Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

DOI:

10.3791/58806

⸱

26 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka pępowina (UC) może być uzyskana w okresie okołoporodowym w wyniku porodu przedwczesnego, terminowego i poterminowego. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z WZJG (UC-MSC) od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają znaczny potencjał terapeutyczny i przyciągają coraz większe zainteresowanie w dziedzinie biomedycyny. MSCs są pierwotnie izolowane i charakteryzowane ze szpiku kostnego (BM), a następnie pozyskiwane z tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, błony maziowej, skóry, miazgi zębowej i przydatków płodu, takich jak łożysko, krew pępowinowa (UCB) i pępowina (UC). MSCs to niejednorodna populacja komórek zdolna do (1) przylegania do tworzywa sztucznego w standardowych warunkach hodowli, (2) ekspresji markera powierzchni CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19- /HLA-DR- fenotypy oraz (3) trójliniowe różnicowanie na adipocyty, osteocyty i chondrocyty, zgodnie z aktualną definicją Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT). Chociaż BM jest najpowszechniej stosowanym źródłem MSC, inwazyjny charakter aspiracji BM etycznie ogranicza jego dostępność. Zdolność do namnażania i różnicowania MSCs uzyskanych z BM na ogół zmniejsza się wraz z wiekiem dawcy. W przeciwieństwie do tego, płodowe MSCs uzyskane z UC mają zalety, takie jak energiczna proliferacja i zdolność różnicowania. Nie ma obaw etycznych związanych z pobieraniem próbek WZJG, ponieważ są one zwykle uważane za odpady medyczne. Ludzkie WZJG zaczyna rozwijać się wraz z ciągłym wzrostem jamy owodniowej w 4-8 tygodniu ciąży i rośnie aż do osiągnięcia 50-60 cm długości i może być izolowane przez cały okres porodu. Aby uzyskać wgląd w patofizjologię chorób nieuleczalnych, wykorzystaliśmy MSC pochodzące z WZJG (UC-MSC) od niemowląt urodzonych w różnym wieku ciążowym. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę UC-MSC od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są pierwotnie izolowane i charakteryzowane ze szpiku kostnego (BM)1,2, ale mogą być również uzyskane z szerokiej gamy tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, mazi maziowej, skóry, miazgi zębowej i przydatków płodu3. MSCs są rozpoznawane jako niejednorodna populacja komórek, która może namnażać się i różnicować w adipocyty, osteocyty i chondrocyty. Ponadto MSCs posiadają zdolność migracji do miejsc urazów, tłumienia i modulowania odpowiedzi immunologicznej oraz przebudowy i naprawy urazów. Obecnie MSCs z różnych źródeł cieszą się rosnącym zainteresowaniem jako źródło terapii komórkowej przeciwko wielu nieuleczalnym chorobom, w tym chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi, zawale mięśnia sercowego i zawałowi mózgu4,5.

Chociaż BM jest najlepiej scharakteryzowanym źródłem MSC, inwazyjność aspiracji BM etycznie ogranicza jego dostępność. Zdolność do namnażania i różnicowania MSCs uzyskanych z BM na ogół zmniejsza się wraz z wiekiem dawcy. W przeciwieństwie do tego, płodowe MSC uzyskane z przydatków płodu, takich jak łożysko, krew pępowinowa (UCB) i pępowina (UC), mają zalety, w tym mniej etycznych obaw dotyczących pobierania próbek oraz solidną zdolność do proliferacji i różnicowania6,7. Wśród przydatków płodu, które są zwykle wyrzucane jako odpady medyczne, UCB i UC są uważane za narząd płodu, podczas gdy łożysko jest uważane za płódź. Ponadto od łożyska i UCB należy pobrać i pobrać je dokładnie w momencie porodu noworodka, natomiast łożysko i UC można pobrać i przetworzyć po porodzie. W związku z tym UC jest obiecującym źródłem MSC dla terapii komórkowej8,9.

Ludzkie UC zaczyna rozwijać się wraz z postępującą ekspansją jamy owodniowej w 4-8 tygodniu ciąży, kontynuuje wzrost do 50-60 cm długości i może być izolowane przez cały okres porodu noworodka10. Aby uzyskać wgląd w patofizjologię chorób nieuleczalnych, używamy MSC pochodzących z UC (UC-MSC) od niemowląt urodzonych w różnym wieku ciążowym11,12. W tym protokole opisujemy, jak izolować i charakteryzować UC-MSC od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie próbek ludzkich do tego badania zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Kobe University Graduate School of Medicine (zatwierdzenie nr 1370 i 1694) i przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Izolacja i kultura UC-MSC

UWAGA: UC-MSC zostały pomyślnie wyizolowane, wyhodowane i rozszerzone (więcej niż przejście numer 4) z ponad 200 UC poddanych temu protokołowi. Spośród ponad 200 UC, 100% wykazało udaną izolację UC-MSC, mniej niż 5% wykazało przypadkowe zanieczyszczenie, mniej niż 15% wykazało zatrzymanie wzrostu, a ponad 80% wykazało udaną ekspansję UC-MSC.

  1. Zbieranie UC.
    1. Przygotować plastikową probówkę o pojemności 50 ml, aseptyczne nożyczki i butelkę o pojemności 500 ml minimalnej pożywki niezbędnej (alpha MEM) modyfikowanej alfa w temperaturze 4 °C.
    2. Aseptycznie wyciąć WZJG nożyczkami chirurgicznymi o długości około 5-10 cm i pobrać go wkrótce po urodzeniu przez cesarskie cięcie.
    3. Natychmiast umieść UC w plastikowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj do niej 20-30 ml alpha MEM.
    4. Przechowuj UC w temperaturze pokojowej (RT) do czasu transportu do laboratorium.
      nuta: Aseptyczne WZJG można przechowywać w podłożu bez surowicy w temperaturze pokojowej do 2 dni. Dlatego WZJG uzyskane z sąsiednich szpitali można odebrać, jeśli zostanie dostarczone do laboratorium w ciągu 2 dni.
  2. Przeanalizuj UC.
    1. Przygotować plastikową tackę, wysterylizowane nożyczki i kleszcze, pipety 10 ml, pipety 25 ml, dwie szalki do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), oczyszczone mieszanki enzymów (patrz tabela materiałów, rozpuszczone za pomocą sterylnego PBS w stężeniu 13 jednostek Wünscha/ml i przechowywane w temperaturze -80 °C) oraz butelkę o pojemności 500 ml ze zredukowaną pożywką surowicy (patrz tabela materiałów).
    2. Rozgrzać PBS, oczyszczone mieszanki enzymów, zredukowaną pożywkę surowicy i pożywkę hodowlaną [alfa MEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (AA) przechowywanego w temperaturze 4 °C] do temperatury pokojowej.
    3. Wyjmij UC z rurki i umieść go w plastikowej tacy.
    4. Zważ i wypreparuj 5 g UC wysterylizowanymi nożyczkami.
    5. Wlej 10 ml 70% etanolu do UC w celu sterylizacji za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    6. Umyj UC 10 ml PBS dwukrotnie za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    7. Umieść UC w wysterylizowanym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm (patrz Rysunek 1, krok 1).
    8. Dodać 10 ml zredukowanej pożywki surowicy do naczynia.
    9. Dodać 0,5 ml oczyszczonych mieszanek enzymatycznych, aby osiągnąć końcowe stężenie około 0,62 jednostki Wünscha/ml.
      nuta: Wykazano, że stosowanie oczyszczonych mieszanek enzymatycznych zamiast tradycyjnej kolagenazy poprawia wydajność i żywotność UC-MSC wyizolowanych z UC.
    10. Pokrój UC na 2-3 mm kawałki za pomocą wysterylizowanych nożyczek i kleszczy (patrz Rysunek 1, krok 2).
      nuta: Proces ten trwa około 30 minut.
    11. Inkubować kawałki UC w temperaturze 37 °C przez 30 minut w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    12. Pokrój częściowo strawione kawałki UC na mniejsze kawałki, które łatwo przepływają przez pipetę o pojemności 25 ml.
      nuta: Proces ten trwa około 30 minut.
    13. Mniejsze kawałki UC inkubować w temperaturze 37 °C przez 15-45 minut w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
      nuta: Inkubację należy kontynuować, aż homogenaty staną się lepkie. Całkowity czas trawienia wynosi około 120 minut. Jednak w przypadku stosowania WZJG u wcześniaków czas trawienia może ulec skróceniu, ponieważ są one łatwo krojone i trawione.
  3. Odizolować UC-MSC.
    1. Przygotuj cztery plastikowe probówki o pojemności 50 ml i butelkę o pojemności 500 ml pożywki hodowlanej.
    2. Podziel homogenat UC na dwie plastikowe probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml, z około 7,5 ml w każdej probówce.
    3. Dodaj 20 ml pożywki hodowlanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj.
    4. Przefiltruj każdy homogenat UC przez sitko o pojemności 100 μm umieszczone na nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml, używając pipety o pojemności 25 ml do zebrania komórek pochodzących z UC.
      nuta: Każdy z tych procesów trwa około 15 minut, ponieważ strawiony roztwór UC jest lepki.
    5. Odwirować dwie probówki o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
    6. Ostrożnie odessać supernatant i wyrzucić go.
    7. Zawiesić osady komórkowe w dwóch probówkach z 5 ml pożywki hodowlanej.
    8. Przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę o średnicy 60 mm i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 (patrz Rysunek 1, krok 3).
  4. Kultura UC-MSC.
    1. Rozgrzej PBS, trypsynę-EDTA (0,25 w/v%) i pożywkę hodowlaną (alfa MEM zawierającą 10% FBS i 1% AA) do RT.
    2. Gdy komórki są przymocowane do płytki o średnicy 60 mm, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj dwukrotnie 5 ml PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i czerwonych krwinek.
      nuta: Przyczepione komórki zwykle pojawiają się po 3-5 dniach od początkowego posiewu (patrz Rysunek 1, krok 4).
    3. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 aż do 90-100% zgrywy.
      nuta: Zwykle trwa to 7-14 dni po wstępnym poszyciu.
    4. Umyj komórki dwukrotnie 5 ml PBS, dodaj 0,5 ml trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
    5. Gdy komórki staną się zaokrąglone i oderwane, dodaj 9 ml pożywki hodowlanej i dobrze wymieszaj, aby dezaktywować trypsynę.
    6. Przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę o średnicy 100 mm i wyhodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 (patrz Rysunek 1, krok 5).
    7. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 aż do 90-100% zgrywy.
      nuta: Zwykle trwa to 4-8 dni po wstępnym poszyciu.
    8. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS, dodaj 1 ml trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
    9. Gdy komórki staną się zaokrąglone i oderwane, dodaj 9 ml pożywki hodowlanej i dobrze wymieszaj, aby dezaktywować trypsynę.
    10. Przenieść zawiesinę komórkową na dwie nowe płytki o średnicy 100 mm i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 (patrz Rysunek 1, krok 5).
    11. Powtarzaj subkulturę (podziały 1:2) aż do dziesiątego przejścia (patrz Rysunek 1, krok 5).
      nuta: Ponieważ komórki hodowane w warunkach mniej zlewających się mają tendencję do wcześniejszego zatrzymania proliferacji, ważne jest, aby pasażować komórki ze stosunkiem podziału 1:2.
    12. Użyj komórek w piątym do ósmym pasażu do analizy markerów powierzchniowych komórek, testu różnicowania komórek i innych eksperymentów.
      nuta: Aby utrzymać energiczną proliferację tak długo, jak to możliwe, komórki są na ogół hodowane w ponad 70-80% zlewających się warunkach.

2. Wyrażenie znacznika powierzchni UC-MSC

  1. Przygotować komórki na płytce o średnicy 100 mm i dysocjować je za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  2. Dodać 9 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut.
  3. Odessać supernatant i wyrzucić go.
  4. Zawiesić granulki komórkowe w 10 ml PBS i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten etap mycia dwukrotnie.
  5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu cytometrii przepływowej (FCM) (PBS zawierający 2 mM EDTA i 10% odczynnik blokujący) na poziomie ~1 × 106 komórek/ml.
  6. Przenieść 50-100 μl zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml; dodać przeciwciała sprzężone z fikoerytryną (PE) przeciwko CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 lub HLA-DR; i inkubować na lodzie przez 45 minut.
  7. Dwukrotnie przemyć komórki buforem FCM i dodać 50-100 μl 0,2% roztworu barwnika o żywotności (patrz tabela materiałów).
  8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, dwukrotnie przemyć komórki buforem FCM i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 70 μm.
  9. Przepuść ogniwa przez FCM i przeanalizuj uzyskane wyniki za pomocą oprogramowania FCM zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Zróżnicowanie trójliniowe UC-MSC

  1. Wykonaj adipogenezę.
    1. Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o stężeniu 5 × 103 komórek/ml.
    2. Umieścić 1 ml zawiesiny komórkowej na 12-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez ~24 godziny.
    3. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do różnicowania adipogenicznego (patrz tabela materiałów) i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2-3 tygodnie. Zmieniaj pożywkę różnicującą adipogenną dwa razy w tygodniu.
    4. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
    5. Inkubować komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj komórki trzykrotnie PBS i trzykrotnie 60% izopropanolem.
    7. Przygotować 0,5% roztwór czerwieni olejowej O, rozpuszczając 84 mg czerwonej oliwy O w 10 ml 100% izopropanolu i dodając 6,7 ml wody destylowanej. Plamić komórki 1 ml 0,5% roztworu czerwieni olejowej O w temperaturze pokojowej przez 20 min.
    8. Umyj komórki trzykrotnie 60% izopropanolem i uwidocznij pod mikroskopem.
  2. Wykonaj osteogenezę.
    1. Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o stężeniu 1 ×10 4 komórek/ml.
    2. Umieścić 1 ml zawiesiny komórkowej na 12-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez ~24 godziny.
    3. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do różnicowania osteogenicznego (patrz tabela materiałów) i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 1-2 tygodnie. Zmieniaj pożywkę różnicującą kości dwa razy w tygodniu.
    4. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
    5. Inkubować komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
    7. Przygotować 2% roztwór czerwieni S alizaryny, rozpuszczając 200 mg czerwieni alizarynowej S w 10 ml wody destylowanej. Barwić komórki 1 ml 2% roztworu czerwieni czerwonej alizarynowej S w temperaturze pokojowej przez 3 min.
    8. Umyj studzienki trzykrotnie PBS i wizualizuj pod mikroskopem.
  3. Wykonaj chondrogenezę.
    1. Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o stężeniu 1,6 × 107 komórek/ml.
    2. Umieścić kroplę zawiesiny komórkowej o objętości 5 μl na środku studzienki na 12-dołkowej płytce (kultury mikromasowe) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2-3 godziny.
    3. Delikatnie dodać 1 ml chondrogennej pożywki różnicującej (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 4-7 dni. Zmieniaj pożywkę do różnicowania chondrogennego dwa razy w tygodniu.
    4. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
    5. Inkubować komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
    7. Przygotować 0,05% roztwór błękitu toluidynowego, rozpuszczając 250 mg błękitu toluidynowego w 500 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,1. Zabarwić komórki 1 ml 0,05% roztworu błękitu toluidynowego w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    8. Umyj komórki trzykrotnie PBS i wizualizuj pod mikroskopem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury od kolekcji UC do kultury MSC są podsumowane w Rysunek 1. UC o długości około 5-10 cm można pobrać od wszystkich noworodków urodzonych przez cesarskie cięcie. UC zaczyna się rozwijać w 4-8 tygodniu ciąży i kontynuuje wzrost do 50-60 cm długości, jak pokazano na Rycina 2. W UC znajdują się dwie tętnice (A), jedna żyła (V), wyściółka rdzenia (CL) i galaretka Whartona (WJ), jak pokazano na Rysunek 3 i <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSCs mogą być izolowane z różnych tkanek i są niejednorodną populacją komórek, z których nie wszystkie wyrażają te same markery fenotypowe. W tym miejscu przedstawiliśmy protokół, który kieruje pobieraniem i sekcją WZJG od wcześniaków i niemowląt urodzonych o czasie oraz umożliwia izolację i hodowlę UC-MSC. Postępując zgodnie z tym protokołem, udało nam się wyizolować UC-MSC, które spełniają kryteria ISCT19 od płodów/niemowląt urodzonych w 19-40 tygodniu ciąży i wykazaliśmy, że reprezentują one ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (numer grantu: 25461644) i Young Scientists (B) (numery grantów: 15K19614, 26860845, 17K16298) JSPS KAKENHI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowa tubka 50 mlAS One Coporation, Osaka, JaponiaViolamo 1-3500-22
12-dołkowa płytkaAGC Techno Glass, Tokio, JaponiaIwaki 3815-012
Naczynie 60 mmAGC Techno Glass, Tokio, JaponiaIwaki 3010-060
Sitko do komórek (100 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2360
Sitko do komórek (70 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2350
Alpha MEMWako Pure Chemical, Osaka, Japonia135-15175
Płodowa surowica bydlęcaSigma Aldrich, St. Louis, MO172012
Zredukowana pożywka w surowicyThermo Fisher Scientific, waltham, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA Gibco 15240-062
Trypsin-EDTAWako Pure Chemical, Osaka, Japonia209-16941
PBSTakara BIO, Shiga, JaponiaT900
Oczyszczone mieszanki enzymatyczneRoche, Mannheim, NiemcyLiberase DH Research Grade 05401054001
mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko CD14BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347497Partia: 3220644, RRID: mysie
przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z AB_400312 PE przeciwko CD19BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ340364Lot: 3198741, RRID: AB_400018
mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko CD34BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555822Lot: 3079912, RRID: AB_396151
mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko CD45BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555483Lot: 2300520, RRID: AB_395875
Pierwszorzędowe przeciwciało myszy sprzężone z PE przeciwko CD73BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ550257Lot: 3057778, RRID: AB_393561
Pierwszorzędowe przeciwciało myszy sprzężone z PE przeciwko CD90BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555596Lot: 3128616, RRID: AB_395970
Pierwszorzędowe przeciwciało myszy sprzężone z PE przeciwko CD105BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ560839Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
mysie przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z PE przeciwko HLA-DRBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347367Lot: 3219843, RRID: AB_400293
Izotyp IgG1 k myszy sprzężony z PEBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555749Lot: 3046675, RRID: AB_396091
Izotyp IgG2a k myszyBioscience, Franklin Lakes, NJ555574Partia: 3035934, RRID: AB_ 395953
Izotyp IgG2b k myszy sprzężony z PEBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555743Partia: 3098896, RRID: AB_396086
Barwnik żywotnościBD Bioscience, Franklin Lakes, NJFixable Viability Stain 450 562247
Odczynnik blokującyDainippon Pharmaceutical, Osaka, JaponiaBlock Ace UKB80
FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSAria  III Sorter
Oprogramowanie FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSDiva
do różnicowania adipogennegoInvitrogen, Carlsbad, CAStemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Pożywka do różnicowania osteogennegoInvitrogen, Carlsbad, CAStemPro Zestaw do różnicowania osteogenezy A10072-01
Różnicowanie chondrogenne Średnie Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro Zestaw do różnicowania chondrogenezy A10071-01
FormaldehydPolyscience, Warrigton, PA16% Ultraczysty formaldehyd EM Grade #18814
Olej czerwony OSigma Aldrich, St. Louis, MOO0625
Arizarin Red SSigma Aldrich, St. Louis, MOA5533
Toluidine BlueSigma Aldrich, St. Louis, MO
MicroscopeKeyence, Osaka, JaponiaBZ-X700
PE komórek Pożywka 198161

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194(2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751(2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzyste p powinyprotok izolacji kom rekanaliza cytometrycznatest r nicowania tr jliniowegoekspresja marker w powierzchniowychtechnika hodowli kom rkowejsekcja p powinymetoda trawienia enzymatycznegokom rki niemowl t przedwcze nie i w terminie urodzonychprotok charakterystyki MSC

Powiązane artykuły