Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58788

⸱

31 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Streszczenie

Komórki mikrogleju to wrodzone komórki odpornościowe mózgu, które nieustannie skanują swoje otoczenie swoimi długimi procesami, a po zakłóceniu homeostazy ulegają szybkim zmianom morfologicznym. Na przykład zmiana laserowa indukuje w ciągu kilku minut zorientowany wzrost procesów mikroglejowych, zwanych również "ruchliwością kierunkową", w kierunku miejsca urazu. Podobny efekt można uzyskać dostarczając miejscowo ATP lub serotoninę (5-hydroksytryptaminę [5-HT]). W tym artykule opisujemy protokół indukowania kierunkowego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnego zastosowania ATP lub 5-HT w ostrych wycinkach mózgu młodych i dorosłych myszy oraz obrazowania tego przyciągania w czasie za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Zaproponowano prostą metodę kwantyfikacji za pomocą bezpłatnego oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Wyzwaniem, które nadal charakteryzuje ostre wycinki mózgu, jest ograniczony czas, skracający się wraz z wiekiem, podczas którego komórki pozostają w stanie fizjologicznym. Protokół ten podkreśla zatem pewne ulepszenia techniczne (pożywka, komora interfejsu powietrze-ciecz, komora obrazowania z podwójną perfuzją) mające na celu optymalizację żywotności komórek mikrogleju w ciągu kilku godzin, zwłaszcza w wycinkach od dorosłych myszy.

Wprowadzenie

Komórki mikrogleju są makrofagami rezydującymi w mózgu i odgrywają rolę zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych1,2. Mają silnie rozgałęzioną morfologię i stale wydłużają i cofają swoje procesy3,4. Uważa się, że to zachowanie "skanowania" jest związane i konieczne do badania ich otoczenia. Plastyczność morfologiczna mikrogleju wyraża się w trzech trybach. Po pierwsze, niektóre związki szybko modulują morfologię mikrogleju: dodanie ATP5,6 lub NMDA5,7 w średnio kąpiących się ostrych wycinkach mózgu zwiększa złożoność rozgałęzień mikrogleju, podczas gdy noradrenalina zmniejsza it6. Efekty te są albo bezpośrednio pośredniczone przez receptory mikrogleju (dla ATP i noradrenaliny), albo wymagają uwalniania ATP z neuronów (dla NMDA). Po drugie, na szybkość wzrostu i retrakcji procesów mikrogleju, zwanych ruchliwością lub "nadzorem", mogą wpływać czynniki zewnątrzkomórkowe8, zakłócenia homeostazy9,10, lub mutacje9,10,11. Po trzecie, oprócz tych izotropowych zmian morfologii i ruchliwości, mikroglej ma zdolność do rozszerzania swoich procesów kierunkowo w kierunku pipety dostarczającej ATP3,5,12,13,14, w hodowli, w ostrych wycinkach mózgu lub in vivo, lub dostarczając 5-HT w ostrych wycinkach mózgu15. Tak zorientowany wzrost procesów mikrogleju, zwany również ruchliwością kierunkową, został po raz pierwszy opisany jako odpowiedź na lokalne uszkodzenie laserowe3,4. Tak więc, fizjologicznie, może to być związane z reakcją na uraz lub wymagane do kierowania procesów mikrogleju w kierunku synaps lub regionów mózgu wymagających przycinania podczas rozwoju15,16, lub w physiological17,18,19 lub sytuacje patologiczne9,18,19,20 w wieku dorosłym. Trzy typy zmian morfologicznych opierają się na różnych mechanizmach wewnątrzkomórkowych11,13,20, a jeden dany związek niekoniecznie moduluje wszystkie z nich (np. NMDA, który działa pośrednio na mikroglej, ma wpływ na morfologię, ale nie indukuje ruchliwości kierunkowej5,7). Dlatego, dążąc do scharakteryzowania wpływu związku, mutacji lub patologii na mikroglej, ważne jest scharakteryzowanie trzech składników jego plastyczności morfologicznej. W tym miejscu opisujemy metodę badania kierunkowego wzrostu procesów mikrogleju w kierunku lokalnego źródła związku, którym jest ATP lub 5-HT.

Istnieje kilka modeli do badania atrakcyjności procesów mikrogleju: kultury pierwotne w środowisku 3D6,18,19, ostre plastry mózgu6,13,15, oraz obrazowanie in vivo3,13. Podejście in vivo jest najlepsze dla zachowania fizjologicznego stanu mikrogleju. Jednak obrazowanie przyżyciowe głębokich obszarów wymaga skomplikowanych zabiegów chirurgicznych i dlatego często ogranicza się do powierzchownych warstw kory mózgowej. Zastosowanie pierwotnej hodowli mikrogleju jest najłatwiejszą techniką testowania dużej liczby warunków na ograniczonej liczbie zwierząt. Niemniej jednak niemożliwe jest uzyskanie takiej samej morfologii komórek jak in vivo, a komórki tracą swoje fizjologiczne interakcje z neuronami i astrocytami. Ostre wycinki mózgu stanowią kompromis między tymi dwoma podejściami. Model ten pozwala naukowcom badać struktury mózgu, do których w inny sposób trudno jest dotrzeć, i obrazować w wysokiej rozdzielczości in vivo, a także badać wycinki z etapów noworodkowych, podczas gdy mikroskopia przezczaszkowa jest najczęściej wykonywana w wieku dorosłym. Wreszcie, umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym efektów miejscowego stosowania leków oraz powtarzanie eksperymentów z wykorzystaniem ograniczonej liczby zwierząt. Niemniej jednak problemem związanym z ostrymi wycinkami mózgu jest ograniczony czas (kilka godzin), podczas którego komórki pozostają żywe, szczególnie w przypadku wycinków myszy starszych niż dwa tygodnie, oraz potencjalna zmiana morfologii mikrogleju w czasie21,22.

Tutaj opisujemy protokół przygotowania ostrych wycinków mózgu młodych i dorosłych myszy Cx3cr1GFP/+ do dwóch miesięcy, z zachowaniem morfologii i ruchliwości mikrogleju przez kilka godzin. Następnie opisujemy, jak wykorzystać te wycinki do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związków takich jak ATP lub 5-HT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (Darwin Committee, zgody nr 170 oraz 10921).

1. Przygotowanie szklanych mikropipet do lokalnej aplikacji związków

  1. Przygotuj pipety z borokrzemianowych cienkościennych kapilar szklanych za pomocą wyciągacza elektrod. Dostosuj parametry tak, aby uzyskać pipety o średnicy 4 - 5 µm na ich końcach. Rycina 2D przedstawia jedną pipetę w jasnym polu przy niskim powiększeniu.

2. Roztwory

  1. Należy upewnić się, że używane jest wyłącznie szkło laboratoryjne, które zostało oczyszczone w cyklu autoklawowania, a następnie 2-3 krotnie wypłukane wodą ultrazczystą. Nigdy nie należy używać szkła, które miało kontakt z paraformaldehydem.
  2. Przygotować roztwór zapasowy CaCl2 o stężeniu 2 mol·L-1, rozpuszczając 14,7 mg CaCl2·2H2O w 50 mL wody wysokiej czystości (woda ultrazczysta, rezystywność 18,2 MΩ; śladowe ilości metali w wodzie destylowanej lub wodzie z kranu mogą prowadzić do nieoptymalnej jakości skrawków ze względu na efekty prooksydacyjne).
    1. Przechowywać ten roztwór zapasowy w temperaturze pokojowej przez maksymalnie jeden miesiąc.
  3. W dniu eksperymentu przygotować 1 L roztworu cholino-aCSF (sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego), w skład którego wchodzi: 10 mmol·L-1 chlorku choliny, 25 mmol·L-1 glukozy, 25 mmol·L-1 NaHCO3, 7 mmol·L-1 MgCl2, 1,6 mmol·L-1 kwasu askorbinowego, 3,1 mmol·L-1 pirogronianu sodu, 2,5 mmol·L-1 KCl, 1,25 mmol·L-1 NaH2PO4 oraz 0,5 mmol·L-1 CaCl2.
    1. Aby przygotować ten roztwór, dodać w następującej kolejności do kolby miarowej o objętości 1 L: 0,186 g KCl, 0,195 g NaH2PO4, 2,04 g kwasu askorbinowego, 2,1 g NaHCO3 oraz 4,5 g glukozy.
    2. Wypełnić kolbę do około połowy objętości końcowej wodą ultrazczystą i mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Dodać 0,34 g pirogronianu sodu oraz 15,36 g chlorku choliny.
      UWAGA: Wygodnie jest najpierw rozpuścić chlorek choliny w 5–10 mL roztworu przygotowanego w punkcie 2.3.2, przed dodaniem go do całego roztworu.
    4. Do roztworu dodać 7 mL MgCl2 o stężeniu 1 mol·L-1 oraz 250 µL CaCl2 o stężeniu 2 mol·L-1 (przygotowanego w punkcie 2.2).
    5. Uzupełnić objętość w kolbie miarowej do 1 L wodą ultrazczystą.
    6. Za pomocą osmometru ciśnienia par sprawdzić, czy osmolarność mieści się w przedziale od 30 do 310 mΩ. Jeśli nie, skorygować ją za pomocą glukozy.
    7. Sprawdzić pH po karbonizacji (tj. napowietrzaniu „karbogenem”, mieszaniną 95% O2/5% CO2) i w razie potrzeby skorygować do wartości 7,3–7,4 przy użyciu 10 M NaOH.
    8. Przenieść roztwór do szklanej butelki do przechowywania. Przechowywać butelkę w lodówce do czasu użycia (KROK 3.1).
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego roztworu w dniu eksperymentu. Jeśli jednak jest to konieczne, cholino-aCSF można przechowywać do dwóch dni w temperaturze 4 °C.
  4. W dniu eksperymentu przygotować 1 L roztworu aCSF, w skład którego wchodzi: 124 mmol·L-1 NaCl, 26,2 mmol·L-1 NaHCO3, 25 mmol·L-1 glukozy, 2,5 mmol·L-1 KCl, 2 mmol·L-1 CaCl2, 1 mmol·L-1 MgCl2 oraz 1,25 mmol·L-1 NaH2PO4.
    1. Aby przygotować ten roztwór, dodać w następującej kolejności do kolby miarowej: 0,150 g NaH2PO4, 0,186 g KCl, 2,2 g NaHCO3, 4,5 g glukozy oraz 7,3 g NaCl. Doprowadzić roztwór do objętości 1 L wodą ultrazczystą i intensywnie mieszać na mieszadle magnetycznym.
    2. Do roztworu dodać 1 mL MgCl2 o stężeniu 1 mol·L-1 oraz 1 mL CaCl2 o stężeniu 2 mol·L-1, a następnie przenieść roztwór aCSF do szklanej butelki do przechowywania.
    3. Sprawdzić, czy osmolarność wynosi 300–310 mΩ·L-1 i w razie potrzeby skorygować ją za pomocą glukozy.
    4. Sprawdzić pH po karbonizacji (tj. napowietrzaniu „karbogenem”) i w razie potrzeby skorygować do wartości 7,3–7,4 przy użyciu 10 M NaOH.
    5. Przenieść roztwór do szklanej butelki do przechowywania. Przechowywać butelkę w lodówce do czasu użycia (krok 3.1).
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego roztworu w dniu eksperymentu. Alternatywnie można jednak przygotować 10-krotny roztwór zapasowy zawierający NaCl, NaHCO3, KCl i NaH2PO4 w stężeniach 10-krotnie wyższych od końcowych, który można przechowywać przez maksymalnie jeden tydzień w temperaturze 4 °C. Końcowy roztwór aCSF przygotować w dniu eksperymentu poprzez rozcieńczenie 10-krotnego roztworu zapasowego wodą ultrazczystą oraz dodanie glukozy, CaCl2 i MgCl2.
  5. Przygotować roztwory leków w dniu eksperymentu. Użyć roztworu aCSF do doprowadzenia ich do stężeń końcowych, które w tym przypadku wynoszą 50 µmol·L-1 dla ATP oraz 5 µmol·L-1 dla 5-HT.
    UWAGA: Dla ATP można przygotować roztwór zapasowy (np. 50 mM ATP w wodzie), przechowywać go w formie alikwotów w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć roztworem aCSF do stężenia końcowego w dniu eksperymentu. Natomiast roztwór 5-HT (serotonina-HCl) musi być przygotowany z proszku w dniu eksperymentu, w stężeniu 1 mg·mL-1 w wodzie, przechowywany w temperaturze 4 °C, aby uniknąć utleniania 5-HT, i rozcieńczony w aCSF w momencie przeprowadzania eksperymentu.

3. Przygotowanie świeżych skrawków mózgu

  1. Przygotowanie obszaru sekcji
    1. Przygotować 70 mL lodowatego roztworu choline-aCSF w zlewce o pojemności 80 mL umieszczonej na lodzie, który zostanie wykorzystany do perfuzji serca, szybkiego schłodzenia mózgu oraz krojenia. Przygotować 150 mL roztworu choline-aCSF w naczyniu krystalizacyjnym o pojemności 20 mL, umieszczonym w łaźni wodnej podgrzanej do 32 °C. W naczyniu krystalizacyjnym umieścić nylonowe sito do zatrzymania skrawków. Służy ono do regeneracji skrawków przez 10 min bezpośrednio po krojeniu.
    2. Przynajmniej 30 min przed rozpoczęciem sekcji (punkt 3.2) rozpocząć napowietrzanie tych dwóch roztworów (70 mL choline-aCSF na lodzie i 150 mL choline-aCSF w 32° C) karbogenem. Przez cały czas trwania procedury należy utrzymywać stałą karbogenację.
    3. Przygotować urządzenie komory interfejsowej (Rysunek 1C), które będzie służyć do przechowywania skrawków do czasu ich użycia.
      1. W szczelnym pojemniku spożywczym (10 x 10 cm lub 10 cm średnicy, 8 cm wysokości), zainstalowanym na mieszadle magnetycznym, umieścić naczynie krystalizacyjne o pojemności 20 mL z magnesem prętoowym.
      2. Dodać 20 mL aCSF do tego naczynia krystalizacyjnego i umieścić na nim wydrukowany w 3D uchwyt do skrawków interfejsowych (uchwyt do skrawków składa się z dwóch idealnie dopasowanych części, pomiędzy którymi rozciągnięta jest poliamidowa siatka, Rysunek 1A,B).
      3. Usunąć nadmiar cieczy z naczynia krystalizacyjnego, tak aby pozostała jedynie cienka warstwa roztworu pokrywająca siatkę uchwytu do skrawków interfejsowych. Stworzy to później wąski pierścień roztworu otaczający skrawki (ale ich nie zakrywający).
      4. Wlać kilka milimetrów aCSF na dno pojemnika spożywczego i rozpocząć jego napowietrzanie karbogenem (przy pierwszym użyciu należy wykonać mały otwór w ściance szczelnego pojemnika, aby upewnić się, że rurka może do niego wejść).
      5. Zamknąć szczelny pojemnik, utrzymując stałą karbogenację. Stworzy to nawilżone środowisko bogate w 95% O2/5% CO2 , do którego skrawki zostaną przeniesione po regeneracji w choline-aCSF i w którym będą utrzymywane przed obrazowaniem. Urządzenie to jest dalej nazywane „komorą interfejsową” (Rysunek 1C).
  2. Sekcja mózgu i krojenie
    1. Uśpić mysz poprzez dostarczenie do jam brzusznej zastrzyku z 50 mg·mL-1 pentobarbitalu (0,15 mL/20 g masy ciała myszy), unieruchomić ją, odsłonić serce i przeprowadzić perfuzję serca za pomocą pompy perystaltycznej przy użyciu 10 mL lodowatego, napowietrzonego karbogenem roztworu choline-aCSF (patrz krok 3.1.1). Bladość wątroby traktować jako wskaźnik prawidłowej perfuzji. Perfuzja trwa mniej niż 5 min.
    2. Dekapitować mysz i rozciąć skórę, aby odsłonić czaszkę. Dużymi nożyczkami wykonać dwa cięcia poprzeczne od otworu wielkiego oraz jedno długie cięcie strzałkowe, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety usunąć płytki czaszki.
    3. Szybko i delikatnie wyodrębnić mózg (w czasie krótszym niż 1 min) i umieścić go na 1 min w zlewce 80 mL zawierającej pozostały (~60 mL) lodowaty roztwór choline-aCSF (nadal pod stałą karbogenacją) w celu jego schłodzenia.
    4. Przenieść mózg na papier filtracyjny uprzednio zwilżony roztworem aCSF.
    5. Wyciąć mózg zgodnie z obszarem zainteresowania i preferowanym kątem krojenia. Na przykład, aby obrazować wzgórze lub hipokamp na skrawkach czołowych, wyciąć skalpelem móżdżek, a następnie około 2 mm z końców rostralnej i kaudalnej mózgu.
      UWAGA: Ważne jest usunięcie części mózgu, które są zbyt rostralne lub zbyt kaudalne, ponieważ im mniejszy obszar do przycięcia przed dotarciem do strefy zainteresowania, tym szybsze będzie krojenie. Zalecany całkowity czas krojenia (krok 3.2.7) wynosi mniej niż 20 min.
    6. W przypadku skrawków czołowych, ustawić i przykleić (klejem cyjanoakrylowym) powierzchnię kaudalną mózgu do szalki Petriego o średnicy 10 cm, przyklejonej do bloku tnącego wibracyjnego krojaka, a następnie umieścić ją w komorze zbiorczej krojaka, która znajduje się w większej komorze wypełnionej lodem. Następnie wypełnić szalkę Petriego całą pozostałą ilością lodowatego roztworu choline-aCSF.
    7. Podtrzymując stałe napowietrzanie lodowatego roztworu choline-aCSF mieszanką 95% O2/5% CO2, wyciąć skrawki czołowe o grubości 30 µm (prędkość: 0,08 mm·s-1, wibracje ostrza: 60 Hz, amplituda wibracji: 1 mm).
    8. Zbierać skrawki mózgu za pomocą jednorazowej pipety transferowej o szerokim wlocie (4 mm średnicy), jeden po drugim po każdym pojedynczym przejściu ostrza, aby uniknąć akumulacji toksycznych składników uwalnianych z obwodu skrawków. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas transferu i umieścić każdy skrawek w roztworze choline-aCSF w 32 °C na około 10 min w celu regeneracji.
    9. Za pomocą pipety transferowej umieścić skrawki na kawałkach papieru do czyszczenia soczewek zwilżonych kroplą choline-aCSF. Odssać nadmiar choline-aCSF i za pomocą szpatułki przenieść skrawki, znajdujące się na papierze do soczewek, na siatkę komory interfejsowej zawierającej napowietrzony karbogenem aCSF w temperaturze pokojowej (patrz 3.1.3.5). Pozostawić skrawek do regeneracji w tym środowisku przez co najmniej 30 min.
      UWAGA: Po tym etapie skrawki są gotowe i mogą być wykorzystane do obrazowania mikrogleju do 6 h po wyjęciu mózgu z młodych myszy (poniżej miesiąca życia) i do 4 h po wyjęciu mózgu z dorosłych osobników w wieku dwóch miesięcy.

4. Mikroskopia dwufotonowa

  1. Konfiguracja parametrów
    1. Włącz system wielofotonowy (detektory hybrydowe, laser, skaner, modulator elektrooptyczny, mikroskop).
    2. Nastroić laser na długość fali 920 nm, sprawdzić, czy laser pracuje w trybie blokady mod (mode-locked), a następnie ustawić moc na poziomie 5%–15% i wzmocnienie (gain) na 10%. Odpowiada to mocy od 3 do 5 mW pod obiektywem. Upewnić się, że detektory niedeskannowane (NDD) są włączone, a zainstalowano odpowiednie filtry emisyjne i wzbudzenia.
    3. Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania na następujące wartości: w przypadku rozmiaru klatki 1024 x 1024 piksele, co odpowiada obszarowi 295,07 x 295.07 µm; dla powiększenia, 2. Jeśli sygnał jest bardzo zaszumiony, zastosuj średnią liniową równą 2. Dla dynamiki pikseli ustaw oprogramowanie do obrazowania na 12 bitów lub więcej.
      UWAGA: Obrazy o wyższej wartości bitowej pozwalają badaczom na rozróżnienie mniejszych różnic w intensywności fluorescencji niż obrazy o niższej wartości bitowej: zmiana jednej wartości szarości w obrazie 8-bitowym odpowiadałaby zmianie 16 wartości szarości w obrazie 12-bitowym i 256 wartości szarości w obrazie 16-bitowym. W związku z tym obrazy o wyższej liczbie bitów są bardziej odpowiednie do analizy ilościowej, jednak ze względu na wzrost ich rozmiaru wraz z głębią bitową, ograniczająca może stać się pojemność pamięci masowej oraz moc obliczeniowa.
    4. Wybierz tryb skanowania XYZT z zakresem interwału Z na poziomie 2 µm oraz odstęp czasowy T wynoszący 2 min.
      UWAGA: Rozdzielczość w osiach x, y i z jest określona przez twierdzenie Nyquista-Shannona o próbkowaniu. Optymalna wielkość kroku Z wynosiłaby około 0,8, aby uzyskać rozdzielczość pozwalającą na zobrazowanie wypustek mikrogleju (o średnicy <1 µm), jednak rozdzielczość optyczna mikroskopii wielofotonowej jest ograniczona (przy 920 nm z obiektywem o aperturze numerycznej NA 0,95 rozdzielczość osiowa wynosi około 1 µm). Poza tą barierą fizyczną, w eksperymencie z obrazowaniem na żywo, istotne są czułość lub stosunek sygnału do szumu, rozdzielczość, szybkość oraz całkowity czas obserwacji. Biorąc pod uwagę wszystkie te parametry, krok z wynoszący 2 µm (jak w licznych badaniach3,11,14), rozmiar obrazu 1024 x 1024 pikseli oraz szybka akwizycja przy użyciu skanera rezonansowego sprzężonego z detektorami HyD (pozyskanie 50 płaszczyzn z zajmuje około 15 s) zostały tutaj wybrane. Częstotliwość akwizycji wynosi jedna seria XYZT co 2 min, a całkowity czas trwania to 30 min. Jeśli zestaw nie jest wystarczająco szybki lub czuły, można zmniejszyć rozdzielczość boczną (do 512 x 512) lub liczbę plastrów z (poprzez obrazowanie wyłącznie w głębokości z, w której występuje najsilniejsza fluorescencja [t. j. nie najgłębszych przekrojów z, gdzie fluorescencja jest słaba]), lub poprzez zmniejszenie prędkości skanera. Rozdzielczość osiową można również zmniejszyć, zwiększając krok z do 3 µmponieważ może to mieć wpływ na kwantyfikację, wszystkie eksperymenty poddawane porównaniu powinny być przeprowadzane przy zastosowaniu tego samego kroku z (z-step).
      UWAGA: Możliwe jest przeprowadzenie podobnych eksperymentów na skrawkach pochodzących od myszy CX3CR1creER-YFP18linia myszy wykorzystywana do indukowania delecji genetycznej wyłącznie w mikrogleju, w której mikroglej konstytutywnie wykazuje ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP). Jednakże poziom ekspresji YFP jest bardzo niski w porównaniu z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w CX3CR1GFP/+ myszy; zatem obrazowanie jest możliwe, lecz wymagające i wymaga optymalizacji parametrów akwizycji. Zaleca się ich dostosowanie w następujący sposób.
    5. Ustaw laser na długość fali 970 nm (która jest lepiej dostosowana do wzbudzenia YFP niż 920 nm), moc na 50% oraz wzmocnienie (gain) na 50%, co odpowiada mocy lasera pod obiektywem na poziomie 5–6 mW.
    6. Ustaw średnią liczbę linii (line average) na 4 (lub więcej), aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
  2. Pozycjonowanie skrawka i szklanej mikropipety oraz lokalna aplikacja związku
    1. Podłącz pompę perystaltyczną do komory rejestracyjnej na 30 min przed rozpoczęciem rejestracji. Po przemyciu całego systemu perfuzyjnego 50 ml wody ultrapurej rozpocznij perfuzję komory rejestracyjnej za pomocą aCSF (50 ml) znajdującego się w zlewce szklanej pod stałym nadciśnieniem karbogenicznym. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj krążący aCSF w 32 °C z wbudowanym grzejnikiem mikroprzepływowym lub grzejnikiem Peltiera.
      UWAGA: Specjalna komora perfuzyjna z perfuzją górną i dolną została zaprojektowana w celu optymalizacji natlenienia obu stron skrawka. Komora perfuzyjna składa się z dwóch idealnie dopasowanych części, pomiędzy którymi rozpięta jest siatka poliamidowa (Rysunek 2A,B). W porównaniu z innymi rodzajami komór, w których skrawka kładzie się bezpośrednio na szkiełku nakrywce, komora ta ogranicza obumieranie neuronów w dolnej części skrawka, poprawia jego żywotność oraz redukuje ruchy skrawka wywołane jego obrzękiem.
    2. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej z szerokim otworem przenieś plaster mózgu przeznaczony do obrazowania do zlewki z aCSF, aby usunąć papier soczewkowy; pozwól mu opaść na dno (co potwierdzi brak przyczepionych pęcherzyków powietrza), a następnie przenieś go do komory rejestracyjnej (perfuzyjnej).
    3. Umieść uchwyt do skrawka (wykonaną z platyny szpilkę z dwoma ramionami połączonymi równoległymi nićmi nylonowymi) na skrawku, aby zminimalizować jego przemieszczanie się pod wpływem przepływu perfuzyjnego.
    4. Użyj oświetlenia w jasnym polu, aby zlokalizować interesujący obszar mózgu (czas ekspozycji: od 50 do 80 ms), korzystając z obiektywu o niskim powiększeniu (5X lub 10X). Przełącz na obiektyw imersyjny (wodny) o większym powiększeniu (25x z soczewką 0,35x) i skoryguj pozycję.
      UWAGA: Należy unikać obrazowania obszarów znajdujących się blisko nylonowych gwintów uchwytu do skrawków, ponieważ mogą one blokować światło i powodować lokalne odkształcenie skrawka. Upewnij się, że obszar zainteresowania jest płaski. W razie potrzeby wyjmij uchwyt, aby zmienić położenie skrawka i/lub uchwytu.
    5. Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby zlokalizować w polu widzenia fluorescencyjne komórki mikroglejowe do obrazowania (czas ekspozycji: 250–50 ms).
      UWAGA: Ten etap pozwala badaczom na sprawdzenie obecności komórek w obszarze zainteresowania oraz ich intensywności fluorescencji, a także na kontrolę ilości debris komórkowego.
    6. Uzupełnij pipetkę za pomocą 10 µL aCSF z dodatkiem ATP, 5-HT lub badanego leku w stężeniu końcowym. Skieruj końcówkę pipety w dół i delikatnie nią potrząśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w końcówce.
      UWAGA: Jeśli roztwór przeznaczony do wstrzyknięcia ma tendencję do tworzenia pęcherzyków powietrza, należy rozważyć zastosowanie pipet borokrzemianowych z wewnętrznym włóknem. Wyciek ATP z pipety może przyciągać wypustki mikrogleju jeszcze przed wstrzyknięciem (jeśli tak się stanie, będzie to widoczne na etapie analizy). Zjawisko to powinno być jednak ograniczone przy zastosowanym stężeniu ATP (500 µmol·L-1), jeśli pojawi się problem, należy rozważyć wcześniejsze napełnienie mikropipety 2 ml aCSF przed dodaniem roztworu ATP (lub innego związku) w kroku 4.2.6.
    7. Zamocuj napełnioną pipetę w uchwycie do pipet, połączonym za pomocą przezroczystej rurki ze strzykawką o pojemności 5 ml, której tłok znajduje się w pozycji 5 ml. Sam uchwyt do pipet jest zamocowany na trójosiowym mikromanipulatorze.
    8. Przy oświetleniu w polu jasnym należy za pomocą mikromanipulatora ustawić pipetę w centrum pola widzenia. Aby uzyskać powtarzalne i optymalne centrowanie, należy wyświetlić i użyć linijek na obrazie.
    9. Powoli opuść pipetę w stronę skrawka, jednocześnie kontrolując i regulując obiektyw, aż końcówka pipety lekko dotknie powierzchni skrawka. Przerwanie opuszczania pipety w momencie, gdy widać, że skrawek został dotknięty, pozwala końcówce pipety wniknąć na głębokość 80 – 100 µm powierzchni przekroju (patrz Rysunek 3B).
    10. Dostrój laser (patrz parametry powyżej) i przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy. Upewnij się, że komora jest osłonięta przed jakimikolwiek źródłami światła (np. ekranem komputera). Włącz detektory niedeskandowane (NDD) i ustaw wzmocnienie. Użyj tabeli przeglądowej (LUT) z kolorowo zakodowaną górną granicą, aby uniknąć nasycenia pikseli na obrazie.
    11. Wyznacz grubość obrazowanego przekroju (tzn. górną i dolną pozycję w osi z, w których wykrywalna jest fluorescencja [zazwyczaj pomiędzy 20 a 290 µm łącznie]).
      UWAGA: Na powierzchni skrawka obserwuje się zwiększoną gęstość wypustek i prawdopodobnie mikrogleju, często o nietypowej morfologii, w porównaniu z wnętrzem skrawka. Nagromadzenie to będzie bardziej wyraźne wraz z upływem czasu (t. j.., bardziej widoczne w ostatnim niż w pierwszym obrazowanym przekroju mózgu). W związku z tym płaszczyzny z w pierwszych ~30 µm nie powinny być wykorzystywane do analizy i mogą zostać nawet pominięte podczas akwizycji.
    12. Rozpocznij rejestrację na całkowity czas trwania 30 min (lub dłużej, jeśli jest to pożądane), a po 5-minutowej linii bazowej zastosuj miejscowo badany związek (bez przerywania obrazowania). W tym celu powoli naciśnij tłok strzykawki połączonej z mikropipetą, przesuwając go z pozycji 5 mL do pozycji 1 mL (w czasie około 5 s). Opór podczas naciskania tłoka powinien być wyczuwalny natychmiast. W przeciwnym razie końcówka może być uszkodzona.
      UWAGA: W przypadku doświadczonego eksperymentatora iniekcje wykonywane tą metodą są powtarzalne, jednak zamiast ręcznego operowania strzykawką, pipetę można połączyć z automatycznym systemem wyrzutu ciśnieniowego, aby zapewnić lepszą kontrolę nad podawaną objętością. Iniekcja powoduje fizyczną deformację skrawka w miejscu podania. Deformacja ta jest widoczna a posteriori na pierwszych dwóch lub trzech obrazach po iniekcji, lecz nie powinna być widoczna na czwartym obrazie (tj. 8 minut po iniekcji). Jeśli deformacja utrzymuje się, należy rozważyć zmianę parametrów przygotowania pipety.
    13. Po zakończeniu akwizycji (30 min) należy wyrzucić mikropipetę i wyjąć skrawek. W razie potrzeby można utrwalić skrawek w celu dalszego immunoznakowania. Przykładowo, metoda SNAPSHOT jest zoptymalizowana pod kątem utrwalania i barwienia grubych skrawków.23.
    14. Przed rozpoczęciem obrazowania nowego skrawka należy wykonać film 2D (rozdział 5.1), aby sprawdzić, czy mikroglej wykazuje prawidłową morfologię i przemieszcza się, co potwierdzi, że skrawki są zdrowe.

5. Analiza przyciągania wypustek mikrogleju

  1. Projekcja 2D i korekcja dryftu
    1. Otwórz plik (.LIF) w programie Fiji24.
    2. W razie potrzeby przygotuj podłoże (Obraz/Stosy/Narzędzia/Utwórz podstos) zawierając jedynie interesujące płaszczyzny z. Na przykład należy wykluczyć płaszczyzny z odpowiadające powierzchni skrawka, jeśli zostały one pozyskane, lecz nie będą wykorzystane do analizy (patrz UWAGA po kroku 4.2.1), a także najgłębsze płaszczyzny z pozbawione fluorescencji. Końcowy stos zazwyczaj zawiera od 90 do 10 warstw z (180 - 220 µm).
    3. Uruchom Projekt Z funkcja (Obraz/Stosy/Projekcja Z") i wybierz Maksymalna intensywność typ projekcji służący do wykonania projekcji stosu z (z-stack) zarejestrowanego w każdym punkcie czasowym.
    4. Uruchom MultiStackReg wtyczka (Wtyczka/Rejestracja/MultiStackReg), wybierając Czynność 1: Dopasowanie i Transformacja: ciało sztywne w celu skorygowania niewielkich przesunięć, które mogły wystąpić podczas akwizycji. Zapisz ten film 2D jako nowy plik (.tiff).
  2. Przetwarzanie danych
    1. Otwórz ten nowy plik za pomocą programu Icy25.
    2. Narysuj okrąg R1 obszar zainteresowania (ROI) w 35 µm o średnicy, z centrycznym położeniem względem miejsca wstrzyknięcia (zidentyfikowanego przede wszystkim po cieniu pipety oraz zniekształceniu powstałym w momencie iniekcji).
    3. Użyj wtyczki Ewolucja intensywności ROI oraz zmierz średnią intensywność w czasie w obszarze R1.
    4. Zapisz wyniki w pliku .XLS.
  3. Ilościowe określenie i przedstawienie wyników
    1. Aby ilościowo określić odpowiedź mikrogleju w czasie, należy ustalić w każdym punkcie czasowym
      Zależny od czasu wzór R(t) z R1(t) w statystycznej analizie danych, wizualizacja równania.
      W tym przypadku R1(0) stanowi średnią wartości R1(t) przed wstrzyknięciem. Następnie wyniki można przedstawić jako kinetykę odpowiedzi mikrogleju lub w określonym punkcie czasowym (patrz Rycina 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania, obserwacji i ilościowego określania zorientowanego wzrostu wypustek mikroglialnych w kierunku lokalnie zastosowanego związku, na przykład ATP lub 5-HT, w ostrych skrawkach mózgu młodych lub dorosłych (co najmniej dwumiesięcznych) myszy. Wśród czynników przyczyniających się do utrzymania skrawków mózgu zwierząt dorosłych w stanie zdrowym przez kilka godzin znajduje się zastosowanie dwóch narzędzi zaprojektowanych w celu optymalizacji przeżywal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Utrzymując, w przeciwieństwie do zdysocjowanych lub organotypowych kultur warstwowych, integralność strukturalną z ograniczonymi dostosowaniami sieci, ostre wycinki mózgu pozwalają naukowcom badać mikroglej w jego fizjologicznym środowisku. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest fakt, że procedura krojenia powoduje urazy, które mogą szybko zagrozić żywotności neuronów, szczególnie w dorosłym mózgu. Ponieważ mikroglej jest szczególnie reaktywny na uszkodzenia komórek, ważne jest, aby w jak największym stopniu ograniczyć...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Komórek i Tkanek w Institut du Fer à Moulin, gdzie przeprowadzono wszystkie akwizycje i analizy obrazów. Prace te były częściowo wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université Sciences oraz przez granty z Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie University (program Emergence-UPMC 2011/2014), Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", francuskie Ministerstwo Badań Naukowych (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 i program Investissements d'Avenir "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) oraz program Collaborative Research in Computational Neuroscience, National Science Foundation/Francuska Narodowa Agencja Badań Naukowych (numer : 1515686). Wszyscy autorzy są afiliowani w grupach badawczych będących członkami Paris School of Neuroscience (ENP) oraz Bio-Psy Labex. F.E. jest doktorantem afiliowanym na Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Paryż, Francja i jest finansowany przez Bio-Psy Labex. V.M. jest adiunktem finansowanym przez program Collaborative Research in Computational Neuroscience, National Science Foundation/Francuską Narodową Agencję Badań (numer: 1515686). Autorzy dziękują Marcie Kołodziejczak, która brała udział w zainicjowaniu projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
do przygotowania pipet
Borokrzemianowe cienkościenne kapilaryHarvard Apparatus30-0065Borokrzemian cienkościenny bez żarnika, 1,5 mm OD, 1,17 mm ID, 75 mm L , opakowanie 225
DMZ Uniwersalny ściągaczZeitz Instrumente
NazwaCompany Numer katalogowyUwagi
do roztworów
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)SigmaC5080
Chlorek cholinySigmaC7527
D-(+)-GlukozaSigmaG8270
Kwas L-askorbinowySigmaA5960
Roztwór chlorku magnezu 1 M (MgCl2)Sigma63020
Chlorek potasu SigmaUltra >99.0% (KCl)SigmaP9333
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS5761
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS5886
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS5011
Pirogronian soduSigmaP2256
Ultraczysta wodaMilliQdo wszystkich roztworów
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
for Przygotowanie plastrów
2x 200 ml naczyń
80 ml zlewki
Antlia-3C Cyfrowa pompa perystaltycznaDD Biolab178961Dla myszy perfuzja i perfuzja w komorze 2-fotonowej (aCSF)
Karbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide Francja Industrie
DolethalVetoquinolDolethal 50 mg/ml
(Whatman)SigmaWHA1001042Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1 (wielkość porów: 11&mikro; M)
Cienkie nożyczki - Ostrenarzędzia do nauki14060-60
Pudełko na żywność o średnicy 10 cm, klej o wysokości
(cyjanoakrylan etylu)Loctitesuper glue 3 power flex
Narzędzie hipokampowe (szpatułka)Narzędzia do nauki o napięciu10099-15Największa kończyna musi być pochylona pod kątem 90&
Kleszcze do tęczówki lodowej
(zakrzywione)MoriaMC31
Chusteczka do czyszczenia soczewekTHOR LABS
Sitkoo średnicy 7 cm
ŻyletkiMikroskopia elektronowa Sciences72000Do ostrza
skalpela
Uchwyt interfejsu Slicedomowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14002-14
Krajalnica wibracyjnaThermo Scientific720-2709Model: HM 650V (mikrotom z ostrzem wibracyjnym)
KąpielZestaw na 32 & stopni; C (pierwszy etap odzyskiwania)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
do obrazowania slice
× 25 0,95 NA obiektyw do zanurzenia w wodzieLeica Microsystems (Niemcy)HCX Irapo
2-fotonowy mikroskop pionowy MP5 ze skanerami rezonansowymi (8 kHz) i dwoma detektorami hybrydowymi HyDLeica Microsystems (Niemcy)
Antlia-3C Cyfrowa pompa perystaltycznaDD Biolab178961Do perfuzji w komorze 2-fotonowej z aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France IndustrieI1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti: laser szafirowyCoherent (Niemcy)
jednorazowe pipety transferowe, szeroka ustaThermoFischer scientificna przykład: 232-115,8 ml z końcówką żeberkową, ale przycięliśmy ją (ok. 7 cm), aby mieć filtr emisyjny o średnicy 4 mm
SP680Leica Microsystems (Niemcy)
kostka fluorescencyjna zawierająca filtr emisji 525/50 i filtr dichroiczny 560 (do zbierania fluorescencji)Leica Microsystems (Niemcy)
szklana zlewka z 50 ml ACSF w celu utrzymania stałej perfuzji plastra
System grzewczyAutomatyczny sterownik grzałkiWarner Instrument Corporationdo utrzymywania roztworu perfuzyjnego na poziomie 32 stopni; Komora
perfuzyjnadomowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w materiale uzupełniającym
uchwyt na plastry ("harfa")domowej roboty: spinka do włosów wykonana z platyny z dwiema gałęziami połączonymi równoległymi nylonowymi nitkami
NazwaFirmaNumer katalogowy Uwagi
do stymulacji plastrów
Adenozyna 5&-trifosforan sól disodowa hydrat (ATP)SigmaA-26209przygotowania ex temporane: 1 mg/ml (3 mM) roztwór podstawowy przygotowany w dniu doświadczenia, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C (kilka godzin) i rozcieńczone tuż przed użyciem
Fluoresceina (opcjonalnie)SigmaF-6377stosować w stężeniu 1 &mikro; M końcowy
MikromanipulatorLuigs i NeumannSM7podłączony do mikropipety trzyma
na mikropipetytaki sam jak w eletrofjologii
Chlorowodorek serotoninySigmaH-9523podwielokrotności 50mM roztwór podstawowy w H20 utrzymywany w temperaturze -20 °C. 500 &mikro; M roztwór przygotowany w dniu eksperymentu.
Strzykawka 5 ml (bez igły)Produkty medyczne TerumoSS+05S1
Przezroczyste rurkiFischer Scientific11750105Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon&handel; E-3603 Rurki bez DEHP
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
do analizy obrazu
Fijihttps://fiji.scSchindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
IcyInstitut Pasteurhttp://icy.bioimageanalysis.orgde Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
myszy
CX3CR1-GFP myszyJung i wsp., 2000samiec lub samica, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129SV.
Myszy CX3CR1creER-YFPParkhurst i in. 2013samce lub samice, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129sv.
Clark krystalizującychPyrex Bibuła filtracyjna 8 cm z siatki nylonowej krajalnicy z materiału uzupełniającego - Sharp wodna TC-324B C do uchwyt

Bibliografia

  1. Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
  2. Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
  6. Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
  7. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  8. Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231(2016).
  9. Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202(2015).
  10. Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466(2016).
  11. Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  12. Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
  13. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  14. Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
  15. Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
  16. Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  17. Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422(2016).
  18. Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  19. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  20. Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
  21. Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
  22. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  23. Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  26. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  27. Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
  28. Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111(2015).
  29. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
  30. Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), San Diego, CA. 231-239 (1999).
  31. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  32. Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
  33. Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).
  34. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

przyci ganie do ATPprzyci ganie do serotoninyruch ukierunkowanymikroskopia wielofotonowaoprogramowanie do analizy obrazukomora perfuzyjnaACSF z cholin
Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.