Artykuł metodologiczny

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

DOI:

10.3791/58786

⸱

8 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest projektowanie białek chimerycznych, w których odrębne regiony białka są zastępowane odpowiadającymi im sekwencjami w strukturalnie podobnym białku, w celu określenia funkcjonalnego znaczenia tych regionów. Takie chimery są generowane za pomocą zagnieżdżonego protokołu PCR przy użyciu nakładających się na siebie fragmentów DNA i odpowiednio zaprojektowanych starterów, a następnie ich ekspresji w systemie ssaków, aby zapewnić natywną strukturę drugorzędową i modyfikacje potranslacyjne.

Funkcjonalna rola odrębnego regionu jest następnie sygnalizowana przez utratę aktywności chimery w odpowiednim teście odczytu. W związku z tym identyfikowane są regiony zawierające zestaw krytycznych aminokwasów, które można dalej badać za pomocą technik uzupełniających (np. mutagenezy ukierunkowanej na miejsce) w celu zwiększenia rozdzielczości molekularnej. Chociaż jest to ograniczone do przypadków, w których można znaleźć strukturalnie powiązane białko o różnych funkcjach, białka chimeryczne zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji krytycznych regionów wiązania w białkach, takich jak cytokiny i receptory cytokin. Metoda ta jest szczególnie przydatna w przypadkach, w których regiony funkcjonalne białka nie są dobrze zdefiniowane, i stanowi cenny pierwszy krok w podejściu do ukierunkowanej ewolucji w celu zawężenia obszarów zainteresowania i zmniejszenia wysiłku związanego z badaniami przesiewowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka rodzajów białek, w tym cytokiny i czynniki wzrostu, są zgrupowane w rodziny, których członkowie mają podobne trójwymiarowe struktury, ale często pełnią różne funkcje biologiczne1,2. Ta funkcjonalna różnorodność jest zwykle konsekwencją niewielkich różnic w składzie aminokwasów w obrębie miejsc aktywnych cząsteczki3. Identyfikacja takich miejsc i funkcjonalnych determinantów nie tylko dostarcza cennych informacji ewolucyjnych, ale także pozwala na zaprojektowanie bardziej szczegółowych agonistów i inhibitorów4. Jednak duża liczba różnic w składzie reszt często występujących między strukturalnie spokrewnionymi białkami komplikuje to zadanie. Mimo że konstruowanie dużych bibliotek zawierających setki mutantów jest obecnie wykonalne, ocena każdej pojedynczej odmiany pozostałości i ich kombinacji nadal pozostaje wyzwaniem i czasochłonnym wysiłkiem5.

Techniki oceniające funkcjonalne znaczenie dużych regionów białkowych są zatem wartościowe, aby zredukować liczbę możliwych reszt do możliwej do opanowania liczby6. Ścięte białka są najczęściej stosowanym podejściem do rozwiązania tego problemu. W związku z tym regiony uważa się za funkcjonalnie istotne, jeśli delecja określonego regionu ma wpływ na badaną funkcję białka7,8,9. Jednak głównym ograniczeniem tej metody jest to, że delecje mogą wpływać na drugorzędową strukturę białka, prowadząc do nieprawidłowego fałdowania, agregacji i niemożności zbadania zamierzonego regionu. Dobrym przykładem jest okrojona wersja onkostatyny cytokin M (OSM), w której wewnętrzna delecja większa niż 7 reszt skutkowała nieprawidłowo sfałdowanym mutantem, którego nie można było dalej badać10.

Generowanie białek chimerycznych stanowi alternatywne i innowacyjne podejście, które pozwala na analizę większych regionów białkowych. Celem tej metody jest zamiana obszarów zainteresowania w białku przez strukturalnie powiązane sekwencje w innym białku, w celu oceny wkładu zastąpionych odcinków w określone funkcje biologiczne. Szeroko stosowane w dziedzinie receptorów sygnałowych do identyfikacji domen funkcjonalnych11,12, białka chimeryczne są szczególnie przydatne do badania rodzin białek o małej tożsamości aminokwasowej, ale zachowanej strukturze drugorzędowej. Odpowiednie przykłady można znaleźć w klasie cytokin typu interleukina-6 (IL-6), takich jak interleukina-6 i rzęskowy czynnik neurotroficzny (6% identyczność sekwencji)13 lub czynnik hamujący białaczkę (LIF) i OSM (20% tożsamości)6, na których opiera się poniższy protokół.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt białka chimerycznego

  1. Wybierz odpowiednie białko (donora), aby wymienić regiony z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (biorcą) Białko dawcy powinno być strukturalnie podobne, najlepiej należące do tej samej rodziny białek, ale pozbawione aktywności biologicznej, która mogłaby być wykorzystana jako odczyt. Jeśli nie są znane żadne strukturalnie spokrewnione białka, potencjalnych kandydatów można zidentyfikować za pomocą zautomatyzowanego narzędzia, takiego jak narzędzie Vector Alignment Search Tool (VAST)14,15
    1. Wejdź na europejską stronę internetową Banku Danych o Białkach (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), wprowadź nazwę interesującego Cię białka w polu wyszukiwania w prawym górnym rogu i kliknij "Szukaj". Pod warunkiem, że struktura krystaliczna jest dostępna, nie w dół identyfikatora PDB (PDB ID; np. 1evs dla OSM).
      UWAGA: jeśli dane strukturalne nie są dostępne w PDB, model homologii białka może zostać wygenerowany za pomocą narzędzia takiego jak SWISS-MODEL17, korzystając z dostępnych protokołów krok po kroku18.
    2. Uzyskaj dostęp do witryny VAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). Jeśli identyfikator PDB jest dostępny, przewiń w dół do sekcji "Pobierz wstępnie obliczone wyniki", wprowadź identyfikator PDB w polu "Pokaż podobne struktury dla" i kliknij "Przejdź". Na następnym ekranie kliknij "Oryginalny VAST", a następnie "Cały łańcuch", aby wyświetlić listę identyfikatorów PDB dla potencjalnych strukturalnie podobnych kandydatów.
      1. Jeśli identyfikator PDB jest niedostępny, ale został wygenerowany model homologii, przewiń w dół do sekcji "Szukaj z nową strukturą" i kliknij link "Wyszukiwanie VAST". Prześlij plik PDB modelu, klikając przycisk "Przeglądaj" obok opcji "Prześlij plik PDB", wybierając plik i klikając przycisk "Prześlij".
      2. Po przesłaniu pliku PDB kliknij przycisk "Start", aby rozpocząć obliczanie VAST. Po wykonaniu obliczeń kliknij "Cały łańcuch" w obszarze Domeny, aby zobaczyć identyfikatory PDB strukturalnie podobnych białek.
    3. Oceń interesujące funkcje biologiczne (np. aktywacja receptora, aktywność enzymatyczna, aktywność czynnika transkrypcyjnego) najlepszych kandydatów, albo eksperymentalnie w wybranym systemie odczytu, albo poprzez przeszukiwanie literatury. Wybierz białko dawcy o rozbieżnej funkcji w porównaniu z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.
  2. Uzyskaj sekwencje aminokwasów białkowych białek biorcy i dawcy z bazy danych sekwencji referencyjnej (RefSeq)19 .
    1. Wejdź w sekcję genów na stronie internetowej RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), wpisz nazwę interesującego Cię białka w polu wyszukiwania i kliknij "Szukaj". Kliknij nazwę genu dla żądanego gatunku na wyświetlonej liście.
    2. Przewiń w dół do sekcji RefSeq, aby zobaczyć wszystkie udokumentowane izoformy. Kliknij identyfikator sekwencji dla interesującej nas izoformy (zaczynając od NM), przewiń w dół i kliknij "CDS", aby podświetlić region kodujący białko genu. W prawym dolnym rogu ekranu kliknij "FASTA" i skopiuj sekwencję genu.
    3. Zapisz sekwencję DNA za pomocą odpowiedniego oprogramowania do edycji DNA. Korzystając z ogólnodostępnego ApE20, otwórz program, wklej skopiowaną sekwencję w puste pole, wybierz nazwę sekwencji i kliknij 'Zapisz'.
      UWAGA: Powtórz kroki 1.2.1. zgodnie z ppkt 1.2.3. dla jednego lub więcej wybranych białek dawcy.
  3. Wybierz regiony białka, które mają zostać podstawione w różnych konstruktach chimerycznych.
    1. Podziel sekwencję białka będącą przedmiotem zainteresowania na odrębne regiony strukturalne. Idealnie byłoby, gdyby w literaturze opisano różne domeny dla danego białka. Jeżeli tak nie jest, w krokach 1.3.1.1 należy ocenić istnienie odrębnych zachowanych cech strukturalnych (helisy, pętle). zgodnie z ppkt 1.3.1.4.
      1. Pobierz dane strukturalne białka będącego przedmiotem zainteresowania ze strony internetowej PDB (patrz krok 1.1.1.). Wejdź na stronę PDB dla białka i pobierz plik PDB, klikając "pobierz" po prawej stronie ekranu.
      2. Otwórz plik PDB w systemie wizualizacji molekularnej, takim jak PyMOL (https://pymol.org/). W PyMOL wyświetl sekwencję nukleotydową (klikając Wyświetl sekwencję > włączoną), ukryj domyślne dane strukturalne (klikając H obok identyfikatora PDB i wybierając "wszystko") i wybierz widok "kreskówka", aby wyraźnie zwizualizować cechy strukturalne białka (klikając S obok identyfikatora PDB i wybierając "kreskówka").
      3. Kliknij sekwencję nukleotydów u góry ekranu, aby podświetlić różne części cząsteczki, notując aminokwasy odpowiadające każdej charakterystycznej cesze strukturalnej.
    2. Opisz różne regiony strukturalne w sekwencji DNA w ApE. Aby to zrobić, otwórz sekwencję DNA z kroku 1.2.3., wybierz nukleotydy kodujące aminokwasy w regionie, kliknij prawym przyciskiem myszy zaznaczenie i wybierz "Nowa cecha", aby nadać jej nazwę i kolor. Powtórz ten proces dla każdego obszaru strukturalnego zidentyfikowanego w poprzednim kroku.
      UWAGA: Wybór nukleotydów można dwukrotnie sprawdzić, klikając ORFs > Translate, a następnie klikając OK, aby upewnić się, że kodują one prawidłową sekwencję aminokwasów.
    3. Wyrównaj sekwencje reszt dwóch białek za pomocą narzędzia do wyrównywania białek (np. Clustal Omega21).
      UWAGA: Ponieważ chimery mają być wytwarzane w systemie ekspresji ssaków, sekwencje te powinny zawierać peptydy sygnałowe białek.
      1. Uzyskaj pełne sekwencje aminokwasów białek donorowych i receptorowych w ApE, otwierając sekwencje DNA z kroku 1.2.3., wybierając je i klikając ORFs > Translate.
      2. Wejdź na stronę internetową Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) i wprowadź sekwencje aminokwasów dwóch białek, a następnie przewiń w dół i kliknij "Prześlij". Każda sekwencja powinna być poprzedzona wierszem tekstowym z ">NazwaBiałka", aby mogła być prawidłowo zidentyfikowana.
      3. Pobierz plik wyrównania, klikając zakładkę "Pobierz plik wyrównania" i zapisz go. Plik ten można otworzyć za pomocą dowolnego programu do edycji tekstu.
      4. Używając pliku wyrównującego jako odniesienia, opisz odpowiednie regiony strukturalne białka dawcy w ich sekwencji DNA (patrz krok 1.3.2.).
    4. Zdecyduj, które regiony białek mają zostać wymienione w białkach chimerycznych i zaprojektuj odpowiednie sekwencje nukleotydowe dla chimer.
      UWAGA: Wobec braku szczegółowych informacji na temat funkcjonalnego znaczenia różnych regionów, sugeruje się wybór dużych podstawień, takich jak całe pętle lub helisy, aby ocenić, które z nich mają wpływ na funkcję białka. Po tym pierwszym eksploracyjnym eksploracyjnym może nastąpić druga runda projektowania białek chimerycznych, skoncentrowana na mniejszych podstawieniach w odpowiednich regionach.
      1. Utwórz kopię opisanej sekwencji DNA białka receptorowego z kroku 1.3.2. i zmień jej nazwę na białko chimeryczne. Otwórz sekwencję DNA o zmienionej nazwie w ApE, wybierz i usuń sekwencję nukleotydów kodującą region, który ma zostać wymieniony, i zastąp ją odpowiednim regionem w białku dawcy (skopiowanym z sekwencji z adnotacjami utworzonej w kroku 1.3.3.), a następnie zapisz zmiany.
        UWAGA: Utwórz nową kopię i powtórz ten krok dla każdej innej zaprojektowanej chimery.

2. Przygotowanie do klonowania molekularnego

  1. Wybierz wektor plazmidowy odpowiedni dla wybranego systemu ekspresji. W przypadku ekspresji ssaków zalecany jest wektor o wysokiej ekspresji, taki jak pCAGGS22 lub seria wektorów pcDNA.
    1. W przypadku klonowania opartego na enzymach restrykcyjnych wykazanego w niniejszym protokole należy upewnić się, że niepowtarzalne miejsca restrykcyjne obecne w miejscu wielokrotnego klonowania (MCS) wektora są zgodne z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Aby to zrobić, otwórz sekwencję DNA konstruktów chimerycznych za pomocą ApE, kliknij "Enzymy > selektor enzymów" i sprawdź, czy co najmniej dwa miejsca restrykcyjne w MCS są nieobecne w sekwencji (wyświetlając zero obok ich nazwy).
  2. Zaprojektuj końcowe startery za pomocą edytora DNA, takiego jak ApE.
    1. Utwórz nowy plik DNA (File > New) i zainicjuj N-końcowy starter z sekwencją liderową (3-9 dodatkowych par zasad, np. AAAGGGAAA), po której następuje pierwsze miejsce restrykcyjne wybrane w MCS wektora (6-8 par zasad, np. TTAATTAA dla PacI), opcjonalny dystans (np. GCTAGCGCATCGCCACC w wektorze pCAGGS użytym w przykładzie) i początkowe 18-27 par zasad interesującego genu (np. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG dla OSM).
    2. W nowym pliku DNA sekwencja startera C-końcowego zaczyna się od końcowych 18-27 par zasad genu będącego przedmiotem zainteresowania (np. CTCGAGCACCACCACCACCACCACCACCAGGA dla genu ze znacznikiem C-końcowym 6xhistydyny), po którym następuje opcjonalny odstęp (np. TAGCGGCCGC w wektorze pCAGGS), drugie wybrane miejsce restrykcyjne (np. GGCGCGCC dla AscI) i sekwencja liderowa (np. AAAGGGAAA). Zaznacz całą sekwencję, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Odwrotne uzupełnienie", aby uzyskać odwrócony starter.
  3. Zaprojektuj startery dla każdego z regionów granicznych w konstrukcjach chimerycznych.
    1. Otwórz sekwencję DNA chimery (utworzoną w kroku 1.3.4.1.) i zaznacz region 30 par zasad w strefie, w której stykają się sekwencje oryginalne i wstawione, składający się z 15 par zasad każdej sekwencji. Skopiuj region (kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Kopiuj") i wklej go do nowego pliku DNA; Ta sekwencja będzie podstawowym elementarzem.
    2. Utwórz kopię startera do przodu wygenerowanego w poprzednim kroku i zmień jego nazwę na starter odwrotny. Zaznacz sekwencję starterów, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Odwrotne uzupełnienie", aby wygenerować odwrotną sekwencję starterów.
    3. Powtórzyć kroki 2.3.1 i 2.3.2 dla każdej strefy kontaktu w sekwencji chimerycznego DNA. Ogólnie rzecz biorąc, do wygenerowania jednej chimery wymagane są dwa zestawy starterów do przodu/do tyłu, chyba że zamiana następuje w obszarach N-końcowych lub C-końcowych.
  4. Zamów końcowe i wewnętrzne startery u dostawcy syntezy oligonukleotydów.
    Notatki: Stosowanie wysoce oczyszczonych starterów końcowych (np. oczyszczonych metodą HPLC) może mieć pozytywny wpływ na wskaźnik powodzenia protokołu. Odsolone podkłady wewnętrzne zwykle zapewniają dobre wyniki.
  5. Uzyskanie sekwencji matrycowych genów dawcy i receptora.
    UWAGA: Zastosowanie plazmidów zawierających otwarte ramki odczytu (ORF) tych sekwencji jako matrycy znacznie ułatwia procedurę i jest zalecane. Alternatywnie, komplementarne DNA (cDNA) wygenerowane z linii komórkowej, o której wiadomo, że wyraża te geny, można wykorzystać jako matrycę dla kolejnych etapów.

3. Amplifikacja pojedynczych fragmentów DNA tworzących chimerę w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

  1. Przygotować indywidualną mieszaninę reakcyjną PCR dla każdego z fragmentów składających się na białko chimeryczne. Typowe białko chimeryczne będzie wymagało trzech pojedynczych fragmentów: części N-końcowej, regionu do wstawienia i części C-końcowej.
    Notatki: Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności (np. Phusion High Fidelity DNA Polymerase), aby uniknąć wprowadzania mutacji w sekwencji. Reakcję PCR można ustawić wieczorem i przeprowadzić przez noc.
    1. Ustawić probówkę do mikrofuge o pojemności 1,5 ml na lodzie i odpipetować różne odczynniki mieszanin PCR w kolejności pokazanej w tabeli 1, upewnić się, że dla każdej reakcji PCR zastosowano właściwe startery i matryce (patrz Tabela 2).
    2. Oznacz dwie cienkościenne probówki PCR o pojemności 0,2 ml dla każdej reakcji i przenieś 20 μl odpowiedniej mieszaniny PCR do każdej probówki. Przenieść probówki PCR do termocyklera PCR i zainicjować protokół wyszczególniony w tabeli 3.
      UWAGA: temperatura wyżarzania powinna być co najmniej o 5 stopni niższa niż temperatura topnienia zaprojektowanych podkładów.
  2. Podczas wykonywania PCR przygotuj 100 ml 1% żelu agarozowego w buforze Tris-Acetate-EDTA (TAE). W tym celu odważyć 1 g agarozy, wymieszać ze 100 ml buforu TAE w szklanej kolbie i podgrzewać w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy, obracając kolbę co 30-40 sekund. Pozostawić do ostygnięcia do około 50 °C, dodać 2-3 μl bromku etydyny (lub równoważnego barwnika DNA) i wlać tackę na żel z pożądanymi grzebieniami.
    UWAGA: bromek etydyny jest znanym mutagenem, należy upewnić się, że stosuje się odpowiedni sprzęt ochronny.
  3. Po zakończeniu reakcji PCR dodać 4 μl 6x buforu ładującego DNA do każdej probówki. Umieścić 1% żel agarozowy w urządzeniu do elektroforezy, przykryć buforem TAE i ostrożnie załadować próbki do żelu wraz z drabinką o masie cząsteczkowej.
    UWAGA: w momencie załadunku zaleca się pozostawienie pustych pasów między próbkami, aby ułatwić późniejsze odzyskanie DNA.
  4. Uruchom żel pod napięciem 80-120 V przez 20-45 minut.
    UWAGA: pasma poniżej 1,000 par zasad można zwykle poddać elektroforezie w ciągu około 20 minut przy napięciu 120 V, podczas gdy większe pasma będą wymagały dłuższego czasu pracy.
  5. Wyłącz urządzenie do elektroforezy, wyjmij żel agarozowy i uwidocznij amplifikowane prążki DNA w świetle UV. Za pomocą żyletki wytnij poszczególne fragmenty DNA z żelu i przenieś je do oznakowanych probówek do mikrofug o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Zminimalizuj czas ekspozycji na światło UV, aby uniknąć uszkodzenia DNA.
  6. Użyj zestawu do czyszczenia PCR (patrz tabela materiałów), aby oczyścić różne fragmenty DNA.
    1. Dodać 500 μl buforu NTI dostarczonego w zestawie do każdej probówki zawierającej fragment żelu. Przenieść do termomiksera w temperaturze 50-55 °C i wstrząsać z prędkością 1000 obr./min, aż żel całkowicie rozpuści się w buforze.
    2. Przenieś każdy roztwór do oznakowanej kolumny zestawu, odwiruj w mikrowirówce (30-60 s, 11 000 x g) i odrzuć przepływ. Dodać 700 μl buforu płuczącego NT3 z zestawu, ponownie odwirować przy tych samych ustawieniach i odrzucić przepływ. Ponownie odwirować kolumny przez 1-2 minuty przy 11 000 x g, aby wysuszyć membranę krzemionkową wewnątrz kolumny.
    3. Przenieś kolumnę do znakowanej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, odpipetuj 30 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny, odstaw na 1 minutę i odwiruj 30-60 s przy 11 000 x g, aby wymyć DNA.
  7. Określić ilościowo ilość odzyskanego DNA, mierząc absorbancję próbki przy 260 nm i 340 nm w spektrofotometrze (zob. tabela materiałów). Stężenie DNA oblicza się, odejmując odczyt 340 nm od liczby 260 nm, a następnie mnożąc wynik przez współczynnik ekstynkcji DNA (50 μg/ml)23.
    Notatki: Dodatkowe pomiary przy 230 nm i 280 nm pozwalają na ocenę czystości DNA: proporcje 260/280 i 260/230 powyżej 1,8 są ogólnie uważane za czyste dla DNA. Po tym kroku protokół można wstrzymać, przechowując wymyte DNA w temperaturze 4 °C (krótkoterminowo) lub -20 °C (długoterminowo).

4. Amplifikacja PCR w celu wygenerowania chimerycznej sekwencji DNA

  1. Przygotuj 50 μl reakcji PCR, aby połączyć oddzielne składniki chimery. Wykonaj te same kroki opisane w 3.1, stosując N-końcowe i C-końcowe startery wraz z 10 ng każdego z fragmentów DNA uzyskanych w kroku 3.7.
    UWAGA: Reakcję PCR można ustawić wieczorem i przeprowadzić przez noc.
  2. Powtórz kroki od 3.2 do 3.7 w celu odzyskania i ilościowego określenia oczyszczonego fragmentu DNA w 30 μl wody wolnej od nukleaz. Fragment ten zawiera chimeryczną sekwencję DNA, otoczoną miejscami restrykcyjnymi zawartymi w końcowych starterach.

5. Wprowadzenie chimerycznego DNA do wektora ekspresji

  1. Oznaczyć dwie probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml i odpipetować różne odczynniki w kolejności wskazanej w tabeli 4, dodając 1 μg wybranego wektora ekspresji do jednej probówki i 1 μg odzyskanego fragmentu DNA do drugiej. Inkubować przez 1-4 godziny w temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia trawienia wybranymi enzymami restrykcyjnymi.
    Notatki: Upewnij się, że oba enzymy restrykcyjne są kompatybilne z zastosowanym buforem. W przypadku, gdy wymagają one zupełnie innych, najpierw wykonaj te czynności tylko z jednym z enzymów i powtórz. Czas potrzebny do trawienia może się różnić w zależności od wybranych enzymów restrykcyjnych: szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta.
  2. Powtórzyć kroki 3.2 do 3.7 w celu oczyszczenia i odzyskania strawionego fragmentu DNA i wektora ekspresji w 30 μl wody wolnej od nukleaz. Określ ilościowo ilość odzyskanego DNA tak jak poprzednio.
  3. Obliczyć ilość wstawienia DNA wymaganą do uzyskania stosunku 3:1 wtrącenia do wektora molowego w reakcji ligacji, korzystając z następującego równania.

    Wstaw (ng) = Stosunek molowy * Wektor (ng) * Rozmiar wkładki (bp) / Rozmiar wektora (bp)

    UWAGA: Można testować różne proporcje molowe insert/wektor, chociaż zwykle stosunek 3:1 jest wystarczający do uzyskania odpowiednich wyników.
  4. Umieścić 20 μl reakcji ligacji w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml z 40 ng wektora ekspresyjnego ilością chimerycznego DNA obliczoną w kroku 5.3, bufor i ligazę DNA T4 zgodnie z kolejnością wskazaną w tabeli 5 i inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.
    UWAGA: Skuteczność ligacji jest na ogół zwiększana przez przeprowadzenie reakcji przez noc w temperaturze 16 °C, ale alternatywnie reakcję można inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Przekształć 5-10 μl mieszaniny ligacyjnej w chemicznie kompetentną Escherichia coli (E. coli) przygotowaną zgodnie ze standardowymi protokołami24 Hoduj na płytkach selekcyjnych i wybieraj pojedyncze kolonie do ekspansji i izolacji plazmidowego DNA zgodnie z ustalonymi protokołami25.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano szczep E. coli XL1-Blue, ale można również użyć innych wariantów E. coli.
  6. Roztrawić 1 μg wyizolowanych plazmidów za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych zgodnie z instrukcjami w kroku 5.1 i ocenić obecność prążka DNA o rozmiarze odpowiadającym sekwencji chimerycznej za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (patrz kroki 3.2-3.5).
    UWAGA: Zaleca się, aby wstawiona sekwencja została zweryfikowana za pomocą usługi sekwencjonowania DNA.
  7. Po pomyślnej weryfikacji sekwencji, plazmidy mogą być produkowane w większych ilościach i wykorzystywane w systemie ekspresji ssaków, postępując zgodnie z dobrze znanymi protokołami26,27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa i generacja białka chimerycznego (Rysunek 1) zostanie zilustrowana na przykładzie dwóch członków rodziny cytokin interleukiny-6, OSM i LIF, które były przedmiotem niedawno opublikowanego badania6. Rysunek 2 pokazuje trójwymiarową strukturę tych białek. Obie cząsteczki przyjmują charakterystyczną strukturę drugorzędową cytokin klasy I, z czterema helisami (określanymi jako A do D) upakowanymi w wiązkę i połącz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wytwarzanie białek chimerycznych stanowi wszechstronną technikę, która jest w stanie wyjść poza granice białek skróconych, aby odpowiedzieć na takie pytania, jak modułowość domen wiążących cytokiny z receptorem13. Projektowanie chimer jest kluczowym krokiem w tego rodzaju badaniach i wymaga starannego rozważenia. Wstępne badania mające na celu ustalenie domen funkcjonalnych będą na ogół wymagały zastąpienia szerokich regionów w pierwszej fazie, podczas gdy mniejsze zamienniki o zmiennej długości s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Towarzystwo Maxa Plancka i Klinikę Schüchtermanna (Bad Rothenfelde, Niemcy). Część tych badań została pierwotnie opublikowana w czasopiśmie Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Pętla AB i D-helisa w miejscu wiązania III ludzkiej onkostatyny M (OSM) są wymagane do aktywacji receptora OSM. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © Autorzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Termocykler LabcyclerSensoquest011-103Do realizacji tego protokołu można użyć dowolnej konwencjonalnej maszyny do PCR
Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000C Kwantyfikacja DNA
GeneRuler 100 bp Drabinka DNAThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler DNA Ladder MixThermoFisher ScientificSM0331
Enzym restrykcyjny AscINew England BiolabsR0558
Enzym restrykcyjny PacINew England BiolabsR0547
Phusion Hot Start II Polimeraza DNAThermoFisher ScientificF-549S
Zestaw dNTP (100 mM)Invitrogen10297018
Ligaza DNA T4PromegaM1804
NucleoSpin Gel i zestaw do czyszczenia PCRMacherey-Nagel740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), zapas gliceroluThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE agarozaBiozym
ElementarzeSigma-AldrichZamówienie niestandardowe
Ludzka onkostatyna M cDNAPrezent dr Heike Hermanns (Oddział Hepatologii, Szpital Uniwersytecki Wü rzburg, Niemcy) 
Wektor pCAGGS z miejscamiDar Dr. André Schneider (Instytut Badań nad Sercem i Płucami im. Maxa Plancka, Bad Nauheim, Niemcy)
840004 ograniczeń PacI i AscI

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
  2. Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
  3. Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
  4. Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
  5. Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787(2017).
  6. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
  7. Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
  8. Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
  9. Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
  10. Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
  11. Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
  12. Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
  13. Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
  14. Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
  15. Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
  16. Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980(2003).
  17. Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
  18. Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
  19. Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
  20. Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
  21. Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539(2011).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351(2018).
  27. Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
  28. Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
  29. Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
  30. Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
  31. Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
  32. Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82(2015).
  33. McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
  34. Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
  35. Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
  36. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
  37. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  38. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  39. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nested PCR ProtocolProtein Region ExchangeStructural Region IdentificationDNA Fragment PurificationGel Electrophoresis AnalysisRestriction Enzyme ScreeningMammalian Protein ExpressionFunctional Activity AssaySite Directed Mutagenesis

Powiązane artykuły