Artykuł metodologiczny

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

DOI:

10.3791/58759

⸱

26 listopada 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki strefy brzeżnej B (MZB) reagują na siłę przepływu ścinającego, reorientując swoją ścieżkę migracji w górę przepływu. Protokół ten pokazuje, jak rejestrować i analizować migrację za pomocą jednostki fluidyki, pompy, systemu obrazowania mikroskopowego i bezpłatnego oprogramowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki B strefy brzeżnej (MZB) to populacja komórek B, które znajdują się w strefach brzeżnych śledziony myszy otaczających mieszki włosowe. Aby dotrzeć do mieszków włosowych, MZB muszą migrować w górę siły ścinającej przepływu krwi. Przedstawiamy tutaj metodę analizy tej indukowanej przepływem migracji MZB in vitro. Po pierwsze, MZB są izolowane ze śledziony myszy. Po drugie, MZB są osadzane na ligandach integrynowych w szkiełkach komory przepływowej, wystawiane na działanie przepływu ścinającego i obrazowane pod mikroskopem podczas migracji. Po trzecie, obrazy migrujących MZB są przetwarzane za pomocą wtyczki MTrack2 do automatycznego śledzenia komórek dla ImageJ, a wynikowe ścieżki komórek są określane ilościowo za pomocą narzędzia chemotaksji Ibidi. Dane migracyjne ujawniają, jak szybko poruszają się komórki, jak często zmieniają kierunek, czy wektor przepływu ścinającego wpływa na ich kierunek migracji i które ligandy integrynowe są zaangażowane. Chociaż używamy MZB, metodę tę można łatwo dostosować do analizy migracji dowolnego leukocytu, który reaguje na siłę przepływu ścinającego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki odpornościowe są najbardziej ruchliwymi komórkami w ludzkim ciele i często muszą zmagać się z siłą ścinającą spowodowaną przepływem krwi i limfy. Istnieje jednak stosunkowo niewiele badań dotyczących migracji leukocytów wywołanej siłą ścinającą1,2,3,4,5. Przedstawiamy tutaj wiarygodny i ilościowy protokół analizy odpowiedzi komórki odpornościowej na przepływ in vitro. Wykonanie testu nie wymaga wytwarzania komponentów, a cały sprzęt i materiały eksploatacyjne są dostępne na rynku. Protokół, w tym oczyszczanie komórek i analiza migracji, można wykonać w ciągu jednego dnia. Wreszcie, chociaż opisujemy migrację komórek strefy brzeżnej B (MZB), protokół można dostosować do analizy migracji w stosunku do przepływu innych typów komórek odpornościowych. Dlatego możliwe jest wykorzystanie tego testu do systematycznej analizy szerokiego zakresu leukocytów z kompleksowym panelem warunków.

MZB to populacja komórek B, które u myszy znajdują się tylko w śledzionie i krążku między wnętrzem mieszków włosowych a strefami brzeżnymi6,7,8,9. Strefa brzeżna to warstwa komórek odpornościowych o grubości około 5–10 komórek. Warstwa komórkowa otacza pęcherzyk i składa się głównie z MZB i makrofagów, ale także z niezmiennych komórek T natural killer (iNKT), komórek dendrytycznych (DC) i neutrofili, między innymi10. Komórki w strefie brzeżnej są narażone na jednokierunkowy przepływ krwi pochodzący z tętnic śledzionowych, które kończą się w zatoce brzeżnej otaczającej pęcherzyk. Krew przepływa z otworów w zatoce brzeżnej przez strefę brzeżną, a następnie jest zbierana w zatokach żylnych w czerwonej miazdze i przywracana do krążenia11. Swobodny przepływ krwi obmywa MZB i wystawia je na działanie antygenów przenoszonych we krwi. MZB przenoszą antygen do pęcherzyka, automatycznie przemieszczając się między strefą brzeżną a wnętrzem pęcherzyka, który nie jest narażony na działanie krwi. Tak więc, gdy MZB przemieszczają się w kierunku pęcherzyka, muszą migrować w górę siły ścinającej przepływu krwi12 (Rysunek 1A).

W tym protokole opisujemy, jak ilościowo określić, jak komórki odpornościowe, takie jak MZB, reagują na brak lub wysoki przepływ in vitro, aby ujawnić, jak są zaprogramowane do migracji in vivo. W pierwszym etapie MZB są oczyszczane ze śledziony myszy za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami z dostępnych na rynku zestawów. Świeżo wyizolowane MZB wprowadza się do studzienki szkiełka komory przepływowej, pozostawia do osadzenia na ligandach integrynowych i wystawia na przepływ bufora migracyjnego za pomocą systemu pomp (Rysunek 2A). Komórki są obrazowane za pomocą systemu mikroskopii poklatkowej. Obrazy są następnie przetwarzane do analizy za pomocą bezpłatnej wtyczki ImageJ, MTrack213,14, aby automatycznie śledzić komórki. Ścieżki można następnie określić ilościowo za pomocą bezpłatnego narzędzia Ibidi Chemotaxis15 w celu określenia różnych parametrów, w tym prędkości, prostoliniowości i indeksu migracji. Wartości te można wykorzystać do określenia wpływu inhibitorów migracji, stymulatorów komórek, chemokin i innych substancji chemicznych wpływających na migrację wywołaną przepływem ścinającym w celu zrozumienia sił kontrolujących ruch komórek odpornościowych in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt zostały wcześniej zatwierdzone przez Landesverwaltungsamt Halle (Saksonia-Anhalt), Niemcy, zgodnie ze wszystkimi wytycznymi wydziału medycznego Uniwersytetu OVGU w Magdeburgu.

1. Oczyszczanie komórek MZB

  1. Wyizoluj leukocyty.
    1. Poświęć mysz w wieku od 8 do 16 tygodni i usuń śledzionę16. Dysocjować śledzionę w 5 ml lodowatego buforu komórkowego [sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,5% albumina surowicy bydlęcej (BSA) bez kwasów tłuszczowych], używając dysocjatora tkankowego lub delikatnie rozgniatając śledzionę przez siatkę sitową o wielkości 70 μm do studzienki na 6-dołkowej płytce za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 5 ml.
    2. Przenieść komórki z buforu komórkowego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zbierz dodatkowe komórki, dodając kolejne 5 ml lodowatego buforu komórkowego do probówki dysocjatora tkanek lub nylonowej siatki w studzience. Przenieść dodatkowe 5 ml buforu komórkowego wraz z komórkami do stożkowej probówki. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT, 20 °C) i odrzucić supernatant.
  2. Wykonaj lizę czerwonych krwinek.
    1. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA), który jest wstępnie podgrzany do RT. Dodaj dodatkowe 1,5 ml buforu do lizy RBC i zawiruj do wymieszania. Inkubować w temperaturze pokojowej (20 °C) łącznie przez 2 minuty, wliczając w to czas potrzebny do ponownego zawieszenia osadu.
    2. Dodaj 7,5 ml lodowatego buforu komórkowego do zawiesiny komórek, aby zatrzymać lizę. Odwirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić sklarowany osad.
    3. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu komórkowego i dodać dodatkowe 9 ml buforu komórkowego. Odpipetować zawiesinę komórek o pojemności 10 ml przez filtr wstępnej separacji 30 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia resztek komórek.
    4. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu komórkowego. Utrzymuj komórki w chłodzie na wszystkich kolejnych etapach procedury, aż do momentu, gdy inkubacja w komorze przepływowej zostanie przeprowadzona.
  3. Oczyść MZB.
    1. Dodaj 50 μl przeciwciał sprzężonych z biotyną z dostępnego na rynku zestawu przeciwko wszystkim niepożądanym komórkom, w tym CD43 (na komórkach innych niż B), CD4 (na limfocytach T), CD93 (na niedojrzałych komórkach B) i Ter119 (na erytrocytach), do zawiesiny komórkowej w stożkowej probówce. Delikatnie potrząśnij lub strzepnij probówkę, aby wymieszać, ale nie mieszaj komórek. Połóż stożkową rurkę na podłożu lodu pod prawie płaskim kątem i kołysz z prędkością 25 obr./min przez 15 minut.
    2. Do zawiesiny komórkowej dodać kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami antybiotyny w łącznej objętości 100 μl. Kontynuuj kołysanie zawiesiną ogniw z prędkością 25 obr./min na lodzie przez 20 minut. Przemyć komórki, dodając 5 ml buforu komórkowego, odwirowując w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 10 minut i odrzucając supernatant. Ponownie zawieś komórki w 1 ml buforu komórkowego.
    3. Zubożyć zawiesinę ogniw sprzężonych z kulkami magnetycznymi, utrzymując je na kolumnie magnetycznej. Odrzuć znakowane komórki (wszystkie komórki inne niż B i niedojrzałe komórki B). Zebrać nieznakowane komórki (dojrzałe komórki B) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, która została wstępnie pokryta krótkim zastosowaniem 5 ml buforu komórkowego, aby zapobiec niespecyficznej adhezji przez MZB.
    4. Przemyć zawiesinę komórkową 5 ml buforu komórkowego. Odwirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić sklarowany osad. Ponownie zawieś komórki w 90 μl buforu komórkowego i dodaj 10 μl kulek sprzężonych z anty-CD23. Zawiesina skalna delikatnie na lodzie przez 20 minut przy 25 obr./min.
    5. Przemyć zawiesinę komórkową 5 ml buforu komórkowego. Odwirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić sklarowany osad. Ponownie zawieś komórki w 1 ml buforu komórkowego.
    6. Zubożyć zawiesinę ogniw sprzężonych z kulkami magnetycznymi, utrzymując je na kolumnie magnetycznej. Wyrzuć oznakowane komórki (pęcherzykowe komórki B). Zbierz nieznakowane komórki (MZB) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, która została wstępnie pokryta krótkim zastosowaniem 5 ml buforu komórkowego. Usunąć 50 μl komórek w celu zliczenia i sprawdzenia czystości.
  4. Zabarwić posortowane MZB, aby sprawdzić czystość.
    1. Dodać 10% objętości (5 μL) bloku Fc do 10 000 komórek w 50 μL i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min. Dodać 50 μl buforu komórkowego zawierającego po 0,3 μl B220-FITC (0,15 μg), CD21-PE (0,06 μg) i CD23-APC (0,06 μg) w całkowitej objętości 105 μL (każde przeciwciało rozcieńczone w stosunku 1:350), lub dowolna inna kombinacja fluoroforów do rozróżnienia pęcherzykowych komórek B od MZB. Barwić komórki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 15 minut.
    2. Przemyj poplamione komórki raz 1 ml buforu komórkowego. Wirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić w 300 μl buforu komórkowego i pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego i standardowych metod. Bramka na żywych limfocytach, następnie na komórkach B220+, a na końcu na niskich komórkach CD21 (Rysunek 1B).
      UWAGA: Procedura zwykle daje 500 000 MZB na śledzionę z myszy C57B/6.
  5. Przygotuj MZB do migracji przepływu.
    1. Przemyć oczyszczone MZB raz w 1–2 ml buforu do zimnej migracji [zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) zawierający kationy, 10 mM Hepes, 0,2% BSA bez kwasów tłuszczowych], aby upewnić się, że bufor migracyjny zawierający kationy nie jest rozcieńczony resztkowym buforem PBS wolnym od kationów. Odwirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić sklarowany osad. Ponownie zawiesić MZB w buforze zimnej migracji do stężenia 50 000 MZB na 30 μL (co odpowiada ilości załadowanej do jednej studzienki szkiełka komory przepływowej).
      UWAGA: Świeżo wyizolowane MZB należy zużyć tak szybko, jak to możliwe. Jednak nadal są one zdolne do migracji do 8 godzin lub dłużej po rozpoczęciu eksperymentu, tak długo, jak długo są trzymane na lodzie. Optymalne temperatury powinny być testowane dla innych typów komórek. Na przykład, lepszym rozwiązaniem może być utrzymywanie hodowanych limfocytów T w temperaturze 37 °C do momentu rozpoczęcia migracji.

2. Eksperyment z przepływem

  1. Szkiełka płaszczowe z ligandem integryny.
    1. W dniu poprzedzającym eksperyment rozmrozić podwielokrotność ICAM-1 (400 μg/ml). Rozcieńczyć ICAM-1 w stosunku 1:80 w PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 μg/ml. Dodać 30 μl ICAM-1 do jednej komory na szkiełku przepływowym dla każdej wymaganej folii migracyjnej. Szkiełko inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Każdy slajd zawiera 6 komór i można łatwo nagrać do 8 filmów podczas jednej sesji.
  2. Zablokuj powlekane studzienki.
    1. W dniu eksperymentu umyć komorę, dodając 100 μl PBS do jednej studzienki i pobierając 100 μl z drugiej studzienki komory. Dodać 100 μl buforu blokującego (2% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych w PBS) do komory i inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny.
    2. Umyć komorę, dodając 100 μl PBS do jednej studzienki, wycofując ją z drugiej studzienki, a następnie dodając 100 μl buforu migracyjnego do komory. Przechowuj szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej do czasu eksperymentu.
  3. Przygotuj jednostkę fluidyki.
    1. Podłącz pompę płynu, podłącz jednostkę fluidyzacji i włącz oprogramowanie pompy. Umyj rurkę raz 5–10 ml buforu migracyjnego, a następnie dodaj 11,7 ml buforu migracyjnego równomiernie do obu zbiorników i usuń pęcherzyki powietrza.
    2. Zacisnąć rurkę w odległości około 10 cm od łącznika. Umieść jednostkę fluidyczną w podgrzewanej komorze inkubacyjnej na mikroskopie.
    3. Ustaw wybór prowadnicy na "μ-slide VI 0.4", a wężyk na "biały" w oprogramowaniu. Ustaw żądane naprężenie ścinające (np. 4 dyn cm-2). Ustaw czas obrazowania na 30 minut.
    4. Ustaw współczynnik kalibracji przewodu, określając natężenie przepływu przez rurkę w ml/min. Zmierz czas potrzebny do przepłynięcia 2 ml buforu z jednego zbiornika drugiego i podziel przez 2. Wykonaj co najmniej 4 pomiary, aby uzyskać dokładność. Użyj rzeczywistego natężenia przepływu, aby ustawić żądane natężenie przepływu i naprężenie ścinające, wprowadzając wartości do oprogramowania pompy.
  4. Przygotuj system obrazowania.
    1. Wstępnie ogrzej komorę inkubacyjną mikroskopu, jednostkę fluidyki i podwielokrotności bufora migracyjnego do 37 °C ( Rysunek 2B). Przetestuj pompę fluidyczną, upewniając się, że bufor migracyjny przepływa tam i z powrotem w zbiornikach oraz że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
  5. Załaduj komórki na slajdzie.
    1. Wyczyść spód szkiełka chusteczką zwilżoną etanolem. Dodać 30 μl zawiesiny komórek do jednego dołka komory i pobrać 30 μl z drugiego dołka. Inkubować szkiełko z założoną pokrywą, aby zapobiec parowaniu w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić połączenie komórek.
    2. Powoli dodawać wstępnie podgrzany bufor migracyjny do każdej studzienki szkiełka komory przepływowej, aż dodatnia menisk wynurzy się ze studzienki i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety.
  6. Przymocuj suwak do modułu fluidyki.
    1. Clamp szkiełko do stolika mikroskopu. Usuń nieoznaczoną stronę rurki płynowej z łącznika i napełnij koniec buforem migracyjnym, aż z końca wynurzy się dodatni menisk bez pęcherzyków powietrza.
    2. Odwróć koniec rurki i włóż ją do górnej studzienki komory przepływowej, wycierając rozlany bufor chusteczką. Trzymając rurkę zaciśniętą, powtórz procedurę dla zaznaczonego końca rurki.
  7. Zobrazuj komórki.
    1. Przełącz system obrazowania na "Na żywo", aby ustawić ostrość na komórkach. Wybierz pole widzenia, które znajduje się w środku slajdu. Lekko rozogniskuj komórki, aby uwydatnić kontur komórki i uzyskać białe wnętrze, które można następnie przekształcić w okrągły kształt komórki na białym tle do użycia z automatycznym programem śledzącym.
    2. Uruchom program sekwencji obrazowania i rejestruj 1 obraz co 5 s przez 30 minut, używając 10-krotnie suchego obiektywu. Zdejmij zacisk z rurki i włącz pompę, wtedy nieprzylegające komórki zostaną zmyte, a przylegające komórki zaczną migrować. Obraz przez 30 minut lub dłużej przy użyciu obiektywu 10x lub większego, w zależności od potrzeb. Oznacz i zapisz film.
  8. Odłącz jednostkę fluidyczną od suwaka.
    1. Pod koniec programu do obrazowania zresetuj pompę do następnego eksperymentu: ponownie przymocuj zacisk do rurki, wyjmij rurkę z suwaka, ponownie zamocuj łącznik, otwórz zacisk i użyj ręcznego sterowania pompą, aby przepchnąć kilka ml buforu z jednego zbiornika do drugiego, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Ponownie zamocuj zacisk i połóż zaciśnięte rurki na stoliku mikroskopu, aby obejrzeć następny film.
      nuta: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na czas nieokreślony. W przypadku stosowania inhibitora lub modyfikatora migracji komórek, w zależności od jego sposobu działania, należy dodać go do zawiesiny komórki przed osiedleniem się w komorze migracyjnej lub do bufora migracyjnego w jednostce płynowej.

3. Analiza ścieżki migracji

UWAGA: Komórki mogą być śledzone automatycznie za pomocą wtyczki MTrack2 lub ręcznie za pomocą wtyczki Manual Tracking17. Automatyczne śledzenie działa dobrze z MZB, ponieważ komórki te są głównie okrągłe i pozostają takie podczas migracji, co ułatwia progowanie obrazu komórek do czarnych obiektów na białym tle. Automatyczne śledzenie jest trudniejsze, jeśli używane są inne typy komórek, takie jak hodowane, aktywowane limfocyty T CD8 +, ponieważ komórki te rozciągają się podczas migracji i stają się nieco przezroczyste, co utrudnia zdefiniowanie krawędzi. W takim przypadku można albo (1) zabarwić komórki barwnikiem fluorescencyjnym w celu uzyskania obrazów, które można ustawić na progu, aby pokazać czarne obiekty na białym tle, albo (2) można użyć innych programów do obrysowania komórek, takich jak segmentacja obrazu i/lub wykrywanie krawędzi. Śledzenie ręczne jest przydatną opcją, gdy nie jest możliwe uzyskanie obrazu konturów komórek o wysokim kontraście.

  1. Wykonaj ręczne śledzenie za pomocą wtyczki.
    1. Zainstaluj wtyczkę "Ręczne śledzenie" w ImageJ i otwórz film w ImageJ. W menu "Śledzenie ręczne" wybierz "dodaj nową ścieżkę". Kliknij środek komórki, gdy film przesuwa się automatycznie klatka po klatce. Gdy komórka zostanie zaznaczona w każdej klatce, wybierz "dodaj nową ścieżkę", aby rozpocząć śledzenie nowej komórki.
    2. Po nagraniu ścieżek skopiuj wyniki wyjściowe do arkusza kalkulacyjnego danych. Zmień format wyświetlania dziesiętnego dla wszystkich komórek arkusza kalkulacyjnego na zero miejsc po ułamku dziesiętnym. Zapisz plik jako plik .txt "rozdzielany tabulatorami" do późniejszej analizy.
      nuta: Zazwyczaj śledzonych jest 50–100 komórek, co zajmuje około 1 godziny w przypadku 20-minutowego filmu składającego się z około 240 klatek.
  2. Wykonuj automatyczne śledzenie za pomocą wtyczki MTrack2. Pobierz i zainstaluj wtyczkę MTrack2 kt zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku (patrz Dodatkowy plik kodowania).
    1. Proguj obrazy z filmu migracji komórek. Otwórz stos obrazów w ImageJ. Przetwarzaj obrazy w ImageJ, aby przekonwertować wideo z kolorowych na obrazy o wysokim kontraście, pokazujące komórki jako czarne obiekty na białym tle (Rysunek 3A).
      1. Wyostrz obrazy dwukrotnie, usuń plamki na obrazach i przekonwertuj obrazy na 8 bitów. Wybierz punkt menu "Obraz | Dostosuj jasność/kontrast" i ustaw suwak Kontrast na maksymalny kontrast, a komórki pojawią się jako białe obiekty na czarnym tle. Wybierz punkt menu "Obraz | Dostosuj próg", aby upewnić się, że komórki są wyświetlane jako czarne obiekty na białym tle.
    2. Uruchom wtyczkę do automatycznego śledzenia komórek "MTrack2 kt" (patrz Dodatkowy plik kodowania). Ustaw następujące parametry na ekranie opcji.
      1. Ustaw minimalny rozmiar cząstek na 1 piksel, a maksymalny rozmiar cząstek na 30 pikseli dla MZB.
      2. W przypadku prędkości (maksymalnej odległości między 2 cząstkami na kolejnych klatkach filmu), jeśli gęstość komórek na slajdzie jest wysoka, ustaw tę wartość na niskim poziomie, aby uniknąć "przeskakiwania" ścieżki z jednej komórki do drugiej. W przypadku MZB ustaw tę wartość na 10 pikseli, aby przechwycić wartości odstające, chociaż MZB zazwyczaj nie przekraczają 2 pikseli w kolejnych klatkach oddalonych od siebie o 5 sekund.
      3. Dla minimalnej liczby klatek, w których cząstka musi być obecna, aby można było ją śledzić, należy ustawić tę wartość na liczbę klatek w filmie dla MZB (np. 240) dla filmu 20-minutowego z 12 klatkami/min. Jeśli jednak komórki są wystarczająco szybkie, aby opuścić pole widzenia przed końcem obrazowania, ustaw minimalną liczbę klatek na mniej niż czas trwania filmu. Na przykład w przypadku szybko poruszających się limfocytów T ustaw minimalną liczbę na odpowiednik 5-10 minut obrazowania.
        UWAGA: Nagraj makro tych kroków (progowanie i MTrack2-kt), aby zautomatyzować tę część procedury i zaoszczędzić czas (patrz Dodatkowy plik kodowania). Użycie makra do automatycznego śledzenia filmu w ImageJ zajmuje mniej niż minutę.
    3. Skopiuj wyniki wyjściowe do arkusza kalkulacyjnego danych. Zmień format wyświetlania dziesiętnego dla wszystkich komórek arkusza kalkulacyjnego na zero miejsc po ułamku dziesiętnym. Dodaj pusty wiersz u góry ścieżek komórek w arkuszu kalkulacyjnym i usuń kolumnę "D". Zapisz plik jako plik .txt "rozdzielany tabulatorami" do późniejszej analizy w narzędziu Ibidi Chemotasaxis.
      nuta: Wtyczka MTrack2 wyprowadza ścieżki komórek w rzędach po 75 równoległych kolumn. W przypadku analizy w narzędziu chemotaksji Ibidi ścieżki komórek muszą znajdować się w jednej kolumnie. Aby przekonwertować dane wyjściowe, wtyczka MTrack2 została zmodyfikowana tak, aby wyświetlała dane wyjściowe w oryginalnym formacie lub jako pojedyncza kolumna (Rysunek 3B) (patrz Dodatkowy plik kodowania "MTrack2 kt", który jest napisany w Javie). Skopiuj plik .java do folderu wtyczek ImageJ. W ImageJ wybierz "Wtyczki > skompilowania i uruchomienia". Uruchom ponownie ImageJ, a zmodyfikowana wersja MTrack2 powinna pojawić się w menu Wtyczki.
  3. Aby przeanalizować ścieżki komórek za pomocą narzędzia Ibidi Chemotaxis, pobierz narzędzie Ibidi Chemotaxis and Migration Tool v2.0 ("samodzielne") i otwórz program.
    1. Wybierz "Importuj dane" i przejdź do plików ścieżek .txt komórek. Można wybrać wiele plików w tym samym czasie. Zaimportowane pliki są wyświetlane w okienku "Zestawy danych" w kolorze czerwonym. Zaznacz je wszystkie i wprowadź poprawne wartości w menu "Inicjalizacja" poniżej, aby zastosować następujące ustawienia.
    2. Wprowadź dokładną liczbę plasterków lub zakres liczby przekrojów (liczbę klatek w filmie).
    3. W menu Calibration (Kalibracja X/Y) wprowadź rozmiar piksela. Znajdź te informacje w pliku właściwości filmu. W przypadku MZB zastosowano obiektyw 10x, dający rozmiar piksela 1,14 μm. W menu "Kalibracja | Przedział czasu", wprowadź czas między klatkami w filmie.
    4. Zastosuj ustawienia. Wybierz opcję "Kreśl dane", aby wyświetlić wykresy ścieżek i potwierdzić, że pliki ścieżek zostaną otwarte. Od tego momentu dostępnych jest wiele opcji, które są opisane w dokumentacji programu, w tym oznaczanie ścieżek różnymi kolorami w oparciu o różne właściwości i wyświetlanie indywidualnych lub średnich wartości prędkości, indeksu migracji do przodu, kierunkowości i innych (Rysunek 3B).
      nuta: MZB potrzebują około 10 minut, aby wykryć i zareagować na przepływ, prawdopodobnie poprzez polaryzację ich kompleksów integrynowych do punktu przepływu do przodu komórki. Wykres indeksu migracji w czasie pokaże początkowy spadek poniżej zera, odpowiadający pierwszym kilku minutom, w których komórka jest wystawiona na przepływ, a następnie stopniowy wzrost w górę, aż wartości indeksu migracji do przodu będą dodatnie. W związku z tym optymalne może być wyłączenie tych pierwszych minut w końcowych obliczeniach, chyba że proces ten jest interesujący.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy opisanego powyżej protokołu do porównania migracji MZB na szkiełkach powlekanych ICAM-1 bez przepływu (0 dyn/cm2) i narażonych na przepływ ścinający (4 dyn/cm2). Komórki były śledzone automatycznie za pomocą MTrack2, a wynikowe pliki ścieżek zostały nałożone na filmy migracji komórek bez przepływu (0 dyn/cm2) i (4 dyn/cm2), aby pokazać rozkład i kształt ścieżek (Rysunek 4A). Ścieżki komórek zostały następnie zaimport...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę analizy migracji komórek, które wykrywają siłę przepływu ścinającego i reagują, zmieniając swoją migrację. Analiza MZB wykazała, że MZB migrują spontanicznie na ICAM-1 i w obecności przepływu będą migrować w górę przepływu. W naszej poprzedniej pracy wykazaliśmy, że MZB nie migrują w górę przepływu na VCAM-1, ale zamiast tego pozostają na swoim miejscu. Mysia strefa brzeżna śledziony zawiera głównie ICAM-1, podczas gdy czerwona miazga zawiera zarówno ICAM-1, jak i VCAM-1. Na podstawie tych danych m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 dla K.-D.F.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr siatkowy VWR, 70 µ mVWR10199-656
Filtry z separacją wstępną, 30 i mikro; mMiltenyi130-095-823
Zestaw do izolacji komórek MZB i FOBMiltenyi130-100-366
B220 CD45R, klon RA3-6B2, FITCBiolegend103206
CD21 / CD 35, klon 7G6, APCBD Biosciences558658
CD23, klon B3B4, PEBiolegend101608
HBSSBiochromL2035
D-PBS 1xGibco firmy Life Technologies14190-094
BSA albumina frakcja V, bez kwasów tłuszczowychRoth"0052.3"
ICAM-1R& D Systems796-IC-050
Ibidi &mikro-prowadnice VI 0.4, hydrofobowe, niepowlekaneIbidi80601
Zestaw perfuzyjny, biały, 50 cm, 0.8 mmIbidi10963
Ibidi System pompowyIbidi10902

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261(2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Migracja w przep ywie cinaj cymtest w komorze przep ywowejledzenie kom rek MTrack2narz dzie do chemotaksji Ibidipowlekanie ICAM 1izolacja leukocyt wsystem pomp do cieczyanaliza w programie ImageJledzenie migracji kom rek

Powiązane artykuły