Artykuł metodologiczny

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

25.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58757

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Streszczenie

Formułowanie związku terapeutycznego w postaci nanocząsteczek (NPs) może nadać unikalne właściwości. W przypadku leków słabo rozpuszczalnych w wodzie, preparaty NP mogą poprawiać biodostępność i modyfikować dystrybucję leków w organizmie. W przypadku leków hydrofilowych, takich jak peptydy lub białka, enkapsulacja w nanocząsteczkach może również zapewnić ochronę przed naturalnymi mechanizmami klirensu. Istnieje kilka technik wytwarzania polimerowych nanocząsteczek, które są skalowalne. Flash NanoPrecipitation (FNP) to proces, w którym wykorzystuje się zmodyfikowane geometrie mieszania do wytwarzania nanocząsteczek o wąskim rozkładzie wielkości i regulowanych rozmiarach od 30 do 400 nm. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące produkcji na skalę laboratoryjną nanocząstek polimerowych typu rdzeń-powłoka o docelowej wielkości przy użyciu FNP. Protokół może być wdrożony do hermetyzacji związków hydrofilowych lub hydrofobowych z niewielkimi modyfikacjami. Technika ta może być z łatwością stosowana w laboratorium w skali miligramowej do przesiewania preparatów. Trafienia ołowiu można bezpośrednio skalować do skali gramowej i kilogramowej. Ze względu na to, że jest to proces ciągły, zwiększanie skali wiąże się z dłuższym czasem trwania procesu mieszania, a nie z translacją na nowe zbiorniki procesowe. NP produkowane przez FNP są silnie obciążone środkiem terapeutycznym, posiadają gęstą stabilizującą szczotkę polimerową i mają powtarzalność wielkości ± 6%.

Wprowadzenie

Od końca lat dziewięćdziesiątych obserwuje się stały wzrost liczby badań klinicznych z wykorzystaniem nanomateriałów1,2. Rosnące zainteresowanie odzwierciedla potencjał nanomateriałów w zakresie poprawy biodostępności leków hydrofobowych i umożliwienia preferencyjnego ukierunkowania w obrębie organizmu3. Nanocząstki polimerowe (określane tutaj jako nanocząstki lub nanocząsteczki) stanowią coraz większą część tej klasy materiałów2. Nanocząsteczki wzbudziły zainteresowanie, ponieważ mają wysoce regulowane właściwości, takie jak rozmiar, skład i funkcjonalizacja powierzchni4. W przypadku stosowania do podawania słabo rozpuszczalnych leków, nanocząsteczki często mają strukturę rdzeń-powłoka, w której środek terapeutyczny jest zamknięty w hydrofobowym rdzeniu, a otoczka składa się z hydrofilowej szczotki polimerowej. Prosty sposób na wygenerowanie tej struktury wykorzystuje amfifilowy kopolimer diblokowy (BCP) składający się z degradowalnego bloku hydrofobowego, który stanowi część rdzenia cząstki, oraz hydrofilowego bloku poli(glikolu etylenowego) (PEG), który tworzy szczotkę polimerową i nadaje stabilizację steryczną4,5.

Nanoprecypitacja jest powszechną techniką wytwarzania nanocząstek polimerowych, ponieważ jest prosta i nie wymaga dużej ilości energii6. W najprostszej formie nanowytrącanie polega na dodaniu pipetą składników NP w rozpuszczalniku organicznym, takim jak aceton, do nadmiaru wymieszanej wody. Zmiana rozpuszczalnika na rozcieńczony roztwór wodny powoduje wytrącenie się nierozpuszczalnego składnika rdzenia. Stabilizator gromadzi się na tej rosnącej powierzchni cząstek, kierowany przez adsorpcję zapadniętego bloku hydrofobowego7,8,9,10. Równomierny rozkład wielkości cząstek uzyskuje się, gdy rozpuszczalnik i woda szybko mieszają się, tworząc jednorodny roztwór. Mieszanie, które jest wolniejsze niż zarodkowanie i składanie składników, skutkuje większą, bardziej polidyspersyjną populacją cząstek. Chociaż jest łatwo dostępne dla prostego testu, podejście wsadowe z mieszadłem powoduje dużą zmienność ze względu na niespójność mieszania i nie nadaje się do skalowania w górę6,11. Mikrofluidyka pojawiła się jako kolejna droga do produkcji NP, która może być prowadzona w sposób ciągły. Ten sposób produkcji został niedawno poddany przeglądowi przez Dinga i wsp.11. Powszechne podejście wykorzystuje ogniskowanie przepływu laminarnego w celu zmniejszenia skali długości rozpuszczalnika do wartości submikronowych. Mieszanie antyrozpuszczalnika odbywa się na drodze dyfuzji, więc małe wymiary przepływu mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia jednorodnych cząstek11,12. Zrównoleglenie wielu komór mikroprzepływowych w celu zwiększenia skali jest problematyczne w przypadku dużych wolumenów produkcji.

Warunki szybkiego mieszania, które sprzyjają równomiernemu nanowytrącaniu w mikrofluidyce, mogą być wytwarzane w ograniczonych, burzliwych przepływach. Nanoprecypitacja Flash (FNP) wykorzystuje specjalne geometrie mieszania, aby osiągnąć te warunki przy wyższych objętościowych natężeniach przepływu niż jest to możliwe w przypadku mikrofluidyki. Strumienie wlotowe wchodzą do komory mieszania w warunkach turbulentnych, które prowadzą do powstawania wirów, tak że na skali długości dyfuzji tworzą się blaszki rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika11,13. W ten sposób uzyskuje się równomierne mieszanie w skali czasowej krótszej niż zarodkowanie i wzrost terapeutyki. Ograniczona geometria mieszalnika nie pozwala na ominięcie strumienia w obszarze, w którym zachodzi turbulentne rozpraszanie energii, a cały system doświadcza tego samego procesu historia13. Zarodkowanie zachodzi równomiernie w komorze mieszania, a wzrost cząstek postępuje do momentu zatrzymania przez złożenie BCP na powierzchni9,14. Mieszany strumień zawierający stabilne cząstki można następnie rozcieńczyć dodatkowym rozpuszczalnikiem, aby zahamować dojrzewanie cząstek Ostwalda15,16,17.

Mieszalnik CIJ (A Limited Impacting Jet) jest najprostszym projektem mieszalnika dla FNP i pozwala na mieszanie dwóch strumieni w sposób skalowalny i ciągły, jak pokazano w Rysunek 1A13. Mieszalnik wirowy z wieloma wlotami (MIVM) został opracowany, aby umożliwić do czterech różnych wejść strumienia, jednocześnie osiągając szybkie mikromieszanie wymagane do równomiernego tworzenia cząstek, jak pokazano na Rysunek 1B18. FNP umożliwia proste badania przesiewowe preparatów, które można łatwo przełożyć na produkcję na skalę komercyjną. Ze względu na ciągły charakter procesu, większe wielkości partii nie wymagają nowych zbiorników, ale raczej dłuższych czasów pracy, co umożliwia proste przełożenie na produkcję na skalę kilogramową w tym samym ciągu urządzeń.

Hydrofilowe związki, takie jak peptydy i białka ('biologiczne') mogą być również kapsułkowane w procesie zwanym odwrotnym nanoprecypitacją błyskawiczną (iFNP). Technika wymaga amfifilowego BCP, gdzie jeden blok jest hydrofobowy, a drugi jest poliacid19. Pierwszym etapem jest szybkie zmieszanie strumienia dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającego lek biologiczny i BCP z rozpuszczalnikiem lipofilowym, takim jak dichlorometan lub chloroform. Powoduje to powstawanie cząstek stabilizowanych hydrofobową szczotką blokową. W tym przypadku taka architektura zostanie określona mianem "odwróconego" NP. Rdzeń zawiera polikwas, który jest następnie sieciowany jonowo za pomocą kationu wielowartościowego. Stabilizuje to cząstki do przetworzenia w środowisku wodnym w postaci mikrocząstek lub nanocząstek pokrytych PEG za pomocą technik, które zostały opisane w literaturze19,20,21.

Ten protokół może być wykorzystany do produkcji na skalę laboratoryjną polimerowych nanocząsteczek typu rdzeń-powłoka, zawierających w sobie związki hydrofobowe lub hydrofilowe. Podrozdziały protokołu zawierają instrukcje dotyczące korzystania z obu klas mikserów - CIJ i MIVM. Czytnik powinien być w stanie dostosować protokół do nowych komponentów rdzeniowych i odtwarzalnie generować nanocząstki o pożądanej wielkości przy użyciu odpowiedniego miksera dla wejść strumienia. Poniżej przedstawiono trzy przykładowe preparaty z wykorzystaniem FNP i iFNP. Dwa z nich wykorzystują mikser CIJ, a jeden wymaga klasy MIVM15,22. Pierwsza formulacja demonstruje enkapsulację modelowego związku hydrofobowego przez FNP. Drugi preparat demonstruje enkapsulację modelowego związku hydrofilowego za pomocą iFNP w mieszalniku CIJ. Ostateczna formuła stanowi przykład enkapsulacji białka przez iFNP przy użyciu MIVM. Protokół dla tej trzeciej formuły opisuje użycie małego, ręcznego MIVM określanego jako "μMIVM". Konstrukcja mieszalnika jest mniejsza, aby umożliwić uproszczone przesiewanie preparatów, ale zachowanie skalowania jest dobrze zrozumiałe, a mieszalnik nie jest urządzeniem mikroprzepływowym22. Ostatnia sekcja protokołu zawiera kilka uwag na temat zwiększania skali preparatów ołowiu zidentyfikowanych podczas badań przesiewowych. Preparaty te mają na celu zapewnienie punktów dostępu do nauki procesu, a co za tym idzie, wykorzystanie nieulegających degradacji polimerów na bazie poli(styrenu). Alternatywne stabilizatory zostały opisane w literaturze, z wieloma dostępnymi biokompatybilnymi opcjami komercyjnymi14,23,24.

Protokół

1. Enkapsulacja związków hydrofobowych w polimerowych NP za pomocą mieszalnika CIJ

  1. Przygotuj i wyczyść sprzęt.
    1. Zakup i walidacja mieszalnika CIJ.
      Uwaga: Patrz sekcja 1 Informacje uzupełniające, aby uzyskać wskazówki dotyczące budowy. Pliki CAD są również dostępne jako informacje uzupełniające.
    2. Przed każdym użyciem upewnij się, że wszystkie złączki miksera CIJ są dobrze dopasowane, a rurka wylotowa nie jest wygięta ani ściśnięta.
    3. W dygestorium podłącz strzykawkę typu luer lock o pojemności 5 ml zawierającą 2-3 ml rozpuszczalnika do każdego adaptera wlotowego. Wybierz rozpuszczalnik (np. aceton), który usunie wszelkie związki ostatnio używane w mieszalniku.
      Uwaga: Typowe wybory to aceton lub tetrahydrofuran (THF). Używaj wyłącznie strzykawek polipropylenowych, aby uniknąć problemów z kompatybilnością rozpuszczalników, takich jak wypłukiwanie. Nie używać strzykawek z gumowymi tłokami uszczelniającymi typu O-ring.
    4. Umieść zestaw CIJ nad pojemnikiem na odpady.
      Uwaga: Dobrze sprawdza się kolba z otworem mniejszym niż korpus CIJ, która podtrzymuje mieszalnik i umożliwia łatwą obsługę strzykawek.
    5. Równomiernie wciskać tłoki strzykawki, aby opróżnić zawartość przez komorę mieszania przez kilka sekund. Wyjąć strzykawki.
      Uwaga: Strzykawki można zachować i ponownie użyć do wielu rund czyszczenia między seriami FNP.
    6. Osuszyć wnętrze miksera CIJ za pomocą strumienia N2. Skuteczny jest męski adapter luer na końcu linii N2.
      Uwaga: Jeśli rozpuszczalnik czyszczący nie jest lotny (np. DMSO), powtórz kroki 1.1.3-1.1.5 z acetonem lub THF przed przejściem do kroku 1.1.6. Bardzo ważne jest, aby usunąć resztki rozpuszczalnika w celu uzyskania spójności między cyklami.
  2. Przygotować strumienie rozpuszczalników i antyrozpuszczalników w docelowych kompozycjach.
    1. Rozpuść związek hydrofobowy (tj. witaminę E) w nieustabilizowanym THF w stężeniu 10 mg/ml w ilości wystarczającej do wykonania żądanej liczby przebiegów FNP. Przygotuj nieco więcej niż potrzeba na bieg.
      Uwaga: Na tych etapach można użyć innych rozpuszczalników, z zastrzeżeniem ograniczeń w sekcji Dyskusja. W przypadku stosowania THF zalecany jest rozpuszczalnik bez stabilizatora, ponieważ butylowany hydroksytoluen ma niską rozpuszczalność w wodzie. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć gromadzenia się nadtlenku (w tym testowania nadtlenków) i należy pamiętać, że niski poziom nadtlenków może zakłócać niektóre zastosowania NP (np. wybielanie barwników).
    2. Wymieszaj roztwór witaminy E w mieszalniku wirowym, aż do rozpuszczenia.
      Uwaga: W przypadku niektórych związków sonikacja kąpieli przez 1-2 minuty może pomóc w wytworzeniu rozpuszczonego roztworu. Ważne jest, aby wszystkie składniki NP były rozpuszczone molekularnie.
    3. Rozpuścić stabilizator kopolimeru blokowego (tj. poli(styren)-b-poli(glikol etylenowy), PS1,6k-b-PEG 5k) w THF w stężeniu 10 mg/ml w przybliżeniu tej samej objętości co w kroku 1.2.1, aby utworzyć roztwór polimeru.
      Uwaga: Można stosować inne rozpuszczalniki, z zastrzeżeniem ograniczeń wyszczególnionych w sekcji Dyskusja.
    4. Wymieszaj roztwór polimeru z mieszalnikiem wirowym, aż do rozpuszczenia. W razie potrzeby umieść roztwór w kąpieli sonizacyjnej na 1-2 minuty, aby ułatwić rozpuszczenie ciał stałych.
      Uwaga: Polimer nie może być w formie micelarnej. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) może być użytecznym narzędziem do określenia, czy nowy skład strumienia spełnia to kryterium.
    5. Utworzyć strumień wejściowy rozpuszczalnika zawierający 5 mg/ml zarówno witaminy E, jak i stabilizatora (50% obciążenia witaminą E), najpierw pipetując 0,25 ml roztworu witaminy E do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie odpipetować 0,25 ml roztworu polimeru do tej samej probówki.
      Uwaga: Objętości większe niż 0,5 ml na serię są możliwe do uzyskania przy różnych rozmiarach strzykawek. Powyżej 10 ml objętości wejściowej praktyczne jest użycie pompy strzykawkowej.
    6. Dobrze wymieszaj w mieszalniku wirowym przez 5-10 s. Opcjonalnie odwiruj probówkę o sile 1000 x g przez 5-10 s, aby odzyskać płyn przyklejony do nakrętki, co poprawia odtwarzalność między cyklami CIJ.
    7. Odpipetować 0,525 ml wody dejonizowanej do drugiej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako strumień antyrozpuszczalnika.
      Uwaga: Lepiej jest mieć nadmiar rozpuszczalnika, co zapewnia, że strumień rozpuszczalnika nigdy nie dostanie się do komory mieszania bez obecności antyrozpuszczalnika. W niektórych przypadkach, gdy rozpuszczalność soli w mieszaninie rozpuszczalnik/antyrozpuszczalnik nie jest ograniczona, można zastosować buforowane systemy wodne.
    8. Odpipetować 4 ml wody dejonizowanej do 20 ml fiolki scyntylacyjnej lub innego odpowiedniego pojemnika jako kąpiel hartowniczą. Umieść małe mieszadło magnetyczne w fiolce.
      Uwaga: Kąpiel hartownicza zmniejsza dojrzewanie Ostwalda poprzez obniżenie końcowej zawartości rozpuszczalnika do 10% objętościowo15,17. Objętość ta może być dostosowywana do ograniczeń procesu i może być bezpośrednio skalowana za pomocą głośności strumienia wejściowego.
  3. Produkcja NP przez FNP przy użyciu mieszalnika CIJ.
    1. Umieścić otwartą fiolkę do kąpieli hartowniczej pod oczyszczonym mieszalnikiem CIJ na płycie mieszającej w dygestorium. Praktyczna konfiguracja wykorzystuje blok stojaka na probówki o pojemności 50 ml do podparcia mieszalnika CIJ z fiolką znajdującą się poniżej i rurką wylotową skierowaną do fiolki. Zobacz Rysunek 1A dla orientacji.
    2. Rozpocznij mieszanie kąpieli hartowniczej za pomocą mieszadła magnetycznego z maksymalną prędkością około 75%.
    3. Za pomocą polipropylenowej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę z końcówką, pobrać pełną objętość z probówki z rozpuszczalnikiem.
      Uwaga: Nie należy używać strzykawek z gumową uszczelką typu O-ring, aby uniknąć problemów z kompatybilnością. W przypadku większych objętości wlotowych należy użyć strzykawki typu luer lock o odpowiedniej wielkości. Wylot strzykawki musi być wyśrodkowany na osi strzykawki, w przeciwnym razie będzie niestabilny podczas depresji.
    4. Ostrożnie usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i wyjąć igłę z końcówką, wyrzucając do pojemnika na ostre przedmioty.
    5. Zalać tłok tak, aby strumień docierał tylko do otworu strzykawki. Podłączyć strzykawkę do jednej ze złączek wlotowych CIJ.
    6. Powtórzyć kroki 1.3.3-1.3.5 dla roztworu rozpuszczalnika.
    7. Szybkie, płynne i równomierne wciskanie strzykawek w tym samym czasie, umieszczając kłębek dłoni, dłoń lub jeden kciuk na końcach tłoków, w zależności od osobistych preferencji. Zebrać ścieki do fiolki z kąpielą hartowniczą.
      Uwaga: Wejście 0.5 ml powinno zostać wciśnięte w mniej niż 0.5 s.
    8. Odstawić na bok mieszalnik CIJ z dołączonymi strzykawkami. Wyjmij mieszadło i zakryj fiolkę, która teraz zawiera dyspersję NP o strukturze cząstek typu rdzeń-skorupa (Rysunek 1C).
    9. Trzymać mikser nad pojemnikiem na roztwór odpadowy i wyjąć strzykawki. Objętość podtrzymania (około 0,25 ml) zostanie następnie opróżniona. Wyrzuć zużyte strzykawki i powtórz krok czyszczenia 1.1 przed następną próbą FNP.
      Uwaga: Nie należy dopuścić do opróżnienia się objętości zatrzymanej do fiolki zawierającej NPs, ponieważ wpłynie to negatywnie na jednorodność próbki.
  4. Wykonaj analizę i obróbkę końcową dyspersji NP.
    1. Aby scharakteryzować wielkość NP za pomocą DLS, należy odpipetować 100 μl dyspersji NP do plastikowej kuwety i dodać 900 μl rozpuszczalnika w kąpieli hartowniczej (np. wody).
      Uwaga: W przypadku kuwet o małej objętości można stosować mniejsze objętości. Na ogół wystarcza 10-krotne rozcieńczenie.
    2. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wstrząsając. Postępuj zgodnie z instrukcjami specyficznymi dla urządzenia, aby przeanalizować próbkę.
      Uwaga: W razie potrzeby można zastosować alternatywne techniki charakteryzacji, takie jak analiza potencjału zeta lub mikroskopia elektronowa. Dyspersja NP może być dalej przetwarzana zgodnie z zaleceniami aplikacji i przeglądana w sekcji Dyskusja.

2. Enkapsulacja związków hydrofilowych w odwróconych nanocząsteczkach za pomocą mieszalnika CIJ

  1. Przygotować rozpuszczalnik, rozpuszczalnik i roztwory hartownicze w dygestorium.
    1. Wykonaj procedury czyszczenia i przygotowania opisane w kroku 1.1, używając DMSO jako rozpuszczalnika czyszczącego i postępując zgodnie z notatką w kroku 1.1.6, aby zakończyć drugie płukanie THF.
    2. Rozpuścić związek hydrofilowy (tj. maltodekstrynę (MD) z ekwiwalentem dekstrozy (DE) 4-7, średnia masa cząsteczkowa = 3,275 g/mol, "3k MD") w DMSO w stężeniu 10 mg/ml w objętości wystarczającej do wykonania żądanej liczby przebiegów FNP.
      Uwaga: Można stosować inne rozpuszczalniki, z zastrzeżeniem ograniczeń opisanych w sekcji Dyskusja.
    3. Wymieszaj roztwór maltodekstryny z mieszalnikiem wirowym aż do rozpuszczenia. W razie potrzeby umieść roztwór w kąpieli sonizacyjnej na 1-2 minuty, aby ułatwić rozpuszczenie ciał stałych.
    4. Utworzyć stabilizator kopolimeru blokowego (tj. poli(styren)-b-poli(kwas akrylowy), PS 5k-b-PAA4,8k) roztwór podstawowy w THF w stężeniu 11,1 mg/ml w przybliżeniu tej samej objętości co w kroku 2.1.2, aby utworzyć roztwór polimeru.
      Uwaga: Można stosować inne rozpuszczalniki i stężenia stabilizatorów. DMSO może być z łatwością stosowany jako rozpuszczalnik zamiast THF.
    5. Wymieszaj roztwór polimeru z mieszalnikiem wirowym, aż do rozpuszczenia. W razie potrzeby umieść roztwór w kąpieli sonizacyjnej na 1-2 minuty, aby ułatwić rozpuszczenie ciał stałych.
      Uwaga: Wkład polimerowy nie może być w formie micelarnej. DLS może być używany do określenia, czy nowy skład strumienia spełnia to kryterium.
    6. Przygotuj wejściowy strumień rozpuszczalnika (0,5 ml), łącząc kolejno następujące elementy w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml: 0,250 ml roztworu 3k MD, 0,225 ml roztworu polimeru i 0,025 ml wody dejonizowanej.
      Uwaga: Zawartość wody w tym strumieniu ma duży wpływ na wielkość NP i polidyspersyjność. Generalnie najlepiej jest działać w zakresie 2,5-10 vol% 20. Wartości na górnym końcu zakresu mogą pomóc w enkapsulacji związków o większej masie cząsteczkowej.
    7. Dobrze wymieszaj na mikserze wirowym przez 5-10 sekund.
    8. Opcjonalnie należy odwirować probówkę o masie 1000 x g przez 5-10 sekund, aby odzyskać płyn przyklejony do nakrętki, co poprawia odtwarzalność między cyklami CIJ.
    9. Przygotować sieciujący roztwór dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl2) w metanolu w stężeniu 25,0 mg/ml.
      Uwaga: Środek sieciujący zostanie dodany w stosunku ładunku 1:1 do grup kwasowych w bloku PAA. Dostosuj odpowiednio stężenie, jeśli używany jest inny środek sieciujący lub jeśli używany jest blok PAA o innym rozmiarze lub stężeniu polimeru20,21.
    10. Przygotować strumień rozpuszczalnika, pipetując 0,5 ml chloroformu i 0,05 ml roztworu środka sieciującego (łącznie 0,55 ml) do probówki do mikrowirówki.
      Uwaga: Inne dopuszczalne rozpuszczalniki są podyktowane wyborem kopolimeru blokowego i zazwyczaj obejmują dichlorometan lub aceton. Zamiast tego środek sieciujący można dodać do kąpieli hartowniczej, z dodatkowym starzeniem dyspersji NP, aby umożliwić tworzenie usieciowania20.
    11. Dobrze wymieszaj na mikserze wirowym przez 5-10 sekund.
    12. Opcjonalnie należy odwirować probówkę o masie 1000 x g przez 5-10 sekund, aby odzyskać płyn przyklejony do nakrętki, co poprawia odtwarzalność między cyklami CIJ.
    13. Dodać 4 ml rozpuszczalnika (tj. chloroformu) do 20 ml fiolki scyntylacyjnej w celu utworzenia kąpieli hartującej. Umieść małe mieszadło magnetyczne w fiolce.
      Uwaga: Objętość ta może być dostosowana w celu uwzględnienia ograniczeń procesu.
  2. Wypełnij protokół tworzenia NP zgodnie z opisem w kroku 1.3.
  3. Wykonaj analizę i obróbkę końcową dyspersji NP.
    1. Aby scharakteryzować wielkość NP za pomocą DLS, należy odpipetować 100 μl dyspersji NP do szklanej kuwety i dodać 900 μl rozpuszczalnika używanego do kąpieli hartowniczej.
    2. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół lub lekko mieszając kuwetę. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby przeanalizować sample.
      Uwaga: Sieciowanie nanocząsteczek można jakościowo ocenić za pomocą DLS przy użyciu dobrego rozpuszczalnika, takiego jak DMSO lub dimetyloformamid (DMF) jako rozcieńczalnik DLS20. Cząstki, które są stabilnie usieciowane, będą wykazywać funkcję autokorelacji w rozpuszczalniku przy minimalnej zmianie wielkości cząstek. Słabo usieciowane cząstki pęcznieją i wykazują słabą funkcję autokorelacji oraz siłę rozpraszania21.
    3. Opcjonalnie dodaj zasadę, taką jak amoniak, aby napędzać kompleksowanie jonowe i wzmacniać sieciowanie w rdzeniu cząstki.
      1. Opcjonalnie należy przygotować grawimetrycznie roztwór amoniaku w metanolu o stężeniu 3,48 mg/ml przy użyciu roztworu wodorotlenku amonu (zazwyczaj 30% wag. amoniaku). Dodawać kroplami 50 μl (tj. 0,6 równoważnika w odniesieniu do grup kwasowych na polimerze) mieszając.
        Uwaga: Odpowiedniki można dostosować w razie potrzeby, zmieniając stężenie lub objętość dodaną25.
      2. Opcjonalnie starzej się nie mniej niż 30 minut z łagodnym mieszaniem, aby nastąpiło sieciowanie.
    4. Przetwarzaj dyspersję NP w celu wytworzenia mikrocząstek lub powlekanych nanocząsteczek zgodnie z opisem w literaturze19,20,21.

3. Enkapsulacja albuminy jaja kurzego w odwróconych nanocząsteczkach za pomocą μMIVM

  1. Przygotować roztwory rozpuszczalników i antyrozpuszczalników.
    1. Przygotować roztwór albuminy jaja kurzego o stężeniu 50 mg/ml w wodzie dejonizowanej ("OVA").
    2. Przygotować 0,75 ml roztworu A w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, rozcieńczając 75 μl roztworu OVA 0,675 ml DMSO, aby uzyskać 5 mg/ml roztworu OVA w DMSO zawierającego 10% objętości wody. Dobrze wymieszać i krótko odwirować, jak opisano wcześniej.
      Uwaga: Patrz krok 2.1.6 dotyczący wpływu wody. Podobnie jak w poprzednich sekcjach, woluminy rozwiązania można skalować w górę lub w dół, aby dopasować je do potrzeb materiałowych.
    3. Przygotować roztwór B, rozpuszczając stabilizator kopolimeru blokowego (tj. poli(styren)-b-poli(kwas akrylowy), PS 5k-b-PAA4,8k) w DMSO w stężeniu 6 mg/ml. Dobrze wymieszaj i poddaj sonikacji do rozpuszczenia, jeśli to konieczne. Odpipetować 0,75 ml do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    4. Odpipetować 0,75 ml THF (roztwór C) do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    5. Pobrać pipetą 1,85 ml chloroformu (roztwór D) do szklanej fiolki scyntylacyjnej.
    6. Przygotować 60,0 mg/ml dwuwodnego roztworu sieciującego chlorku wapnia w metanolu. Wymieszaj za pomocą miksera wirowego.
    7. Przygotować roztwór amoniaku o stężeniu 4,17 mg/ml w metanolu, jak opisano w kroku 2.3.4.
    8. Dodać 5,25 ml chloroformu do 15 ml probówki wirówkowej jako kąpiel hartowniczą.
  2. Przygotuj zespół miksera i postaw.
    1. Zbierz dolny odbiornik, dysk geometrii mieszającej, górny dysk, klucz płaski i O-ring. Zobacz Rysunek 2 dla schematu komponentów i terminologii stanowisk mikserów.
      Uwaga: Szczegółowe informacje na temat budowy MIVM można znaleźć w Informacjach uzupełniających (sekcja 1) oraz w literaturze22. Pliki CAD są również dostępne jako informacje uzupełniające.
    2. Umieść O-ring w rowku, upewniając się, że jest dobrze dopasowany i że nie ma śladów zużycia lub uszkodzenia.
      Uwaga: Normalna eksploatacja doprowadzi do zużycia lub spuchniętych rozpuszczalnikiem O-ringów. Jeśli O-ring wydaje się rozciągnięty lub zdeformowany, pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu przez noc przed użyciem. Jeśli kształt nie odzyska się przez noc, wyrzuć O-ring. Zachowaj duży zapas, ponieważ jest to część eksploatacyjna.
    3. Ostrożnie wyrównaj otwory tarczy mieszającej z kołkami na górnej tarczy i dociśnij do siebie. Upewnij się, że O-ring nie zostanie przemieszczony, sprawdzając, czy oba elementy są równo osadzone.
    4. Odwróć dwa elementy i ręcznie zmontuj je z dolnym odbiornikiem. Upewnij się, że złączka rurki wylotowej została poluzowana, aby nie przeszkadzała w całkowitym dokręceniu dysku.
      Uwaga: Jeśli gwint zaczepi się podczas montażu, ostrożnie zdemontuj i nałóż na gwint środek zapobiegający zatarciu klasy spożywczej lub farmaceutycznej, aby zapobiec zacieraniu.
    5. Po ręcznym dokręceniu przymocuj klucz płaski do górnych kołków dyskowych i mocno dokręć zespół. Następnie dokręć złączkę rurki wylotowej tak, aby mocno przylegała do dolnej powierzchni geometrii mieszania. Upewnij się, że łączniki strzykawki na górnym dysku są dobrze dopasowane.
    6. Umieść zmontowany mikser na stojaku miksera tak, aby rurka wylotowa wystawała poniżej płyty nośnej. Podeprzyj ruchomą płytę tak, aby była zawieszona poza przestrzenią roboczą.
    7. Opcjonalnie, aby sprawdzić wyrównanie ogranicznika mechanicznego, najpierw podłącz puste szklane strzykawki do wlotów mieszalnika.
      Uwaga: Objętościowe natężenia przepływu są zmieniane za pomocą strzykawek o różnych średnicach cylindrów, ponieważ strzykawki są wciskane jednocześnie z tą samą prędkością liniową. Początkowa i końcowa wysokość pionowa musi być taka sama dla wszystkich strzykawek i może być regulowana za pomocą ustalających wkręconych w wałek tłoka22. Mechaniczne ograniczniki zapewniają, że nie dojdzie do nadmiernego uszkodzenia szklanych strzykawek.
      1. Opcjonalnie opuść ruchomą płytę tak, aby spoczęła na ogranicznikach mechanicznych. Upewnij się, że są one wyrównane w taki sposób, aby płytka również zatrzymała się bezpośrednio przed zetknięciem się z pustymi strzykawkami (jak pokazano na Rysunek 2).
      2. Opcjonalnie poluzuj ograniczniki mechaniczne i w razie potrzeby zmień ich położenie. Wyjąć szklane strzykawki i zresetować ruchomą płytkę.
        Uwaga: W przypadku pracy ze strzykawkami z tworzywa sztucznego ograniczniki mechaniczne nie są wymagane.
    8. Umieść otwartą wannę hartowniczą poniżej rurki wylotowej, aby zebrać ścieki.
    9. Pobrać roztwór A do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły z końcówką. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza i wyrzucić igłę. Zalać roztwór do końca złączki luer strzykawki. Powtórz ten proces dla roztworów B i C.
    10. Pobrać roztwór D do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 2,5 ml za pomocą igły z końcówką. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza i wyrzucić igłę. Zalać roztwór do końca złączki luer strzykawki.
      Uwaga: Objętości te zostały dobrane w taki sposób, aby początkowe wysokości tłoka strzykawki były takie same. Jeśli woluminy zostaną zmienione, nadal muszą spełniać to wymaganie dotyczące wysokości.
    11. Umieścić cztery strzykawki na mikserze w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, w kolejności alfabetycznej. Zobacz Rysunek 1B dla ostatecznego wyglądu i schematu orientacji strzykawki.
      Uwaga: Sprawdź, czy żadna ze strzykawek nie różni się znacząco od innych i rozwiąż problemy w razie potrzeby.
  3. Wykonaj obsługę miksera i czyszczenie.
    1. Chwyć obudowę łożyska po obu stronach ruchomej płyty. Nie kładź palców na dolnej powierzchni obudowy, ponieważ stwarza to ryzyko przytrzaśnięcia mechanicznych ograniczników. Powoli opuścić ruchomą płytkę, tak aby spoczywała równomiernie, ale ledwo dotykała strzykawek.
    2. Równomiernie i płynnie wciskaj płytkę, dążąc do zakończenia operacji w około 0,5-1 s dla tych objętości strumienia22.
      1. Zdjąć i zakryć rurkę wanny do gaszenia, która teraz zawiera dyspersję NP.
    3. Wziąć mikser z nadal dołączonymi strzykawkami i przytrzymać go nad pojemnikiem na odpady. Wyjąć strzykawki, pozwalając, aby płyn podtrzymający spłynął do pojemnika. Przytrzymaj zespół miksera do góry nogami i zdemontuj mikser za pomocą klucza płaskiego.
    4. Za pomocą butelki z rozpylaczem przepłucz rurkę wylotową kilkoma mililitrami rozpuszczalnika (np. acetonu) i osusz powietrzem lub azotem.
    5. Przepłukać geometrię mieszania dobrym rozpuszczalnikiem (np. wodą dejonizowaną lub DMSO), a następnie spłukać acetonem za pomocą kilku mililitrów z butelki z rozpylaczem. Wysuszyć strumieniem powietrza lub azotu.
    6. O-ring opłukać w strumieniu wody dejonizowanej i osuszyć.
    7. Dokładnie spłucz górny dysk kilkoma mililitrami acetonu za pomocą butelki z rozpuszczalnikiem, aż będzie wizualnie czysty. Osuszyć strumieniem powietrza lub azotu zarówno powierzchnię, jak i złączki strzykawki.
    8. Przepłukać każdą strzykawkę kilkoma mililitrami dobrego rozpuszczalnika (np. wody dejonizowanej lub acetonu) z butelki z rozpuszczalnikiem. Nałóż ostatnie płukanie kilku mililitrów acetonu i wysusz na powietrzu przed następnym użyciem.
  4. Wykonywanie przetwarzania końcowego i analizy.
    1. Dodawać kroplami 50 μl roztworu sieciującego dwuwodnego chlorku wapnia, mieszając z maksymalną prędkością około 75%.
    2. Dodawać kroplami 50 μl roztworu amoniaku, mieszając z maksymalną prędkością 75%. Starzenie się przez co najmniej 30 minut.
    3. Scharakteryzować wielkość NP zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 i 2.3.2.
    4. Przetwarzaj dyspersję NP w celu wytworzenia mikrocząstek lub powlekanych nanocząsteczek zgodnie z opisem w literaturze19,20,21.

4. Modyfikacje dla zwiększenia skali formulacji

  1. Przygotować roztwory rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika zgodnie z opisem w krokach 1, 2 lub 3 w pożądanym składzie i w objętości wystarczającej do wymaganej wielkości preparatu.
  2. Opcjonalnie, w razie potrzeby, wyczyść i wysterylizuj mieszalnik na miejscu przy użyciu odpowiedniego protokołu przed utworzeniem NP.
    Uwaga: W przeszłości stosowano sekwencyjne płukanie 100, wodą (do neutralnego pH), 200, wodą (do neutralnego pH) i odpowiednim rozpuszczalnikiem. Dodatkowo sterylne filtry mogą być przymocowane do wlotów mieszalnika w przypadkach, gdy końcowa wielkość cząstek wyklucza sterylizację przez filtrację.
  3. Załadować roztwory do gazoszczelnych strzykawek o odpowiedniej objętości i podłączyć rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) z adapterem luer zamontowanym na końcu. Ręcznie zagruntuj roztwory do końca rurki.
    1. Załadować strzykawki do pompy strzykawkowej i podłączyć je do wlotów mieszalnika w CIJ lub MIVM, zgodnie z wymaganiami.
      Uwaga: Alternatywnie, regulatory przepływu mogą być używane w skali laboratoryjnej lub pilotażowej, aby zapewnić większe możliwości objętościowe niż pompa strzykawkowa. Udana eksploatacja wymaga stałego przepływu i wystarczającego spadku ciśnienia, co oznacza, że zbiorniki ciśnieniowe z pomiarem przepływu na wylocie są najbardziej odpowiednim wyborem do produkcji na dużą skalę.
  4. Umieścić naczynie zbiorcze zawierające kąpiel hartowniczą o wystarczającej objętości, jeśli jest to wymagane, pod rurką wylotową.
  5. Ustaw objętościowe natężenia przepływu tak, aby odpowiadały tym osiąganym ręcznie (np. około 30-60 ml/min na strumień).
    Uwaga: W przypadku korzystania z CIJ natężenia przepływu pompy muszą być identyczne. W przypadku korzystania z MIVM różne wloty mogą mieć różne natężenia przepływu.
  6. Jednocześnie uruchom pompy. Zebrać około 5-10 ml ścieków jako odpady do małej fiolki (jest to "objętość początkowa"), a następnie rozpocząć zbieranie w kąpieli hartowniczej.
  7. Scharakteryzować i przetworzyć zgodnie z opisem w odpowiedniej sekcji dotyczącej formułowania powyżej.

Wyniki

Przesiewanie formulacji NP za pomocą FNP jest szybkie i wymaga niewielkich ilości materiału (rzędu 1-10 mg). Protokół FNP służący do enkapsulacji związków hydrofobowych, takich jak witamina E (krok 1), pozwala na otrzymanie stabilnej, przejrzystej lub lekko opalizującej dyspersji NP. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) stanowi niezawodny sposób charakteryzacji wielkości cząstek. Jak pokazano na Rysunku 3, proces ten w sposób powtarzalny wytwarza NP o niskiej polidyspersyjności. Typowy indeks polidyspersyjności (PDI) wynosi mniej niż 0,20, co wskazuje na relatywnie monodyspersyjną populację. PDI jest wyznaczany z funkcji autokorelacji i często jest implementowany w oprogramowaniu urządzenia. Jest to stosunek drugiego do pierwszego momentu, gdzie dla cząstek monodyspersyjnych zazwyczaj uzyskuje się wartości rzędu 0,126. Dla czterech zgłoszonych powtórzeń formulacji witamina E/PS-b-PEG wartość ta wyniosła 0,12 ± 0,02, a średnica wynosiła 107 ± 7 nm. Na Rysunku 3 przedstawiono również typowy „błąd” wynikający z nierównomiernego lub zbyt wolnego nacisku na strzykawki. Polidyspersyjność nie uległa zmianie, ale rozmiar był nieco większy (135 nm). Uwzględniając tę próbkę, nowe parametry wielkości cząstek wynoszą 113 ± 14 nm. Błąd prowadzi do okresów, w których w komorze znajduje się tylko jeden rodzaj strumienia. Ważne jest, aby cały strumień przechodził przez tę samą historię procesu i posiadał te same wzglбne objętości strumieni organicznego i wodnego wewnątrz mieszalnika. Bez stabilizatora powstaje nieprzezroczysty roztwór z widocznymi agregatami. Funkcja autokorelacji DLS dla tej próbki jest niemonotoniczna i nie wygasza się gładko, co widać na wstawce do Rysunku 3.

Kontrola rozmiaru cząstek za pomocą FNP została przedstawiona na Rysunku 4, gdzie zmiana względnych ilości materiału rdzenia – w tym przypadku poli(styrenu)1.8k – oraz stabilizatora PS-b-PEG doprowadziła do uzyskania cząstek o rozmiarach od 49 do 152 nm. Rozmiary te uzyskano przy strumieniach THF o całkowitym stężeniu masowym rdzenia i stabilizatora wynoszącym 20 mg/mL, w których materiał rdzenia w postaci poli(styrenu) stanowił 25%, 50% lub 75% całkowitej masy. Polidyspersyjność nanocząstek była zawsze niższa niż 0,15. Szczegółowe omówienie wpływu parametrów na rozmiar cząstek wytwarzanych metodą FNP można znaleźć w literaturze10. Stopień obciążenia można dostosować, utrzymując stałą objętość rozpuszczalnika i zmieniając względne objętości roztworów stokowych rdzenia i stabilizatora. Podobnie, całkowite stężenie masowe można zmieniać, przygotowując roztwory stokowe o stężeniach innych niż 10 mg/mL. W określonych warunkach za pomocą DLS27 można zaobserwować populację pustych miceli. Nie ma to żadnego szkodliwego wpływu, poza poszerzeniem zmierzonego rozkładu wielkości cząstek. W przypadku podobnych rozmiarów może się to objawiać w postaci jednego szerokiego piku zamiast dwóch oddzielnych pików.

Ten sam mieszalnik CIJ może być również wykorzystany do enkapsulacji związków hydrofilowych za pomocą iFNP, co przedstawiono w kroku 2 protokołu. Cząstki wytworzone w opisanej formulacji mają wielkość około 65 nm przy niskiej polidyspersyjności wynoszącej 0,08. Rozkład wielkości przedstawiono na Rysunku 5A (linie przerywane). Wpływ sieciowania reszt kwasu karboksylowego PAA na stabilność cząstek wykazano za pomocą analizy DLS w silnym rozpuszczalniku, takim jak DMSO, co przedstawiono na Rysunku 5B. Funkcja autokorelacji dla dobrze sieciowanych cząstek powinna rozpoczynać się w pobliżu wartości 1 i gwałtownie spadać do 0 w czasie charakterystycznym, który jest powiązany z wielkością cząstek (linia ciągła). Cząstki, które znacznie pęcznieją lub rozpuszczają się, nie są sieciowane i wykazują minimalny sygnał autokorelacji (linia kropkowana). W przypadku iFNP nieudane próby objawiają się w sposób podobny do opisanych powyżej FNP. Mogą być widoczne agregaty lub może zostać zaobserwowany niewłaściwy kształt funkcji autokorelacji DLS. Urządzenie MIVM może być stosowane do FNP lub iFNP, gdy z powodu ograniczeń systemowych, takich jak rozpuszczalność lub niekompatybilność chemiczna, wymaganych jest więcej niż dwa strumienie wlotowe. Wersja małoscale MIVM (μMIVM) wraz ze statywem mieszalnika przedstawiona jest na Rysunku 2. Podobnie jak w przypadku CIJ, mieszalnik ten może być wykorzystany do enkapsulacji związków hydrofobowych lub hydrofilowych22. W kroku 3 opisano protokół enkapsulacji białka hydrofilowego, OVA, za pomocą iFNP. Rozkład wielkości cząstek przedstawiono na Rysunku 5A (linia ciągła). Wielkość wynosi około 125 nm przy PDI wynoszącym 0,16. Ogólny protokół obsługi pompy strzykawkowej w większej skali znajduje się w kroku 4.

Układ wygaszania rozpuszczalnik-antyrozpuszczalnik; schemat, aparatura eksperymentalna, tworzenie nanocząstek.
Rysunek 1: Schematy zestawu mieszalnika i wewnętrznego wzorca przepływu. (A) Mieszalnik z ograniczonymi zderzającymi się strumieniami (CIJ) z przymocowanymi strzykawkami znajduje się nad kąpielą wygaszającą. Na zdjęciu nie widoczny jest mieszadło magnetyczne w fiolce z kąpielą wygaszającą oraz mieszadło magnetyczne. Geometria mieszania przedstawiona jest w widoku powiększonym, ukazującym dwa wloty strumieni, które zderzają się w centrum komory. (B) Przedstawiono wielowlotowy mieszalnik wirowy (μMIVM) ze szklanymi strzykawkami, umieszczony w statywie nad kąpielą wygaszającą. Płyta ruchoma i ograniczniki mechaniczne zostały wycięte ze zdjęcia. Widok powiększony schematycznie przedstawia komorę wirową i kanały wlotowe. (C) Schematyczne przedstawienie nanocząstek (NP) typu rdzeń-otoczka wytworzonych za pomocą FNP. Czerwone sfery reprezentują lek terapeutyczny, który wraz z niebieskim zapadniętym blokiem polimerowym tworzy rdzeń NP. Żółty blok polimerowy tworzy warstwę szczotkową zapewniającą stabilizację steryczną NP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do badania ściskania, schemat z opisanymi elementami: płyta ruchoma, ogranicznik mechaniczny, płyta wsporcza.
Rysunek 2: Terminologia μMIVM i komponenty do montażu. μMIVM wymaga statywu mieszacza, aby umożliwić równomierne wciskanie czterech strzykawek. W tym przypadku wysokości tłoków strzykawek muszą być identyczne, aby zapewnić spójne mieszanie. Alternatywnie urządzenie można obsługiwać za pomocą pomp strzykawkowych. Po lewej stronie rysunku przedstawiono statyw mieszacza z opisanymi komponentami. Po prawej znajduje się rozmontowany mieszacz z zamontowanym pierścieniem O-ring na tarczy geometrii mieszania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rozkład wielkości nanocząstek, wykres znormalizowanej intensywności z wstawką czasu korelacji względem intensywności.
Rysunek 3: Rozkład wielkości polimerowych nanocząstek zawierających rdzeń z witaminą E i stabilizowanych przez PS-b-PEG. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) dostarcza rozkładów wielkości ważonych intensywnością, które wskazują rozkład średnicy NP. Krzywe stanowią średnią z analiz powtórzonych trzykrotnie dla każdej próby i zostały przeskalowane w celu uzyskania identycznych maksymalnych wysokości piku. Cztery powtórzenia (linie ciągłe) wskazują na wysoką powtarzalność metody (odchylenie standardowe = 7 nm). Uwzględniono również reprezentatywny błąd wykonania (linia przerywana), taki jak zbyt mała prędkość tłoka strzykawki lub nierównoprzydatne dociśnięcie dwóch strzykawek, co skutkuje większą średnicą cząstek. Odchylenie standardowe wielkości NP z uwzględnieniem błędu wykonania wynosiło 14 nm. (Wstawka) Bez stabilizatora PS-b-PEG powstają duże agregaty w skali mikronowej (lub krople, w przypadku oleju takiego jak witamina E). Funkcja autokorelacji DLS z pomiaru bez stabilizatora (linia kropkowana) jest przedstawiona wraz z reprezentatywną autokorelacją z powtórzenia dla nanocząstek (linia ciągła). Funkcja autokorelacji wykazuje szereg charakterystycznych skal czasowych dla próbki kontrolnej, co wskazuje na populację polidyspersyjną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres rozkładu wielkości nanocząstek; zmienne zawartości rdzenia, znormalizowana intensywność względem średnicy.
Rysunek 4: Kontrola wielkości cząstek za pomocą FNP poprzez zmienianie względnych stosunków materiału rdzenia do stabilizatora. Przedstawiono rozkłady wielkości ważone intensywnością dla trzech formulacji z rdzeniem z poli(styrenu) stabilizowanym przez PS-b-PEG. Całkowite stężenie masy w THF wynosiło 20 mg/mL, a antyrozpuszczalnikiem była woda. Formulacje przygotowano w mieszalniku CIJ. Ułamek masy stanowiący materiał rdzenia jest podany w legendzie. Na przykład próbka z 25% rdzeniem zawierała 5 mg/mL poli(styrenu) i 15 mg/mL PS-b-PEG. Średnie wielkości dla zawartości rdzenia 25% (linia ciągła), 50% (linia przerywana) i 75% (linia mieszana) wynosiły odpowiednio 49 nm, 96 nm i 152 nm. Wszystkie wartości PDI były mniejsze niż 0,15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy rozkładu wielkości nanocząstek i funkcji korelacji; analiza dynamicznego rozpraszania światła.
Rycina 5: Charakterystyka odwróconych NP wykonanych w mieszalniku CIJ lub μMIVM. (A) Krzywe DLS stanowią średnią z analiz przeprowadzonych w trzech powtórzeniach dla każdej formulacji. Linia przerywana wskazuje rozkład wielkości cząstek 3k MD wykonanych w mieszalniku CIJ, natomiast linia ciągła przedstawia rozkład wielkości cząstek OVA wykonanych w μMIVM. (B) Stopień sieciowania można ocenić za pomocą DLS, stosując DMSO jako rozcieńczalnik. Funkcja autokorelacji DLS wskazuje na stopień sieciowania poprzez początkową wartość autokorelacji oraz obserwację wyraźnego przejścia do wartości zero. Linia przerywana przedstawia funkcję autokorelacji dla cząstki bez sieciowania, wykazując słaby sygnał początkowy i szeroki czas zaniku. Linia ciągła przedstawia autokorelację po dodaniu silnego sieciowania (w tym przypadku tetraetylenopentaminy), co objawia się silnym sygnałem początkowym i zdefiniowaną skalą czasu zaniku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przesycenie a rozpuszczalnik organiczny; wykres porównujący poziomy rozpuszczalności Peptydu B i boskalidu.
Rysunek 6: Przesycenie, S, jako funkcja względnych stosunków mieszania rozpuszczalnika organicznego do wody. (A) Porównanie najwyższego osiągalnego przesycenia dla (○) boskalidu, pestycydy, oraz (■) peptydu B, siedmiorezystowego peptydu modelowego. Strumień organiczny zawiera boskalid w stężeniu 230 mg/mL i peptyd B w stężeniu 200 mg/mL, co odpowiada ich stężeniom nasycenia. Maksymalne przesycenie zależy od każdego układu aktywny składnik farmaceutyczny (API)/rozpuszczalnik. (B) Gdy stężenie boskalidu w strumieniu organicznym zostanie zmniejszone 20-krotnie, warunki, w których osiągane jest przesycenie i nanowytrącanie, stają się ograniczone. Rysunek przedrukowano za zgodą wydawnictwa Elsevier9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pliki uzupełniające. Aby pobrać pliki, kliknij tutaj.

Dyskusja

Enkapsulacja związków hydrofobowych, takich jak witamina E, podobnie jak w kroku 1 Protokołu, została obszernie opisana 9,14,28. Wytwarzane są stosunkowo monodyspersyjne cząstki, ponieważ skala czasu mieszania jest krótsza niż skala czasu agregacji i wzrostu cząstek. W szczególności zmieszany roztwór rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika szybko staje się jednorodny, co umożliwia równomierne zarodkowanie. Montaż kopolimeru blokowego z powierzchnią cząstek zapewnia następnie stabilizację steryczną, która zatrzymuje wzrost cząstek5. Ponieważ czas mieszania w komorze (turbulencje) jest funkcją natężenia przepływu na wlocie do CIJ lub MIVM, istnieje szybkość wlotu, która występuje po przejściu do mieszania turbulentnego, gdzie wielkość cząstek jest zasadniczo stała13. Zapewnia to dodatkową odporność procesu, ponieważ pewne różnice w natężeniu przepływu na wlocie (tj. prędkość wciągania strzykawki) mogą być tolerowane bez znaczącego wpływu na ostateczną wielkość NP, jak pokazano na rysunku 3. Wolniejsze lub nierówne prędkości wlotowe mogą skutkować większymi cząstkami lub większą dystrybucją polidyspersji, jak widać w przykładzie przerw zapłonu. FNP został również rozszerzony o enkapsulację związków hydrofilowych w nanocząstkach poprzez odwrotne nanowytrącanie Flash. Te odwrócone nanocząstki można następnie wykorzystać do wytworzenia mikrocząstek lub pokryć PEG w celu wytworzenia nanocząstek dyspergowalnych w wodzie25. Podstawowe zasady montażu pozostają takie same, chociaż istnieje dodatkowa złożoność sieciowania rdzenia cząstek. Jest to konieczne do stabilizacji cząstki w środowisku wodnym. Ogólnie rzecz biorąc, stosunek ładunku 1:1 w porównaniu z blokiem wielokwasowym jest wystarczający, chociaż oddziaływania jonowe można promować poprzez dostosowanie pH poprzez dodanie zasady19. W tym protokole opisano tylko pierwszy krok procesu tworzenia odwróconych NP.

Oprócz szybkiego mieszania, skuteczne opracowanie preparatu przez FNP lub iFNP jest ograniczone do przypadków, w których może być spełnionych kilka warunków 9,14. Po pierwsze, wszystkie wejścia strumienia muszą być mieszalne. Podczas gdy emulsje były używane do produkcji NP, FNP wymaga jednolitej fazy roztworu w mieszalniku. Po drugie, składnik rdzeniowy musi być prawie nierozpuszczalny w warunkach rozpuszczalnika w mieszalniku (w przypadku CIJ jest to mieszanina 50/50 objętościowo), aby umożliwić szybkie zarodkowanie. W przeciwnym razie znaczna część pozostanie niekapsułkowana lub wytrąci się po dalszym rozcieńczeniu rozpuszczalnikiem. MIVM może zapewnić wyższą zawartość rozpuszczalnika w komorze mieszania, aby rozwiązać problem ograniczeń rozpuszczalności materiału rdzeniowego. Często przydatne jest generowanie krzywych przesycenia na podstawie danych rozpuszczalności w funkcji składu rozpuszczalnika w celu kierowania projektowaniem procesu9. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne krzywe dla dwóch związków. Niskie przesycenie w warunkach komory mieszania uzasadnia pracę w różnych składach, zwykle przy użyciu MIVM. Wyższe przesycenie sprzyja zarodkowaniu składnika rdzenia w stosunku do wzrostu cząstek, ale niedopasowanie czasu montażu materiału rdzenia i stabilizatora może skutkować dużymi agregatami terapeutycznymi. D'Addio i Prud'homme dokonali szczegółowego przeglądu zastosowania takich krzywych przesycenia9. Na koniec BCP musi zostać molekularnie rozpuszczony w strumieniu rozpuszczalnika, a strumień antyrozpuszczalnika musi być selektywny dla jednego bloku. BCP musi być wystarczająco amfifilowy, aby zapewnić zarówno solwonofobiczną siłę napędową od zapadniętego bloku w celu zakotwiczenia stabilizatora na powierzchni cząstki, jak i aby solwatowany blok nadawał cząstce stabilność steryczną. Rozpuszczalniki inne niż opisane w protokole mogą być stosowane, o ile spełniają te ograniczenia.

Praktyka z ręczną obsługą strzykawki może poprawić wskaźnik powodzenia podczas badań przesiewowych. Jak wspomniano powyżej, praca powyżej przejścia do jednorodnych, turbulentnych warunków mieszania oznacza, że w procesie tolerowane są niewielkie zmiany natężenia przepływu28. Skalowanie do przepływów sterowanych przez pompę, sterowanych komputerowo skutkuje jeszcze większymi korzyściami w zakresie spójności dzięki powtarzalnym natężeniom przepływu na wlocie. W dowolnym momencie podczas przetwarzania końcowego cząstek, oględziny lub analiza DLS mogą wykazać obecność dużych agregatów, które mogą być spowodowane przypadkowym pyłem lub niestabilnością cząstek. W razie potrzeby strumień może być filtrowany za pomocą odpowiedniej wielkości porów filtra. Ze względu na brak agregatów stwierdziliśmy, że podczas filtrowania nanocząstek pokrytych PEG zwykle traci się mniej niż 5% masy, jeśli nominalny rozmiar filtra jest większy niż rozkład wielkości cząstek. Podczas filtrowania agregatów konieczne jest eksperymentalne określenie masy utraconej podczas procesu. Kwantyfikacja ubytku masy może być przeprowadzona na jeden z dwóch sposobów. Całkowitą masę ciał stałych w danej objętości można określić za pomocą analizy termograwimetrycznej przed i po filtracji w celu określenia zakresu zmian (patrz sekcja 2 Informacje Uzupełniające ). Alternatywnie cząstki można odzyskać (np. przez liofilizację) i rozpuścić w dobrym rozpuszczalniku. Stężenie materiału rdzenia można następnie bezpośrednio zmierzyć za pomocą odpowiedniej techniki, takiej jak spektrofotometria w ultrafiolecie lub chromatografia.

W przypadku FNP pozostałości rozpuszczalnika organicznego o stężeniu 10% obj. (np. THF) muszą zostać usunięte z dyspersji wodnej. Można to osiągnąć poprzez destylację wyparną14,29, dializę30 lub filtrację o przepływie stycznym31,32. Praktyczne rozważania dotyczące każdego etapu przetwarzania są opisane w zamieszczonych cytatach. W przypadku dializy typowe membrany to odcięcia 3,5 kDa lub 6-8 kDa, chociaż dostępne są większe opcje. Ta granica masy cząsteczkowej jest wystarczająca do usunięcia rozpuszczalnika podczas dializowania przez 24 godziny przy użyciu kilku zmian kąpieli. Zastosowanie filtracji z przepływem stycznym pociąga za sobą pewien rozwój procesu, ponieważ należy zachować ostrożność, aby uniknąć indukowania agregacji z powodu polaryzacji stężenia na powierzchni membrany. Odkryliśmy, że zmniejszenie składu rozpuszczalnika organicznego poniżej wartości zależnej od układu, zwykle 2-10 obj., eliminuje agregację na powierzchni membrany. Po przetworzeniu stężenie nanocząstek można łatwo określić za pomocą analizy termograwimetrycznej (zob. sekcja 2 Informacje uzupełniające). Często pożądane jest transportowanie lub przechowywanie cząstek w bardzo stabilnej formie. Dyspersje wodne można po prostu szybko zamrozić za pomocą mieszaniny suchego lodu i acetonu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, suche proszki można otrzymać przez liofilizację33,34 lub suszenie rozpyłowe24. Często należy dodać krioprotektant, aby zmniejszyć agregację nanocząstek podczas zamrażania lub suszenia. Cukry (sacharoza, trehaloza itp.), poli(glikol etylenowy) lub cyklodekstryny mogą być badane pod kątem skuteczności w zakresie stężeń poprzez monitorowanie wielkości za pomocą DLS 35,36,37,38. Typowe problemy ze stabilnością nanocząsteczek podczas przetwarzania są często związane z rozpuszczalnością lub separacją faz w rdzeniu, co skutkuje przegrupowaniem w kierunku niższego stanu energetycznego w warunkach, w których zwiększa się ruchliwość. Zastosowanie materiałów współrdzeniowych, alternatywnych stabilizatorów lub zmodyfikowanego składu roztworu zewnętrznego może pomóc w poprawie stabilności 14,16,17,39,40,41.

Jak wspomniano powyżej, MIVM umożliwia wyższą zawartość rozpuszczalnika w komorze mieszania, gdy jest to wymagane do osiągnięcia wysokiego przesycenia. Może również pozwolić na fizyczną segregację gatunków na więcej niż dwa strumienie, gdy wymagają tego ograniczenia reaktywności lub rozpuszczalności. Przykładem jest tworzenie stabilizowanych białkiem zeiny nanocząstek antybiotyku klofaziminy24. Hydrofobowa klofazymina jest wprowadzana do strumienia acetonu; Zeina jest wprowadzana do 60% etanolowego strumienia wodnego; Kazeina, która kompleksuje się z zeiną, jest wprowadzana za pomocą wodnego strumienia buforowego, a czwarty strumień jest dodatkowym buforem w celu zwiększenia stosunku wody do acetonu i etanolu. Wymagane są dwa strumienie rozpuszczalników, ponieważ klofazymina i zeina nie są rozpuszczalne w zwykłym rozpuszczalniku. Proces ten nie mógł być zrealizowany w dwustrumieniowym mikserze CIJ. Ten stabilizowany białkiem preparat pokazuje również, że FNP nie ogranicza się do stabilizatorów BCP. Cząstki janusa zostały wyprodukowane bez stabilizatora42 i zademonstrowano szereg tanich stabilizatorów do zastosowań doustnych24. W szczególności kopolimery, takie jak hydroksypropylometyloceluloza, mogą być stosowane zamiast kopolimerów blokowych24. Materiały rdzeniowe mogą być bardziej hydrofobowe za pomocą wielu technik. Hydrofobowe parowanie jonów zostało zastosowane do enkapsulacji szerokiej gamy związków, które mają pośrednią rozpuszczalność 43,44,45. Ekstremalnie hydrofobowe proleki zostały wygenerowane, a następnie zamknięte w kapsułkach46. Kwasy nukleinowe zostały otoczone kapsułkami poprzez kompleksowanie z lipidami kationowymi47. Co ważne, badania te wykazały, że FNP może wytwarzać szereg substancji chemicznych na powierzchni cząstek. Ponadto zastosowano mieszane stabilizatory zawierające frakcję BCP, która została zmodyfikowana za pomocą liganda celującego na końcu łańcucha. Umożliwia to precyzyjną kontrolę zawartości ligandów na powierzchni, ponieważ skład cząstek odzwierciedla skład strumienia wejściowego23,48. Podobnie, możliwe jest również włączenie wielu podstawowych składników, w tym barwników i nieorganicznych nanocząstek 3,8.

Flash NanoPrecipitation to skalowalne podejście do nanocząstek polimerowych składających się z rdzenia hydrofobowego lub hydrofilowego. Jeśli spełnione są kryteria wymienione powyżej, na ogół ponad 95% materiału rdzenia jest zamknięte w cząsteczce przy wysokim ułamku masowym. Trzy przedstawione tutaj przykłady zostały przeprowadzone w skali laboratoryjnej, wymagając kilku miligramów materiału i około 0,5 ml w każdym strumieniu wlotowym. Pozwala to na szybkie badanie przesiewowe warunków cząstek w celu optymalizacji receptury. Zwiększenie skali preparatów ołowiu do większych wielkości partii jest kwestią dłuższego prowadzenia procesu, co można łatwo osiągnąć za pomocą pomp strzykawkowych lub regulatorów przepływu. Z kolei zwiększenie skali nanoprecypitacji z dodatkiem masowym napotyka na dobrze udokumentowane wyzwania związane z utrzymaniem wystarczającego mikromieszania w miejscu dodawania i uwzględnianiem skutków zmiany geometrii naczynia49. Jest to poważna bariera, ponieważ kluczowe znaczenie ma produkcja cząstek w spójny sposób, aby spełnić wymagania FDA50. Techniki mikrofluidyczne mogą również wytwarzać jednolite, powtarzalne nanocząstki, ale umożliwiają produkcję tylko w zakresie miligramów. Na przykład Karnik i wsp. podali tempo produkcji 0,25 mg/min w badaniu uwalniania leku51. Dalsze zwiększanie skali zazwyczaj wiąże się z równoległością przy wysokich kosztach kapitałowych12. W przypadku FNP łatwo jest wyprodukować 1 gram nanocząstek w tempie 600 mg/min za pomocą pompy strzykawkowej i kilku złączek do podłączenia do wlotów mieszalnika. W związku z tym FNP stanowi zarówno dostępne narzędzie do badań przesiewowych na skalę laboratoryjną, jak i skalowalne podejście do produkcji nanocząsteczek na potrzeby prac translacyjnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez fundusze Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) przyznane K.D.R.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mieszalnik z ograniczonymi strumieniami uderzeniowymiNANARysunki techniczne można znaleźć w informacjach uzupełniających. Zapoznaj się z tekstem do walidacji nowego miksera
Dopasowanie LuerIdex Health & ScienceP-604Montaż na wlocie mieszalnika CIJ lub MIVM z odpowiednimi gwintami
Złączka wtykowaIdex Health & ScienceP-309Montaż po bokach mieszalnika CIJ (punkt dostępu uszczelki po wierceniu)
Złączka wylotowa - CIJIdex Health & ScienceP-205Montaż z tulejką i rurką na wylocie komory CIJ
Tuleja wylotowa - CIJIdex Health & ScienceP-200Montaż ze złączką wylotową (duży koniec zlicowany z rurką)
Rurka wylotowa - CIJIdex Health & Science1517Użyj obcinaka do rurek do czystych końcówek. Upewnij się, że dodatkowe rurki nie wnikają do komory mieszania
Tetrahydrofuran (THF)Fisher ScientificT425-4Użyj THF bez stabilizatora, aby uniknąć ograniczeń rozpuszczalności BHT. Nadtlenki mogą zakłócać niektóre zastosowania.
Strzykawka z normą (3 ml)VWR53548-017
Witamina E (alfa;-tokoferol)Sigma-Aldrich90669-50G-F Przechowywaćw zimnym
poli(glikolu styreno-b-etylenowo), PS1.6k-b-PEG5kŹródłopolimeru P13141-SEOInne rozmiary bloków dopuszczalne w zależności od zastosowania
poli(styren)1,8kŹródło polimeruP2275-SPrzykład hydrofobowego materiału rdzenia
Fiolka scyntylacyjnaDWK Lifesciences74504-20
Plastikowe strzykawki Luer-slip, 1ml (100 pk)NationalS7510-1
Maltodekstryna DE 4-7Sigma-Aldrich419672-100G
poli(styren-b-kwas akrylowy), PS5k-b-PAA4.8kŹródło polimeruP5917-SAA:Inne rozmiary bloków dopuszczalne w zależności od zastosowania
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificD159-4
Dihdyrat chlorku wapniaSigma-Aldrich223506-25GHigroskopijny.
MetanolFisher ScientificA452-4
Wodorotlenek amonuFisher ScientificAC423300250
Albumina z białka jaja kurzego (albumina jaja kurzego, OVA)Sigma-AldrichA5503-1G
Multi-Inlet Vortex MixerNANA Zobaczinformacje uzupełniające dla rysunków technicznych. Zapoznaj się z tekstem w celu walidacji nowego miksera
Armatura wylotowa - MIVMIdex Health & ScienceP-942Połączenie z tulejką
Rurka wylotowa - MIVMNAPasuje do identyfikatora tulejki.
O-ring (MIVM)C.E. ConoverMM1.5 35.50 V75Zamów luzem - część eksploatacyjna. Upewnij się, że jest kompatybilny z rozpuszczalnikiem, jeśli używasz alternatywnego źródła.
Stojak na mikserNANAZobacz Markwalter & Prud'homme for design.17
: :

Bibliografia

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud'homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D'Addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud'homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud'homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud'homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud'homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud'homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud'homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud'homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D'Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D'Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. Perry's Chemical Engineers' Handbook. , McGraw-Hill. 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem? ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enkapsulacja hydrofobowaenkapsulacja hydrofilowaodwr cona nanofiltracja b yskawicznarozk ad wielko ci nanocz stekdynamiczne rozpraszanie wiat amieszalnik CIJMicro MIVMk piel hartowania rozpuszczalnikiem
Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.