Artykuł metodologiczny

Preparat peptydowy inhibitora kinazy białkowej C-delta wykorzystujący nanocząstki złota

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58741

⸱

9 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Respiratory Medicine Research Laboratory, Institute of Translation Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University, 3Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Wcześniej używaliśmy hybrydy peptydowej z nanocząsteczkami złota, aby dożylnie dostarczyć syntetyczny peptyd, inhibitor kinazy białkowej C-delta, który zmniejszył ostre uszkodzenie płuc wywołane niedokrwieniem i reperfuzją. Tutaj pokazujemy szczegółowy protokół formuły leku. Inne peptydy wewnątrzkomórkowe mogą być formułowane w podobny sposób.

Streszczenie

Inhibitor kinazy białkowej C-delta (PKCδi) jest obiecującym lekiem zapobiegającym uszkodzeniom narządów wywołanym niedokrwieniem. Zwykle jest sprzężony z peptydem penetrującym komórkę, TAT, w celu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Jednak TAT wykazał niespecyficzną aktywność biologiczną. Nanocząstki złota (GNP) mogą być stosowane jako nośniki leków bez rozpoznanej toksyczności. Dlatego użyliśmy hybrydy GNP/peptyd do dostarczenia PKCδi. Dwa krótkie peptydy (P2: CAAAAE i P4: CAAAAW), w stosunku 95:5, użyto do modyfikacji właściwości powierzchni GNP. GNP sprzężone z PKCδi (GNP/PKCi) są stabilne w wodzie destylowanej, 0,9% NaCl i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej albuminę surowicy bydlęcej lub płodową surowicę bydlęcą. Wcześniej wykazano, że dożylne wstrzyknięcie GNP-PKCi zapobiega uszkodzeniu płuc spowodowanemu niedokrwieniem i reperfuzją. W artykule przedstawiono protokół formułowania PNB/PKCi i oceny właściwości fizykochemicznych PNB/PKCi. Użyliśmy podobnych metod do sformułowania innych leków opartych na peptydach z GNP. Mamy nadzieję, że ten artykuł zwróci większą uwagę na tę nowatorską technologię wewnątrzkomórkowego dostarczania leków i jej zastosowania in vivo.

Wprowadzenie

Przeszczep płuc ratuje pacjentów ze schyłkową fazą choroby płuc1. Przeszkodą pozostają jednak poważne powikłania po przeszczepie płuc. We wczesnych stadiach po przeszczepieniu płuc pierwotna dysfunkcja przeszczepu jest najbardziej szkodliwym powikłaniem1, a jej główną przyczyną jest ostre uszkodzenie płuc wywołane niedokrwieniem i reperfuzją (IR)2.

Pod wpływem zimna, metabolizm w płucach dawcy jest ograniczony do bardzo niskiego poziomu. Jednak reaktywne formy tlenu i synteza tlenku azotu są aktywowane z powodu ustania przepływu krwi3. Po przeszczepie zostaje przywrócone krążenie krwi, a reaktywne formy tlenu i tlenek azotu powstające podczas zimnego niedokrwienia nasilają stan zapalny i śmierć komórek, powodując uszkodzenie tkanek.

Aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym przez IR, w sercu, mózgu i płucach zastosowano inhibitor kinazy białkowej Cδ (PKCδi)4,5,6,7,8. Badania te wykazały, że PKCδi zmniejsza stan zapalny i apoptozę podczas reperfuzji. Zapobiegło to również uszkodzeniom płuc w podczerwieni u szczurów i w modelu przeszczepu płuc6. PKCδi jest zwykle sprzężony z peptydem penetrującym komórkę, TAT, w celu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Wykazano jednak, że sam peptyd TAT ma niespecyficzne działanie biologiczne, w tym promowanie angiogenezy, apoptozy i hamowanie wielu cytokin9,10,11. Nanocząstki, małe cząstki o średnicy od 1 do 100 nm12, zostały zbadane jako kandydaci ułatwiający dostarczanie leków13. W szczególności nanocząstki złota (GNP) są uważane za nieinwazyjne i nietoksyczne. W związku z tym opracowaliśmy GNP jako nośniki dostarczające leki na bazie peptydów14,15.

Powierzchnią GNP można manipulować pod kątem konkretnych zastosowań, takich jak rozpoznawanie molekularne16,17, chemical sensing18, imaging19 i dostarczanie leków. Opracowano hybrydowy system GNP/peptyd, zawierający 20 nm GNP i dwa krótkie peptydy (P2: CAAAAE i P4: CAAAAW) w stosunku 95:5, w celu modyfikacji właściwości powierzchniowych GNP. Peptyd P2, z ujemnie naładowanym kwasem glutaminowym (E) na końcu, stabilizuje GNP w roztworze wodnym, a peptyd P4, z hydrofobowym tryptofanem (W) na końcu, pomaga GNP wejść do komórek14. Reszta cysteiny (C) na końcu N tych peptydów zawiera grupę tiolową, która może być sprzężona ze złotymi powierzchniami14. Ta hybryda peptydu i GNP została następnie wykorzystana do dostarczenia PKCδi (CSFNSYELGSL). Zoptymalizowany stosunek molowy P2:P4 do PKCδi wynosi 47,5:2,5:50. GNP sprzężone z PKCδi (GNP/PKCi) są stabilne w wodzie destylowanej, 0,9% NaCl i PBS zawierającej albuminę bydlęcą lub płodową surowicę bydlęcą14. Wykazano, że dożylne wstrzyknięcie GNP/PKCi zapobiega uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnemu płuc15. W artykule przedstawiono metodę formułowania PNB/PKCi oraz opisano sposób oceny właściwości fizykochemicznych PNB/PKCi. Użyliśmy podobnych metod do sformułowania innych leków na bazie peptydów skoniugowanych z GNP20,21,22. Mamy nadzieję, że ten artykuł zwróci większą uwagę na ten nowatorski preparat do wewnątrzkomórkowego dostarczania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów peptydowych

  1. Pobrać peptydy (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) z zamrażarki -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Trzymaj butelkę zamkniętą, aby zapobiec kondensacji wilgoci na peptydach.
  2. Zważ 0,01 g każdego peptydu na mikrowadze. Umieść każdy peptyd w osobnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  3. Dodaj 18,74 ml wody dejonizowanej (DI) do probówki P2.
  4. Dodaj 16,93 ml wody DI do probówki P4.
  5. Dodać 8,21 ml 50% acetonitrylu rozcieńczonego w wodzie DI do probówki PKCδi.
  6. Krótko odwiruj roztwory peptydów. Umieść stożkowe probówki o pojemności 50 ml w sonikatorze (40 MHz) na 5 minut.
  7. Przynieś roztwory peptydów do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie przygotowane roztwory peptydów powinny mieć 1 mM.
  8. Przenieść 1 ml każdego roztworu peptydu do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 19 ml wody demineralizowanej do probówek P2 i P4 i dodać 19 ml 50% acetonitrylu do probówki PKCδi, tak aby każdy roztwór rozcieńczyć do 50 μM i przechowywać we własnej probówce.

2. Formułowanie PNB/PKCi

  1. Peptydy powinny być dodawane do roztworu GNP, gdy nadal znajdują się w BSC
  2. Dodać 475 μl P2, 25 μl P4 i 500 μl roztworu δPKCi do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 9 ml roztworu GNP o długości 20 nm (7,0x1011 cząstek/ml) do tej samej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Wyjdź z szafy bezpieczeństwa biologicznego. Owiń probówkę o pojemności 15 ml folią aluminiową. Pozostaw go na noc na shakerze w RT.
  4. Umieścić próbki z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Podaniec 1 ml GNP/PKCi do każdej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Odwirować probówki w mikrowirówce przez 30 minut w temperaturze 15,294 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant z każdej probówki znajdującej się pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby usunąć supernatant, upewniając się, że granulka GNP pozostaje nienaruszona i nie jest zasysana.
  7. Ponownie zawiesić osad w żądanym rozpuszczalniku zgodnie z wymaganym stężeniem. Odpowiednimi rozpuszczalnikami mogą być woda DI, PBS i 0,9% NaCl.
    UWAGA: Począwszy od 1 ml GNP/PKCi, granulka GNP zawiera 6,3 x 1011 cząstek, w oparciu o stężenie GNP podane przez producenta. Aby podać 1,3 x 1012 cząstek w 500 μL 0,9% NaCl, dodajemy 232 μL 0,9% NaCl do każdej z trzech granulek. Po zebraniu ich razem możemy zebrać 500 μL roztworu GNP/PKCi.
    UWAGA: Dobrze wymieszaj żądany rozpuszczalnik przed rozcieńczeniem granulki GNP/PKCi, w przeciwnym razie GNP/PKCi ulegnie agregacji.

3. Ocena rozpuszczalności hybryd GNP/PKCi

  1. Wlać 0,5 ml roztworu GNP/PKCi do kuwety akrylowej. Umieść kuwetę akrylową na spektrofotometrze UV-Vis i przetestuj absorpcję pików15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Należy zwrócić szczególną uwagę na ocenę właściwości biofizycznych hybrydy GNP/PKCi, ponieważ GNP wykazują tendencję do agregacji w rozpuszczalniku. W przypadku agregacji GNP kolor roztworu zmienia się z różowego na fioletowy (Rysunek 1a). Spektrofotometr UV-Vis pozwala na bardziej czułe wykrycie tych zmian. Jeśli GNP/PKCi nie uległy agregacji, maksimum absorpcji powinno znajdować się przy 525 nm (Rysunek 1b). W przypadku agregac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zapewnić prawidłowe sformułowanie, ważne jest, aby roztwór δPKCi został poddany etapowi sonikacji opisanemu w ppkt 1.6. Sekwencja peptydu δPKCi zawiera ugrupowania hydrofobowe, więc sonikator pomaga w rozpuszczaniu PKCi w 50% roztworze acetonitrylu. Ponadto bardzo ważne jest dokładne wymieszanie rozpuszczalnika, jak opisano w kroku 2.7. Hybryda GNP/PKCi nie będzie dobrze sformułowana, jeśli te kroki nie zostaną wykonane prawidłowo, ze względu na agregację peptydu δPKCi23.
 
Preparaty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia na temat tego projektu.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty badawcze z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (PJT-148847), Ministerstwa Badań i Innowacji Ontario (RE-08-029) oraz Canada First Research of Excellence Program, Medicine by Design na Uniwersytecie w Toronto. Dr Mingyao Liu jest kierownikiem Katedry Urazów, Naprawy i Regeneracji Płuc im. Jamesa i Mary Davie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ujemnie naładowany peptyd kwasu glutaminowego (P2)CanPeptideSekwencja: CAAAAE-NH2
Długość: 6aa
Modyfikacja: C-końcowe amidowanie
Ilość: 50 mg < br / > Czystość: >95%
hydrofobowy peptyd tryptofanu (P4)CanSekwencja peptydów: CAAAAW-NH2
Długość: 6aa
Modyfikacja: C-końcowe amidacja
Ilość: 50mg
Czystość: >95%
δ Peptyd PKCiCanPeptideSeqeuence: CSFNSYELGSL-NH2
Długość: 11aa
Modyfikacja: C-końcowe amidowanie
Ilość: 50 mg < br / > Czystość: > 95%
Rurka stożkowa (50 ml)Corning Life Sciences3582070
Rurka stożkowa (15 ml)Corning Life Sciences3582096
AcetonitrylSigma-Aldrich271004-100ML
SonikatorBranson Ultrasonics Corp.Branson 2510MTH
MicrotubeDiamed.caAD 150-N
Roztwór nanocząstek złotaTed Pella15705-5Wielkość cząstek to 20nm
Wytrząsarka z platformą kołyszącąVWR international40000-304 
MikrowirówkaEppendorf5417R
Kuweta akrylowaSARSREDT67.758
Spektrofotometr UV-VisAgilentCaty 60 UV-Vis

Bibliografia

  1. Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
  2. Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
  3. Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
  4. Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
  5. Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
  6. Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
  7. Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
  8. Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
  9. Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
  10. Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
  11. Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
  12. Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
  13. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  14. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  15. Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
  16. Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
  17. Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
  18. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
  19. Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
  20. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  21. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  22. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  23. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
  24. Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
  25. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
  26. Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360(2009).
  27. Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
  28. Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
  29. Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie nanocz steczek z otakoniugacja peptyd wuszkodzenie niedokrwienno reperfuzyjnespektrofotometria UV Visagregacja nanocz steczekpobieranie kom rkowesynteza peptyd wsystem dostarczania lek wstabilno nanocz steczek

Powiązane artykuły