1 ml buforu sortującego na 10⁷ PBMC jako etap płukania i odwirować przez 10 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu sortującego na 10⁸ PBMCs.
4. Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora. Przygotować kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu sortującego.
5. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę. Kolumna zależy od liczby komórek, które mają zostać wyizolowane (w tym przypadku używane są kolumny LS dla maksymalnie 10⁹ PBMC). Zbierz przepływ zawierający nieoznakowane komórki.
   UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie probówki (selekcja ujemna i dodatnia) są przechowywane do późniejszego sprawdzenia różnych etapów za pomocą cytometrii przepływowej.
6. Przemyć kolumnę 3 x 3 ml buforu sortującego. Zbierz nieoznakowane komórki przechodzące przez tę samą probówkę z kroku 3.12. Wykonaj kroki mycia, dodając bufor sortujący, uważając, aby nie wysuszyć kolumny. Umieść probówkę zbiorczą pod kolumną i wyjmij ją z separatora.
7. Odpipetować 5 ml buforu sortującego do kolumny. Natychmiast wypłukać magnetycznie oznaczone ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny. Aby zwiększyć czystość komórek CD14⁺, eluowaną frakcję wzbogaca się w drugiej kolumnie.
8. Powtórz kroki od 3.4 do 3.7 z nową kolumną.

4. Posiewy monocytów

1. Policz monocyty w komorze Malasseza. Sprawdź czystość komórek CD14 ⁺ za pomocą cytometrii przepływowej. Pobrać ilość monocytów niezbędną do eksperymentu i umieścić je w probówce wirówkowej.
2. Wirować przez 10 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad monocytów w pożywce makrofagowej. Płytki komórek i pozwól im osiąść przez 50 minut do 1 godziny. Odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką makrofagową + 10% SAB + 25 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w celu wywołania różnicowania.

5. Polaryzacja makrofagów w dniu 6

1. Zassać pożywkę. Zastąp go pożywką makrofagową + 10% SAB z różnymi bodźcami. Na przykład dodaj 10 ng/ml interferonu gamma (INFγ) + 1 ng/ml lipopolisacharydu (LPS), aby uzyskać polaryzację M1, lub 20 ng/ml interleukiny 4 (IL4) + 20 ng/ml interleukiny 13 (IL13) dla polaryzacji M2.
   UWAGA: Stymulację można wykonać w okresie od 24 do 48 godzin przed przystąpieniem do innych testów.
2. Zbieraj komórki za pomocą roztworu oddzielającego lub skrobaka do komórek.

6. Hodowla komórkowa w warunkach niskiej zawartości tlenu

1. Zaczynając od kroku 4, utrzymuj monocyty, a następnie makrofagi w środowisku kontrolowanym tlenem, aby przeprowadzić analizę stanu niedotlenienia. Użyj stacji roboczej do hipoksji, aby utrzymać komórki pod pożądanym ciśnieniem parcjalnym tlenu podczas eksperymentu.
   UWAGA: Podczas pracy pod niskim ciśnieniem tlenu ważne jest, aby przygotować wszystkie media i myjące pod stacją i odczekać wystarczająco dużo, aby uzyskać prawidłowe ciśnienie parcjalne w cieczy. Na przykład 10 ml PBS na szalce Petriego o średnicy 60 mm potrzebuje około 2 godzin, aby osiągnąć 25 mmHg dla ciśnienia parcjalnego_O2, zaczynając od ciśnienia atmosferycznego (jak zmierzyliśmy za pomocą światłowodowego czujnika tlenu). W wielu stacjach hipoksyjnych lub inkubatorach ciśnienie tlenu jest ustawione jako procent ciśnienia atmosferycznego. Jeśli konieczne są precyzyjne pomiary, lepiej skorzystać ze stacji upoważniającej do bezpośredniego ustawienia ciśnienia tlenu w mmHg.

7. Liza i trawienie w żelu (Protokół 1)

UWAGA: W tej i następnych sekcjach opisane są dwa protokoły używane do otrzymywania peptydów i przeprowadzania analizy LC-MS/MS. Protokół 1 opisuje lizę komórek oraz frakcjonowanie i trawienie w żelu, a protokół 2 opisuje lizę komórek w roztworze, po której następuje trawienie i frakcjonowanie w roztworze przy użyciu metody ogniskowania izoelektrycznego.

1. Przeprowadzić lizę komórek w buforze Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glicerol, 33,3% (v/v) β-merkaptoetanol, błękit bromofenolowy 0,2% w/v]. Załaduj odpowiednik białka 300 000 komórek dla każdej próbki na 4-12% żelach akrylamidowych bis-Tris.
2. Kontroluj czas trwania migracji elektroforetycznej, aby umożliwić podzielenie każdej próbki białka na 6 pasm żelowych, jak pokazano w Rysunek 3.
3. Utrwalić żel roztworem utrwalającym (30% etanol + 7,5% kwas octowy przez 20 min), a następnie dodać roztwór barwiący (R-250 Coomassie blue przez 45 min). Dodaj roztwór odbarwiający (30% etanolu + 7,5% octu, aż pojawią się prążki) przed wycięciem pasm białkowych czystym skalpelem.
4. Każdą wyciętą prążek pokrój w kostkę przed wprowadzeniem do probówek o pojemności 500 μl. Gwarantowana jest czysta szklana powierzchnia, aby uniknąć zanieczyszczenia keratynami (do czyszczenia powierzchni można użyć 5% roztworu SDS w wodzie dejonizowanej).
5. Umyj plastry żelu 3 razy w 200 μl 25 mM wodorowęglanu amonu przez 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemyj je raz w 25 mM wodorowęglanu amonu i acetonitrylu (50% v/v). Odwodnić kawałki żelu za pomocą 200 μl 100% acetonitrylu przez 10 minut.
6. Inkubować każdy kawałek żelu z 10 mM DTT (ditiotreitol) w 25 mM wodorowęglanie amonu przez 45 minut w temperaturze 56 °C (200 μl), a następnie 55 mM jodoacetamidu w 25 mM wodorowęglanu amonu (200 μl) przez 35 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
7. Aby zatrzymać alkilację, inkubować każdy kawałek żelu z 200 μl 10 mM naziemnej telewizji cyfrowej w 25 mM wodorowęglanie amonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj kawałki żelu w 200 μl 25 mM wodorowęglanu amonu, a następnie odwodnić 200 μl 100% acetonitrylu przez 10 minut.
8. Białka trawić przez noc w temperaturze 37 °C za pomocą mieszanki trypsyny/Lys-C zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Ekstrahuj powstałe peptydy z kawałków żelu, dodając 50 μl 50% acetonitrylu przez 15 minut, następnie 50 μl 5% kwasu mrówkowego przez 15 minut, a na koniec 50 μl 100% acetonitrylu przez 15 min. Połącz i wysusz każdą frakcję w probówkach o niskiej absorpcji, aby ograniczyć adsorpcję peptydów i utratę próbki. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

8. Ekstrakcja białka i trawienie w roztworze (Protokół 2)

1. Przeprowadzić lizę komórek (2 x 10⁶ komórek) za pomocą 150 μl następującego buforu do lizy:
   1. 7 M mocznik, 2 M tiomocznik, 40 mM Tris i 4% CHAPS, uzupełnione inhibitorami proteazy (kompletny mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy).
2. Homogenizować roztwory przez 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą termoshakera. Odwirować przy 13 800 x g przez 20 min RT i zachować supernatant.
3. Usuń zanieczyszczenia za pomocą zestawu do czyszczenia 2D:
   1. Zestaw zawiera roztwór strącający, roztwór współstrącający, bufor do płukania i dodatek do mycia.
   2. Dodać 300 μl roztworu strącającego i dobrze wymieszać. Inkubować na lodzie przez 15 minut. Dodać 300 μl roztworu współstrącającego. Odwirować probówki (co najmniej) o masie 12 000 x g przez 5 minut. Powinna być widoczna mała granulka. Przejdź szybko do następnego kroku, aby uniknąć ponownego zawieszenia lub dyspersji granulki. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.
   3. Ponownie odwirować probówki z zawiasem nasadki i granulką skierowaną na zewnątrz, aby sprowadzić pozostały płyn na dno probówki. Wystarczy krótki impuls. W probówkach nie powinien pozostać żaden widoczny płyn.
   4. Nie naruszając osadu, dodać 40 μl roztworu współstrącającego. Pozostaw probówkę na lodzie na 5 minut. Wirować przez 5 minut, a następnie wyjąć i wyrzucić mycie. Dodać 25 μl wody dejonizowanej. Wiruj każdą rurkę przez 5-10 s. Granulki powinny się rozproszyć, ale nie rozpuszczać się w wodzie.
   5. Dodać 1 ml buforu do płukania (wstępnie schłodzonego przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20°C) i 5 μl dodatku do mycia. Wirować, aż granulka zostanie całkowicie zdyspergowana. Inkubować probówki w temperaturze -20°C przez co najmniej 30 minut. Wiruj przez 20-30 s co 10 min
      UWAGA: Probówki można przechowywać w temperaturze -20°C przez okres do 1 tygodnia przy minimalnej degradacji lub modyfikacji białka.
   6. Odwirować probówki (co najmniej) o masie 12 000 × g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powinna być widoczna biała granulka. Pozostaw pellet do wyschnięcia na powietrzu nie dłużej niż 5 minut (jeśli pellet jest zbyt suchy, trudno będzie go ponownie zawiesić).
4. Zawiesić osad białkowy w 300 μl 8 M mocznika i 0,1 M wodorowęglanu amonu. Mocno wirować przez 1 min. Określ stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego.

9. Trawienie w roztworze (Protokół 2)

1. Zredukować mostki dwusiarczkowe przez dodanie 5,1 μl wodnego roztworu DTT o stężeniu 700 mM (stężenie końcowe 12,5 mM) do zawieszonych białek z kroku 8.4 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut za pomocą termoshakera. Reszty alkilatowo-cysteinowe przez dodanie 20,3 μl wodnego roztworu jodoacetamidu o stężeniu 700 mM (stężenie końcowe 40 mM) i inkubację w temperaturze 25°C przez 30 minut w ciemności za pomocą termoshakera.
2. Dodać 990 μl 0,1 M wodorowęglanu amonu do próbki. Dodać odpowiednią objętość mieszanki trypsyny/Lys-C (stosunek enzym do substratu 1:100 w/w). Inkubować w temperaturze 37°C przez noc za pomocą termoshakera.

10. Kaseta czyszcząca (Protokół 2)

1. Zwilżyć wkład 1 objętością kolumny (1 ml) metanolu. Wyczyść wkład 1 objętością kolumny (1 ml) 80% acetonitrylu/wody klasy HPLC i wyrzuć przepływ. Zrównoważyć wkład z 4 objętościami kolumny (4 ml) 0,1% kwasu mrówkowego/wody klasy HPLC i odrzucić przepływ
.
2. Zakwasić próbki 90 μl 10% kwasu mrówkowego lub wodą do pH 2-3 (sprawdzić pH za pomocą wskaźnika pH). Załadować zakwaszone próbki i zebrać przepływ. Ponownie załaduj przepływowy (zawierający niezatrzymane peptydy). Umyj wkład 6 objętościami kolumn (6 ml) 0,1% kwasu mrówkowego/wody klasy HPLC.
3. Elute peptydy z wkładu z 1 objętością kolumny (1 ml) 0,1% kwasu mrówkowego/50% acetonitrylu/wody klasy HPLC. Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zagęścić próbkę za pomocą koncentratora próżniowego (150 x g, próżnia przy ciśnieniu 160 mBar).

11. Frakcjonowanie przez ogniskowanie izoelektryczne (Protokół 2)

UWAGA: Peptydy są rozdzielane według ich punktów izoelektrycznych za pomocą frakcjonatora off-gel na 13 cm pasku pokrywającym zakres pH od 3 do 10. Skorzystaliśmy z następującego protokołu dostarczonego przez dostawcę (podsumowanego poniżej):

1. Przygotować następujące roztwory: roztwór A (600 μl roztworu glicerolu, 60 μl buforu OFFGEL, 4,34 ml wody ultraczystej) i roztwór B (1,776 ml roztworu A i 444 μl wody ultraczystej).
2. Zmontuj paski, ramki i elektrody IPG zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Zawiesić próbkę w 1,8 ml roztworu B. Dodać 40 μl roztworu B do każdej studzienki. Załadować 150 μl próbki do każdego dołka.
4. Wybierz domyślną metodę dla peptydów: OG12PE00 (domyślna metoda OFFGEL dla peptydów do stosowania z zestawem 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, ramki 12-dołkowe. Poczekaj, aż ta metoda zostanie zakończona (~20 godzin). Zbierz frakcje w odpowiednio oznakowanych tubach.

12. Porządkowanie kolumny aparatury Harvarda Odwrócony C18 Post-IEF (Protokół 2)

1. Stopniowo dodawaj po kilka μl jednorazowo 1% TFA w wodzie dejonizowanej do każdej frakcji w celu zakwaszenia próbki. Sprawdź za pomocą papieru pH, czy pH wynosi około 3 lub mniej.
2. Przygotuj następujące roztwory: roztwór 1 (5 ml acetonitrylu, 10 μl kwasu mrówkowego, 4,99 ml wody ultraczystej) i roztwór 2 (0,5 ml acetonitrylu, 10 μl kwasu mrówkowego, 9,49 ml wody ultraczystej).
3. Wstępnie zwilżyć kolumnę wirową 150 μl roztworu 1. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ. Przemyć kolumnę wirową 150 μl roztworu 2. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ.
4. Przepuść ułamek przez kolumnę. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ. Przemyć 150 μl roztworu 2. Wirować przez 90 s przy 750 x g i odrzucić przepływ.
5. Eluować frakcję za pomocą 50 μl roztworu 1. Wirować przez 90 s przy 750 x g. Powtórz te kroki jeszcze raz.
6. Suchą frakcję za pomocą koncentratora próżniowego (150 x g, próżnia 160 mBar) i przechowywać w temperaturze -80°C

13. Analiza danych proteomicznych i bioinformatyki¹⁸

1. Analizuj dane uzyskane przez spektrometr masowy nano-LC MS/MS za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji, takiego jak MaxQuant (wersja 1.5.2.8) i wyszukiwarki Andromeda.
2. Ustaw współczynnik fałszywych odkryć (FDR) na 1% zarówno dla białek, jak i peptydów oraz minimalną długość 7 aminokwasów. Ustaw swoistość enzymu jako C-koniec na Arg i Lys. Pozwól na 2 pominięte rozszczepienia na wiązaniach prolinowych. Wybierz karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację oraz N-końcową acetylację białek i utlenianie metioniny jako modyfikacje zmienne.
3. Kontynuuj analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Przeprowadź analizę wzbogacenia funkcjonalnego za pomocą oprogramowania FunRich (www.funrich.org/). Wykonaj analizę wzbogacenia ontologii genów za pomocą oprogramowania DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).

Wyniki

Począwszy od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) uzyskanych przez wirowanie różnicowe, protokół pozwala na uzyskanie populacji monocytów CD14⁺ o czystości ocenianej na poziomie ponad 98% za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 1). Te monocyty są wtórnie zróżnicowane w kierunku różnych polaryzacji (Ryc. 2). Gdy wybrana jest frakcjonacja na żelu, migracja na żelach ze strony SDS jest dostosowywana do uzyskania liczby...

Dyskusja

Ponieważ proteomika jest potężnym narzędziem do badania ekspresji różnych białek z całej komórki lub przedziałów subkomórkowych, optymalizacja protokołu lizy komórek i trawienia białek była przedmiotem wielu badań. Istnieją trzy główne klasy metod, które obejmują trawienie w żelu (trawienie białek w matrycy żelu poliakrylamidowego)¹⁷, trawienie w roztworze¹⁸ i przygotowywanie próbek wspomagane filtrem¹⁹. Doniesiono, że ta ostatnia metoda, początkowo ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stacja robocza do hipoksji	Oxford Optronix	Hypoxylab
C6 Cytometr przepływowy	BD	Accuri C6
Mocznik	Agilent Technologies	5188-6435
Kwas mrówkowy (FA)	ARISTAR	450122M
R-250 Coomassie niebieski	Biorad	1,610,436
Lipopolisacharyd, E.Coli (LPS)	Zestaw	437627
	GE Healthcare	80-6484-51
RPMI 1640 podłoże, suplement glutamax	Gibco	61870044
HEPES 1 M	Gibco	15630-080
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (NEAA) 100X	Gibco	11140-035
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1X	Gibco	14190-094
Kolumna aparatury Harvard Odwrócona kolumna mikrospinowa C18	Aparatura Harvard	74-4601
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Zainstaluj	AM9260G
NuPAGE Bis-tris 4-12%	Life Technologies SAS	NP0321 BOX
CD14 Mikrokulki ludzkie	Miltenyi Biotec	130-050-201
Kolumna separacyjna MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF)	Miltenyi Biotec	130-096-485
Interleukina 4 (IL4)	Miltenyi Biotec	130-093-917
Interleukina 13 (IL13)	Miltenyi Biotec	130-112-410
Interferon gamma (INFγ)	Miltenyi Biotec	130-096-482
CD14-FITC (klon TÜ K4)	Miltenyi Biotec	130-080-701
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Pierce	28904
Mieszanka trypsyny/Lys-C	PROMEGA	V5073
Kompletny mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001
Roztwór gradientu gęstości ( Histopaque 1077)	Sigma Aldrich	10771-100ML
Accumax	Sigma Aldrich	A7089-100ML
Surowica ludzka z ludzkiego męskiego osocza AB (SAB)	Sigma Aldrich	H4522-100ML
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 30%	Sigma Aldrich	A9576-50ML
Trisma-base	Sigma Aldrich	T1503
Glicerol	Sigma Aldrich	49767
β-Merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148
Błękit bromofenolowy	Sigma Aldrich	114405
Dodecylowy siarczan sodu (SDS) 20%	Sigma Aldrich	5030
Wodorowęglan amonu	Sigma Aldrich	9830
Acetonitryl	Sigma Aldrich	34888
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43819
Jodoacetamid	Sigma Aldrich	57670
Tiomocznik	Sigma Aldrich	T8656
CHAPS	Sigma Aldrich	C9426
Zestaw do oznaczania mikro BCA	ThermoFisher	23235
5 ml sterylna pipeta plastikowa	VWR	612-1685
Thermomixer C Eppendorf	VWR	460-0223
Sep-Pak tC18 wkłady z odwróconą fazą, 100 mg	wody	WAT036820