Artykuł metodologiczny

Powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur DNA origami

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58771

⸱

19 stycznia 2019

 , 
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół ochrony nanostruktur DNA origami w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy przy użyciu naturalnych kationowych powłok polisacharydowych chitozanu i syntetycznych liniowych powłok polietylenoiminy (LPEI).

Streszczenie

Nanostruktury origami DNA mają ogromny potencjał do wykorzystania w zastosowaniach biologicznych i medycznych. Jednak warunki o niskiej zawartości soli i nukleazy w płynach fizjologicznych indukują denaturację i degradację samoorganizujących się nanostruktur DNA. W przypadku dostarczania genów niewirusowych enzymatyczna degradacja DNA jest przezwyciężana przez enkapsulację ujemnie naładowanego DNA w powłoce kationowej. W niniejszym dokumencie, zainspirowanym postępami w dostarczaniu genów, przedstawiono prostą, jednoetapową i solidną metodologię stabilizacji nanostruktur DNA origami poprzez pokrycie ich chitozanem i liniową polietylenominą. Powłoka polikationowa skutecznie chroni nanostruktury origami DNA w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy. Metoda ta zachowuje również pełną adresowalność funkcjonalizacji nanostruktur DNA opartej na enzymach i aptamerach.

Wprowadzenie

DNA to wszechstronny budulec do programowalnego samodzielnego montażu struktur w nanoskali1. Najpopularniejszą metodą tworzenia nanostruktur DNA jest technika origami DNA, która opiera się na samoorganizacji długiego, okrągłego, jednoniciowego rusztowania DNA za pomocą setek krótszych, determinujących kształt syntetycznych nici odszywkowych2. Obecnie tworzenie nanostruktur DNA w prawie każdej geometrii i morfologii jest łatwo wykonalne. Nanostruktury DNA mogą być funkcjonalizowane specyficznie dla miejsca z dużą precyzją3,4 i mogą być zaprogramowane tak, aby ulegały allosterycznym zmianom konformacyjnym5,6. W związku z tym wykorzystanie DNA jako materiału budowlanego daje wyjątkową możliwość tworzenia programowalnych i responsywnych, specjalnie zaprojektowanych nanostruktur do zastosowań w biodetekcji, diagnostyce i dostarczaniu leków. Jednak nanostruktury DNA są podatne na trawienie przez egzo- i endonukleazy, a nanostruktury origami DNA 3D oparte na sieci zazwyczaj wymagają o wysokim zasoleniu (np. 5-20 mM Mg+2), aby zachować ich integralność7,8.

Szybka degradacja DNA przez nukleazy obecne we krwi i macierzy zewnątrzkomórkowej jest główną przeszkodą w efektywnym dostarczaniu in vivo produktów genetycznych do komórek9. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w przypadku dostarczania genów niewirusowych, DNA miesza się z polimerem kationowym przy określonym stosunku ładunku N/P (stosunek amin w polikacji do fosforanów w DNA)10. Kompleks DNA z polimerem kationowym, znany jako polyplex, chroni DNA przed degradacją za pośrednictwem nukleazy i zwiększa jego wychwyt komórkowy11. Zainspirowane postępami w dostarczaniu genów, do stabilizacji nanostruktur DNA origami zastosowano polimery na bazie oligolizyny12, kopolimery oligolizyny i glikolu polietylenowego (PEG)13, polimery na bazie poli(2-dimetyloaminometakrylanu etylu) (PDMAEMA)14 oraz białka kapsydu wirusa15 zostały wykorzystane do stabilizacji nanostruktur DNA origami.

Niedawno opisaliśmy metodę ochrony nanostruktur DNA origami w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy przy użyciu naturalnego kationowego polisacharydu chitozanu i syntetycznej liniowej polietylenoiminy (LPEI)16. Niniejszy artykuł jest adaptacją naszej wcześniejszej pracy i opisuje szczegółowy protokół przygotowania polipleksów, ich charakterystykę, testowanie stabilności nagich i chronionych nanostruktur w pożywkach o niskiej zawartości soli i bogatych w nukleazy oraz badanie adresowalności funkcjonalizowanych enzymami i aptamerami nanostruktur origami DNA po powłoce polikationowej.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu zapasowego polikationu

  1. Roztwór zapasowy LPEI
    1. Do zlewki szklanej zawierającej <10 mL H2O dodać 10 mg LPEI.
    2. Aby całkowicie rozpuścić LPEI, dodawać HCl (32%) do osiągnięcia pH 2,0.
    3. Dostosować pH do wartości 7,0 poprzez dodanie NaOH (10 M).
    4. Uzupełnić objętość do uzyskania stężenia końcowego 1 mg/mL.
    5. Przefiltrować roztwór zapasowy LPEI przez membranę 0,22 µm.
  2. Roztwór zapasowy chitosanu
    1. Rozpuścić 16,6 mg mleczanu oligosacharydu chitosanu (Mw ~ 5 kDa, 60% składu oligosacharydowego, deacetylowany z chityny w 90%) w 1 mL wodnego roztworu kwasu octowego (10%), aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/mL.

2. Oczyszczanie nanostruktur DNA origami

  1. W probówce o pojemności 1,5 mL zmieszaj 100 µL próbki origami DNA (w buforze 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl (oznaczonym jako TB) z dodatkiem 18 mM MgCl2) z równą objętością (100 µL) buforu TB uzupełnionego o 22 mM MgCl2.
  2. Dodaj 200 µL buforu oczyszczającego (15% (w/v) PEG 8,000, 5 mM Tris, 1 mM EDTA oraz 505 mM NaCl). Delikatnie wymieszaj poprzez odwracanie probówki.
  3. Wiruj próbkę przy 16,000 × g w temperaturze pokojowej (r.t.) przez 25 min.
  4. Ostrożnie odlej nadsącz i resuspenduj osad w buforze TB uzupełnionym o 16 mM MgCl2. Nadsącz zawiera nadmiar nici stapli, natomiast osad zawiera wytrącone origami DNA.
  5. Inkubuj próbkę przez jeden dzień w temperaturze pokojowej (r.t.) przy 650 rpm w termomikserze. Krok ten służy do całkowitej resuspensji origami DNA.

3. Elektroforeza w żelu agarozowym (AGE)

  1. Do zlewki szklanej dodać 1.6 g agarozy i 80 mL buforu TAE 0,5x (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM kwasu octowego, pH 8), aby przygotować 2% żel agarozowy. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 5 min. Przez 1 min delikatnie mieszać zawartość zlewki w kąpieli wodnej. Dodać 352 µL MgCl2 (2,5 M), aby uzyskać żel o stężeniu 11 mM MgCl2. Zabarwić żel uprzednio, dodając 10 µL barwnika do żeli DNA.
  2. Wylać roztwór żelu do suchej formy i włożyć grzebień do elektroforezy. Pozostawić roztwór do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15-30 min.
  3. Uzupełnić bufor do prowadzenia (bufor TAE 0,5x) o 11 mM MgCl2.
  4. Zmieszać 10-20 µL próbki z 20% objętościowo 6x buforu do ładowania (30% (v/v) glicerolu, 0,25% (w/v) błękitu bromofenolowego, 0,25% (w/v) xylene cyanol FF) i nanieść do studzienek żelu agarozowego.
  5. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 70 V w temperaturze pokojowej przez 2,5-3 h.
  6. Wizualizować żel za pomocą skanera UV.

4. Transmisyjna mikroskopia elektronowa z barwieniem negatywowym (nsTEM)

  1. Nanieś 5 µL rozcieńczonej nanostruktury lub polypleksu na siatkę TEM Cu400 pokrytą węglem i poddaną wyładowaniom żarowym. Pozostaw do adsorpcji na ok. 1 min.
  2. Odsącz nadmiar cieczy z krawędzi siatki za pomocą kawałka papieru filtrującego.
  3. Nanieś 5 µL 2% wodnego roztworu octanu uranylu i odczekaj 1 min.
  4. Użyj krawędzi papieru filtrującego, aby całkowicie odsączyć nadmiar cieczy z krawędzi siatki.
  5. Pozostaw siatkę do całkowitego wyschnięcia przed wprowadzeniem jej do TEM.

5. Tworzenie polipleksów

UWAGA: Przykład ilustrujący przygotowanie polypleksu składającego się z origami DNA i chitosanu przy stosunkach N/P 0,01-8.

  1. Oblicz liczbę grup aminowych na polikation, korzystając z formuły-1 (Tabela 1).
  2. Zmierz stężenie oczyszczonego DNA origami za pomocą spektrofotometru UV przy 260 nm. W celu kalibracji urządzenia użyj 2 µL buforu TB jako próbki ślepej. Oblicz „nmol fosforanu”, korzystając z formuły-2.
  3. Przygotuj 15 µL struktury DNA origami zawierającej 1 nmol fosforanu.
  4. Użyj formuły-3, aby obliczyć objętość chitozanu niezbędną do przygotowania polipleksu przy N/P 0,01-8. Na przykład, aby przygotować polipleks przy N/P 8, wymagane jest 1,8 µL chitozanu (0,8 mg/mL) (przy N/P wynoszącym 8, liczbie moli fosforanu równej 1, masie cząsteczkowej chitozanu 5 000 g/mol, stężeniu roztworu zapasu chitozanu 0,8 mg/mL oraz liczbie grup aminowych na cząsteczkę chitozanu równej 28). Dodaj 13,2 µL buforu TB do 1,8 µL chitozanu (0,8 mg/mL). Dodaj 15 µL roztworu chitozanu (0,8 mg/mL) do 15 µL DNA origami z kroku 5.3, aby otrzymać polipleks DNA origami-chitozan z N/P 8. Polipleks tworzy się samoistnie.
  5. Powtórz krok 5.4, aby przygotować polipleksy o różnych stosunkach N/P.
  6. Przeprowadź AGE zgodnie z opisem w kroku 3 (Rycina 1A). Jako kontrolę uwzględnij nieosłonięte DNA origami.
  7. Wykonaj obrazowanie polipleksu zgodnie z opisem w kroku 4 (Rycina 2).

    Formuła-1) liczba grup aminowych na polikation
    Równanie stosunku masy cząsteczkowej, chemia polielektrolitów, formuła edukacyjna, analiza biochemiczna.

    Formuła-2) mole fosforanu
    =Równanie stężenia DNA origami; obliczenia z wykorzystaniem masy cząsteczkowej, ng/µL oraz objętości w µL.

    Formuła-3) Objętość (µL) polikationów
    =Formuła analizy polimerów, obliczanie stosunku N/P, równanie analizy grup fosforanowych i aminowych.

6. Dekapsulacja z użyciem siarczanu dekstranu

  1. Oblicz liczbę grup siarczanowych w cząsteczce siarczanu dekstranu, korzystając z wzoru-4 (Tabela 2).
  2. Oblicz objętość siarczanu dekstranu niezbędną do dekompleksacji polipleksu przy zdefiniowanym stosunku A/P, korzystając z wzoru-5. Stosunek ładunków A/P to stosunek grup siarczanowych polianionu (A) do grup fosforanowych (P) origami DNA. Do wydajnej dekompleksacji polipleksów wymagana jest nadmiarowa ilość siarczanu dekstranu (np. 500-1 000). Na przykład, aby zdekompleksować polipleks przygotowany w sekcji 5 (polipleks zawiera 1 nmol fosforanu) przy A/P 1 000, potrzebne jest 3,6 µL siarczanu dekstranu 40 kDa (50 mg/mL) (A/P wynosi 1 000, liczba moli fosforanu to 1, masa cząsteczkowa siarczanu dekstranu wynosi 40 000 g/mol, stężenie roztworu stokowego siarczanu dekstranu wynosi 50 mg/mL, a liczba grup siarczanowych to 220). Dodaj 3,6 µL siarczanu dekstranu (50 mg/mL) do polipleksu z kroku 5.4 i dokładnie wymieszaj.
  3. W przypadku pracy z polipleksem chitosanowym, dodaj NaOH, aby ułatwić proces dekompleksacji. Dodaj NaOH do uzyskania stężenia końcowego 10 mM. Pomiń ten krok w przypadku polipleksów LPEI.
  4. Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym (AGE) zgodnie z opisem w Kroku 3 (Rysunek 1B). Jako kontrolę uwzględnij „gołe” origami DNA oraz polipleks.

    Wzór-4) liczba grup siarczanowych na polianion=
    Równanie przedstawiające obliczanie masy cząsteczkowej polianionu w analizie chemii polimerów.

    Wzór-5) Objętość (µL) siarczanu dekstranu
    =Wzór na ilościowe oznaczenie fosforanu, obejmujący stężenie siarczanu dekstranu i masę cząsteczkową.

7. Stabilność w warunkach niedoboru Mg

  1. Przemyć 20 µL origami DNA lub odpowiedni polipleks (zawierający 2 nmol fosforanu) 4x 600 µL buforu Mg-zero (5 mM Tris, 1 mM EDTA i 30 mM NaCl), korzystając z kolumny do ultrafiltracji (MWCO ~ 3 kDa). Każde przemywanie wirować z prędkością 14 000 × g w temperaturze pokojowej przez 3-5 min.
  2. Zebrać pozostały roztwór (80 µL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez jeden dzień przy 650 rpm w termomikserze.
  3. W przypadku testowania polipleksu LPEI, dodać 2,5 µL MgCl2 (500 mM), aby uzyskać stężenie końcowe 16 mM MgCl2. Następnie dodać 7 µL siarczanu dekstranu-40 kDa (50 mg/mL) (odpowiadającego stosunkowi A/P 1 000), aby rozwinąć rdzeniowe nanostruktury DNA (dekapsulacja, patrz Krok 6).
    UWAGA: Pominąć ten krok w przypadku pracy z polipleksem chitozanowym lub gołym origami DNA.
  4. Przeprowadzić obrazowanie nsTEM zgodnie z opisem w Kroku 3 (Rysunek 2).

8. Test miareczkowania DNazą I dla gołych nanostruktur origami DNA

  1. W probówkach PCR o pojemności 0,2 mL wymieszaj 3 µL gołego DNA origami zawierającego 1 nmol fosforanu z 2 µL 10x buforu do DNase I (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7.6), 1 µL MgCl2 (250 mM) oraz 12 µL wody. Dodaj 2 µL DNase I (10x). Dostosuj stężenie roztworu stokowego DNase I (10x), aby uzyskać końcowe stężenie DNase I na poziomie 0,25-2 U/mL.
  2. Inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 1-2 h.
  3. Umieść próbki w lodzie i zneutralizuj aktywność nukleolityczną, dodając 2 µL 500 mM ditiotreitolu (DTT) oraz 2,5 µL EGTA (33 mM).
  4. Próbki poddaj analizie za pomocą AGE zgodnie z opisem w kroku 3.

9. Stabilność polipleksów wobec DNazy I

  1. W probówce PCR o pojemności 0,2 mL wymieszać 4 µL polipleksu (zawierającego 1 nmol fosforanu, przygotowanego przy różnych stosunkach N/P) z 1,5 µL buforu do DNazy I (10x), 8 µL TB oraz 1,5 µL DNazy I (100 U/mL).
  2. Inkubować próbkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
  3. Dodać 2 µL proteinazy K (20 mg/mL) w celu strawienia DNazy I. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
    UWAGA: Zamiast trawienia enzymatycznego można przeprowadzić chemiczną dezaktywację DNazy I poprzez dodanie 1,5 µL DTT (500 mM) i 2 µL EGTA (33 mM).
  4. Dodać 3,6 µL siarczanu dekstranu-40 kDa (50 mg/mL) (odpowiadającego A/P 1 000), aby rozplątać rdzeniowe nanostruktury DNA.
  5. Przeprowadzić AGE zgodnie z opisem w kroku 3 (Rycina 3A, Rycina 3C). W ramach kontroli do pomiaru i porównania intensywności prążków na żelu należy uwzględnić świeże origami DNA.
  6. Wyciąć prążek z żelu AGE i wyekstrahować origami DNA za pomocą kolumny do ekstrakcji metodą mrożenia z wyciskaniem (squeeze freeze extraction), zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
  7. Przeprowadzić obrazowanie nsTEM zgodnie z opisem w kroku 4 (Rycina 2).

10. Stabilność w obecności płodowej surowicy bydlęcej (FBS)

  1. W probówkach PCR o pojemności 0,2 mL zmieszać 4 µL gołego DNA origami lub odpowiadającego mu polypleksu (zawierającego 1 nmol fosforanu) z 17 µL buforu TB + 10% FBS. Należy użyć świeżo rozmrożonego FBS.
  2. Próbkę inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 ˚C przez 24 h.
  3. Próbkę zanurzyć w łaźni lodowej.
  4. W przypadku testowania polypleksu przeprowadzić proces dekapsulacji poprzez dodanie 3,6 µL siarczanu dekstranu-40 kDa (50 mg/mL). Dodatkowo dodać NaOH w przypadku pracy z polypleksami chitozanowymi (patrz krok 6.3).
  5. Przeprowadzić AGE zgodnie z opisem w kroku 3. Świeże DNA origami należy dołączyć jako kontrolę do pomiaru i porównania intensywności prążków na żelu.
  6. Wyciąć prążek z żelu AGE i wyekstrahować DNA origami za pomocą kolumny do ekstrakcji metodą squeeze freeze.
  7. Do wyekstrahowanego roztworu DNA origami (20 µL) w probówce PCR o pojemności 0,2 mL dodać 2 µL proteinazy K (20 mg/mL). Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w termocyklerze w celu strawienia białek surowicy związanych z nanostrukturami.
  8. Próbkę przemyć 5x 500 µL buforu TB zawierającego 16 mM MgCl2 przy użyciu kolumny do ultrawirowania (MWCO ~ 100 kDa), aby usunąć proteinazę K (MW ~ 28,9 kDa). Każde przemywanie wirować przy 14 000 × g w temperaturze pokojowej przez 3-5 min.
  9. Przeprowadzić obrazowanie nsTEM zgodnie z opisem w kroku 4 (Rycina 3).
    UWAGA: Próbkę wyekstrahowaną z żelu w kroku 10.6 można wykorzystać bezpośrednio do obrazowania nsTEM. Jednak obrazowanie może być bardzo trudne ze względu na przyłączenie białek surowicy do nanostruktur DNA origami. Dlatego w celu ułatwienia procesu obrazowania zaleca się traktowanie proteinazą K (kroki 10.7-10.9).

11. Badanie adresowalności origami DNA funkcjonalizowanego peroksydazą chrzanową (HRP) po powleczeniu polikationami

  1. Oczyścić samoorganizujące się biotynilowane NR (Biotin-NR) zgodnie z opisem w kroku 2.
  2. Inkubować 200 µL oczyszczonego Biotin-NR (36 nM, w uzupełnionym buforze TB 16 mM) z 200 µL streptawidyny koniugowanej z HRP (540 nM w buforze TB). Dodać 4.8 µL MgCl₂2 (500 mM) do stężenia końcowego 14 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 12 h przy 650 obr./min w termomikserze
  3. Oczyść nanorurki funkcjonalizowane HRP (HRP-NR) metodą oczyszczania PEG (opisaną w kroku 2), aby usunąć niezwiązane enzymy HRP. Resuspenduj wytrącony produkt HRP-NR w buforze TB zawierającym 16 mM MgCl2.2.
  4. Wymieszać 6.5 µL oczyszczonego HRP-NR (36 nM) z 6.5 µL polikationów o różnych stężeniach w celu przygotowania polipleksów przy stosunkach N/P wynoszących 1, 2, 4, 10 i 20 (przy użyciu formuła 3).
  5. Powtórz kroki 11.2–11.4 dla niebiotynilowanego NR. Ponieważ enzym HRP może wiązać się niespecyficznie z origami DNA, kontrolą w teście będzie niebiotynilowane origami DNA, które zostało poddane działaniu enzymów HRP i oczyszczone za pomocą PEG (podobnie jak Biotin-NR).
  6. Wymieszać 6.5 µL wody destylowanej z 6.5 µL polikationów o różnych stężeniach, odpowiadających określonym stosunkom N/P wynoszącym odpowiednio 1, 2, 4, 10 i 20. Próbki te służą jako grupa kontrolna.
  7. Dodaj roztwór przygotowany w krokach 11.4–11.6 (12.5 µL) do płytki 96-dołkowej, w tym 72.5 µL buforu HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7,4) i dokładnie wymieszać.
  8. Dodaj 10 µL 2,2'-azino-bis(3-etylibenzotiazolino-6-kwasu sulfonowego) (ABTS) (15 mM).
  9. Dodaj 5 µL wodoru2O2 (12 mM) i wymieszać dokładnie, pipetując ciecz w górę i w dół. H2O2 inicjuje reakcję.
  10. Pomiar absorbancji przy 421 nm przez 4 h za pomocą wielofunkcyjnego czytnika płytek (Rycina 4A).

12. Badanie adresowalności funkcjonalizowanych aptamerami wiążącymi hemin (HBA) struktur DNA origami po powleczeniu polikationami

  1. Oczyścić nanorurki funkcjonalizowane HBA (HBA-NR) zgodnie z opisem w kroku 2. Zawiesić wytrącony HBA-NR w buforze TB uzupełnionym o 6 mM MgCl2 (wyższe stężenie soli prowadzi do agregacji HBA-NR).
  2. Zmieszać 10 µL HBA-NR (40 nM) z 10 µL polikationów o różnych stężeniach, aby przygotować polipleksy o określonych stosunkach N/P wynoszących 1, 2, 10 i 20.
  3. Zmieszać 10 µL gołych nanorurek (naked-NR, 40 nM) lub wody destylowanej z 10 µL polikationów o różnych stężeniach odpowiadających stosunkom N/P 1, 2, 10 i 20.
  4. Dodać przygotowany 20 µL roztwór z kroków 12.2 i 12.3 do płytki 96-dołkowej zawierającej 60 µL buforu HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7,4) i dokładnie wymieszać. Należy uwzględnić co najmniej jedną próbkę ślepą, zastępując 20 µL roztworu polipleksu lub polikationu (z kroków 12.2 i 12.3) wodą.
  5. Dodać 5 µL heminy (0,04 mM), a następnie 10 µL ATBS (15 mM). Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5 min.
  6. Dodać 5 µL H2O2 (12 mM) i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
  7. Zmierz absorbancję przy 421 nm przez 30 min za pomocą wielomodalnego czytnika płytek (Rysunek 4B).

Wyniki

Zaprojektowano trzy nanostruktury origami z DNA o różnych konfiguracjach, w tym nanopręt (NR), nanobutelkę (NB) oraz nanostrukturę szkieletową (WN) (modele 3D nanostruktur przedstawiono na Rysunku 2). NR i NB zostały zaprojektowane odpowiednio w oparciu o sieć kwadratową i plastromiodową przy użyciu oprogramowania caDNAno17, natomiast WN utworzono za pomocą oprogramowania Daedalus18. Kompleksowy protokół projektowania i samoorganizacji nanostruktur DNA został już opublikowany19,20,21,22. Specyficzne dla kształtu nici zszywające (staple strands) zostały zamówione, samoorganizowane i następnie oczyszczone zgodnie z protokołem opisanym przez Stahl et al.23 (krok 2).

Polipleksy scharakteryzowano za pomocą testu opóźnienia w żelu oraz obrazowania nsTEM. Po zmieszaniu origami DNA z polikationami zaobserwowano przesunięcie pasma gołej nanostruktury w stronę katody (Rysunek 1A). Można to przypisać zneutralizowaniu ujemnego ładunku grup fosforanowych podczas wiązania z polikationami oraz ogólnemu zwiększeniu rozmiaru kompleksu. Dodanie nadmiaru polianionów, takich jak siarczan dekstranu, może odwrócić proces tworzenia polipleksów. W tym względzie siarczan dekstranu o wyższej masie cząsteczkowej (MW ~ 40 kDa) okazał się bardziej efektywny w dekompleksowaniu niż siarczan dekstranu o niższej masie cząsteczkowej (MW ~ 4 kDa) (Rysunek 1B).

Podczas obrazowania polipleksów LPEI za pomocą TEM z negatywowaniem octanem uranylu, obrazowanie jakichkolwiek cząstek było utrudnione. Postawiono hipotezę, że LPEI może utrudniać wiązanie octanu uranylu z szkieletem fosforanowym ze względu na szczelne ekranowanie origami DNA. Dlatego przed obrazowaniem nsTEM do polipleksów LEPI dodano nadmiar siarczanu dekstranu. Rozplecione nanostruktury origami DNA nie wykazywały oznak defektów ani rozkładu. W przeciwieństwie do nich, polipleksy chitozanowe zostały pomyślnie zobrazowane bez konieczności stosowania obróbki polianionowej (Rysunek 2).

Wszystkie nieosłonięte nanostruktury DNA (niezależnie od ich różnych konfiguracji) uległy całkowitej denaturacji po jednym dniu inkubacji w 37 °C w buforze Mg-zero, co potwierdzono obrazowaniem nsTEM. W przeciwieństwie do nich, nanostruktury powlekane LPEI lub chitosanem przy N/P≥1 pozostały nienaruszone. Podobnie, testy miareczkowe z DNazą I wykazały podatność nieosłoniętych nanostruktur na trawienie enzymatyczne. Podczas gdy nieosłonięte nanostruktury zostały całkowicie strawione w obecności 1 U/mL DNazy I po 2 h, origami DNA zamknięte w LPEI lub chitosanie pozostały nienaruszone w buforze Mg-zero uzupełnionym o 10 U/mL DNazy I przez co najmniej jeden dzień (Rycina 2). Wyższą stabilność wobec trawienia nukleolitycznego osiągnięto poprzez zwiększenie stosunku N/P polipleksów. Dodatkowo LPEI chroni nanostruktury DNA bardziej efektywnie niż chitosan (Rycina 3A, Rycina 3C), prawdopodobnie ze względu na wyższą gęstość ładunku LPEI, a tym samym wyższe powinowactwo wiązania do DNA24. Nie zaobserwowano różnic przy zastosowaniu LPEI o różnej masie cząsteczkowej (Rycina3B).

Możliwość adresowania grup funkcyjnych w nanostrukturach DNA po enkapsulacji w polimerowej otoczce jest istotną cechą. Ponadto zbadano kompatybilność powłoki polikationowej z DNA origami funkcjonalizowanym peroksydazą chrzanową (HRP) oraz aptamerami wiążącymi heminę (HBA). Trzy biotynilowane nici stapel wystawały z powierzchni NR, a następnie zostały funkcjonalizowane streptawidyną sprzężoną z HRP (trzy enzymy na jedno DNA origami). Do tych eksperymentów wybrano wysoką aktywność katalityczną (Kd: 439 nM) aptamer HBA PS2.M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3')25. Do 24 nici stapel wystawało z powierzchni NR z łącznikiem o długości 5 nm (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3'), po którym następowała sekwencja PS2.M (24 aptamery na jedno DNA origami). Nie zaobserwowano znaczącego zahamowania aktywności enzymatycznej ani aptamerowej po pokryciu funkcjonalizowanego HRP lub HBA DNA origami polimerami LPEI i chitosanem przy różnych stosunkach N/P (Ryc. 4A-B)16. Jednakże kinetyka enzymu HRP uległa drastycznej zmianie po związaniu z DNA origami (Ryc. 4C).

Wyniki elektroforezy żelowej; kompleksy DNA-polimer, analiza stosunku N/P, badanie tworzenia polipleksów.
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy AGE przedstawiające tworzenie polipleksów i dekapsulację. (A) Analiza przesunięcia mobilności elektroforetycznej dla NB zmieszanego z chitosanem przy stosunkach N/P od 0,01 do 8. Każda ścieżka zawiera 1 nmol NB. Pierwsza ścieżka to referencyjne NB. (B) Dekapsulacja polipleksów za pomocą polianionowego siarczanu dekstranu (DS). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanego rysunku16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia elektronowa oddziaływań nanocząsteczek; efekty LPEI i chitosanu, usunięcie Mg, DNaza, TB.
Rycina 2: Mikrografie TEM z barwieniem negatywowym origami DNA i polipleksów. Model 3D i mikrografie nsTEM gołych nanostruktur origami DNA (kolumny 1 i 2). Mikrografie nsTEM polipleksów LPEI (po dekapsulacji) i polipleksów chitosanowych (kolumny 3 i 4). Obrazy nsTEM gołego i chronionego origami DNA (polipleks) poddanego usunięciu Mg (kolumny 5, 6 i 7), degradacji enzymatycznej (kolumny 8 i 9) oraz trawieniu w surowicy (kolumny 10 i 11) przez jedną dobę w 37 °C. W tym badaniu zastosowano LPEI-5 kDa. Gołe nanostruktury DNA uległy degradacji poniżej granicy wykrywalności w AGE w obecności 1 U/mL DNase I lub w TB + 10% FBS po 2 h inkubacji w 37 °C. Paski skali: 100 nm. Rycina ta została zmodyfikowana z wcześniej opublikowanej ryciny16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy żelowej i wykres słupkowy; analiza LPEI przy różnych stosunkach N/P, wykazująca trendy stężeń.
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki testów ochrony przed DNazą I. (A) Test ochrony przed DNazą I dla polipleksów WN z LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa oraz LPEI-25 kDa przygotowanych przy stosunkach N/P wynoszących 2, 4, 8 i 10. Próbki poddano działaniu 10 U/mL DNazy I przez 24 h w temperaturze 37 °C. Ostatnia ścieżka to kontrolne WN. Polipleksy zostały odkapsułkowane przed naniesieniem na żel. (B) Znormalizowana średnia intensywność prążka dla polipleksów origami DNA z różnymi LPEI, wyekstrahowana z obrazu AGE-A. Oś Y przedstawia znormalizowaną średnią intensywność prążka. (C) Test ochrony przed DNazą I polipleksów chitosan-WN przygotowanych przy stosunkach N/P wynoszących 1, 2, 4, 10 i 20. Próbki poddano działaniu 10 U/mL DNazy I przez 24 h w temperaturze 37 °C. Ścieżka 6 to kontrolny polipleks (N/P 20). Ostatnia ścieżka to kontrolne WN. Wszystkie polipleksy chitosanowe zostały odkapsułkowane przed naniesieniem na żel. Rycina ta została zmodyfikowana z wcześniej opublikowanej ryciny16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe absorbancji w funkcji stosunku N/P oraz krzywa absorbancji w funkcji czasu; analiza HRP-NR, HBA-NR, chitosanu.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki kolorymetrycznych testów z wykorzystaniem origami DNA funkcjonalizowanego enzymami i aptamerami. (A) Test kolorymetryczny nanostruktur funkcjonalizowanych enzymami (HRP-NR) powleczonych chitosanem 3,7 h po rozpoczęciu reakcji. (B) Test kolorymetryczny nanostruktur funkcjonalizowanych aptamerami (HBA-NR) powleczonych chitosanem, 6 min po zainicjowaniu reakcji. Oś Y przedstawia znormalizowaną absorbancję. (C) Monitorowanie testu kolorymetrycznego HRP i HRP-NR w czasie. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanej ryciny16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Polimery kationoweChitosanLPEI-5 kDaLPEI-10 kDaLPEI-25 kDa
Masa cząsteczkowa polimeru (kDa)551025
Masa cząsteczkowa monomeru (g/mol)161434343
Liczba grup aminowych na monomer1111
Liczba grup aminowych na polimer28116232581

Tabela 1. Obliczanie liczby grup aminowych na polikation.

Masa cząsteczkowa siarczanu dekstranu (kDa)440
Masa cząsteczkowa monomeru (g/mol)366366
Liczba grup siarczanowych na monomer22
Liczba grup siarczanowych na polimer22220

Tabela 2. Obliczanie liczby grup siarczanowych na polianion.

Dyskusja

W samoorganizacji origami DNA, nici zszywkowe są zwykle dodawane w proporcji 5-10 nadmiaru do rusztowania. Te nadmiarowe nici odszywkowe również wiążą się z polikacją i tworzą polipleksy w zakresie monometru, które są dodatkowo trudne do oddzielenia od polipleksów origami DNA. Dlatego krytycznym krokiem w tworzeniu polipleksu jest usunięcie nadmiaru nici zszywek i użycie dobrze oczyszczonych nanostruktur DNA origami.

Opracowano inne metody stabilizacji nanostruktur DNA, takie jak cyklizacja nici DNA poprzez reakcję kliknięcia26. Ponieważ nici zszywkowe modyfikowane alkinami i azydkami są wymagane do tworzenia zazębiających się jednoniciowych pierścieni, technika ta jest ograniczona do stabilizacji małych nanostruktur, takich jak katenan DNA, i nie jest łatwo skalowalna dla większych struktur origami DNA, takich jak te używane w tym protokole. Niedawno Gerling i in.27 opisali metodę tworzenia kowalencyjnych wiązań dimerów pirymidynowych (CPD) między sąsiednimi tymidynami w nanostrukturach DNA za pomocą promieniowania ultrafioletowego. Chociaż metoda ta jest selektywna i skalowalna, jej skuteczność w ochronie origami DNA jest znacznie niższa niż powlekanie polikationowe. Na przykład, obiekty origami DNA stabilizowane CPD wytrzymują tylko 0,4 U/ml DNazy I przez 1 godzinę, podczas gdy polipleksy były stabilne w obecności 10 U/ml DNazy I przez co najmniej jeden dzień.

Krótko mówiąc, chitozan inspirowany terapią genową i powlekanie LPEI jest tanią, jednoetapową i skuteczną metodą rozwiązywania problemów związanych z długoterminową stabilnością nanostruktur origami DNA w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy. Odwracalność tworzenia polipleksu ułatwia jego zastosowanie w wieloetapowych testach diagnostycznych, w których ochrona origami DNA przed degradacją nukleolityczną lub zubożeniem soli jest kluczowa w jednym etapie, ale może powodować problemy w innych etapach, takich jak amplifikacja DNA. Ponadto powlekanie polikacyjne jest potencjalnym podejściem do zwiększenia wychwytu komórkowego nanostruktur origami DNA do zastosowań związanych z dostarczaniem leków28.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z niniejszym raportem.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 686647. Obrazy TEM zostały zarejestrowane na maszynie Morgagni pracującej pod napięciem 80 kV w obiekcie EM należącym do Vienna Biocenter Core Facilities GmbH (VBCF). Serdecznie dziękujemy Tadiji Kekic za pomoc w projekcie graficznym oraz Elisie De LIano za zaprojektowanie szkieletowej nanostruktury.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 i razy; Bufor reakcyjny DNazy INew England Biolab (NEB)B0303
ABTS (sól diamonowa kwasu 2′-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego)Alfa AesarJ65535
Kolumny ultrawirówki AmiconMerck MilliporeUCF500308, UCF510024
Oligosacharydowy mleczan chitozanu (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylowany, 60%. Skład: oligosacharydySigma-Aldrich523682
Nici odcinkowe specyficzne dla projektuIntegruj technologie DNA (IDT)
Sól sodowa siarczanu dekstranu (Mr ~ 4 kDa)Sigma-Aldrich75027
Sól sodowa siarczanu dekstranu (Mr ~ 40 kDa)Sigma-Aldrich42867
Barwnik ładujący żel DNA (6&razy;)ThermoFischer sceintificR0611
DNaza I (bez RNazy)New England Biolab (NEB)M0303
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Sigma-AldrichE3889
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) BioUltra, bezwodny, ≥ 99% (miareczkowanie)Sigma-AldrichEDS
Freeze'N Squeeze Ekstrakcja żelu DNA Kolumny wirująceBiorad7326165
HeminSigma-AldrichH9039
HEPESSigma-AldrichH3375
Zawiesiny wodoru (32% wag%)Sigma-Aldrich216763
LPEI-25 kDaPolysciences, Inc23966-1
NuPAGE Środek redukujący próbki (500 mM ditiotreitol (DTT))ThermoFischer sceintificNP0004
Glikol polietylenowy (PEG, MW ~ 8000 Da)Carl RothO263.1
Polietylen, liniowy, średnia Mn 10 000, PDI ≤ 1.2Sigma-Aldrich765090
Polietylenina, liniowa, średnia Mn 5,000, PDI ≤ 1.3764582Sigma-Aldrich
(20 mg/ml)ThermoFischer sceintificAM2548
HRP sprzężony ze streptawidynąThermoFischer sceintificN100
SYBER bezpieczny barwnik żelowy DNAThermoFischer sceintificS33102
Roztwór proteinazy K

Bibliografia

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901(2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671(2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654(2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534(2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272(2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268(2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486(2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157(2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pow oka z chitosanuliniowa poliethyleniminaochrona przed degradacj enzymatycznstosunek N Pelektroforeza w elu agarozowymtest ochrony przed DNaz ITEM z barwieniem negatywowympobieranie kom rkowe
Powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur DNA origami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.