Artykuł metodologiczny

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58837

⸱

19 października 2021

 ,  ,  ,  , 
1University Paris Descartes Hospital Necker-Enfants Malades, Institut Imagine, 2Institut du Cerveau et de la Moelle épinière - ICM, Sorbonne Universités Paris, 3Transylvanian Institute of Neuroscience (TINS)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Streszczenie

Padaczka stanowi jedno z najczęstszych zaburzeń neurologicznych, dotykające około 50 milionów ludzi na całym świecie. Ostatnie postępy w badaniach genetycznych ujawniły szerokie spektrum genów związanych z różnymi formami padaczki, podkreślając niejednorodny charakter tego zaburzenia. Odpowiednie modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów patologicznych wywoływanych przez mutacje genetyczne związane z padaczką oraz do opracowywania specjalistycznych, celowanych terapii. W ostatnich latach danio pręgowany stał się cennym organizmem kręgowym do modelowania padaczki, przy użyciu zarówno manipulacji genetycznych, jak i ekspozycji na znane leki przeciwpadaczkowe, takie jak pentylenotetrazol (PTZ), w celu zidentyfikowania nowych leków przeciwpadaczkowych. Szkodliwe mutacje w regulatorze mTOR DEPDC5 są związane z różnymi postaciami padaczki ogniskowej, a powalenie ortologa danio pręgowanego powoduje nadpobudliwość związaną ze spontanicznymi epizodami podobnymi do napadów, a także zwiększoną aktywnością elektrograficzną i charakterystycznym pływaniem kołem zwrotnym. W tym miejscu opisaliśmy metodę związaną z generowaniem modelu utraty funkcji DEPDC5 i zilustrowaliśmy protokół oceny aktywności motorycznej po 28 i 48 godzinach od zapłodnienia (hpf), a także metodę rejestrowania aktywności terenowej w tektum wzrokowym danio pręgowanego. Przedstawiono również ilustrację wpływu leku przeciwpadaczkowego PTZ na aktywność neuronów w czasie.

Wprowadzenie

Ze względu na swoje małe rozmiary, jajorodny rozwój i przezroczystość we wczesnych stadiach rozwoju, danio pręgowany stał się cennym organizmem kręgowym do modelowania chorób ludzkich tak różnorodnych, jak choroby sercowo-naczyniowe, nowotworowe czy neurologiczne1,2. Danio pręgowany łączy w sobie zalety kręgowców, w tym wysoką ochronę architektury narządów i kodu genetycznego, z niewielkimi rozmiarami i łatwością manipulacji genetycznej prostszych organizmów modelowych, ułatwiając w ten sposób zarówno badania podstawowe, jak i zastosowania translacyjne. W szczególności jego podatność na wysokoprzepustowe zautomatyzowane badania przesiewowe zachowania i fluorescencyjne markery procesów komórkowych sprawiły, że danio pręgowany stał się szczególnie atrakcyjnym modelem do badań nad padaczką. Świadczy o tym wysoki wzrost w ciągu ostatniej dekady liczby publikacji przedstawiających chemicznie indukowane i/lub genetyczne modele padaczki3,4,5 oraz, ostatnio, doniesienia o obiecujących terapiach uzyskanych z chemicznych badań przesiewowych w tych modelach6,7,8.

DEPDC5 jest członkiem kompleksu GATOR1, negatywnego regulatora sygnalizacji mTOR9. Mutacje w genie DEPDC5 zostały po raz pierwszy odkryte w 2013 roku u probantów cierpiących na padaczkę ogniskową dziedziczoną autosomalnie dominująco10,11 i od tego czasu zostały zgłoszone w wielu stanach klinicznych związanych z ogniskowymi objawami padaczkowymi i ogniskową dysplazją korową12. Przewiduje się, że zdecydowana większość zgłoszonych mutacji spowoduje utratę funkcji genu12, co zostało formalnie wykazane dla wielu zmutowanych transkryptów DEPDC5, które są celem nonsensownego rozpadu mRNA za pośrednictwem 12,13. Zgoda, knockdown genu ortologicznego u danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino (AMO) powoduje szereg cech, które są wspólne dla modeli padaczkowych w tym organizmie, w tym nadpobudliwość, pływanie jak koło zwrotne, spontaniczne drgawki i zwiększoną aktywność neuronalną14,15,16,17,18. Co ciekawe, leczenie rapamycyną, inhibitorem sygnalizacji mTOR, odwróciło cechy behawioralne tego modelu18, wspierając hipotezę, że utrata funkcji DEPDC5 może wywołać padaczkę z powodu nieprawidłowej regulacji szlaku mTOR9,19.

Przejściowe obniżenie ekspresji genów in vivo za pomocą antysensownych oligonukleotydów przenoszących modyfikację morfolino było nieocenionym narzędziem do badania roli określonych genów, na równi z technikami opartymi na si/shRNA. Ostatnio strategie oparte na AMO znalazły również zastosowania kliniczne, a pierwsza terapia AMO otrzymała zgodę FDA na leczenie zaniku mięśni Duchenne'a w 2016 roku20. Chociaż doniesiono, że u danio pręgowanego fenotyp ostrego knock-down genu opartego na AMO nie zawsze koreluje z konstytutywnymi modelami knock-out21, może to być przynajmniej w niektórych przypadkach spowodowane mechanizmami kompensacyjnymi wywołanymi przez konstytutywne modyfikacje genetyczne22. Jednak kwestia swoistości fenotypu indukowanego przez AMO jest niepodważalnym problemem, który musi być pilnie rozwiązany w badaniach z wykorzystaniem tej technologii23. Aby zapewnić specyficzność fenotypu knock-down opartego na AMO, konieczne jest przeprowadzenie kilku kluczowych kontroli. Obejmują one krzywą dawka-odpowiedź, która pozwala na wybór najniższej dawki AMO, która jest skuteczna w przypadku knock-downu genu, unikając ogólnej toksyczności spowodowanej wprowadzeniem nadmiaru materiału genetycznego. Zastosowanie niedopasowania AMO, które nie jest ukierunkowane na żaden konkretny region genomu, jest również wymagane do ustalenia odpowiedniej dawki i identyfikacji określonego fenotypu. Drugi AMO, który jest ukierunkowany na inny region tego samego genu, taki jak AMO blokujący splice, jest niezbędny do potwierdzenia, że fenotyp jest spowodowany nokautem docelowego genu. Uratowanie fenotypu knock-down za pomocą cDNA genu, albo ludzkiego ortologu, albo zmodyfikowanej kodonem wersji genu danio pręgowanego, która nie może być celem AMO, dostarcza mocnego argumentu na rzecz specyficzności fenotypu. Brak ratunku z tym samym cDNA zawierającym mutacje powodujące utratę funkcji (takich jak wprowadzenie wczesnych kodonów stop) jest kolejnym dowodem w tym kierunku.

Tutaj prezentujemy metodę generowania modelu utraty funkcji DEPDC5 u danio pręgowanego oraz protokół fenotypowania behawioralnego po 28 i 48 godzinach od zapłodnienia (hpf). Przy 28 hpf utrata funkcji DEPDC5 powoduje ogólną nadpobudliwość, o czym świadczą zwiększone ruchy zwijania i drgania zarodków w kosmówce. Na tym etapie można zastosować zautomatyzowany system detekcji ruchu w celu ilościowego określenia ogólnej aktywności na zarodek. Przy 48 hpf danio pręgowany wykazuje stereotypowe pływanie ucieczki w odpowiedzi na dotyk. U danio pręgowanego ze zmniejszoną ekspresją DEPDC5 trajektoria pływania jest znacznie bardziej kręta niż w grupie kontrolnej, przy czym ryby wykazują wzór podobny do "korkociągu" lub "koła obrotowego", podobny do innych zgłoszonych modeli padaczki w tym organizmie3,4. Zapisy elektrofizjologiczne uzyskano w tektum nerwu wzrokowego u larw danio pręgowanego między 4-6 dniem po zapłodnieniu (dpf) i wskazują na wyjściowy wzrost aktywności neuronalnej u zwierząt z powalonym DEPDC5. Zaletą tego modelu jest to, że przedstawia on kilka cech fenotypowych w różnych punktach czasowych, co może być przydatne w monitorowaniu i ocenie skuteczności terapii lekowych podczas opracowywania.

Protokół

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Krajowe i Instytucjonalne Komisje Etyczne.

1. Przejściowe wyłączenie genu DEPDC5 w zarodku danio pręgowanego

  1. Przygotowanie narzędzi:
    1. Przygotuj płytki Petriego do iniekcji pokryte elastomerem silikonowym: Wymieszaj bazę i utwardzacz zestawu (patrz tabela materiałów) w stosunku 10:1. Napełnij do połowy szalkę Petriego o średnicy 35 mm mieszanką. Poczekaj, aż silikon stwardnieje przed użyciem (może to potrwać kilka dni).
    2. Przygotować 1,2 mmol/l roztworów podstawowych antysensownych oligonukleotydów morfolino-ligonukleotydów (AMO; patrz tabela materiałów). Dodaj 250 μl sterylnej wody do 300 nmol liofilizowanego AMO, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1,2 mmol/l. W celu całkowitego rozpuszczenia podgrzewać fiolki przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Krótko przetrząsnąć. Uszczelnij nakrętkę tubki folią z tworzywa sztucznego (patrz Tabela materiałów).
    3. Do kontrolnych eksperymentów ratunkowych należy przygotować plazmid ekspresyjny zawierający ludzkie cDNA DEPDC5 (patrz Tabela Materiałów) sklonowany w szkielecie pCS2 lub podobny plazmid ekspresyjny kompatybilny z danio pręgowanym. Jako kontrola negatywna do cDNA wprowadzono mutację powodującą wczesny kodon stop (p.Arg487*).
    4. Przygotuj wodę z zarodka: 0,06 g/l soli akwariowej (patrz tabela materiałów) w wodzie z odwróconej osmozy + 0,5 mg/l błękitu metylenowego.
    5. W dniu wstrzyknięcia należy przygotować igły ze szkła borokrzemianowego do mikroiniekcji za pomocą ściągacza (patrz Tabela materiałów). Ustal odpowiednie ustawienia temperatury na ściągaczu igłowym. Użyj kapilary ze szkła borokrzemianowego o długości 10 cm, 1/0,5 OD/ID mm, aby wygenerować dwie ~5 cm kapilary z cienkimi końcówkami o długości około 1 cm.
    6. Jeśli końcówka igieł jest bardzo cienka, co zapobiega wyrzucaniu roztworu, złamij sam koniec stożkowej końcówki za pomocą kleszczy pod mikroskopem.
    7. Tuż przed wstrzyknięciem należy przygotować roztwory robocze AMO. Zawsze przygotowuj świeży roztwór, aby zapewnić powtarzalność wyników. Podgrzewać fiolki z zapasem AMO w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Przygotować 5 μl próbki iniekcyjnej zawierającej barwnik Fast Green (0,02% stężenie końcowe, patrz tabela materiałów) i AMO rozcieńczoną w wodzie do stężenia roboczego.
    8. Określić stężenie robocze AMO empirycznie dla każdego genu za pomocą krzywej dawka-odpowiedź. Stężenie robocze reprezentuje stężenie, w którym AMO jest skuteczne w powalaniu genu bez powodowania ogólnej toksyczności, takiej jak poważne wady morfologiczne. Zazwyczaj stężenia robocze AMO mieszczą się w zakresie od 0,2 mmol/L do 1 mmol/L (0,4 mmol/L określono jako stężenie efektywne dla tego badania18). Wstrzyknąć kontrolny morfolino Mismatch w tym samym stężeniu, co skuteczny AMO.
    9. Wirować probówki i krótko odwirować, aby kropelki opadły na dno probówek.
    10. Do eksperymentów ratunkowych należy przygotować próbkę iniekcyjnej o objętości 5 μl z AMO rozcieńczonym do stężenia roboczego i plazmidem ekspresji cDNA rozcieńczonym w wodzie do końcowego stężenia, które zostanie określone empirycznie. W przypadku ekspresji DEPDC5 i plazmidu kontroli ujemnej 100 ng / μL było skuteczne w ratowaniu fenotypowym.
  2. Przygotowanie zarodków:
    1. Dzień przed mikroiniekcją należy założyć zbiorniki godowe danio pręgowanego. Rano w dniu wstrzyknięcia należy usunąć przegrody, aby umożliwić tarło. Zebrać jaja na 100-milimetrowych szalkach Petriego wypełnionych wodą z zarodków za pomocą drobnego sitka. Wstrzyknąć w ciągu 20-30 minut od pobrania, gdy jaja są w fazie jednokomórkowej.
    2. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura należy pobrać 60-80 jaj i ułożyć je na pokrytej silikonem szalce Petriego do wstrzyknięcia. Silikonowa powierzchnia zapobiegnie przesuwaniu się jaj podczas wstrzyknięć. Usuń większość wody z zarodka, pozostawiając tylko tyle, aby przykryć jaja do połowy.
  3. Mikroiniekcje:
    1. Napełnij szklaną igłę roztworem do wstrzykiwań. Umieścić igłę pionowo w jednej z probówek zawierających roztwór do wstrzykiwań, upewniając się, że dolny koniec igły dotyka roztworu. Odczekać kilka minut, aż kolorowy roztwór do wstrzykiwań uniesie się kapilarnie i będzie widoczny na końcu igły.
    2. Zamontować napełnioną igłę na uchwycie iniekcyjnym mikrowstrzykiwacza (patrz Tabela materiałów).
    3. Włącz sprężarkę powietrza i dostosuj ustawienie ciśnienia, aby wygenerować objętość wtrysku ~2 nL.
    4. Aby obliczyć objętość wstrzykniętego roztworu, umieść kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrotomowym. Wstrzyknąć roztwór zawierający barwnik, stosując ustawione parametry ciśnienia i czasu. Zmierz średnicę wstrzykiwanej kuli płynu i oblicz całkowitą objętość za pomocą wzoru Objętość = 4/3 * π * (d / 2)3, gdzie d = zmierzona średnica wstrzykniętego bolusa.
    5. Używając mikroskopu dwuokularowego z 4-krotnym powiększeniem, wstrzyknij jaja na etapie pojedynczej komórki, przechodząc przez kosmówkę i żółtko i rozpylając roztwór bezpośrednio do komórki.
    6. Zebrać zarodki, którym wstrzyknięto wstrzyknięte zarodki, umieścić je na płytce Petriego o średnicy 100 mm z wodą z zarodków, oznaczyć szalkę i inkubować w temperaturze 28 °C.
    7. Upewnij się, że temperatura inkubatora jest stabilna w czasie, ponieważ tempo rozwoju zarodków jest termowrażliwe. Na przykład, wzrost byłby przyspieszony w wyższych temperaturach, a etap rozwoju jest krytyczny dla prawidłowej oceny fenotypu24.
    8. Sprawdź jakość komórek jajowych 6-8 godzin po wstrzyknięciu i usuń martwe i niezapłodnione zarodki za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
    9. Następnego ranka policz i usuń martwe zarodki z każdego naczynia za pomocą plastikowej pipety Pasteura.

2. Analiza zachowania

  1. Globalna analiza aktywności przy 28 hpf:
    1. Przeprowadzić test po południu następnego dnia po mikrowstrzyknięciu (28 hpf), upewniając się, że pora dnia, w której przeprowadza się test, jest spójna z doświadczeniami w celu przeprowadzenia prawidłowej analizy statystycznej, ponieważ rozwój zarodków jest bardzo szybki.
    2. Napełnić naczynie o średnicy 35 mm (naczynie do badań) wodą z zarodków i pozostawić je do rozgrzania w inkubatorze (28 °C) przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem badania.
    3. Umieść plastikową siatkę (1.2x1.2 mm) przyciętą na wymiar na dnie naczynia testowego.
    4. Niech inny eksperymentator wylosuje kolejność testowania embrionów i zamaskuje nazwy warunków, które mają być testowane.
    5. Upewnij się, że współczynnik śmiertelności nie zmienia się w zależności od warunków i w porównaniu z zarodkami, którym nie wstrzyknięto, aby zapewnić specyficzność fenotypu. Odsetek martwych zarodków w każdych warunkach nie może przekraczać 10-13%18.
    6. Umieść 10-12 zarodków w obrębie ich kosmówki na plastikowej siatce za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Napełnij naczynie testowe wystarczającą ilością wody z zarodków, aby zarodki były zanurzone, ale nie unosiły się na wodzie. W razie potrzeby ostrożnie przesuwaj zarodki za pomocą plastikowej końcówki, aby ustawić je na siatce.
    7. Za pomocą kamery wideo (patrz Spis materiałów) dołączonej do mikroskopu preparacyjnego, rejestruj spontaniczną aktywność zwijania przez określony czas (10-20 minutowe filmy są zwykle wystarczające do uzyskania reprezentatywnych próbek wybuchów aktywności do oceny ilościowej)
    8. Włóż zarodki do odpowiedniego naczynia i umieść je z powrotem w inkubatorze. Powtórz eksperyment z tyloma zarodkami, ile potrzeba dla każdego stanu (zgodnie z 90% analizą mocy).
    9. Aby przeanalizować całkowity ruch spontaniczny, użyj systemu ZebraLab (patrz tabela materiałów). Korzystając z modułu kwantyfikacji aktywności, prześlij nagrany film i zaprojektuj odpowiednio areny śledzenia wokół każdego zarodka. Ustaw próg zamrożenia i serii odpowiednio na 10 i 50.
    10. Uruchom automatyczną analizę wideo, która określa ilościowo całkowitą aktywność na każdej ze zdefiniowanych aren, a następnie odzyskaj zestaw danych jako arkusz kalkulacyjny i przeprowadź analizę za pomocą oprogramowania do analizy danych.
  2. Reakcja ucieczki wywołana dotykiem (TEER) przy 48 hpf:
    1. Test należy wykonać rano, dwa dni po iniekcji (48 godzin po zapłodnieniu).
    2. Co najmniej 2 godziny przed badaniem należy usunąć zarodki za pomocą cienkich kleszczy. Upewnij się, że pora dnia na dechorionację i test zachowania jest spójna w porównaniu z eksperymentami.
    3. Napełnić naczynie o średnicy 130 mm (naczynie do badań) wodą z zarodków i pozostawić do rozgrzania w inkubatorze (28 °C) przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem badania.
    4. Policz i usuń martwe i morfologicznie zdeformowane larwy. Zapisz liczby dla każdego warunku.
    5. Niech inny eksperymentator wylosuje kolejność i skodyfikuje nazwy warunków, które mają być testowane.
    6. Zamontuj kamerę (patrz Tabela materiałów) nad czaszą testową, upewniając się, że cała czasza testowa znajduje się w polu view. Umieszczenie linijki w polu widzenia zapewnia wewnętrzną kalibrację odległości.
    7. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura umieść zarodek na środku naczynia testowego i rozpocznij zapis z szybkością 30 kl./s.
    8. Cienką plastikową końcówką delikatnie dotknij ogona zarodka ruchem wahadłowym.
    9. Zatrzymaj nagrywanie, gdy larwa zakończy swój ruch.
    10. Wyjmij zarodek z naczynia testowego i umieść go w nowym naczyniu wypełnionym wodą z zarodka. Powtórz test z tyloma zarodkami, ile jest potrzebne dla każdego stanu (zgodnie z 90% analizą mocy).
    11. Włóż zarodki z powrotem do ich pierwotnego naczynia i umieść je z powrotem w inkubatorze.
    12. Aby przeanalizować parametry zachowania podczas pływania, załaduj nagrane wideo do oprogramowania analitycznego ImageJ. Pobierz i zainstaluj wtyczkę Manual Tracking firmy ImageJ (patrz Spis materiałów). Uruchom wtyczkę, wybierając Narzędzia | Wtyczka | Śledzenie ręczne w menu.
    13. W oknie dialogowym wprowadź skalibrowaną skalę obrazu. Umieszczenie linijki w polu kamery ułatwia konwersję cm na piksele.
    14. Wybierz Dodaj ślad i rozpocznij śledzenie trajektorii, klikając obraz larwy danio pręgowanego w pierwszej klatce. Klatki są automatycznie przesuwane wraz z każdym punktem dodanym do trasy.
    15. Kontynuuj śledzenie ruchu aż do końca epizodu pływackiego.
    16. Wybierz opcję Zakończ tor w oknie śledzenia, pobierz współrzędne X-Y i oblicz całkowitą odległość, prędkość i kąt skrętu.

3. Analiza elektrofizjologiczna

  1. Przygotowanie odczynników i narzędzi:
    1. Przygotować 1% agarozy w wodzie z zarodka (patrz punkt 1.1.4). Ciekłą agarozę rozdzielić na porcje w probówkach do mikrowirówek i przechowywać je w bloku grzewczym w temperaturze 42 °C, aby zapobiec stwardnieniu agarozy.
    2. Przygotować roztwór zapisujący (w mmol/l): NaCl 134, KCl 2,9, CaCl2 2,1, MgCl2 1,2, glukoza 10, HEPES 10, pH 7,8.
    3. Mikropipety ze szkła borokrzemianowego z otworem końcówki o średnicy 1,5-2 μm (5-6 mm o rezystancji2·kg·s−3·A−2) należy wyciągnąć nieoszlifowane.
  2. Przygotowanie larw danio pręgowanego do elektrofizjologii:
    1. Umieścić rybę na szalce Petriego ze szklanym dnem (patrz Tabela Materiałów) i usunąć nadmiar pożywki zewnątrzkomórkowej, aby zapewnić, że ryba jest jak najbardziej zbliżona do szkiełka nakrywkowego.
    2. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura dodaj ciepłą płynną agarozę na larwę i wokół niej. Użyj tylko tyle agarozy, aby przykryć rybę. Podczas gdy agaroza twardnieje, użyj cienkich kleszczy, aby ustawić rybę w pozycji prostej, brzuszną stroną do dołu, na środku naczynia.
    3. Dodać 2 ml roztworu rejestrującego zawierającego 10 μM bromku pankuronium (patrz tabela materiałów) w celu zablokowania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego. Dodanie paraliżera jest konieczne, aby wyeliminować artefakty spowodowane niewielkimi ruchami podczas nagrań.
  3. Zapis elektrofizjologiczny
    1. Napełnij mikropipetę roztworem do nagrywania.
    2. Za pomocą wzmacniacza patch clamp (patrz Tabela materiałów) w konfiguracji cęgów napięcia zmierz rezystancję elektrody w kąpieli, aby potwierdzić jej prawidłową wartość.
    3. Używając obiektywu 20x, ustaw głowę larwy w centralnym polu widzenia i opuść mikropipetę, aby osiągnąć pozycję zapisu w mózgu, w obrębie tarczy wzrokowej.
    4. Przełącz wzmacniacz patch clamp na prąd cęgi i ustal prąd podtrzymania na 0 mA.
    5. Korzystając z filtra dolnoprzepustowego 1 kHz, szybkości akwizycji 1 kHz i wzmocnienia cyfrowego 10, rejestruj spontaniczną aktywność przez 60 minut w celu określenia podstawowych poziomów aktywności.
    6. Po upływie 1 godziny od zapisu linii podstawowej dodać do kąpieli 200 μl pentylenotetrazolu (PTZ, patrz tabela materiałów) roztwór o stężeniu 300 mmol/l, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mmol/l PTZ.
    7. Rejestruj aktywność neuronalną w PTZ przez kolejne 120 minut.
  4. Wyznaczanie zdarzeń depolaryzacji
    1. Zdarzenia rejestrujące w terenie mają bardzo wolną dynamikę (interesujące nas częstotliwości mieszczą się w zakresie 0,005-0,2 s-1). Dlatego należy przefiltrować sygnał dolnoprzepustowym (LPF 5. rzędu Butterwortha przy 100 s-1), aby uniknąć aliasingu. Podpróbkuj zarejestrowane dane o napięciu z szybkości klatek akwizycji (w tym przypadku 1 ks-1) do 250 s-1 (SYGNAŁ RAW).
    2. Aby zidentyfikować znaczniki czasu dla każdego zdarzenia depolaryzacji, użyj SYGNAŁU DETEKCJI, który jest filtrowaną górnoprzepustową wersją zarejestrowanego sygnału (HPF Butterwortha 1. rzędu przy 0,01 s-1).
    3. Eliminując składowe o niskiej częstotliwości, detekcja zdarzeń depolaryzacji może być przeprowadzona za pomocą prostej metody progowania. Użyj ustalonego progu do eliminacji szumów i wykrywania zdarzeń (w tym badaniu użyto 0,3 mV).
    4. Scharakteryzuj zdarzenie depolaryzacji za pomocą serii przecięć progów, które występują w odstępach czasu krótszych niż 4 s. Oblicz początek i koniec zdarzenia depolaryzacji zgodnie z kolejnymi sekwencjami przekroczeń progów. Zdarzenia, które są krótsze niż 40 ms, mogą zostać odrzucone jako szum.
    5. Oblicz amplitudę zdarzeń w niefiltrowanym (SYGNAŁ RAW), aby wyeliminować błędy wynikające z wpływu filtrowania dolnoprzepustowego na szczyt zdarzenia. Wybierz falkę depolaryzacyjną z surowego sygnału, korzystając ze znaczników czasu określonych w filtrowanym sygnale. Zmierz amplitudę jako różnicę między maksymalnymi i minimalnymi wartościami falki wybranej z sygnału surowego.
      nuta: Pliki skryptów do wykonania kroku 3.4 — Określanie zdarzenia depolaryzacji — i do uzyskania Rysunek 1 są dostarczane jako plik uzupełniający załączony do tego artykułu.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia reprezentatywne zapisy napięcia z zewnątrzkomórkowych pomiarów pola w larwach danio pręgowanego w 4-6 dpf dla dwóch warunków genetycznych: kontroli Mismatch oraz wyciszenia genu DEPDC5. W okresie bazowym pomiaru w przypadku wyciszenia DEPDC5 obserwuje się częstsze występowanie zdarzeń spontanicznych, podczas gdy w kontroli Mismatch występuje bardzo mało fluktuacji. Wzorce aktywności te reprezentują istotny wzrost aktywności neuronalnej wynikający z utraty funkcji DEPDC5, co zgłaszaliśmy we wcześniejszych publikacjach18. Po zastosowaniu PTZ zarówno w grupie kontrolnej Mismatch, jak i w grupie z wyciszeniem DEPDC5 obserwuje się zwiększoną liczbę zdarzeń depolaryzacyjnych. W pierwszym okresie po podaniu PTZ (10–60 min) w obu grupach (Mismatch i wyciszenie DEPDC5) odnotowano częstotliwość 0,8 zdarzeń na min, przy czym większość zdarzeń miała wysoką amplitudę (>1 mV). W późniejszym okresie odpowiedzi (60–120 min po podaniu PTZ) częstotliwość zdarzeń depolaryzacyjnych wzrosła do około 1 zdarzenia na min, a większość z nich miała niską amplitudę (≤1 mV).

Wyniki elektrofizjologii; przebiegi napięcia i histogramy; kontrola mismatch vs. KD Depdc5; aktywność komórkowa.
Rycina 1: Przykładowe przebiegi rejestracji potencjałów polowych w mózgu larw danio pręgowanego. (A) Przegląd 180-minutowej rejestracji dla larwy kontrolnej Mismatch oraz dla larwy z wyciszeniem DEPDC5. Najpierw zarejestrowano spontaniczną aktywność podstawową, a następnie zastosowano PTZ w kąpieli (czerwony pasek). (B) Histogramy czasu okołobodźcowego (PSTH) zdarzeń depolaryzacyjnych dla kontroli Mismatch i wyciszenia DEPDC5. Zdarzenia zaklasyfikowano jako o wysokiej amplitudzie (>1 mV – niebieski) i niskiej amplitudzie (≤1 mV – czarny). (C-E) Przykładowe przebiegi z różnych okresów rejestracji: (C) aktywność spontaniczna, (D) zdarzenia o wysokiej amplitudzie w pierwszym okresie po zastosowaniu PTZ, (E) zdarzenia o niskiej amplitudzie w późniejszym okresie po zastosowaniu PTZ. Należy zauważyć, że pliki skryptów służące do uzyskania tych rycin są dostępne jako Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający: Pliki skryptów do kroku 3.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Dyskusja

Padaczka jest złożoną chorobą neurologiczną, charakteryzującą się szerokim zakresem etiologii, które zaczynają być wyjaśniane wraz z pojawieniem się technologii sekwencjonowania genetycznego 25,26,27. Wszechstronne modele zwierzęce są niezbędne dla skutecznej strategii translacyjnej, która przyniesie zarówno wgląd w patologiczne mechanizmy genetycznie powiązanych padaczek, jak i ukierunkowane terapie różnych form tego schorzenia. Modele danio pręgowanego okazały się bardzo skuteczne w odtwarzaniu głównych cech padaczki i dostarczaniu wiarygodnych odczytów do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych 5,28. Spontaniczne napady padaczkowe można wykryć u genetycznie zmodyfikowanego danio pręgowanego 15,29,30,31, a analiza neurofizjologiczna w tych modelach 28 potwierdziła neuronalne podstawy zachowania podobnego do padaczkowego 32,33. Małe larwy danio pręgowanego są podatne na badania chemiczne w formacie 96-dołkowym przy użyciu automatycznego wykrywania prostych zachowań, takich jak spontaniczne pływanie, co pozwala na szybkie wykrycie potencjalnych środków terapeutycznych.

Przedstawiony tutaj model knock-down DEPDC5 uzyskuje się przez wstrzyknięcie AMO do zarodka danio pręgowanego w celu zablokowania ekspresji genów podczas rozwoju. Model ten przedstawia kilka kluczowych cech fenotypowych w różnych punktach czasowych rozwoju larw, które można wykorzystać jako wskaźniki skuteczności terapii podczas chemicznego lub genetycznego protokołu przesiewowego. Nokautowanie genów za pośrednictwem AMO jest potężną techniką, wykazującą przewagę nad chemicznie indukowanymi modelami napadów, ponieważ jest ukierunkowana na ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, umożliwiając w ten sposób identyfikację podstawowych mechanizmów patogennych wywołanych przez mutację genetyczną. Induktory chemiczne, które są jednak potężnymi narzędziami do badań przesiewowych leków, mogą działać poprzez wiele szlaków komórkowych, które nie zawsze muszą być istotne dla badanej mutacji genetycznej. Chociaż wstrzykiwanie AMO jest samo w sobie prostą techniką, gdy jest opanowane przez eksperymentatora, przedstawia również szereg ograniczeń. Wstrzyknięcia muszą być wykonywane w stadium zarodka w jednym stadium komórkowym; W naszych rękach zastrzyki w późniejszych stadiach znacznie zwiększyły zmienność fenotypu. Ogranicza to czas dostępny do wstrzyknięcia; Dlatego przydatna jest strategia generowania komórek jajowych do wstrzykiwania w sekwencji czasowej. Rutynowo stosujemy 4-5 krzyżaków, które otwieramy w odstępach 15-20 minut, co pozwala na wstrzyknięcie jednego sprzęgła przed uzyskaniem kolejnego. Ponadto należy zadbać o to, aby ocenić fenotyp w tych samych punktach czasowych między różnymi eksperymentami, ponieważ stereotypowe zachowania szybko ewoluują w pierwszych dniach rozwoju. Objętość i stężenie AMO muszą być również dokładnie kontrolowane, ponieważ ogólna toksyczność spowodowana wstrzykiwaniem nadmiernych ilości maskuje określony fenotyp. Różne kontrole przedstawione we wstępie mają zasadnicze znaczenie dla określenia właściwej dawki iniekcyjnej i odpowiadającego jej fenotypu.

Zapisy terenowe mózgu larw danio pręgowanego są użytecznym narzędziem do badania szkodliwego wpływu mutacji genetycznych zaangażowanych w różne zaburzenia mózgu na globalną aktywność neuronalną34. Zdarzenia depolaryzacji obserwowane w tych warunkach eksperymentalnych są uznaną metodą oceny elektrofizjologicznych efektów leków w różnych stanach padaczkowych15,35. Jednak ocena tych skutków została w większości przeprowadzona jakościowo, a nie ilościowo, a w analizie uczestniczył subiektywny obserwator. W tym miejscu opracowujemy strategię automatycznego wykrywania, która może obiektywnie określić ilościowo szybkość depolaryzacji, ich amplitudę i czas trwania, a także może ocenić postęp tych parametrów w czasie lub przy różnych interwencjach genetycznych lub farmakologicznych.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki pokazują oczekiwaną aktywność polową modelu genetycznego knock-down DEPDC5 w porównaniu z kontrolą niedopasowania u 4-6 dpf danio pręgowanego, przed i po zastosowaniu PTZ w celu wprowadzenia aktywności elektrograficznej podobnej do padaczkowej. Wcześniej wykazaliśmy znaczny wzrost podstawowej aktywności warunku knockdown 18 DEPDC5. Tutaj pokazujemy, że odpowiedź tych dwóch stanów na PTZ, chemiczny induktor aktywności padaczkowej, ma podobną trajektorię w czasie, zaczynając od okresu zdarzeń depolaryzacji o stosunkowo niskiej częstotliwości i wysokiej amplitudzie, a kończąc na okresie depolaryzacji o wyższej częstotliwości i niższej amplitudzie. Zdarzenia rejestrujące w terenie mają niską dynamikę (interesujące nas częstotliwości mieszczą się w zakresie 0,005-0,2 s-1), dlatego w tym protokole stosuje się zarówno filtry dolnoprzepustowe, jak i górnoprzepustowe do izolowania interesujących zdarzeń. Po wyeliminowaniu szumów o niskiej częstotliwości, detekcja zdarzeń depolaryzacji odbywa się za pomocą prostego progu. Ponieważ na statystyki sygnału duży wpływ ma obecność zdarzeń depolaryzacji, nie mogliśmy użyć odchylenia standardowego całkowitego sygnału do określenia tego progu. Zmienność wartości odchylenia standardowego w różnych zbiorach danych była większa niż obserwowane poziomy szumu podczas nagrywania. W związku z tym, po oględzinach ścieżek, zastosowaliśmy stałą wartość progu 0,3 mV, aby uniknąć polaryzacji wywołanej różnymi poziomami aktywności depolaryzacyjnej.

Opisany protokół zapewnia ustandaryzowaną i prostą metodę oceny zachowań motorycznych i aktywności pola neuronalnego, poprzez zewnątrzkomórkowy zapis napięcia cęgów prądowych w połączeniu z automatycznym wykrywaniem zdarzeń depolaryzacji w tektum wzrokowym, w celu scharakteryzowania fenotypów podobnych do padaczkowatych w modelach danio pręgowanego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować personelowi platformy elektrofizjologicznej ICM, gdzie przeprowadzono eksperymenty neurofizjologiczne. Dziękujemy również Ance Marian za pomoc techniczną. SC był wspierany przez Trampoline Grant #21488. EK był wspierany przez AFM Grant #18469 oraz ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC został wsparty nagrodami doktorskimi od Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) i ARSLA. W przypadku AD i RM prace te były wspierane przez trzy granty z rumuńskiego Krajowego Urzędu ds. Badań Naukowych i Innowacji, CNCS-UEFISCDI (numery projektów PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 i COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), grant z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 – umowa o grant nr 668863-SyBil-AA oraz grant National Science Foundation NSF-IOS-1656830 finansowany przez rząd USA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-Aldrich, FrancjaA9539
Sól akwariowa Instant Ocean, Blacksburg, VASS15-10
Szkło borokrzemianowe z żarnikiemSutter InstrumentsBF100-50-10OD: 1,5 mm, ID: 0,5 mm
CaCl2Sigma-Aldrich, FrancjaC1016
Depdc5-atg antysensowne morpholinoGeneTools, OR, USAN/Asekwencja 5'- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3'  
Depdc5-mis antisense morpholinoGeneTools, OR, USAn/asekwencja 5'- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3'  
Depdc5-splice antisense morpholinoGeneTools, OR, USAN/Asekwencja 5'- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3'
DigitizerMolecular Devices, CA, USADigidata 1550
Fast Green DyeSigma-Aldrich, FrancjaF7258Roztwór podstawowy 0,2%
szalek Petriego ze szklanym dnemIbidi, Niemcy81218
GlukozaSigma-Aldrich, Francja68270
Kamera Grasshopper 2FLIR, BC, KanadaGRAS-03K2M-Cdawniej Point Grey Badania
HEPESSigma-Aldrich, FrancjaH3375
Ludzkie cDNA DEPDC5 typu dzikiegoDharmacon, FrancjaNM_001242897.1  Akcesja: BC144291 Clone ID 905
ImageJ softwareNIH, USAN/A
KClSigma-Aldrich, FrancjaP9333 
Oprogramowanie MatlabMathWorks, MA, USANie dotyczy
MgCl2Sigma-Aldrich, FrancjaM2670
NaClSigma-Aldrich, FrancjaS7653 
NaOHSigma-Aldrich, Francja71687
Bromek pankuronium Alomone LabsP-130Roztwór podstawowy 60 mM w wodzie
ParafilmSigma-Aldrich, FrancjaP7793
Wzmacniacz z zaciskiem krosowymMolecular Devices, CA, USAMultiClamp 700BSterowany komputerowo wzmacniacz zacisków krosowych
Oprogramowanie akwizycyjne pClamp10Urządzenia molekularneN/A
Pentylenotetrazol (PTZ)Sigma-Aldrich, FrancjaP6500Roztwór podstawowy 300 mM (rozpuszczony w roztworze nagrywającym)
Ściągacz do pipetNarishige, JaponiaPC-10
Pneumatyczna pompa PicoPump WPI, FrancjaPV 820
Sylgard 184 zestawSigma-Aldrich Intl.
Plastikowe pipety transferoweSigma-Aldrich, FrancjaZ350605
ZebralabViewpoint, FrancjaN/A
761036

Bibliografia

  1. Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish. Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).
  2. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The Power of Zebrafish in personalised medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).
  3. Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. , (2005).
  4. Cunliffe, V. T. Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  5. Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models. Progress in Brain Research. , (2016).
  6. Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome. Brain. , (2017).
  7. Orellana-Paucar, A. M., et al. Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy. PLoS ONE. , (2013).
  8. Baxendale, S., et al. Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures. Disease Models & Mechanisms. , (2012).
  9. Bar-Peled, L., et al. A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1. Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).
  10. Ishida, S., et al. Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies. Nature Genetics. , (2013).
  11. Dibbens, L. M., et al. Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci. Nature Genetics. , (2013).
  12. Baulac, S., Weckhuysen, S. DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).
  13. Picard, F., et al. DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology. , (2014).
  14. Teng, Y., et al. Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype. Human Molecular Genetics. , (2010).
  15. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. , (2013).
  16. Suls, A., et al. De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome. American Journal of Human Genetics. , (2013).
  17. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS ONE. , (2016).
  18. de Calbiac, H., et al. DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish. Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).
  19. Panchaud, N., Péli-Gulli, M. P., De Virgilio, C. Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1. Science Signaling. , (2013).
  20. Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Design, Development and Therapy. , (2017).
  21. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. , (2015).
  22. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. , (2015).
  23. Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. , (2017).
  24. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).
  25. Møller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).
  26. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. , (2013).
  27. Dunn, P., et al. Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes. Frontiers in Genetics. , (2018).
  28. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions. Nature Neuroscience. , (2015).
  29. Zhang, Y., et al. Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine. PLoS ONE. , (2015).
  30. Swaminathan, A., et al. Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development. Current Biology. , (2018).
  31. Samarut, É, et al. γ-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment. Epilepsia. , 2061-2074 (2018).
  32. Turrini, L., et al. Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish. Scientific Reports. , (2017).
  33. Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures. PLoS Computational Biology. , (2018).
  34. Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2013).
  35. Afrikanova, T., et al. Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs. PLoS ONE. , (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model epilepsji u rybek danio zebswyciszenie genu DEPDC5analiza behawioralnatechnika mikroiniekcjispontaniczna aktywno zwijania siucieczka wywo ana dotykiemrejestracja elektrofizjologicznaaplikacja pentylenotetrazolurejestracja z tektaum optycznego
Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.