Artykuł metodologiczny

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

DOI:

10.3791/58788

⸱

31 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mikrogleju to wrodzone komórki odpornościowe mózgu, które nieustannie skanują swoje otoczenie swoimi długimi procesami, a po zakłóceniu homeostazy ulegają szybkim zmianom morfologicznym. Na przykład zmiana laserowa indukuje w ciągu kilku minut zorientowany wzrost procesów mikroglejowych, zwanych również "ruchliwością kierunkową", w kierunku miejsca urazu. Podobny efekt można uzyskać dostarczając miejscowo ATP lub serotoninę (5-hydroksytryptaminę [5-HT]). W tym artykule opisujemy protokół indukowania kierunkowego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnego zastosowania ATP lub 5-HT w ostrych wycinkach mózgu młodych i dorosłych myszy oraz obrazowania tego przyciągania w czasie za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Zaproponowano prostą metodę kwantyfikacji za pomocą bezpłatnego oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Wyzwaniem, które nadal charakteryzuje ostre wycinki mózgu, jest ograniczony czas, skracający się wraz z wiekiem, podczas którego komórki pozostają w stanie fizjologicznym. Protokół ten podkreśla zatem pewne ulepszenia techniczne (pożywka, komora interfejsu powietrze-ciecz, komora obrazowania z podwójną perfuzją) mające na celu optymalizację żywotności komórek mikrogleju w ciągu kilku godzin, zwłaszcza w wycinkach od dorosłych myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mikrogleju są makrofagami rezydującymi w mózgu i odgrywają rolę zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych1,2. Mają silnie rozgałęzioną morfologię i stale wydłużają i cofają swoje procesy3,4. Uważa się, że to zachowanie "skanowania" jest związane i konieczne do badania ich otoczenia. Plastyczność morfologiczna mikrogleju wyraża się w trzech trybach. Po pierwsze, niektóre związki szybko modulują morfologię mikrogleju: dodanie ATP5,6 lub NMDA5,7 w średnio kąpiących się ostrych wycinkach mózgu zwiększa złożoność rozgałęzień mikrogleju, podczas gdy noradrenalina zmniejsza it6. Efekty te są albo bezpośrednio pośredniczone przez receptory mikrogleju (dla ATP i noradrenaliny), albo wymagają uwalniania ATP z neuronów (dla NMDA). Po drugie, na szybkość wzrostu i retrakcji procesów mikrogleju, zwanych ruchliwością lub "nadzorem", mogą wpływać czynniki zewnątrzkomórkowe8, zakłócenia homeostazy9,10, lub mutacje9,10,11. Po trzecie, oprócz tych izotropowych zmian morfologii i ruchliwości, mikroglej ma zdolność do rozszerzania swoich procesów kierunkowo w kierunku pipety dostarczającej ATP3,5,12,13,14, w hodowli, w ostrych wycinkach mózgu lub in vivo, lub dostarczając 5-HT w ostrych wycinkach mózgu15. Tak zorientowany wzrost procesów mikrogleju, zwany również ruchliwością kierunkową, został po raz pierwszy opisany jako odpowiedź na lokalne uszkodzenie laserowe3,4. Tak więc, fizjologicznie, może to być związane z reakcją na uraz lub wymagane do kierowania procesów mikrogleju w kierunku synaps lub regionów mózgu wymagających przycinania podczas rozwoju15,16, lub w physiological17,18,19 lub sytuacje patologiczne9,18,19,20 w wieku dorosłym. Trzy typy zmian morfologicznych opierają się na różnych mechanizmach wewnątrzkomórkowych11,13,20, a jeden dany związek niekoniecznie moduluje wszystkie z nich (np. NMDA, który działa pośrednio na mikroglej, ma wpływ na morfologię, ale nie indukuje ruchliwości kierunkowej5,7). Dlatego, dążąc do scharakteryzowania wpływu związku, mutacji lub patologii na mikroglej, ważne jest scharakteryzowanie trzech składników jego plastyczności morfologicznej. W tym miejscu opisujemy metodę badania kierunkowego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnego źródła związku, którym jest ATP lub 5-HT.

Istnieje kilka modeli do badania atrakcyjności procesów mikrogleju: kultury pierwotne w środowisku 3D6,18,19, ostre plastry mózgu6,13,15, oraz obrazowanie in vivo3,13. Podejście in vivo jest najlepsze dla zachowania fizjologicznego stanu mikrogleju. Jednak obrazowanie przyżyciowe głębokich obszarów wymaga skomplikowanych zabiegów chirurgicznych i dlatego często ogranicza się do powierzchownych warstw kory mózgowej. Zastosowanie pierwotnej hodowli mikrogleju jest najłatwiejszą techniką testowania dużej liczby warunków na ograniczonej liczbie zwierząt. Niemniej jednak niemożliwe jest uzyskanie takiej samej morfologii komórek jak in vivo, a komórki tracą swoje fizjologiczne interakcje z neuronami i astrocytami. Ostre wycinki mózgu stanowią kompromis między tymi dwoma podejściami. Model ten pozwala naukowcom badać struktury mózgu, do których w inny sposób trudno jest dotrzeć, i obrazować w wysokiej rozdzielczości in vivo, a także badać wycinki z etapów noworodkowych, podczas gdy mikroskopia przezczaszkowa jest najczęściej wykonywana w wieku dorosłym. Wreszcie, umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym efektów miejscowego stosowania leków oraz powtarzanie eksperymentów z wykorzystaniem ograniczonej liczby zwierząt. Niemniej jednak problemem związanym z ostrymi wycinkami mózgu jest ograniczony czas (kilka godzin), podczas którego komórki pozostają żywe, szczególnie w przypadku wycinków myszy starszych niż dwa tygodnie, oraz potencjalna zmiana morfologii mikrogleju w czasie21,22.

Tutaj opisujemy protokół przygotowania ostrych wycinków mózgu młodych i dorosłych myszy Cx3cr1GFP/+ do dwóch miesięcy, z zachowaniem morfologii i ruchliwości mikrogleju przez kilka godzin. Następnie opisujemy, jak wykorzystać te wycinki do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związków takich jak ATP lub 5-HT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny (Komitet Darwina, umowy #1170 i #10921).

1. Przygotowanie szklanych mikropipet do miejscowego nakładania związków

  1. Przygotuj pipety z cienkościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza elektrod. Dostosuj parametry, aby uzyskać pipety o średnicy 4 - 5 μm na końcu. Rysunek 2D pokazuje jedną pipetę w jasnym polu przy małym powiększeniu.

2. Rozwiązania

  1. Upewnij się, że używane będą tylko naczynia szklane, które zostały oczyszczone w cyklu autoklawu, a następnie spłukane 2x - 3x ultraczystą wodą. Nigdy nie używaj naczyń szklanych, które miały kontakt z paraformaldehydem.
  2. Przygotować roztwór podstawowy 2 mol·L-1 CaCl2 rozpuszczając 14,7 mg CaCl2·2H2O w 50 ml wody o wysokiej czystości (woda ultraczysta, rezystancja 18,2 MΩ; śladowe ilości metalu w wodzie destylowanej lub wodzie z kranu mogą prowadzić do nieoptymalnej jakości plastra ze względu na działanie prooksydacyjne).
    1. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej maksymalnie przez jeden miesiąc.
  3. W dniu doświadczenia należy przygotować 1 l roztworu choliny-aCSF (sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego), którego skład to 110 mmol·L-1 choliny Cl, 25 mmol·L-1 glukozy, 25 mmol·L-1 NaHCO3, 7 mmol·L-1 MgCl2, 11,6 mmol·L-1 kwasu askorbinowego, 3,1 mmol·L-1 pirogronianu sodu, 2,5 mmol·L-1 KCl, 1,25 mmol·L-1 NaH2PO4 i 0,5 mmol·L-1 CaCl2, 0,5.
    1. Aby przygotować ten roztwór, dodać w następującej kolejności do kolby miarowej o pojemności 1 l: 0,186 g KCl, 0,195 g NaH2PO4, 2,04 g kwasu askorbinowego, 2,1 gNaHCO3 i 4,5 g glukozy.
    2. Napełnij około połowy końcowej objętości ultraczystą wodą i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Dodać 0,34 g pirogronianu sodu i 15,36 g choliny Cl.
      UWAGA: Wygodnie jest najpierw rozpuścić cholinę Cl w 5 do 10 ml roztworu przygotowanego w kroku 2.3.2 przed dodaniem jej do całego roztworu.
    4. Dodać 7 ml 1 mol·L-1 MgCl2 i 250 μl 2 mol·L-1 CaCl2 (przygotowanych w kroku 2.2) do roztworu.
    5. Napełnić kolbę miarową do objętości 1 l ultraczystą wodą.
    6. Za pomocą osmometru ciśnienia pary sprawdź, czy osmolarność wynosi od 300 do 310 mΩ. Jeśli nie, dostosuj go za pomocą glukozy.
    7. Sprawdzić pH po karbonowaniu (tj. bulgotaniu "karbogenem", mieszaniną 95% O2/5% CO2) i w razie potrzeby dostosować je do 7,3 - 7,4 za pomocą 10 M NaOH.
    8. Przenieś roztwór do szklanej butelki do przechowywania. Butelkę należy przechowywać w lodówce do czasu użycia (KROK 3.1).
      nuta: Zaleca się przygotowanie świeżego roztworu w dniu eksperymentu. Jednakże, w razie konieczności, cholina-aCSF może być przechowywana do dwóch dni w temperaturze 4 °C.
  4. W dniu doświadczenia należy przygotować 1 l roztworu aCSF, którego skład wynosi 124 mmol·L-1 NaCl, 26,2 mmol·L-1 NaHCO3, 25 mmol·L-1 glukozy, 2,5 mmol·L-1 KCl, 2 mmol·L-1 CaCl2, 1 mmol·L-1 MgCl2 i 1,25 mmol·L-1 NaH2PO4.
    1. Aby przygotować ten roztwór, dodać do kolby miarowej w następującej kolejności: 0,150 g NaH2PO4, 0,186 g KCl, 2,2 gNaHCO3, 4,5 g glukozy i 7,3 g NaCl. Doprowadzić roztwór do objętości 1 l ultraczystą wodą i energicznie wymieszać na talerzu mieszającym.
    2. Dodać 1 ml 1 mol·L-1 MgCl2 i 1 ml 2 mol·L-1 CaCl2 do roztworu i przenieść roztwór aCSF do szklanej butelki w celu przechowywania.
    3. Sprawdź, czy osmolarność wynosi 300 - 310 mΩ·L-1, a jeśli nie, dostosuj ją glukozą.
    4. Sprawdzić pH po karbonowaniu (tj. bulgotaniu z "karbogenem") i w razie potrzeby dostosować je do 7,3 - 7,4 za pomocą 10 M NaOH.
    5. Przenieś roztwór do szklanej butelki do przechowywania. Butelkę należy przechowywać w lodówce do czasu użycia (krok 3.1).
      nuta: Zaleca się przygotowanie świeżego roztworu w dniu eksperymentu. Jednakże alternatywą jest przygotowanie 10-krotnego roztworu podstawowego zawierającego NaCl,NaHCO3, KCl iNaH2PO4 o 10-krotnym stężeniu końcowym, który może być przechowywany nie dłużej niż jeden tydzień w temperaturze 4 °C. Wykonać końcowy aCSF w dniu doświadczenia, rozcieńczając 10-krotny roztwór podstawowy ultraczystą wodą i dodając glukozę, CaCl2 i MgCl2.
  5. Przygotuj roztwory leków w dniu eksperymentu. Użyj roztworu aCSF, aby doprowadzić je do końcowych stężeń, które wynoszą 500 μmol·L-1 dla ATP i 5 μmol·L-1 dla 5-HT.
    nuta: Dla ATP można przygotować roztwór podstawowy (np. 50 mM ATP w wodzie), przechowywać w porcji w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć aCSF do końcowego stężenia w dniu doświadczenia. W przeciwieństwie do tego, roztwór 5-HT (serotonina-HCl) musi być przygotowany z proszku w dniu doświadczenia, w stężeniu 1 mg·mL-1 w wodzie, przechowywany w temperaturze 4 °C w celu uniknięcia utleniania 5-HT i rozcieńczony w aCSF w czasie doświadczenia.

3. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu

  1. Przygotowanie obszaru rozwarstwienia
    1. Przygotuj 70 ml lodowatej choliny-aCSF w 80 ml zlewce umieszczonej na lodzie, która ma być użyta do perfuzji serca, szybkiego schładzania mózgu i krojenia. Przygotować 150 ml choliny-aCSF w naczyniu krystalizującym o pojemności 200 ml, umieścić w podgrzanej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 32 °C. Umieścić sitko z nylonowej siatki w naczyniu krystalizującym, aby zachować plastry. Zostanie to użyte, aby plastry zregenerowały się przez 10 minut zaraz po pokrojeniu.
    2. Co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem sekcji (sekcja 3.2) rozpocząć bulgotanie tych dwóch roztworów (70 ml choliny-aCSF na lodzie i 150 ml choliny-aCSF w temperaturze 32°C) z karbogenem. Utrzymuj stałą karbonizację podczas całego zabiegu.
    3. Przygotuj urządzenie z komorą interfejsu (Rysunek 1C), które będzie używane do przechowywania plastrów do czasu ich użycia.
      1. W szczelnie zamkniętym pojemniku na żywność (10 x 10 cm lub 10 cm średnicy, 8 cm wysokości), zainstalowanym na mieszadle magnetycznym, umieść naczynie krystalizujące o pojemności 200 ml z magnesem sztabkowym.
      2. Dodaj 200 ml aCSF do tego krystalizującego naczynia i umieść na nim wydrukowany w 3D uchwyt na plasterki interfejsu (uchwyt na plasterki interfejsu składa się z dwóch idealnie pasujących części, z rozciągniętą między nimi siatką poliamidową, Rysunek 1A, B).
      3. Usunąć nadmiar objętości z naczynia krystalizującego, aby pozostała tylko cienka warstwa roztworu pokrywająca siatkę uchwytu na plasterki interfejsu. Spowoduje to później powstanie cienka obwódka roztworu otaczająca plastry (ale bez ich przykrożenia).
      4. Umieść kilka milimetrów CSF na dnie pudełka na żywność i zacznij bulgotać go karbogenem (przy pierwszym użyciu zrób mały otwór w szczelnej ściance pojemnika na żywność, aby upewnić się, że rurka może wejść do pudełka).
      5. Zamknąć szczelnie zamknięte pudełko, zachowując stałą karbonogenizację. Stworzy to nawilżone środowisko bogate w 95% O2/5% CO2 , w którym plastry zostaną przeniesione po ich odzyskaniu w cholinie-aCSF i utrzymane przed obrazowaniem. Urządzenie to jest dalej nazywane "komorą interfejsu" (Rysunek 1C).
  2. Sekcja i krojenie mózgu
    1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg·mL-1 pentobarbitalu (0,15 ml/20 g masy ciała myszy), unieruchomić ją, odsłonić serce i wykonać perfuzję serca za pomocą 10 ml lodowatego, karbogenowanego choliny-aCSF (patrz krok 3.1.1), za pomocą pompy perystaltycznej. Obserwuj bladość wątroby jako wskaźnik dobrej perfuzji. Perfuzja trwa krócej niż 5 minut.
    2. Odetnij głowę myszy i przetnij skórę, aby odsłonić czaszkę. Dużymi nożyczkami wykonaj dwa poprzeczne nacięcia z dużego otworu i jedno długie cięcie strzałkowe, a następnie za pomocą cienkich kleszczy usuń płytki czaszki.
    3. Szybko i delikatnie wyekstrahuj mózg (w czasie krótszym niż 1 minuta) i umieść go na 1 minutę w zlewce o pojemności 80 ml zawierającej pozostałą (~60 ml) lodowatą cholinę-aCSF (nadal pod stałą karbogenacją), aby go schłodzić.
    4. Przenieś mózg na bibułę filtracyjną uprzednio zwilżoną płynem CSF.
    5. Wytnij mózg zgodnie z interesującym obszarem mózgu i preferowanym kątem krojenia. Na przykład, aby zobrazować wzgórze lub hipokamp na wycinkach koronalnych, wytnij ostrzem skalpela móżdżek, a następnie około 2 mm od rostralnych i ogonowych kończyn mózgu.
      nuta: Ważne jest, aby usunąć części mózgu, które są zbyt rostralne lub zbyt ogonowe, ponieważ im mniejszy obszar do przycięcia przed dotarciem do obszaru zainteresowania, tym szybsze krojenie. Zalecany jest całkowity czas krojenia w plastry (etap 3.2.7) krótszy niż 20 minut.
    6. W przypadku plastrów koronalnych należy umieścić i skleić (klejem cyjanoakrylowym) ogonową powierzchnię mózgu na 10-centymetrowej szalce Petriego, przyklejonej do bloku tnącego wibracyjnej krajalnicy i umieścić ją w komorze zbiornika wibrującej krajalnicy, która jest umieszczona w większej komorze wypełnionej lodem. Następnie napełnij szalkę Petriego całą pozostałą lodowatą choliną-aCSF.
    7. Utrzymując stałe bulgotanie 95% O2/5% CO2 lodowatej choliny-aCSF, wytnij plastry koronalne o grubości 300 μm (prędkość: 0,08 mm·s-1, wibracje ostrza: 60 Hz, amplituda drgań: 1 mm).
    8. Zbierz wycinki mózgu za pomocą jednorazowej pipety do przenoszenia o szerokim otworze (4 mm średnicy), jedna po drugiej po każdym przejściu ostrza, aby uniknąć gromadzenia się toksycznych składników uwalnianych przez obrzeża plasterków. Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia i umieścić każdą kromkę w cholinie-aCSF w temperaturze 32 °C na około 10 minut w celu odzyskania.
    9. Za pomocą pipety transferowej ułóż plastry na kawałkach bibuły do czyszczenia soczewek posypanych kroplą choliny-aCSF. Odessać nadmiar choliny-aCSF i za pomocą szpatułki umieścić plastry, ułożone na chusteczce do czyszczenia soczewek, na siatce komory granicy faz zawierającej karbogenowany aCSF w temperaturze pokojowej (patrz ppkt 3.1.3.5). Pozwól plasterkowi zregenerować się w tym środowisku przez co najmniej 30 minut.
      nuta: Następnie plastry są gotowe i mogą być używane do obrazowania mikrogleju do 6 godzin po ekstrakcji mózgu od młodych (poniżej jednego miesiąca) myszy i do 4 godzin po ekstrakcji mózgu od dwumiesięcznych dorosłych.

4. Mikroskopia dwufotonowa

  1. Ustawianie parametrów
    1. Włącz system wielofotonowy (detektory hybrydowe, laser, skaner, modulator elektrooptyczny, mikroskop).
    2. Dostrój laser do 920 nm, sprawdź, czy laser jest zablokowany w trybie i ustaw moc na 5% - 15%, a wzmocnienie na 10%. Odpowiada to mocy 3 - 5 mW pod obiektywem. Upewnij się, że detektory nieuszkodzone są włączone i zainstalowane są odpowiednie filtry emisji i wzbudzenia.
    3. Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania na następujące wartości: dla rozmiaru klatki, 1024 x 1024 pikseli odpowiadających obszarowi 295,07 x 295,07 μm; dla zoomu, 2. Jeśli sygnał jest bardzo głośny, zastosuj średnią liniową 2. Aby uzyskać dynamikę pikseli, ustaw oprogramowanie do obrazowania na 12 bitów lub więcej.
      nuta: Obrazy o wyższej wartości bitowej pozwalają badaczom rozróżnić mniejsze różnice w intensywności fluorescencji niż obrazy o niższej wartości bitowej: zmiana jednej wartości szarości w obrazie 8-bitowym odpowiadałaby zmianie 16 wartości szarości w obrazie 12-bitowym i 256 wartości szarości w obrazie 16-bitowym. W związku z tym obrazy o wyższych bitach są bardziej odpowiednie do analizy ilościowej, ale wraz ze wzrostem ich rozmiaru wraz z głębią bitową, pojemność pamięci masowej i moc obliczeniowa mogą stać się ograniczone.
    4. Wybierz tryb skanowania XYZT z zakresem interwału Z wynoszącym 2 μm i interwałem T wynoszącym 2 min.
      nuta: Rozdzielczość x,y i z jest określana przez twierdzenie o próbkowaniu Nyquista. Wielkość kroku Z około 0,8 byłaby optymalna do rozróżnienia procesów mikrogleju (o średnicy <1 μm), ale rozdzielczość optyczna mikroskopii wielofotonowej jest ograniczona (przy 920 nm przy obiektywie 0,95 NA rozdzielczość osiowa wynosi około 1 μm). Oprócz tej fizycznej bariery, w eksperymencie obrazowania na żywo, liczy się czułość lub stosunek sygnału do szumu, rozdzielczość, prędkość i całkowity czas obserwacji. Biorąc pod uwagę wszystkie te parametry, wybrano tutaj krok z rzędu 2 μm (jak w licznych badaniach3,11,14), rozmiar obrazu 1024 x 1024 pikseli oraz szybka akwizycja za pomocą skanera rezonansowego sprzężonego z detektorami HyD (uzyskanie 50 z-planów zajmuje około 15 s). Częstotliwość akwizycji to jedna seria XYZT co 2 minuty, a łączny czas trwania to 30 minut. Jeśli konfiguracja nie jest wystarczająco szybka lub czuła, możliwe jest zmniejszenie rozdzielczości bocznej (do 512 x 512) lub liczby warstw z (poprzez obrazowanie wyłącznie w głębokości z, która wykazuje najsilniejszą fluorescencję [tj. nie w najgłębszych warstwach z, w których fluorescencja jest słaba]) lub zmniejszenie prędkości skanera. Rozdzielczość osiową można również zmniejszyć, zwiększając krok z do 3 μm, ale ponieważ może to mieć wpływ na kwantyfikację, wszystkie eksperymenty, które mają być porównane, powinny być wykonywane z tym samym krokiem z.
      nuta: Możliwe jest przeprowadzenie podobnych eksperymentów na wycinkach myszy CX3CR1creER-YFP18, linii myszy używanej do indukowania delecji genetycznej tylko w mikrogleju, w której mikroglej konstytutywnie wyraża białko żółtej fluorescencji (YFP). Jednak poziom ekspresji YFP jest bardzo niski w porównaniu z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) u myszy CX3CR1GFP / +; Obrazowanie jest więc możliwe, ale trudne i wymaga optymalizacji parametrów akwizycji. Zaleca się ich dostosowanie w następujący sposób.
    5. Dostosuj laser do 970 nm (który jest lepiej przystosowany do wzbudzenia YFP niż 920 nm), mocy na 50%, a wzmocnienia na 50%, co odpowiada mocy lasera pod celem 5 - 6 mW.
    6. Ustaw średnią liniową równą 4 (lub więcej), aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
  2. Umiejscowienie plastra i szklanej mikropipety oraz miejscowe zastosowanie związku
    1. Podłączyć pompę perystaltyczną do komory nagrywającej, 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania. Po oczyszczeniu całego układu perfuzyjnego 50 ml ultraczystej wody, należy rozpocząć perfuzję komory rejestracyjnej za pomocą CSF (50 ml) zawartego w szklanej zlewce pod stałą karbonizacją. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj krążący aCSF na poziomie 32 °C za pomocą wbudowanego mikrogrzejnika lub grzałki Peltiera.
      nuta: Specjalna komora perfuzyjna z perfuzją górną i dolną została zaprojektowana w celu optymalizacji natlenienia po obu stronach plastra. Komora perfuzyjna składa się z dwóch idealnie pasujących do siebie części, pomiędzy którymi rozciągnięta jest siatka poliamidowa (rys. 2A,B). W porównaniu z innymi typami komór, w których plaster leży bezpośrednio na szklanym szkiełku nakrywkowym, komora ta zmniejsza śmierć neuronów w dolnej części warstwy, poprawia żywotność i zmniejsza ruchy plastra wywołane jego pęcznieniem.
    2. Za pomocą jednorazowej pipety do przenoszenia z szeroką szyjką przenieś wycinek mózgu, który ma być zobrazowany, do zlewki aCSF, aby usunąć papier do soczewek, pozwól mu zatonąć (jako dowód, że nie ma przyczepionego pęcherzyka powietrza) i przenieś go do komory zapisu (perfuzji).
    3. Umieść uchwyt na plasterki (spinkę do włosów wykonaną z platyny z dwiema gałęziami połączonymi równoległymi nylonowymi nitkami) na plasterku, aby zminimalizować ruch plastra spowodowany przepływem perfuzji.
    4. Użyj oświetlenia jasnego pola, aby skierować się w obszar zainteresowania mózgu (czas ekspozycji: od 50 do 80 ms) za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (5X lub 10X). Przełącz się na obiektyw zanurzeniowy o większym powiększeniu (25x z obiektywem 0,35x) i dostosuj pozycję.
      nuta: Unikaj obrazowania pól w pobliżu nylonowych nici uchwytu plasterka, ponieważ mogą one blokować światło i miejscowo deformować plasterek. Upewnij się, że obszar zainteresowania jest płaski. W razie potrzeby wyjmij uchwyt na plasterek, aby zmienić położenie plasterka i/lub uchwytu na plasterki.
    5. Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby zlokalizować fluorescencyjne komórki mikrogleju, które mają być zobrazowane w terenie (czas ekspozycji: 250 - 500 ms).
      nuta: Ten krok pozwala naukowcom sprawdzić obecność komórek w obszarze zainteresowania i ich intensywność fluorescencji, a także kontrolować ilość szczątków komórkowych.
    6. Napełnić pipetę 10 μl aCSF z ATP, 5-HT lub lekiem będącym przedmiotem zainteresowania w jego końcowym stężeniu. Skieruj końcówkę w dół i delikatnie potrząśnij pipetą wypełnioną lekiem, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w końcówce.
      nuta: Jeśli roztwór do wstrzyknięcia ma tendencję do tworzenia pęcherzyków, należy rozważyć użycie pipet borokrzemianowych z wewnętrznym włóknem. Wyciek ATP z pipety może przyciągać procesy mikrogleju jeszcze przed wstrzyknięciem (jeśli do tego dojdzie, będzie to widoczne na etapie analizy). Chociaż powinno to być umiarkowane przy zastosowanym stężeniu ATP (500 μmol·L-1), jeśli stanowi to problem, należy rozważyć wstępne napełnienie mikropipety 2 ml roztworu aCSF przed dodaniem roztworu ATP (lub innego związku) w kroku 4.2.6.
    7. Zamontuj napełnioną pipetę w uchwycie na pipety, połączonym przezroczystą rurką ze strzykawką o pojemności 5 ml, z tłokiem umieszczonym w pozycji 5 ml. Sam uchwyt na pipety jest zamontowany na trójosiowym mikromanipulatorze.
    8. Przy jasnym oświetleniu użyj mikromanipulatora, aby ustawić pipetę na środku pola. Aby uzyskać powtarzalne i optymalne wyśrodkowanie, wyświetl i użyj linijek na obrazie.
    9. Delikatnie opuść pipetę w kierunku plasterka, jednocześnie kontrolując i regulując obiektyw, aż końcówka pipety lekko dotknie powierzchni plasterka. Zatrzymanie opadania pipety, gdy tylko widać, że plasterek został dotknięty, pozwala końcówce pipety wniknąć w 80 - 100 μm powierzchni plasterka (patrz Rysunek 3B).
    10. Dostrój laser (patrz parametry powyżej) i przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy. Upewnij się, że komora jest osłonięta od wszelkich źródeł światła (np. ekranu komputera). Włącz detektory bez deskryptanów i ustaw wzmocnienie. Użyj tabeli przeglądowej (LUT) z górnym limitem oznaczonym kolorami, aby uniknąć nasycenia pikseli na obrazie.
    11. Określ grubość warstwy, która ma być zobrazowana (tj. górne i dolne pozycje z, w których wykrywalna jest fluorescencja [zwykle łącznie od 220 do 290 μm]).
      nuta: Na powierzchni wycinka występuje zwiększona gęstość procesów i prawdopodobnie mikrogleju, często o nietypowej morfologii, w porównaniu z wnętrzem wycinka. Akumulacja ta będzie z czasem bardziej rzucająca się w oczy (tj. bardziej widoczna w ostatnim niż w pierwszym obrazowanym wycinku mózgu). W związku z tym płaszczyzny z w pierwszych ~30 μm nie powinny być używane do analizy, a nawet można je pominąć do akwizycji.
    12. Rozpocznij nagrywanie przez łączny czas 30 minut (lub więcej, jeśli jest to pożądane), a po upływie 5 minut linii bazowej nałóż lokalnie badany związek (bez przerywania obrazowania). W tym celu należy powoli nacisnąć tłok strzykawki podłączonej do mikropipety, od pozycji 5 ml do pozycji 1 ml (w około 5 sekund). Opór podczas naciskania tłoka musi być natychmiast wyczuwalny. Jeśli nie, końcówka może być uszkodzona.
      nuta: Dla wyszkolonego eksperymentatora zastrzyki tą metodą są powtarzalne, ale alternatywnie do ręcznej manipulacji strzykawką, pipeta może być połączona z automatycznym systemem wyrzucania ciśnienia, aby umożliwić lepszą kontrolę dostarczanej objętości. Wstrzyknięcie powoduje fizyczne zniekształcenie plastra w miejscu wstrzyknięcia. Zniekształcenie to jest widoczne a posteriori na pierwszych dwóch lub trzech obrazach po wstrzyknięciu, ale nie powinno być widoczne na czwartym obrazie (tj. 8 minut po wstrzyknięciu). Jeśli problem będzie się powtarzał, należy rozważyć zmianę parametrów przygotowania pipety.
    13. Pod koniec pobierania (30 min) wyrzuć mikropipetę i usuń plasterek. W razie potrzeby utrwal plasterek w celu dalszego znakowania immunologicznego. Na przykład metoda SNAPSHOT jest zoptymalizowana pod kątem utrwalania i barwienia grubych plastrów23.
    14. Przed rozpoczęciem obrazowania nowego wycinka należy wykonać film 2D (sekcja 5.1) w celu sprawdzenia, czy mikroglej ma normalną morfologię i porusza się, a tym samym, czy wycinki są zdrowe.

5. Analiza przyciągania procesów mikrogleju

  1. Projekcja 2D i korekcja dryfu
    1. Otwórz plik (. LIF) z Fiji24.
    2. Jeśli to konieczne, utwórz podstos (Obraz/Stosy/Narzędzia/Utwórz podstos) tylko z interesującymi Cię płaszczyznami z. Na przykład, należy wykluczyć płaszczyzny z odpowiadające powierzchni przekroju, jeśli zostały one uzyskane, ale nie mają być używane do analizy (patrz UWAGA po kroku 4.2.11) oraz najgłębsze płaszczyzny z bez fluorescencji. Ostateczny stos zawiera zazwyczaj 90 - 110 plasterków Z (180 - 220 μm).
    3. Uruchom funkcję projektu Z (Image/Stacks/Z Project") i wybierz typ projekcji Max Intensity (Maksymalna intensywność), aby uzyskać projekcje stosu z w każdym punkcie czasowym.
    4. Uruchom wtyczkę MultiStackReg (Plugin/Registration/MultiStackReg), wybierając opcję Action 1: Align and Transformation: Rigid Body, aby skorygować niewielkie dryfty, które mogły wystąpić podczas przejęcia. Zapisz ten film 2D jako nowy plik (.tiff).
  2. przetwarzanie danych
    1. Otwórz ten nowy plik za pomocą polecenia Icy25.
    2. Narysuj okrągły obszar zainteresowania R1 (ROI) o średnicy 35 μm, wyśrodkowany w miejscu wstrzyknięcia (identyfikowany w szczególności przez cień pipety i zniekształcenie powstałe w momencie wstrzyknięcia).
    3. Użyj wtyczki Ewolucja intensywności ROI i zmierz średnią intensywność w czasie w R1.
    4. Zapisz wyniki w pliku .XLS.
  3. Kwantyfikacja i przedstawienie wyników
    1. Aby określić ilościowo odpowiedź mikrogleju w czasie, należy określić w każdym punkcie czasowym
      figure-protocol-1
      Tutaj "R1(0) jest średnią wartości R1(t) przed wstrzyknięciem. Następnie wyniki można przedstawić jako kinetykę odpowiedzi mikrogleju lub w określonym punkcie czasowym (patrz Rysunek 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę indukowania, obserwacji i ilościowego określania ukierunkowanego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnie stosowanego związku, na przykład ATP lub 5-HT, w ostrych wycinkach mózgu młodych lub dorosłych (co najmniej do dwóch miesięcy) myszy. Wśród czynników, które przyczyniają się do utrzymania wycinków mózgu dorosłych zwierząt w zdrowym stanie przez kilka godzin, jest użycie dwóch narzędzi zaprojektowanych w celu optymalizacji przeżycia komórek na dwóch e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymując, w przeciwieństwie do zdysocjowanych lub organotypowych kultur warstwowych, integralność strukturalną z ograniczonymi dostosowaniami sieci, ostre wycinki mózgu pozwalają naukowcom badać mikroglej w jego fizjologicznym środowisku. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest fakt, że procedura krojenia powoduje urazy, które mogą szybko zagrozić żywotności neuronów, szczególnie w dorosłym mózgu. Ponieważ mikroglej jest szczególnie reaktywny na uszkodzenia komórek, ważne jest, aby w jak największym stopniu ograniczyć...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Komórek i Tkanek w Institut du Fer à Moulin, gdzie przeprowadzono wszystkie akwizycje i analizy obrazów. Prace te były częściowo wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université Sciences oraz przez granty z Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie University (program Emergence-UPMC 2011/2014), Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", francuskie Ministerstwo Badań Naukowych (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 i program Investissements d'Avenir "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) oraz program Collaborative Research in Computational Neuroscience, National Science Foundation/Francuska Narodowa Agencja Badań Naukowych (numer : 1515686). Wszyscy autorzy są afiliowani w grupach badawczych będących członkami Paris School of Neuroscience (ENP) oraz Bio-Psy Labex. F.E. jest doktorantem afiliowanym na Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Paryż, Francja i jest finansowany przez Bio-Psy Labex. V.M. jest adiunktem finansowanym przez program Collaborative Research in Computational Neuroscience, National Science Foundation/Francuską Narodową Agencję Badań (numer: 1515686). Autorzy dziękują Marcie Kołodziejczak, która brała udział w zainicjowaniu projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
do przygotowania pipet
Borokrzemianowe cienkościenne kapilaryHarvard Apparatus30-0065Borokrzemian cienkościenny bez żarnika, 1,5 mm OD, 1,17 mm ID, 75 mm L , opakowanie 225
DMZ Uniwersalny ściągaczZeitz Instrumente
NazwaCompany Numer katalogowyUwagi
do roztworów
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)SigmaC5080
Chlorek cholinySigmaC7527
D-(+)-GlukozaSigmaG8270
Kwas L-askorbinowySigmaA5960
Roztwór chlorku magnezu 1 M (MgCl2)Sigma63020
Chlorek potasu SigmaUltra >99.0% (KCl)SigmaP9333
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS5761
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS5886
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS5011
Pirogronian soduSigmaP2256
Ultraczysta wodaMilliQdo wszystkich roztworów
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
for Przygotowanie plastrów
2x 200 ml naczyń
80 ml zlewki
Antlia-3C Cyfrowa pompa perystaltycznaDD Biolab178961Dla myszy perfuzja i perfuzja w komorze 2-fotonowej (aCSF)
Karbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide Francja Industrie
DolethalVetoquinolDolethal 50 mg/ml
(Whatman)SigmaWHA1001042Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1 (wielkość porów: 11&mikro; M)
Cienkie nożyczki - Ostrenarzędzia do nauki14060-60
Pudełko na żywność o średnicy 10 cm, klej o wysokości
(cyjanoakrylan etylu)Loctitesuper glue 3 power flex
Narzędzie hipokampowe (szpatułka)Narzędzia do nauki o napięciu10099-15Największa kończyna musi być pochylona pod kątem 90&
Kleszcze do tęczówki lodowej
(zakrzywione)MoriaMC31
Chusteczka do czyszczenia soczewekTHOR LABS
Sitkoo średnicy 7 cm
ŻyletkiMikroskopia elektronowa Sciences72000Do ostrza
skalpela
Uchwyt interfejsu Slicedomowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14002-14
Krajalnica wibracyjnaThermo Scientific720-2709Model: HM 650V (mikrotom z ostrzem wibracyjnym)
KąpielZestaw na 32 & stopni; C (pierwszy etap odzyskiwania)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
do obrazowania slice
× 25 0,95 NA obiektyw do zanurzenia w wodzieLeica Microsystems (Niemcy)HCX Irapo
2-fotonowy mikroskop pionowy MP5 ze skanerami rezonansowymi (8 kHz) i dwoma detektorami hybrydowymi HyDLeica Microsystems (Niemcy)
Antlia-3C Cyfrowa pompa perystaltycznaDD Biolab178961Do perfuzji w komorze 2-fotonowej z aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France IndustrieI1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti: laser szafirowyCoherent (Niemcy)
jednorazowe pipety transferowe, szeroka ustaThermoFischer scientificna przykład: 232-115,8 ml z końcówką żeberkową, ale przycięliśmy ją (ok. 7 cm), aby mieć filtr emisyjny o średnicy 4 mm
SP680Leica Microsystems (Niemcy)
kostka fluorescencyjna zawierająca filtr emisji 525/50 i filtr dichroiczny 560 (do zbierania fluorescencji)Leica Microsystems (Niemcy)
szklana zlewka z 50 ml ACSF w celu utrzymania stałej perfuzji plastra
System grzewczyAutomatyczny sterownik grzałkiWarner Instrument Corporationdo utrzymywania roztworu perfuzyjnego na poziomie 32 stopni; Komora
perfuzyjnadomowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w materiale uzupełniającym
uchwyt na plastry ("harfa")domowej roboty: spinka do włosów wykonana z platyny z dwiema gałęziami połączonymi równoległymi nylonowymi nitkami
NazwaFirmaNumer katalogowy Uwagi
do stymulacji plastrów
Adenozyna 5&-trifosforan sól disodowa hydrat (ATP)SigmaA-26209przygotowania ex temporane: 1 mg/ml (3 mM) roztwór podstawowy przygotowany w dniu doświadczenia, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C (kilka godzin) i rozcieńczone tuż przed użyciem
Fluoresceina (opcjonalnie)SigmaF-6377stosować w stężeniu 1 &mikro; M końcowy
MikromanipulatorLuigs i NeumannSM7podłączony do mikropipety trzyma
na mikropipetytaki sam jak w eletrofjologii
Chlorowodorek serotoninySigmaH-9523podwielokrotności 50mM roztwór podstawowy w H20 utrzymywany w temperaturze -20 °C. 500 &mikro; M roztwór przygotowany w dniu eksperymentu.
Strzykawka 5 ml (bez igły)Produkty medyczne TerumoSS+05S1
Przezroczyste rurkiFischer Scientific11750105Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon&handel; E-3603 Rurki bez DEHP
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
do analizy obrazu
Fijihttps://fiji.scSchindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
IcyInstitut Pasteurhttp://icy.bioimageanalysis.orgde Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
myszy
CX3CR1-GFP myszyJung i wsp., 2000samiec lub samica, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129SV.
Myszy CX3CR1creER-YFPParkhurst i in. 2013samce lub samice, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129sv.
Clark krystalizującychPyrex Bibuła filtracyjna 8 cm z siatki nylonowej krajalnicy z materiału uzupełniającego - Sharp wodna TC-324B C do uchwyt

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
  2. Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
  6. Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
  7. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  8. Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231(2016).
  9. Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202(2015).
  10. Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466(2016).
  11. Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  12. Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
  13. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  14. Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
  15. Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
  16. Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  17. Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422(2016).
  18. Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  19. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  20. Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
  21. Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
  22. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  23. Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  26. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  27. Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
  28. Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111(2015).
  29. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
  30. Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), San Diego, CA. 231-239 (1999).
  31. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  32. Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
  33. Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).
  34. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

przyci ganie do ATPprzyci ganie do serotoninyruch ukierunkowanymikroskopia wielofotonowaoprogramowanie do analizy obrazukomora perfuzyjnaACSF z cholin

Powiązane artykuły