Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Podsumowanie

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Streszczenie

Istnieje wiele strategii stosowanych przez patogeny bakteryjne, aby przetrwać i namnażać się wewnątrz komórki eukariotycznej. Tak zwane "cytozolowe" patogeny (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis i Rickettsia spp.) uzyskują dostęp do zakażonej cytozolu komórkowego poprzez fizyczną i enzymatyczną degradację pierwotnej błony wakuolarnej. Po dostaniu się do cytozolu patogeny te zarówno namnażają się, jak i generują wystarczające siły mechaniczne, aby przeniknąć przez błonę plazmatyczną komórki gospodarza w celu zainfekowania nowych komórek. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten końcowy etap cyklu infekcji komórkowej L. monocytogenes (Lm) można określić ilościowo zarówno za pomocą testów jednostek tworzących kolonie, jak i cytometrii przepływowej, a także podajemy przykłady, w jaki sposób czynniki kodowane przez patogen i gospodarza wpływają na ten proces. Wykazaliśmy również ścisłą zgodność dynamiki infekcji Lm w hodowanych komórkach zakażonych in vitro i komórkach wątroby pochodzących od myszy zakażonych in vivo. Te testy oparte na funkcjach są stosunkowo proste i można je łatwo skalować do opartych na odkryciach wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla modulatorów funkcji komórek eukariotycznych.

Wprowadzenie

Eksperymentalne modele oparte na infekcjach są z natury trudne ze względu na ich zależność od warunków początkowych gospodarza i patogenu, różne strategie infekcji patogenów oraz trudności w przypisywaniu procesów sterowanych przez patogeny i gospodarzy na podstawie wyników. Bakteria Listeria monocytogenes (Lm) stała się idealnym patogenem do badania odpowiedzi obronnych gospodarza ze względu na jej genetyczną i mikrobiologiczną podatność, szybką i procesową strategię infekcji komórkowej oraz stosunkowo wyraźny związek między fenotypami infekcji na poziomie komórkowym i organizmu. Infekcja komórkowa Lm przebiega przez cztery odrębne fazy¹: (i) inwazja komórkowa, która kończy się zamknięciem Lm w wakuoli; (ii) rozpuszczanie błony wakuoli kierowane Lm i uwalnianie Lm do cytozolu; (iii) replikacja wewnątrzcytozolowa; oraz (iv) fizyczna penetracja błony plazmatycznej, która powoduje albo zakażenie bezpośrednio sąsiadujących komórek (takich jak arkusz nabłonka), albo, w komórkach pojedynczych, uwolnienie Lm do środowiska zewnątrzkomórkowego. Każda z tych faz jest promowana przez specyficzne czynniki kodowane przez Lm (zwane "czynnikami wirulencji"), które po usunięciu powodują defekty infekcji zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych. Ta ogólna strategia infekcji została niezależnie rozwinięta przez szereg tak zwanych "cytozolowych" patogenów².

Testy jednostek tworzących kolonie (CFU) są szeroko stosowane do oceny zarówno in vitro (tj. komórkowych), jak i in vivo (tj. organizmów) wyników infekcji. Oprócz wysokiej czułości, szczególnie w przypadku zakażeń in vivo, testy CFU zapewniają jednoznaczny odczyt inwazji patogenu i przeżycia/proliferacji wewnątrzkomórkowej. Testy CFU są szeroko stosowane do analizy zarówno Lm, jak i determinantów komórek gospodarza, które wpływają na infekcję. Jakkolwiek pouczające były te wcześniejsze badania analizujące inwazję komórkową i replikację wewnątrzcytozolową, testy CFU nie były, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wykorzystywane do śledzenia czwartej fazy procesu infekcji Lm: ucieczki komórkowej. W tym miejscu opisujemy stosunkowo proste sposoby, w jaki ucieczka komórkowa (zwana dalej "wynurzeniem") może być monitorowana za pomocą testu CFU (a także cytometrii przepływowej) i pokazujemy przykłady, w jaki sposób zarówno czynniki kodowane przez patogen, jak i gospodarza regulują tę fazę cyklu infekcji LM. Analiza końcowej fazy komórkowego cyklu infekcji Lm może umożliwić identyfikację dodatkowych czynników i działań specyficznych dla patogenu i komórki gospodarza.

Protokół

Myszy były traktowane humanitarnie zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi rządowymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health, a ich użycie zostało zatwierdzone dla całego badania przez University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (protokół 16-053).

1. Przygotowanie komórek do infekcji

1. Rozmnażać mysią linię komórkową podobną do makrofagów RAW 264.7 w pożywkach do hodowli tkankowych DMEM uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą (odtąd określaną jako DMEM/FCS) przy użyciu kolby o pojemności 125 ml i inkubatora do hodowli tkankowych utrzymywanego w temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
2. Dzień przed zakażeniem należy użyć skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z kolby rozprężnej i zebrać w stożkowej probówce z zakrętką o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 800 x g przez 10 minut, zdekantować supernatant i zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM/FCS (bez antybiotyków) i oznaczyć miano za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
3. Dostosuj miano do 2 x 10⁶ komórek/ml i dodaj 0,10 ml (2 x 10⁵ komórek) do studzienek 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że zawiesina komórek pokrywa całą powierzchnię studzienki.
   1. Umieść komórki w dodatkowych studzienkach dla późniejszego źródła kondycjonowanych pożywek. Umieść również 0,10 ml DMEM/FCS w trzech dodatkowych studzienkach, aby służyły jako "kontrola bez komórek".
4. Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C/5% CO₂ . Następnego dnia nie wyjmować z inkubatora, dopóki inokulum bakterii nie zostanie przygotowane i nie będzie gotowe do użycia.

2. Przygotowanie Listeria monocytogenes (Lm) do zakażenia

1. Zaszczepić 2 ml naparu mózgowo-sercowego (BHI) pojedynczą kolonią ze świeżo pokrytej płytki agarowej (<2 dni) Lm i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 130 obrotów/min.
2. Następnego dnia dodać 0,10 ml kultury przez noc do 2 ml wstępnie ogrzanego BHI i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż gęstość optyczna (OD₆₀₀) wyniesie od 0,4 do 0,6.
3. Określ przybliżone miano bakterii za pomocą empirycznie wyznaczonego wzoru konwersji. W naszym laboratorium wykładniczo rosnąca kultura Lm w BHI wynosi około 1,3 x 10⁹ jednostek tworzących kolonie (CFU) / OD₆₀₀. Zminimalizuj czas, w którym kultury bakterii są wystawione na działanie temperatury pokojowej.
4. Tuż przed zakażeniem dostosować miano do 5 x 10⁷ CFU/ml, używając wstępnie podgrzanego DMEM/FCS jako rozcieńczalnika.

3. Infekcja

1. Pracując szybko i precyzyjnie, dodać 20 μl (1 x 10⁶ CFU; wielokrotność infekcji, MOI = 5) świeżo przygotowanego inokulum Lm (krok 2.4 powyżej) do studzienek, lekko przechylając szalkę i ostrożnie umieszczając końcówkę pipety w leżącej pożywce;
   UWAGA: unikaj dotykania ścianek studni końcówką pipety.
2. Delikatnie odpipetować zawartość każdej studzienki, aby zapewnić całkowite wymieszanie; nie potrząsać ani nie przechylać płytki znacząco, ponieważ spowoduje to rozprowadzenie Lm po ściankach studzienki. Umieścić naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO_{2 .}
3. Przygotować roztwór gentamycyny o stężeniu 10 μg/ml, używając kondycjonowanych pożywek z niezakażonych studzienek jako rozcieńczalnika.
4. Po 30 minutach od zakażenia (mpi) ostrożnie dodać 30 μl roztworu gentamycyny (końcowe stężenie 2,5 μg/ml) i delikatnie odpipetować zawartość studzienki jak poprzednio, a następnie umieścić naczynie do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
5. Przy 60 mpi należy zebrać odpowiednie dołki do testu CFU (punkt czasowy 60 mpi) lub analizy FCM (jak opisano poniżej odpowiednio w sekcjach 4 i 5).
6. W przypadku pozostałych studzienek, w różnych momentach po ich zakończeniu, albo pobiera się komórki, jak poprzednio, albo, w przypadku testu wschodów Lm, całkowicie usuwa się pożywkę ze studzienki i zastępuje się ją 150 μl pożywki kondycjonowanej bez gentamycyny.

4. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza wewnątrzkomórkowych i emergentnych Lm za pomocą testu CFU

1. Aby zebrać, lekko przechyl naczynie i ostrożnie wyjmij całe podłoże ze studni. Dodać 0,50 ml destylowanej sterylnej wody (_dsH2O) do studzienki. Po 30 s przenieś powstały lizat wodny (10:⁰) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i energicznie wiruj przez 10 s.
2. Przygotować rozcieńczenia ^10-1 i ^10-2, dodając 4,5 μl lub 50 μl lizatu wodnego do 450 μl dsH₂O i krótko przemieszać, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
3. Rozprowadzić 50 μl 10 0, ^10-1 i/lub ^10-2 próbek na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB).
4. Aby oznaczyć obecność Lm (krok 3.6 powyżej), należy usunąć 10 μl pożywki wierzchniej i podzielić ją na dwie podwielokrotności po 5 μl: do jednej podwielokrotności dodać 5 μl DMEM/FCS, a do drugiej podwielokrotności dodać 5 μl DMEM/FCS zawierającej 5 μg/ml gentamycyny. Ta ostatnia kontrola rozróżnia zewnątrzkomórkowy Lm (wrażliwy na gentamycynę) i wewnątrzkomórkowy Lm (odporny na gentamycynę) w kolejnym teście CFU.
5. Po 5 minutach w temperaturze pokojowej dodać 90 μl dsH₂O, energicznie wirować przez 10 s i rozprowadzić 50 μl na płytkach agarowych LB.
6. Wymienić kolonie Lm na płytkach agarowych LB po 2 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C.

5. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza wewnątrzkomórkowych i emergentnych lm za pomocą cytometrii przepływowej (FCM)

1. Przygotuj komórki RAW 264.7 zgodnie z opisem w krokach 1.1-4. Dostosuj komórki do 1 x 10⁶ komórek/ml i dodaj 1 ml (1 x 10⁶ komórek) do studzienek 6-dołkowego naczynia do hodowli tkankowej.
2. Przygotować inokulum bakterii zgodnie z opisem w kroku 2.1-2.3 i zainfekować komórki objętością inokulum odpowiadającą MOI wynoszącej 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. Po 1,5 godziny od zakażenia (hpi) zebrać pożywkę z pierwszego zestawu studzienek i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i umieścić na lodzie, aż wszystkie studzienki zostaną przetworzone.
4. Aby zebrać wewnątrzkomórkowy Lm, dodaj 1 ml dsH₂O do studzienki i po 60 s przenieś powstały lizat wodny do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z 500 μl 4% PFA. Wiruj energicznie przez 10 s i umieść na lodzie, aż wszystkie dołki zostaną przetworzone. (Przetwarzanie próbki opisano w kroku 5.8 poniżej).
5. W przypadku pozostałych studzienek usuń pożywkę i zastąp 1 ml DMEM/FCS 5 μg/ml gentamycyny, aby zabić zewnątrzkomórkowy Lm i natychmiast zwrócić komórki do inkubatora.
6. Po 30 minutach (2 hpi) usuń pożywkę i zastąp ją DMEM/FCS bez gentamycyny.
7. Po 2 i 4 godzinach (4 i 6 hpi) należy wykonać drugi i trzeci punkt czasowy, zbierając pożywki i lizaty w krokach 5.3 i 5.4.
8. Probówki wirówkowe o masie 10 000 x g przez 7 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.
9. Zawiesić każdą granulkę w koktajlu barwiącym zawierającym 50 μl 4% PFA i 15 μl falloidyny. Inkubować probówki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
10. Po inkubacji dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.
11. Wirować probówki o sile 10 000 x g przez 7 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu.
12. Zawiesić każdą osadkę w 400 μl buforu FACS do natychmiastowego użycia lub 200 μl buforu FACS i 200 μl 4% PFA, jeśli jest przechowywana do późniejszej analizy.
13. Uruchom próbki na cytometrii przepływowej i przeanalizuj zebrane dane.

6. Pobieranie próbek, przetwarzanie i analiza kolonizacji Lm i reakcji gospodarza w wątrobie

1. Przygotuj Lm na infekcję zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.3.
2. Oblicz niezbędną ilość subkultury dla pożądanego miana 3 x 10⁶ jtk/ml.
3. Tuż przed infekcją rozcieńczyć ilość obliczonych bakterii wstępnie podgrzanym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) w końcowej objętości 1 ml. Jest to inokulum wejściowe, które jest wstrzykiwane myszy.
4. Za pomocą strzykawki insulinowej 28 G1/2 100U pobrać 100 μl (3 x 10⁵ CFU) inokulum wejściowego i usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza.
5. Umieścić mysz (szczep C57BL/6; samce w wieku od 6 do 12 tygodni) w uchwycie i użyć ciepłej wody (nie wyższej niż 45 °C) do rozszerzenia żyły ogonowej, a następnie wstrzyknąć inokulum wejściowe do żyły.
6. Rozcieńczenia inokulum wejściowego na płytkach ^10-2 i ^10-3 na płytkach LB agar 10bcm i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu określenia rzeczywistej dawki wejściowej.
7. W wieku 18 hpi humanitarnie poddaj mysz eutanazji (uduszenie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy) i za pomocą sterylnych nożyczek rozetnij otrzewną myszy, aby zebrać płat czołowy wątroby za pomocą oddzielnych par pęset i nożyczek na zewnątrz i wewnątrz myszy. Umieść wątrobę na 6-centymetrowej szalce Petriego na lodzie.
8. Pokrój wątrobę w drobną kostkę i umieść w szklanej fiolce z magnetycznym mieszadłem. Dodać 2 ml kolagenazy D o stężeniu 2 mg/ml rozpuszczonej w DMEM bez FCS. Inkubować fiolki w temperaturze 37 °C na mieszadle magnetycznym przez 30−45 min. Po homogenizacji tkanki dodaj 3 ml DMEM/FCS, aby dezaktywować kolagenazę.
9. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm do stożkowej probówki, w razie potrzeby dodając więcej DMEM/FCS.
10. Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do osadzania w temperaturze 4 °C przez 10 minut, usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu ACK w celu lizy czerwonych krwinek.
11. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w buforze ACK. Zawieś komórki w 1 ml DMEM/FCS.
12. Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do osadzania w temperaturze 4 °C przez 10 minut, usunąć supernatant i zawiesić w 1 ml DMEM/FCS. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
13. Przenieś 1 x 10⁶ komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj do granulek. Następnie zawiesić w 1 ml dsH₂O i wirować w celu lizy komórek. Umieścić 50 μl na płytkach LB w nierozcieńczonych i ^10-2 rozcieńczeniach i inkubować w temperaturze 37 °C w celu oznaczenia Lm do analizy CFU.
14. Przenieść 1 x 10⁶ komórek do probówek FACS dla każdej próbki tkanki zgodnie z liczbą komórek i przemyć 1 ml buforu FACS.
15. Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do osadzania w temperaturze 4 °C przez 10 minut i usunąć supernatant.
16. Przygotować koktajl przeciwciał zawierający interesujące przeciwciała w oparciu o zalecane stężenie dla każdego przeciwciała i buforu FACS. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z zalecanymi ilościami użytymi w analizie.
17. Zawiesić osad w 100 μl koktajlu przeciwciał i inkubować probówki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
18. Po inkubacji dodać 2 ml buforu FACS do każdej probówki i zawiesić komórki.
19. Odwirować komórki w temperaturze 800 x g do granulacji w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Następnie zawiesić osad w 400 μl buforu FACS do natychmiastowego użycia lub 200 μl buforu FACS i 200 μl 4% PFA w przypadku przechowywania na później.
20. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej (patrz krok 5.13).

Wyniki

Ocena roli patogenów i czynników kodowanych przez gospodarza wpływających na infekcję komórkową
Stosując warunki infekcji opisane powyżej, 0,15% wejściowego Lm typu dzikiego jest odzyskiwane po 1,5 h koinkubacji z hodowanymi makrofagami (Rysunek 1A). W ciągu kolejnych 1,5 godziny koinkubacji (3 godziny po zakażeniu, hpi) nastąpił 4-krotny wzrost odzysku żywego Lm i od 3 do 6 hpi nastąpił dodatkowy 7,5-krotny wzros...

Dyskusja

Ze względu na szybki i procesowy program infekcji komórkowych, Lm jest idealnym patogenem do badania aktywności komórkowej, która wpływa na infekcję. Zidentyfikowano szereg czynników gospodarza, które pozytywnie lub negatywnie wpływają na infekcję komórkową Lm 11,12,13,14. Dwa takie czynniki gospodarza scharakteryzowane w naszym laboratorium, Perforyna-2 i inhibitor regulowany...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor ACK Lysing	Gibco
ArC Aminowe reaktywne koraliki kompensacyjne	Life Technologies	A10346
Rosół BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
sitko do komórek, 70 i mikro; m	VWR	10199-656
Kolagenaza D	Roche	11088858001
nośniki DMEM	Gibco	11965-092
Rury FACS	BD Falcon	352054
FBS - Inaktywacja termiczna	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks' Zrównoważony roztwór soli	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB	agar Grow Cells MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy żółtych martwych komórek	Life Technologies	L349S9
Rodamina falloidyna	Thermo Fischer	R415
SP6800
28 G 1/2 "1cc	BD	329461
TPP Kultura tkankowa 48 dołków	MIDSCI	TP92048
Kultura tkankowa TPP Płytki 6-dołkowe	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
antygenowy
CD11b	Biolegend		Flurochrom = PE Cy5, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = M1/70
CD11c	Flurochrom Biolegend		= AF 647, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = N418
CD45	Biolegend		Flurochrom = APC Cy7, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrom = PE, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = BM8
Żywy/Martwy	Invitrogen		Flurochrom = AmCyN, Rozcieńczenie = 1/100
Ly6C	Biolegend		Flurochrome = PacBlue, Rozcieńczenie = 1/200, Klon = HK1.4
MHC II	Biolegend		Flurochrom = AF 700, Rozcieńczenie = 1/200, Klon = M5/114.15.2
NK 1.1	Biolegend		Flurochrom = BV 605, Rozcieńczenie = 1/100, Klon = PK136