Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

DOI:

10.3791/58751

⸱

4 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Anesthesiology Department, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2Scientific Research Center, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy przy użyciu wzmocnionej zielonej fluorescencji wyrażającej białko Escherichia coli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje prostą i powtarzalną metodę przeprowadzania testu fagocytozy. Pierwsza część tej metody polega na zbudowaniu wektora pET-SUMO-EGFP (SUMO = mały modyfikator podobny do ubikwityny) i ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w Escherichia coli (BL21DE). E. coli wykazująca ekspresję EGFP jest inkubowana z makrofagami przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C; Ujemną grupę kontrolną inkubuje się na lodzie przez ten sam czas. Następnie makrofagi są gotowe do oceny. Do zalet tej techniki należą proste i nieskomplikowane kroki, a fagocytozę można zmierzyć zarówno za pomocą cytometru przepływowego, jak i mikroskopu fluorescencyjnego. E. coli wykazujące ekspresję EGFP są stabilne i wykazują silny sygnał fluorescencyjny nawet po utrwaleniu makrofagów paraformaldehydem. Metoda ta nadaje się nie tylko do oceny linii komórkowych makrofagów lub pierwotnych makrofagów in vitro, ale także do oceny fagocytozy granulocytów i monocytów w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Wyniki pokazują, że zdolność fagocytarna makrofagów otrzewnowych u młodych (ośmiotygodniowych) myszy jest wyższa niż makrofagów u starszych (16-miesięcznych) myszy. Podsumowując, metoda ta mierzy fagocytozę makrofagów i nadaje się do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy fagocytozy makrofagów są często używane do badania wrodzonej funkcji odpornościowej. Wrodzona odpowiedź immunologiczna może wskazywać na podatność na infekcje. Linie komórkowe makrofagów są szeroko stosowane w badaniach immunologicznych. Jednak przedłużone pasaż może spowodować utratę genów i upośledzenie funkcji odpornościowych w tych liniach komórkowych. Tak więc pierwotne makrofagi otrzewnowe są idealnym obiektem do badania funkcji komórki1.

Chociaż wrodzona odpowiedź immunologiczna była uważana za nienaruszoną w starszym ciele, zdolność fagocytarna może się zmniejszyć w porównaniu do tej w młodszym ciele2,3. Tutaj pokażemy metodę oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej od młodej (ośmiotygodniowej) i starszej (16-miesięcznej) myszy przy użyciu E. coli z ekspresją EGFP, co jest wygodne, szybkie i ekonomicznie wykonalne.

Użycie szczepu E. coli wykazującego ekspresję EGFP jest jedną z zalet tego testu, ponieważ bakterie te są stabilne i wykazują silny sygnał fluorescencyjny, nawet po utrwaleniu makrofagów przez 4% (w/v) paraformaldehydu. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu E. coli wykazującej ekspresję EGFP, naukowcy nie potrzebują dalszego barwienia po fagocytozie, co oszczędza czas. Ponadto makrofagi reagują immunologicznie na antygen powierzchniowy E. coli, co sprawia, że E. coli jest bardziej odpowiednia do testu fagocytozy niż przy użyciu grzybów eksprymujących EGFP lub kulek znakowanych fluoresceiną.

Z ekspresją EGFP E. coli, test fagocytozy może być łatwo wykonany w ciągu 2 godzin i zmierzony zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii fluorescencyjnej, w zależności od celu badacza. Ponieważ ta metoda bezpośrednio mierzy zdolność fagocytarną, wyniki są bardziej powtarzalne niż inne metody pośrednie.

Ta metoda została również zweryfikowana w linii komórkowej RAW264.7 i ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej4. Poniższy tekst zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania tego testu i podkreśla krytyczne kroki, które naukowcy mogą zmodyfikować, aby spełnić potrzeby swoich eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Szesnastomiesięczne (o masie ciała 30-35 g) i ośmiotygodniowe (20-25 g) samce myszy C57BL/6 z filtrem SPF (wolne od specyficznych patogenów) uzyskano z centrum dla zwierząt SPF Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Wszystkie myszy trzymano w pomieszczeniach dla zwierząt z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Temperatura była utrzymywana na poziomie 20-24 °C, wilgotność wynosiła 40%-70%, a oświetlenie było 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Zwierzętom pozwolono zaaklimatyzować się w środowisku przez co najmniej 7 dni przed eksperymentem.

1. Budowa plazmidu pET-SUMO-EGFP i indukcja ekspresji EGFP

  1. Zsyntetyzować fragment genu EGFP (sekwencja 717 pz zsyntetyzowana przez niestandardową usługę syntezy genów, patrz Tabela materiałów i plik uzupełniający 1 dla sekwencji) i amplifikować fragment za pomocą startera do przodu (5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGC-3') i startera odwrotnego (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), przy użyciu polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności.
  2. Aby upewnić się, że produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mają pojedyncze 3' zwisy adeniny do klonowania TA w następnym kroku, należy zastosować 30-minutowe przedłużenie w temperaturze 72 °C po ostatnim cyklu (patrz plik uzupełniający 1 dla warunków PCR). Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
  3. Sklonuj produkt PCR do wektora pET-SUMO (patrz tabela materiałów) przy użyciu metody klonowania TA5 z ligazą DNA T4. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 30 minut. Wektor jest linearyzowany między nukleotydami 653 i 654 z nawisem T 1 pz 5′ na każdej nici.
  4. Przekształcić produkt ligacji w chemicznie kompetentny szczep BL21(DE) E. coli w następujący sposób: dodać 5 μl (100 ng) produktu PCR do 100 μl kompetentnych komórek BL21(DE) poprzez szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s; przechowywać mieszaninę na lodzie przez 3 minuty, a następnie dodać 400 μl bulionu lizogenicznego (LB) podgrzanego w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 120 obr./min.
  5. Inokulować 100 μl bakterii na powierzchni płytki LB-kanamycyny (100 μg/ml) induktorem laktozy (0,5 mmol/l), uzyskując szczep ekspresji EGFP. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Jeśli EGFP zostanie pomyślnie wyrażony, niektóre kolonie można zaobserwować jako świecące zielone światło w ciemności.
    1. Opcjonalnie wybierz kolonie, aby zweryfikować wstawiony fragment EGFP za pomocą sekwencjonowania DNA. Startery do sekwencjonowania DNA to: forward, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; rewers, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
  6. Zaszczepić dodatnią kolonię w 5 ml pożywki LB za pomocą 100 μg/ml kanamycyny. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy prędkości 120 obr./min przez 2 godziny, a następnie dodać induktor laktozy do końcowego stężenia 0,5 mmol/l i kontynuować wstrząsanie przez 6 godzin, wywołując ekspresję EGFP. Empirycznie, podczas wytrząsania przez 6 godzin, gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) może osiągnąć 0,7 lub więcej.
  7. Dodać 10 μl pożywki bakteryjnej na szkiełko podstawowe, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zbadać ekspresję EGFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Bakterie wykazujące ekspresję EGFP mogą być przechowywane w pożywce w temperaturze 2-8 °C przez kilka tygodni.

2. Izolacja makrofagów otrzewnowych myszy i hodowla pierwotna

  1. Dodać 3,5 g tioglikolanu do 100 ml wody destylowanej i przed użyciem przelać mieszaninę w autoklawie do sterylności. Przepompować pożywkę tioglikolanową do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml w kapturze do wstrzykiwań otrzewnowych dla myszy. Użyj jednej myszy na strzykawkę, aby uniknąć infekcji. Stosowanie tioglikolanu może zwiększyć liczbę makrofagów. Rezydentne makrofagi otrzewnowe można wyizolować bez tioglikolanu, ale z niższą wydajnością makrofagów.
  2. Znieczulij mysz metodą zatwierdzoną przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Wstrzyknąć 1 ml 3,5% pożywki tioglikolanowej do jamy otrzewnej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły 23 G.
    UWAGA: Wywołując znieczulenie, wstrzyknięcie otrzewnowe można łatwo wykonać i zmniejsza ryzyko urazów narządów wewnętrznych spowodowanych wstrzyknięciem.
  3. Utrzymuj mysz z wodą i jedzeniem ad libitum przez 3 dni. Codziennie monitoruj masę ciała i spożycie pokarmu przez zwierzę. Jeśli utrata masy ciała jest większa niż 10% w ciągu 3 dni, wyklucz zwierzę z eksperymentu.
  4. Po 3 dniach poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po szybkim wywołaniu znieczulenia sewofluranem w zamkniętym pudełku. Alternatywnie, użyj metody, która została zatwierdzona przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania, aby poddać mysz eutanazji.
  5. Włóż mysz do naczynia (o średnicy 10 cm) z 75% etanolem do sterylizacji i szybko przenieś do kaptura. Umieść mysz na talerzu i przypnij przednią łapę do tablicy, aby ustalić pozycję myszy.
  6. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przymocowanej do igły o sile 20 g, umieszczając igłę pod kątem 30°-40°, wstrzyknąć 5 ml zimnej (4-10 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w dolnej części brzucha do jamy otrzewnej myszy, unikając nakłuwania jelita. Jeśli jelito (lub jakikolwiek inny narząd) zostanie przebite, mysz i jej komórki nie mogą być już wykorzystywane do eksperymentów, ponieważ może to aktywować komórki, które nie nadają się do pierwotnej hodowli komórek.
  7. Wykonaj delikatny masaż po obu stronach brzucha myszy. Następnie delikatnie i powoli zasysaj płyn. Dozuj płyn otrzewnowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Powtórz te kroki 2x lub 3x.
  8. Odwirować zawieszone komórki przez 10 minut przy 400 x g w wirówce z chłodzeniem (4-8 °C). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Policz komórki. Empirycznie gęstość komórek jest w przybliżeniu równa 5 x 106 komórek/ml, gdy komórki są ponownie zawieszone w 10 ml pożywki.
  9. Dodać 5 x 106 komórek do każdej studzienki 6-dołkowej płytki do testu cytometrii przepływowej i 5 x 105 komórek na studzienkę do 24-dołkowej płytki do mikroskopu fluorescencyjnego. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez noc. Pożywkę hodowlaną można odświeżyć po 3 godzinach w celu usunięcia nieprzylegających komórek, ponieważ większość z nich to limfocyty. Przylegające komórki to głównie makrofagi, które mogą dobrze przylegać do plastiku poddanego działaniu kultur tkankowych.

3. Test fagocytozy makrofagów przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego

  1. Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola, aby ocenić żywotność i gęstość komórek.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej. Dodać 100 μl świeżej pożywki hodowlanej i 10 μl zawiesiny bakteryjnej (około 2 x 107 komórek) do każdego dołka, jak opisano w tabeli 1. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% emisjiCO2
    3. .
  3. Delikatnie przemyj 3x-5x 500 μl zimnego PBS na studzienkę, aby wypłukać nieinternalizowane bakterie.
  4. Inkubować komórki z 4% formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Przemyć stałe komórki 3x PBS (500 μL/studzienkę).
  6. Dodać 200 μl sprzężonego roztworu roboczego z barwnikiem fluorescencyjnym phalloidyny 633 (patrz tabela materiałów), aby zabarwić F-aktynę. Przechowywać w ciemnym, wilgotnym miejscu (60%-80%) w temperaturze pokojowej przez 60 min. Przepłucz komórki 3x PBS (500 μL/studzienkę), aby usunąć nadmiar falloidyny. Poprzez barwienie F-aktyny można zarysować cytoplazmę i pomóc w odróżnieniu zinternalizowanych bakterii.
  7. Dodać 200 μl roztworu roboczego DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindolowego) (1 μg/ml) w celu wybarwienia jądra komórkowego i inkubować przez 5 minut w ciemnym, wilgotnym miejscu w temperaturze pokojowej. Przepłukać 1x PBS (500 μL/studzienkę) i 1x tą samą objętością wody destylowanej. Następnie komórki będą gotowe do obserwacji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Test fagocytozy makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Aby zminimalizować błędy eksperymentalne i dokonać właściwej interpretacji wyników, należy ustawić grupy i probówki kontrolne dla eksperymentu zgodnie z listą w Tabeli 2.
    1. W przypadku grupy kontrolnej, która zostanie umieszczona na lodzie (grupa 4 w tabeli 2), należy usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej i przemyć ją 1x PBS. Następnie dodaj 1 ml 70 mM zimnego EDTA do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej. Do probówki dodać 50 μl zawiesiny bakteryjnej i umieścić ją na lodzie na 1 godzinę.
    2. W przypadku pozostałych grup należy usunąć pożywkę hodowlaną. Dodaj 1 ml świeżego podłoża do każdej studzienki. Dodać 50 μl zawiesiny bakteryjnej do studzienek zgodnie z ustawieniem grupy, jak opisano w tabeli 2. Następnie umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę.
  2. Aby ugasić fluorescencję niezinternalizowanej E. coli, dodaj 200 μl 0,8% roztworu wodnego fioletu krystalicznego (CV) do studzienki i krótko się kołysz, unikając w ten sposób fałszywie dodatniego wyniku przez E. coli wyrażającą EGFP wiążącą się z powierzchnią makrofagów, ale nie zinternalizowaną. Umyj ogniwa 3x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości CV.
  3. Następnie dodaj 1 ml 70 mM zimnego EDTA do studzienki, aby odłączyć komórki i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.
  4. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Dodać 100 μl PBS w celu ponownego zawieszenia komórek. Dodać 5 μl przeciwciała sprzężonego z F4/80-PE (antygen powierzchniowy wyrażany na makrofagach myszy) do probówek lub użyć izotypu IgG2a-PE, zgodnie z ustawieniem grupy. Krótko wirować i inkubować próbki na lodzie przez 5-10 minut w ciemności.
  6. Dodać 1 ml PBS do każdej probówki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osady komórkowe za pomocą 200-300 μl PBS do analizy cytometrii przepływowej. Uruchom każdą probówkę i uzyskaj dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń komórek F4/80+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektor pET-SUMO wykorzystuje mały modyfikator podobny do ubikwityny, aby umożliwić ekspresję natywnych białek w E. coli. Fuzja SUMO może znacznie zwiększyć rozpuszczalność EGFP, umożliwiając jego łatwe wykrycie. Jeśli ekspresja EGFP zostanie skutecznie wywołana przez laktozę, zielone kolonie można zaobserwować w ciemności (Rysunek 1A). Zielone kropki, które reprezentują E. coli wykazującą ekspresję EGFP, można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki w tym protokole są dość proste i nieskomplikowane. Jednym z krytycznych etapów jest indukcja ekspresji EGFP na E. coli. Zwykle, gdy planuje się ekspresję genu eukariontów, takiego jak EGFP, u prokariontów, takich jak E. coli, istnieje ryzyko, że białko utworzy nieaktywne agregaty (ciała inkluzyjne), co zmieni natywną strukturę i aktywność białka. Wykorzystując wektor pET-SUMO i konstruując plazmid pET-SUMO-EGFP, białko fuzyjne EGFP-SUMO uległo pomyślnej ekspresji, a sygnał świetlny był wystarczają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 31800046) oraz Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Liaoning (nr 20170540262) wsparły tę pracę. Praca ta została wykonana w laboratoriach Centrum Badań Naukowych w Drugim Szpitalu Uniwersytetu Medycznego w Dalian. Autorzy chcieliby podziękować Xiao-Lin Sang za jej pomoc w cytometrii przepływowej oraz Bo Qu i Dong-Chuan Yangowi za pomoc w produkcji filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD FACSCanto II Cytometr przepływowyBD Biosciences-Biotyna
anty-mysie CD16/32 PrzeciwciałoBiolegendCat101303
Champion pET SUMO System ekspresji białekInvitrogenK300-01
Niestandardowa usługa syntezygenów Takara Biotech.-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)PrzeciwciałoD1306
F4/80-PE dla FACSBiolegendCat123110
Leica DMI3000 B  Mikroskop odwróconyLeicaMicrosystems-PE
Rat IgG2a, kontrola izotypu κ-izotypBiolegendCat400507
Phalloidin 633 fluorescencyjny roztwór roboczy sprzężony z barwnikiemAAT BioquestCat23125
Podłoże tioglikolanoweSigma-AldrichT9032
przeciw mysim ThermoFisher

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).
  2. Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
  3. Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
  4. Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
  5. Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
  6. Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
  7. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
  8. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  9. Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
  10. Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
  11. Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Escherichia coli ekspresuj ca EGFPanaliza cytometri przep ywowmikroskopia fluorescencyjnaizolacja makrofag w otrzewnowychindukcja tioglikolanemkoinkubacja bakterii EGFPgaszenie fioletem krystalicznymbarwienie przeciwcia em F4 80funkcja odporno ci wrodzonej

Powiązane artykuły