Artykuł metodologiczny

Edycja genomu ludzkiego patogenu grzybowego Candida albicans za pośrednictwem CRISPR

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58764

⸱

14 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Whitehead Institute for Biomedical Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Efektywna inżynieria genomu Candida albicans jest kluczowa dla zrozumienia patogenezy i rozwoju terapii. Tutaj opisaliśmy protokół szybkiej i dokładnej edycji genomu C. albicans za pomocą CRISPR. Protokół pozwala badaczom na wprowadzenie szerokiej gamy modyfikacji genetycznych, w tym mutacji punktowych, insercji i delecji.

Streszczenie

Ta metoda opisuje efektywną edycję genomu diploidalnego ludzkiego patogenu grzybowego Candida albicans, za pośrednictwem CRISPR. Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR u C. albicans wymaga Cas9, przewodnika RNA i szablonu naprawczego. Wygenerowano plazmid wyrażający Cas9 zoptymalizowany pod kątem kodonu drożdży (CaCas9). Sekwencje prowadzące bezpośrednio przed miejscem PAM (NGG) są klonowane do wektora wyrażenia Cas9. Następnie wykonuje się szablon naprawczy przez przedłużenie podkładu in vitro. Kotransformacja szablonu naprawczego i wektora do C. albicans prowadzi do edycji genomu. W zależności od użytego szablonu naprawczego, badacz może wprowadzić zmiany nukleotydów, insercje lub delecje. Ponieważ C. albicans jest diploidem, mutacje powstają w obu allelach genu, pod warunkiem, że allele A i B nie zawierają SNP, które zakłócają celowanie w przewodnik lub wprowadzanie szablonu naprawy. Wieloczłonowe rodziny genów mogą być edytowane równolegle, jeśli odpowiednie konserwatywne sekwencje istnieją u wszystkich członków rodziny. Opisany system CRISPR C. albicans jest otoczony miejscami FRT i koduje flippazę. Po indukcji flippazy marker antybiotykowy (CaCas9) i przewodnik RNA są usuwane z genomu. Dzięki temu badacz może dokonywać kolejnych edycji genomu. C. albicans (C. albicans) CRISPR jest potężnym narzędziem inżynierii genetycznej grzybów, a niewielkie zmiany w opisanych protokołach pozwalają na modyfikację innych gatunków grzybów, w tym C. glabrata, N. castellii i S. cerevisiae.

Wprowadzenie

Candida albicans jest najbardziej rozpowszechnionym ludzkim patogenem grzybiczym1,2,3. Zrozumienie różnic między C. albicans a biologią molekularną ssaków ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowej generacji leków przeciwgrzybiczych. Wymaga to od badaczy możliwości szybkiej i dokładnej manipulacji genetycznej C. albicans.

Manipulacja genetyczna C. albicans była historycznie wyzwaniem. C. albicans nie utrzymuje plazmidów, dlatego wszystkie konstrukty muszą zostać włączone do genomu. Ponadto C. albicans jest diploidalny; Dlatego podczas eliminowania genu lub wprowadzania mutacji ważne jest, aby upewnić się, że obie kopie zostały zmienione4. Ponadto niektóre loci C. albicans są heterozygotyczne, co dodatkowo komplikuje badania genetyczne5. Aby genetycznie manipulować C. albicans, typowe jest przeprowadzanie wielu rund rekombinacji homologicznej6. Jednak diploidalna natura genomu i pracochłonny rozwój konstruktów sprawiły, że jest to potencjalnie żmudny proces, zwłaszcza jeśli wymagane jest wiele zmian. Te ograniczenia i medyczne znaczenie C. albicans wymagają opracowania nowych technologii, które umożliwią badaczom łatwiejsze manipulowanie genomem C. albicans.

Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) jest potężnym narzędziem, które pozwala badaczom zmieniać sekwencję genomu. CRISPR wymaga trzech komponentów: 1) nukleazy Cas9, która rozszczepia docelowe DNA, 2) 20-zasadowego przewodnika RNA, który kieruje Cas9 do interesującej sekwencji, oraz 3) naprawy matrycy DNA, która naprawia miejsce cięcia i zawiera zamierzoną zmianę7,8. Gdy przewodnik przeniesie Cas9 do docelowej sekwencji genomu, Cas9 wymaga sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (NGG) bezpośrednio przed sekwencją prowadzącą, aby rozszczepić DNA9. Wymóg zarówno 20 podstawowych sekwencji wzorniczych, jak i PAM zapewnia wysoki stopień swoistości celowania i ogranicza rozszczepienie poza celem.

Systemy CRISPR zostały zaprojektowane do edycji genomów różnych organizmów i rozwiązywania różnorodnych problemów10. Opisano tutaj elastyczny, wydajny protokół CRISPR do edycji interesującego nas genu C. albicans. Eksperyment wprowadza do genu kodon stop, powodując zakończenie translacji. Inne zmiany można wprowadzić w zależności od wprowadzonego szablonu naprawy. Fragment oznaczony nourseotrycyną (Natr) zawierający Cas9 (CaCas9) zoptymalizowany pod kątem kodonu drożdżowego i przewodnik RNA jest wprowadzany do genomu C. albicans w neutralnym miejscu. Kotransformacja z matrycą naprawczą kodującą pożądaną mutację prowadzi do naprawy rozszczepienia poprzez rekombinację homologiczną i wydajną edycję genomu. Poniżej opisano edycję TPK2, ale wszystkie otwarte ramki odczytu C. albicans mogą być wielokrotnie atakowane przez CRISPR. System CRISPR jest otoczony miejscami FRT i może zostać usunięty z genomu C. albicans poprzez indukcję flippazy kodowanej na plazmidzie ekspresji CaCas9. System CRISPR C. albicans umożliwia badaczom dokładną i szybką edycję genomu C. albicans 11,12.

Protokół

1. Identyfikacja i klonowanie sekwencji przewodnika RNA

  1. Identyfikacja sekwencji przewodnika RNA
    1. Zidentyfikuj sekwencję PAM 5'-NGG-3' w pobliżu miejsca, w którym zostanie wstawiony kodon stop. (Rysunek 1A) Oznaczone są wszystkie sekwencje PAM znalezione w pierwszych 100 parach zasad TPK2 (Rysunek 1A).
      nuta: Sekwencje przewodników ukierunkowane na każdą otwartą ramkę odczytu C. albicans można znaleźć pod adresem http://osf.io/ARDTX 11,12.
    2. Zidentyfikuj sekwencję Primer_3 prowadnicy do przodu, która będzie składać się z 20 zasad bezpośrednio przed lokalizacją NGG PAM i nie będzie zawierać więcej niż 5 T w rzędzie. Kliknij lewym przyciskiem myszy bazę bezpośrednio przed NGG i przeciągnij kursor 20 podstaw, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę startera, aby dodać podkład.
    3. Zidentyfikuj sekwencję Primer_3 odwróconą prowadnicę, która będzie uzupełnieniem sekwencji prowadnicy do przodu.
      nuta: Pokazane są przewodniki, które używają PAM_3 (Rysunek 1B).
    4. Kliknij starter prawym przyciskiem myszy i wybierz "kopiuj dane startera". Wklej sekwencje do programu do edycji tekstu.
  2. Dodaj sekwencje zwisów do oligonukleotydów prowadnicy do przodu i do tyłu, aby ułatwić klonowanie (Tabela 1, Rysunek 1B).
    1. Dodaj sekwencję nukleotydową ATTTG do końca 5' Primer_3 prowadnicy do przodu przed zakupem.
    2. Dodaj G do końca 3' prowadnicy do przodu Primer_3 przed zakupem.
    3. Dodaj sekwencję nukleotydową AAAAC do końca 5' Primer_3 odwróconego przewodnika przed zakupem.
    4. Dodaj C do końca 3' prowadnicy wstecznej Primer_3 przed zakupem.
  3. Skrót wektora wyrażenia CaCas9 pV1524 za pomocą BsmBI.
    UWAGA: pV1524 zawiera markery ampicyliny (Ampr) i nourseotrycyny (Natr). Cas9 został zoptymalizowany pod kątem kodonów dla C. albicans.
    1. Trawić plazmid, dodając: 2 μg pv1524, 5 μl 10x buforu, 1 μl BsmBI iH2Odo 50 μL w probówce o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 20 minut (Alternatywnie, trawić pv1524 przez 15 minut z Esp3I, izoschizomerem BsmBI, w temperaturze 37 °C).
    2. Schłodzić do temperatury pokojowej (RT) i wirować przez 30 s przy 2,348 x g, aby doprowadzić kondensację na dno rurki. Przejść do kroku 1.4 lub przechowywać strawiony plazmid w temperaturze -20 °C.
  4. Fosfataza - traktuj strawiony kręgosłup.
    1. Dodać 1 μl fosfatazy jelitowej cieląt () do mieszaniny wytrawiającej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Oczyść strawiony plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (instrukcja dołączona do zestawu) i wymyj go w 30 μl buforu elucyjnego (EB).
  5. Fosforylan i wyżarzanie Prowadnica do przodu Primer_3 i Primer_3 do prowadzenia wstecznego.
    1. Dodaj 0,5 μl 100 μM Primer_3 prowadzącego do przodu, 0,5 μl ze 100 μM Primer_3 prowadzącego wstecznego, 5 μl 10x buforu ligazy T4, 1 μl kinazy polinukleotydowej T4 i 43 μl H2O do probówki PCR.
    2. Dodać 5 μl 10x buforu ligazy T4, 1 μl kinazy polinukleotydowej T4 i 44 μlH2Oklasy biologii molekularnej do drugiej probówki PCR.
      nuta: Będzie to służyć jako kontrola negatywna.
    3. Mieszaniny reakcyjne inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    4. Schłodzić mieszaninę przy najwolniejszym tempie narastania do 16 °C w celu wyżarzania oligonukleotydów. Następnie umieścić wyżarzoną mieszaninę oligonugojadów w temperaturze 4 °C.
  6. Zligować wyżarzone oligonukleotydy do przefermentowanego pv1524 z kroku 1.4.3.
    1. Do probówki do PCR dodać: 1 μl 10x buforu ligazy T4, 0,5 μl ligazy DNA T4, 0,5 μl wyżarzonej mieszanki oligogo, strawiony oczyszczony plazmid poddany działaniu (20–40 ng) iH2Odo całkowitej objętości 10 μl.
    2. Do probówki do PCR dodać następujące ilości: 1 μl 10x buforu ligazy T4, 0,5 μl ligazy DNA T4, strawiony oczyszczony wektor poddany działaniu (20–40 ng), 1 μl mieszaniny kontroli ujemnej iH2Odo 10 μl całkowitej objętości.
    3. Inkubować obie probówki w termocyklerze w temperaturze 16 °C przez 30 minut, następnie w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić do temperatury 25 °C.
  7. Przekształć 5 μl mieszanin ligacyjnych w chemicznie kompetentną Escherichia coli DH5α przy użyciu standardowego protokołu transformacji szoku cieplnego. Wybierz na pożywce LB Amp/Nat (200 μg/mL Amp, 50 μg/mL Nat).
    nuta: Niewybranie pV1524 i jego pochodnych na pożywkach podwójnej selekcji spowoduje utratę modułu Nat/CaCas9/guide przez wycięcie FLP/FRT w bakteriach.
  8. Oczyść plazmidy z czterech transformantów za pomocą miniprepu i zsekwencjonuj sekwencję insercji za pomocą startera sekwencjonującego (Tabela 1).
    Uwaga: W większości przypadków sekwencjonowanie 4 transformantów jest wystarczające do zidentyfikowania co najmniej 1 prawidłowego klonu.
  9. Zachowaj plazmidy, które mają sekwencję przewodnika RNA sklonowaną jednorazowo do miejsca cięcia BsmBI w temperaturze -20 °C.

2. Projektowanie i generowanie szablonu naprawy

  1. Wstaw kodon stop, klikając lewym przyciskiem myszy sekwencję genu i dodając nukleotydy, które kodują kodon stop i miejsce trawienia restrykcyjnego (Rysunek 1C, Tabela 1).
    nuta: Wstawienie zakłóci sekwencję PAM.
    nuta: Miejsce trawienia restrykcyjnego zostanie włączone do sekwencji szablonu naprawy, aby ułatwić skuteczne badania przesiewowe klonów (Rysunek 1C).
  2. Kliknij lewym przyciskiem myszy 10 baz poniżej miejsca, w którym zostanie dokonana mutacja i przeciągnij kursor 60 baz w górę. Kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę startera, aby dodać podkład. Spowoduje to dodanie szablonu naprawy Forward_3. Kliknij lewym przyciskiem myszy 10 baz przed miejscem, w którym zostanie dokonana mutacja i przeciągnij kursor 60 baz w dół. Kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę startera, aby dodać podkład. Spowoduje to dodanie Repair Template Reverse 3. (Rysunek 1C)
  3. Wykonaj rozszerzenie podkładu, aby wygenerować szablon naprawy.
    1. Dodać 1,2 μl 100 μm startera do naprawy matrycy do przodu, 1,2 μl 100 μm odwróconego startera do naprawy matrycy, 6 μl trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP) (całkowite stężenie 40 mM), 6 μl buforu, 0,6 μl polimerazy Taq (3 jednostki) i 45 μlH2Odo każdej z 4 probówek PCR.
    2. Wykonaj przedłużenie startera, przeprowadzając od 20 do 30 rund PCR. Przykładowe warunki przedłużenia: 2 min w 95 °C, (30 s w 95 °C, 1 min w 50 °C, 1 min w 68 °C) x 34, 10 min w 68 °C.
    3. Połącz zawartość wszystkich 4 probówek PCR w probówce o pojemności 1,5 ml i użyj zestawu do oczyszczania PCR do oczyszczenia produktów w 50 μlH2O.
    4. Oznacz ilościowo produkty przedłużania startera, aby zapewnić wystarczającą ilość DNA, oznaczając absorbancję przy 260 nm.
      nuta: Typowe stężenie końcowe produktu przedłużającego grunt wynosi ~200–300 ng/μL.

3. Transformacja C. albicans za pomocą szablonu naprawczego i plazmidu

  1. Zrób TE / octan litu.
    1. Zmieszaj 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, 100 mM octanu litu iH2O(wszystkie roztwory podstawowe pH 7,5), aby uzyskać całkowitą objętość 50 mL.
  2. Zrób TALERZ
    1. Wymieszaj 40% PEG 3350, 100 mM octanu litu, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA iH2O(wszystkie roztwory podstawowe o pH 7,5), aby uzyskać całkowitą objętość 50 mL.
  3. Strawij poprawnie sklonowane plazmidy z kroku 1.9.
    1. Dodać 10 μg plazmidu, 4 μl 10x buforu, 0,4 μl 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 μl KpnI, 0,5 μl SacI i H20 do 40 μl całkowitej objętości w probówce o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (Rysunek 1D).
  4. Hoduj przez noc kulturę C. albicans SC5314, prototrofu typu dzikiego, w temperaturze 25 °C w dekstrozie peptonowej drożdży uzupełnionej 0,27 mM urydyny (YPD + Uri), najlepiej do OD600 mniej niż 6.
    1. Osad 5 OD600 jednostek komórek na transformację, wirując przez 5 minut przy 2,348 x g i zawiesić 5 OD600 granulowanych komórek w 100 μl TE/octanu litu.
  5. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać następujące ilości w podanej kolejności: 1) 100 μl komórek z kroku 3.4.1, 2) 40 μl ugotowanego i szybko schłodzonego DNA plemników łososia (10 mg/ml), 3) 10 μg trawienia plazmidowego z kroku 3.3.1, 4) 6 μg oczyszczonej matrycy naprawczej i 5) 1 ml PLATE.
  6. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać następujące ilości w podanej kolejności: 1) 100 μl komórek, 2) 40 μl ugotowanego i szybko schłodzonego DNA plemników łososia (10 mg/ml), 3) objętość H2O równą objętości transformacji DNA w kroku 3.5 oraz 4) 1 ml PLATE.
    Uwaga: Będzie to służyć jako kontrola negatywna.
  7. Przemiany należy delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić do inkubacji w temperaturze 25 °C na noc.
  8. Poddaj ogniwa szokowi termicznemu, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 44 °C na 25 minut.
  9. Wirować przez 5 minut przy 2,348 x g w wirówce stołowej i usunąć supernatant mieszaniny PLATE. Umyć raz, dodając 1 ml YPD + Uri i ponownie odwirować przez 5 minut przy 2,348 x g.
  10. Zawiesić komórki w 0,1 ml YPD + Uri i inkubować na bębnie rolkowym lub wytrząsarce w temperaturze 25 °C przez noc.
  11. Płytka na YPD + Uri z 200 μg/ml nourseotrycyny. Kolonie pojawią się za 2–5 dni.

4. Smugi dla pojedynczych kolonii

  1. Podziel szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm na ćwiartki i oznacz każdą ćwiartkę.
    1. Dotknij jednej z kolonii z płytki transformacyjnej sterylną wykałaczką lub aplikatorem i przeciągnij smugą po najdłuższym boku kwadrantu.
    2. Smugę dla pojedynczych rodzin pęczkowych stosuje się technikę aseptyczną i pozostawić koloniom do wzrostu w temperaturze 30 °C przez 2 dni.

5. PCR kolonii

  1. Zaprojektuj starter kontroli do przodu (FCP) ~200 par zasad przed miejscem ograniczenia, które zostało wprowadzone, oraz starter kontroli odwrotnej (RCP) ~300 par zasad poniżej.
    1. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 0,3 μl FCP, 0,3 μl RCP, 0,3 μl termostabilnej polimerazy (ExTaq 1,5 jednostki), 3 μl dNTP (całkowite stężenie 40 mM), 3 μl buforu ExTaq i 23 μlH2O.
      nuta: Dodanie 0,5 μl / reakcyjnego dimetylosulfotlenku (DMSO) może poprawić wydajność PCR.
    2. Dodać 0,25 μl pojedynczej kolonii drożdży z kroku 4.1.2 do mieszaniny z kroku 5.1.1, używając końcówki pipety P10 i uważając, aby nie naruszyć agaru.
    3. Amplifikuj DNA metodą PCR i uruchom 5 μl PCR na żelu, aby upewnić się, że amplifikacja się powiedzie, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego na dnie probówki.

6. Ograniczenie trawienia PCR kolonii

  1. Dodać 10 μl produktu PCR (uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego na dnie probówki), 3 μl buforu, 1 μl enzymu restrykcyjnego i 16 μlH2O, następnie inkubować zgodnie z instrukcjami producenta i rozpuścić na żelu agarozowym w celu zidentyfikowania prawidłowych zmian genomu.
    nuta: Zastosowany tutaj enzym restrykcyjny to miejsce zakodowane w szablonie naprawczym specyficznym dla TPK2.

7. Ratowanie szczepów

  1. Wyhoduj kulturę przez noc z kolonii, które zostały potwierdzone przez trawienie restrykcyjne w YPD + Uri w temperaturze 30 °C.
  2. Dodać 1 ml kultury i 1 ml 50% glicerolu (doprowadzając końcowe stężenie glicerolu do 25%) do probówki odpowiedniej do przechowywania w temperaturze -80 °C.
  3. Przechowuj właściwe klony w temperaturze -80 °C.
    nuta: Odpowiednie szczepy mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez wiele lat.

8. Usunięcie znacznika Natr

  1. Smuga prawidłowego transformantu na drożdżową maltozę peptonową (YPMaltoza) (2% maltozy).
  2. Wybrać kolonię z płytki z prążkami i hodować drożdże przez 48 godzin w temperaturze 30 °C w płynnej YPMaltozie 20 g/l maltozy.
  3. Umieścić 200–400 komórek na YPMaltozie 20 g/l maltozy i inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.
  4. Powtórzyć płytkę na YPMaltose i YPMaltose 200 μg/ml Nat.
  5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 h.
    nuta: Kolonie, które nie rosną już na YPMaltose 200 μg/ml nourseotrycyny, ale rosną na YPMaltozie, utraciły marker Natr (CaCAS9) i przewodnik RNA.
  6. Zapisz szczepy, które utraciły marker Natr (CaCAS9) i prowadź RNA, jak to zrobiono w krokach 7.1–7.3.
    nuta: Podobny plazmid, pV1393, wykorzystuje SAP2 w przeciwieństwie do promotora MAL2. Wzrost na YCB-BSA indukuje flippazę i usuwanie Natr, jeśli pV1393 jest używany do edycji genów.

Wyniki

Sekwencje gRNA i matryc naprawczych ukierunkowanych na C. albicans TPK2, katalityczna podjednostka kinazy cAMP zostały zaprojektowane zgodnie z sugerowanymi powyżej wytycznymi. Sekwencje przedstawiono w (Tabela 1, Rysunek 1). Przewodniki RNA sklonowano do wektorów ekspresyjnych CaCas9, a następnie współtransformowano wraz z matrycą naprawczą do typu dzikiego C. albicans. An EkologiaMiejsce cięcia restrykcyjnego RI oraz kodony stop w matrycy naprawczej zaburzają sekwencję PAM i ułatwiają selekcję prawidłowych mutantów (Rysunek 1Transformanty wykreślono w celu otrzymania pojedynczych kolonii, a następnie poddano analizie za pomocą PCR kolonii oraz trawienia restrykcyjnego w celu potwierdzenia wbudowania matrycy naprawczej. (Rycina 2)Trawienie restrykcyjne pozwala na szybkie rozróżnienie sekwencji typu dzikiego od sekwencji zmutowanych.

Nazwa oligonukleotydu Sekwencja oligonukleotydowa
Przymierka przewodnia w kierunku właściwym_3ATTTGgggtgaactatttgttcgccG
Odwrócony starter prowadzący_3AAAACggcgaacaaatagttcacccC
Matryca naprawcza Forward_3tcagcaatatcagcaacaatttcaacaaccgcagcaacaactttatTAAGAATTCggcga
Szablon naprawczy Reverse_3attttgtccagtttgggctgcagcagggtgaactatttgttcgccGAATTCTTAataaag
Starter sprawdzający forwardttaaagaaacttcacatcaccaag
Starter kontrolny odwrotnyactttgatagcataatatctaccat
Starter do sekwencjonowaniaggcatagctgaaacttcggccc

Tabela 1: Lista oligonukleotydów użytych w niniejszym badaniu. Miejsca dodane w celu klonowania są zapisane wielkimi literami i pogrubione w sekwencjach starterów prowadzących. Sekwencje w matrycy naprawczej, które mutują DNA genomowe, są zapisane wielkimi literami i pogrubione.

Schematy edycji genów przedstawiające celowanie i naprawę za pomocą systemu CRISPR-Cas9; obejmują primery sekwencyjne oraz sgRNA.
Rycina 1Schemat projektu gRNA (przewodzącego RNA) i matrycy naprawczej. (A) Oznaczenie wszystkich sekwencji PAM w pierwszych 10 nukleotydach TPK2Wyróżniono sekwencję PAM 3 (PAM_3), ponieważ jest to sekwencja wykorzystana w niniejszym badaniu. (B) Projektowanie przewodniego RNA (gRNA) z wykorzystaniem PAM_3. Primery o długości 20 zasad, zaprojektowane w programie SnapGene, zapisano małymi literami w kolorze niebieskim. Dodatkowe zasady wymagane do klonowania zapisano wielkimi literami w kolorze zielonym z przesunięciem. (C) startery do matrycy naprawczej, które wprowadzają kodon stop TAA i Ekologiamiejsca uznawane przez restryktazę (RI) są wstawiane do TPK2 rama odczytu. DNA różniące się od sekwencji typu dzikiego zaznaczono kolorem czerwonym i wielkimi literami. (D) Przykład projektowania przewodnika na nici dodatniej DNA przy użyciu PAM_4. (E) Schemat pV1524 po klonowaniu gRNA i trawieniu enzymami KpnI oraz SacI. Neut5L-5' i Neut5L-3' kierują wektor do miejsca Neut5L w C. albicans genom CaENO1p jest promotorem sterującym ekspresją zoptymalizowanego pod kątem drożdży CaCas9. Natr jest kasetą oporności na nourseotrycynę. CaSNR52p jest promotorem sterującym ekspresją przewodzącego RNA (sgRNA). Miejsca FRT są rozcinane i rekombinowane przez flippazę (FLP), co prowadzi do usunięcia kasety CRISPR po ekspresji flippazy. Schemat podobny do (E) został opublikowany przez Vyasa i in..11. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza edycji genu TPK2; wyniki elektroforezy; trawienie EcoRI; wzory prążków DNA; PCR.
Rysunek 2Wprowadzenie i potwierdzenie kodonu stop oraz Ekologiamiejsce restrykcyjne RI do TPK2. Startery użyte do amplifikacji wykazano w Tabela 1Sekwencje typu dzikiego oraz mutantów przedstawiono pod żelem. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Vyas i wsp.11. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat edycji genów; elementy powyżej i poniżej (upstream/downstream), promotor, znacznik powinowactwa, transkrypcja DNA.
Rycina 3Schematyczna ilustracja matryc naprawczych, które generują (A) delecje i (B) insercje. Szare kreski w (A) przedstawiają sekwencje pośrednie, które nie występują w starterach matrycy naprawczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

C. albicans (C. albicans) CRISPR skutecznie edytuje genom C. albicans . pV1524 koduje Cas9 zoptymalizowany pod kątem kodonu drożdżowego i jest zaprojektowany w taki sposób, że badacze mogą łatwo klonować prowadzone sekwencje RNA za promotorem CaSNR52 (Figura 1)11. Należy zapewnić, że tylko jedna kopia sekwencji przewodnikowej została sklonowana do wektorów ekspresyjnych CaCas9 przez sekwencjonowanie, ponieważ dodatkowe kopie utrudnią edycję genomu. W przypadku konsekwentnego wprowadzania wielu kopii prowadnika, należy obniżyć stężenie wyżarzonego prowadnika stosowanego w podwiązywaniu. Opisany wektor i protokół pozwalają na celowanie w dowolny gen C. albicans . Chociaż C. albicans jest diploidalny, do celowania w oba allele genu potrzebna jest tylko jedna transformacja. Co więcej, procesywny charakter edycji genomu CRISPR-CaCas9 umożliwia naukowcom celowanie w wielu członków rodzin genów. Wiele rodzin genów, takich jak wydzielane proteazy aspartylowe (SAPS) i białka o sekwencji podobnej do aglutyniny (ALS), jest ważnych dla zjadliwości C. albicans . Edycja genomu CRISPR ułatwi badanie tych rodzin genów.

Opisane powyżej protokoły wprowadzają kodon stop do otwartej ramki odczytu, co daje fenotypowy odpowiednik wartości zerowej (ryc. 2). Poprzez zmianę szablonu naprawczego można dokonać wielu różnych zmian genetycznych. Mutacje nonsensowne, błędne i ciche mogą być wprowadzane poprzez rekombinację z odpowiednim szablonem naprawczym. Włączenie miejsca ograniczenia usprawnia badania przesiewowe transformacyjne, ponieważ osoby bez nich muszą być badane przez sekwencjonowanie12,13. Ponadto C. albicans CRISPR umożliwia naukowcom generowanie insercji i delecji, co czyni go idealnym systemem do wstawiania znaczników powinowactwa, wykonywania zamian promotorów i generowania nokautów (ryc. 3). Badanie przesiewowe pod kątem prawidłowych transformantów dla tych mutacji jest bardziej pracochłonne, ponieważ konieczne jest sekwencjonowanie edycji, aby potwierdzić prawidłowe włączenie szablonów naprawy. Co więcej, Southern blot może być konieczny, aby upewnić się, że dodatkowe kopie genu nie zostały wstawione w dodatkowych miejscach w genomie. Wymóg lokalizacji NGG PAM nakłada niewielkie ograniczenia na regiony genomu, które mogą być celem ataku. Rozwój alternatywnych systemów CRISPR, które wykorzystują alternatywne nukleazy, takie jak Cpf1 lub wariacje systemu Cas9, złagodziły/złagodzą wiele z tych ograniczeń14. Zgodnie z wiedzą badaczy, systemy te nie zostały jeszcze zastosowane do C. albicans.

System CRISPR opisany w powyższym protokole został opracowany w taki sposób, że może być stosowany u wielu różnych gatunków, w tym Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castellii i ludzkiego patogenu Candida glabrata11. Transformacja i wydajna edycja tych drożdży wymaga niewielkich zmian w opisanym protokole, ale ramy edycji tych alternatywnych genomów są niezwykle podobne do tych opisanych dla C. albicans12. Co więcej, drożdże stanowią doskonały mechanizm do opracowywania procedur edycji genomu. W drożdżach, gdy ADE2 jest zmutowany, gromadzi się prekursor szlaku biosyntezy adeniny, zmieniając kolor komórek na czerwony. Ten łatwy do zaobserwowania fenotyp pozwala badaczom identyfikować edytowane komórki i szybko rozwiązywać problemy z protokołami edycji genomu. W połączeniu z obszernym zestawem narzędzi biologii molekularnej dostępnym dla grzybów, opracowano protokoły edycji wielu gatunków drożdży15,16. Tak szerokie zastosowanie technologii edycji genomu u grzybów może mieć znaczący wpływ na wiele różnych dyscyplin naukowych.

CRISPR znacznie poprawił wydajność inżynierii genomu u C. albicans, ale do tej pory CRISPR nie był używany do przeprowadzania badań przesiewowych całego genomu u C. albicans. Obecne protokoły wymagają szablonu naprawczego do wprowadzania mutacji, ponieważ niehomologiczny szlak łączenia końców u C. albicans jest nieefektywny12. Generowanie naprawczych oligonukleotydów matrycowych dla każdego genu stanowi istotną barierę w wykonywaniu badań przesiewowych całego genomu. Połączenie obniżonych kosztów syntezy DNA i postępów w technologiach CRISPR sprawi, że rozwój bibliotek delecyjnych stanie się bardziej wykonalny. Na przykład ekspresja matrycy naprawczej z wektora CaCas9 toruje drogę do rozwoju zrównoważonych bibliotek plazmidowych, które są ukierunkowane na każdy gen11. Ponadto opracowano przejściowe protokoły CRISPR Candida, które nie wymagają wektora ekspresji CaCas9 włączonego do genomu C. albicans 17. Ponadto zwiększona ekspresja przewodnika zwiększa wydajność edycji genomu18. Te i inne postępy w technologiach CRISPR mają kluczowe znaczenie dla rozwoju badań przesiewowych całego genomu u C. albicans 19,20,21,22.

Genom C. albicans jest diploidalny, ale allele A i B nie zawsze są identyczne5. Taka heterozygotyczność stwarza zarówno wyzwania, jak i możliwości. Jeśli ktoś ma na celu celowanie w oba allele, musi użyć miejsca PAM, sekwencji przewodnika i szablonu naprawczego, który będzie działał na obie kopie genu. Jednak w zależności od polimorfizmów pojedynczego nukleotydu obecnych w genie, system CRISPR C.albicans umożliwia badaczom celowanie w pojedynczy allel. Taka precyzja może pozwolić badaczom na zbadanie funkcjonalnych różnic między allelami. Celowanie w określone allele musi być wykonywane ostrożnie, ponieważ zaobserwowano utratę heterozygotyczności (LOH) w allelu lub całym chromosomie. Podczas edycji pojedynczych alleli C. albicans należy zbadać sąsiednie sekwencje DNA, aby ustalić, czy klon zachował diploidalny profil SNP. Ponadto efekty off-target są dość niskie w przypadku C. albicans CRISPR, ale w przypadku kluczowych szczepów można rozważyć sekwencjonowanie całego genomu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Gennifer Mager za przeczytanie i pomocne komentarze do manuskryptu. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe laboratorium Ball State University oraz NIH-1R15AI130950-01 do D.A.B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
AgarBD Bacto214010
agarozaamresco0710-500G
AmpicillanSigma-AldrichA9518
Bacto PeptoneBD Bacto211677
Bsmb1New England BiolabsR0580L
Fosfataza jelitowa cielęcia ()New England BiolabsM0290L
Cut Smart BufferNew England BiolabsB7204S
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
dNTPsNew England BiolabsN0447L
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich3609
Lodowcowy Kwas octowySigma-Aldrich2810000ACS
GlukozaBDH VWRBDH9230
GlicerolSigma-Aldrich49767
Kpn1New England BiolabsR3142L
LB-MediumMP3002-032
Octan lituSigma-Aldrich517992
L-tryptofanSigma-AldrichT0254
MaltozaSigma-AldrichM5885
Biologia molekularna WodaSigma-AldrichW4502
NEB3.1 BuforNew England BiolabsB7203S
NourseothricinWerner Bioagents74667
Poli(glikol etylenowy) PEG 3350Sigma-AldrichP4338
Sac1New England BiolabsR3156L
DNA plemników łososiaInvitrogenAM9680
T4 Kinaza polinukleotydowaNew England BiolabsM0201S
T4 DNA Ligaza NewEngland BiolabsM0202L
Taq PolimerazaNew England BiolabsM0267X
Tris HClSigma-AldrichT3253
urydynaSigma-AldrichU3750
Ekstrakt drożdżowyBD Bacto212750
Equipment < / strong>
Electroforeza Appartus
Inkubator
Microcentifuge
Replika aparatu
Bęben rolkowy lub wytrząsarka
Spektrofotometr
Łaźnia
analityczny Maszyna do PCR galwanicznego wodna

Bibliografia

  1. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinincal Microbiology Review. 20 (1), 133-163 (2007).
  2. Magill, S. S., et al. Multistate point-prevalence survey of health care-associated infections. New England Journal of Medicine. 370 (13), 1198-1208 (2014).
  3. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Disease. 39 (3), 309-317 (2004).
  4. Jones, T., et al. The diploid genome sequence of Candida albicans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 101 (19), 7329-7334 (2004).
  5. Muzzey, D., Schwartz, K., Weissman, J. S., Sherlock, G. Assembly of a phased diploid Candida albicans genome facilitates allele-specific measurements and provides a simple model for repeat and indel structure. Genome Biology. 14 (9), (2013).
  6. Morschhauser, J., Michel, S., Staib, P. Sequential gene disruption in Candida albicans by FLP-mediated site-specific recombination. Molecular Microbiololgy. 32 (3), 547-556 (1999).
  7. Lau, V., Davie, J. R. The discovery and development of the CRISPR system in applications in genome manipulation. Biochemistry and Cell Biology. 95 (2), 203-210 (2017).
  8. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  9. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513 (7519), 569-573 (2014).
  10. Reardon, S. Welcome to the CRISPR zoo. Nature. 531 (7593), 160-163 (2016).
  11. Vyas, V. K., et al. New CRISPR Mutagenesis Strategies Reveal Variation in Repair Mechanisms among Fungi. mSphere. 3 (2), (2018).
  12. Vyas, V. K., Barrasa, M. I., Fink, G. R. A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families. Science Advances. 1 (3), e1500248(2015).
  13. Evans, B. A., et al. Restriction digest screening facilitates efficient detection of site-directed mutations introduced by CRISPR in C. albicans UME6. PeerJ. 6, e4920(2018).
  14. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  15. Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. , e1700586(2018).
  16. Raschmanova, H., Weninger, A., Glieder, A., Kovar, K., Vogl, T. Implementing CRISPR-Cas technologies in conventional and non-conventional yeasts: Current state and future prospects. Biotechnology Advances. 36 (3), 641-665 (2018).
  17. Min, K., Ichikawa, Y., Woolford, C. A., Mitchell, A. P. Candida albicans Gene Deletion with a Transient CRISPR-Cas9 System. mSphere. 1 (3), (2016).
  18. Ng, H., Dean, N. Dramatic Improvement of CRISPR/Cas9 Editing in Candida albicans by Increased Single Guide RNA Expression. mSphere. 2 (2), (2017).
  19. Huang, M. Y., Woolford, C. A., Mitchell, A. P. Rapid Gene Concatenation for Genetic Rescue of Multigene Mutants in Candida albicans. mSphere. 3 (2), (2018).
  20. Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
  21. Grahl, N., Demers, E. G., Crocker, A. W., Hogan, D. A. Use of RNA-Protein Complexes for Genome Editing in Non-albicans Candida Species. mSphere. 2 (3), (2017).
  22. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An Efficient, Rapid, and Recyclable System for CRISPR-Mediated Genome Editing in Candida albicans. mSphere. 2 (2), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja genomu CRISPRekspresja Cas9projektowanie przewodniego RNAmatryca naprawczatransformacja plazmidowaPCR koloniitrawienie restrykcyjnemiejsca FRTindukcja flippazy
Edycja genomu ludzkiego patogenu grzybowego Candida albicans za pośrednictwem CRISPR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.