Przygotowanie funkcjonalizowanych kulek SiO2 z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek

Podsumowanie

Przedstawiono protokół przygotowania szczepionych kulek krzemionkowych z poli(pentafluorofenylu akrylanu) (poli(PFPA)). Funkcjonalizowana powierzchnia poli(PFPA) jest następnie unieruchamiana przeciwciałami i z powodzeniem wykorzystywana do separacji białek poprzez immunoprecypitację.

Streszczenie

Pokazujemy prostą metodę przygotowania poli(akrylanu pentafluorofenylu) (poli(PFPA)) szczepionych kulek krzemionkowych do immobilizacji przeciwciał i późniejszej aplikacji immunoprecypitacji (IP). Powierzchnia szczepiona z poli(PFPA) jest przygotowywana w prostym, dwuetapowym procesie. W pierwszym etapie 3-aminopropylotrimetoksysilan (APTMS) osadza się jako cząsteczkę łącznikową na powierzchni krzemionki. W drugim etapie homopolimer poli(PFPA), syntetyzowany przez polimeryzację odwracalnego dodawania i przenoszenia łańcucha fragmentacji (RAFT), jest szczepiony do cząsteczki łącznika w wyniku reakcji wymiany między jednostkami pentafluorofenylu (PFP) na polimerze i grupami aminowymi na APTMS. Osadzanie się APTMS i poli(PFPA) na cząstkach krzemionki jest potwierdzane za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS), a także monitorowane przez zmianę wielkości cząstek mierzoną za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). W celu poprawy hydrofilowości powierzchniowej kulek przeprowadza się również częściowe podstawienie poli(PFPA) poli(glikolem etylenowo-glikolowym) (amino-PEG) funkcjonalizowanym aminami. Podstawione przez PEG kulki krzemionki z poli(PFPA) są następnie unieruchamiane przeciwciałami do aplikacji IP. W celu demonstracji stosuje się przeciwciało przeciwko kinazie białkowej aktywowanej RNA (PKR), a wydajność IP określa się za pomocą Western blot. Wyniki analizy pokazują, że kulki unieruchomione przeciwciałem mogą być rzeczywiście wykorzystane do wzbogacenia PKR, podczas gdy nieswoiste interakcje białkowe są minimalne.

Wprowadzenie

Reaktywne szczotki polimerowe cieszą się dużym zainteresowaniem w ostatnich latach. Mogą być używane do immobilizacji funkcjonalnych cząsteczek na materiałach organicznych lub nieorganicznych w celu tworzenia aktywowanych powierzchni z zastosowaniami w obszarach takich jak wykrywanie i separacja^1,2,3,4,5. Spośród zgłoszonych polimerów reaktywnych, te zawierające jednostki estru pentafluorofenylu są szczególnie przydatne ze względu na ich wysoką reaktywność z aminami i odporność na hydrolizę⁶. Jednym z takich polimerów jest poli(PFPA) i może być łatwo funkcjonalizowany po polimeryzacji cząsteczkami zawierającymi pierwszorzędowe lub drugorzędowe aminy^7,8,9^,10. W jednym z przykładów pędzle poli(PFPA) przereagowały z amino-spiropyranami, aby stworzyć powierzchnie reagujące na światło⁷.

Przygotowanie poly(PFPA) i jego zastosowania zostały opisane w wielu poprzednich publikacjach^6,7,8,9^{,10,11,12,13,14, 15,16,17}. W szczególności Theato i współpracownicy opisali syntezę pędzli poli(PFPA) zarówno metodą "szczepienia", jak i "szczepienia z"^7,8,10,11,12. W podejściu "szczepienie do" zsyntetyzowano hybrydowy polimer poli(metylosilseskwioksan)-poli(akrylan pentafluorofenylu) (poli(MSSQ-PFPA)) hybrydowy polimer^8,10,11,12. Składnik poli(MSSQ) był w stanie wytworzyć silną przyczepność do wielu różnych powierzchni organicznych i nieorganicznych, umożliwiając w ten sposób składnikowi poli(PFPA) utworzenie warstwy pędzla na powierzchni powlekanego materiału. W podejściu "szczepienie z" zastosowano inicjowaną powierzchniowo polimeryzację odwracalnego dodawania i przenoszenia łańcucha fragmentacji (SI-RAFT) do przygotowania szczotek poli(PFPA)⁷. W tym przypadku czynnik przenoszący łańcuch unieruchomiony powierzchniowo (SI-CTA) został najpierw kowalencyjnie przyłączony do podłoża w reakcji krzemionka-silan. Unieruchomiony SI-CTA uczestniczył następnie w polimeryzacji monomerów PFPA metodą SI-RAFT, generując gęsto upakowane szczotki poli(PFPA) o stabilnym wiązaniu kowalencyjnym z podłożem.

Wykorzystując szczotki poli(PFPA) zsyntetyzowane metodą polimeryzacji SI-RAFT, niedawno zademonstrowaliśmy immobilizację przeciwciał na cząstkach krzemionki szczepionej poli(PFPA) i ich późniejsze zastosowanie w oczyszczaniu białek¹⁸. Stwierdzono, że zastosowanie szczotek poli(PFPA) do immobilizacji przeciwciał rozwiązuje szereg problemów związanych z obecną separacją białek za pomocą IP. Konwencjonalne IP opiera się na wykorzystaniu białka A/G jako łącznika do immobilizacji przeciwciał^19,20,21. Ponieważ zastosowanie białka A/G pozwala na przyłączanie przeciwciał o określonej orientacji, osiąga się wysoką skuteczność odzyskiwania docelowego antygenu. Jednak stosowanie białka A/G cierpi z powodu niespecyficznej interakcji białkowej, a także utraty przeciwciał podczas odzyskiwania białek, co przyczynia się do wysokiego poziomu szumu tła. Aby rozwiązać te niedociągnięcia, zbadano bezpośrednie sieciowanie przeciwciał do stałego nośnika^22,23,24. Skuteczność takich technik jest zazwyczaj niska ze względu na losową orientację usieciowanych przeciwciał. W przypadku substratu szczepionego poli(PFPA) immobilizacja przeciwciał jest trwała, osiągana poprzez reakcję wymiany między jednostkami PFP i funkcjami aminowymi na przeciwciałach. Chociaż orientacja przeciwciał jest nadal losowa, system korzysta z wielu reaktywnych miejsc PFP, które można kontrolować za pomocą stopnia polimeryzacji. Ponadto wykazaliśmy, że poprzez częściowe zastąpienie jednostek PFP amino-PEG, hydrofilowość powierzchni może być dostrojona, co jeszcze bardziej poprawia wydajność odzyskiwania białek w systemie¹⁸. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że szczepione cząstki krzemionki poli(PFPA) są skuteczną alternatywą dla tradycyjnego IP z rozsądną wydajnością, a także znacznie czystszym tłem.

W tym wpisie opisujemy alternatywną metodę przygotowania poli(PFPA) szczepionej powierzchni do immobilizacji przeciwciał i aplikacji IP. W prostym dwuetapowym procesie, jak pokazano na Rysunek 1, cząsteczka łącznika APTMS jest najpierw osadzana na powierzchni krzemionki, a następnie polimer poli(PFPA) jest kowalencyjnie przyłączany do cząsteczki łącznika poprzez reakcję między jednostkami PFP na polimerze a funkcjami aminowymi na APTMS. Ta metoda przygotowania pozwala na trwałe sieciowanie poli(PFPA) z powierzchnią podłoża, ale pozwala uniknąć wielu komplikacji związanych z syntezą SI-CTA i polimeryzacją SI-RAFT szczotek poli(PFPA). Częściowe zastąpienie jednostek PFP amino-PEG może być nadal wykonane, co pozwala na precyzyjne dostrojenie właściwości powierzchni szczotek polimerowych. Pokazujemy, że tak przygotowane szczepione kulki krzemionki z poli(PFPA) można unieruchomić przeciwciałami i wykorzystać do wzbogacania białek za pomocą IP. Szczegółowa procedura przygotowania kulek, immobilizacja przeciwciał i testowanie IP są udokumentowane w tym artykule, dla czytelników zainteresowanych poszukiwaniem alternatywy dla konwencjonalnego IP opartego na białku A / G.

Protokół

1. Przygotowanie homopolimeru poli(PFPA)

1. Rekrystalizacja AIBN
   1. Połączyć 5 g 2,2'-azobis(2-metylopropionitrylu) (AIBN) z 25 ml metanolu w zlewce o pojemności 250 ml. Zanurzyć zlewkę w kąpieli olejowej o temperaturze 60 °C, a następnie energicznie mieszać mieszaninę za pomocą mieszadła, aż do całkowitego rozpuszczenia AIBN.
   2. Przefiltrować ciepły roztwór przez bibułę filtracyjną (zatrzymanie cząstek 5-8 μm) i przechowywać filtrat w temperaturze 4 °C, aby umożliwić powolne tworzenie się kryształów.
   3. Zebrać zrekrystalizowany AIBN przez filtrację. Połączyć zebrany produkt z 25 ml świeżego metanolu i powtórzyć proces rekrystalizacji.
   4. Wysuszyć 2x zrekrystalizowany AIBN w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej (RT) przez noc. Produkt przechowywać w ciemności w temperaturze < -10 °C.
2. Synteza ditiobenzoesanu benzylu²⁵
   1. Przygotować kolbę okrągłodenną o pojemności 500 ml z trzema szyjkami, wyposażoną w mieszadło magnetyczne, chłodnicę zwrotną, lejek do zakraplacza i gumową przegrodę. Podłączyć kolbę do przewodu gazowego azotu przez chłodnicę zwrotną i wypłukać powietrze z wnętrza azotem. Włóż termometr przez przegrodę. Dodać 41 ml (0,041 mola) 1 M roztworu bromku fenylomagnezu w tetrahydrofuranie (THF) przez strzykawkę przez tę samą przegrodę.
   2. Podgrzać roztwór bromku fenylomagnezu do temperatury 40 °C w kąpieli olejowej. Następnie powoli dodać 3,1 g (0,041 mola) dwusiarczku węgla przez lejek do zakraplania, utrzymując temperaturę roztworu na poziomie 40 °C.
   3. Dodać 7,1 g (0,042 mola) bromku benzylu do otrzymanej mieszaniny przez lejek do zakraplacza przez 15 minut. Zwiększyć temperaturę reakcji do 50 °C. Kontynuować mieszanie w tej temperaturze przez 45 minut.
   4. Przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza i rozcieńczyć 15 ml lodowatej wody. Wyekstrahować produkt, dodając 15 ml eteru dietylowego i usunąć dolną warstwę wody. Powtórz ekstrakcję eterem dietylowym jeszcze dwa razy.
   5. Połączone fazy organiczne przemyć dużą ilością wody, następnie zalać solanką (roztwór 50% (w/v) NaCl w wodzie) i wysuszyć produkt na bezwodnym siarczanie magnezu.
   6. Usunąć rozpuszczalnik w próżni w temperaturze 35 °C za pomocą wyparki obrotowej.
   7. Oczyścić produkt metodą chromatografii kolumnowej przy użyciu 400 ml żelu krzemionkowego (wielkość porów 60 A, wielkość cząstek siatki 63-200) i eteru naftowego jako eluentu, otrzymując 5 g ditiobenzoesanu benzylu (BDB) w postaci czerwonego oleju. Czystość produktu potwierdzić za pomocą ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,02-7,99 (2H, m), 7,55-7,50 (1H, m), 7,41-7,29 (7H, m), 4,60 (2H, s).
3. Synteza poli(PFPA) metodą polimeryzacji RAFT^9,26
   1. Dostępny na rynku monomer PFPA zawiera niewielką ilość inhibitorów. Przed polimeryzacją należy usunąć inhibitory, przepuszczając monomer przez jednorazową strzykawkę wypełnioną zasadowym tlenkiem glinu.
   2. Dodać 0,4 mg (0,0024 mmol) rekrystalizowanego AIBN, 4,3 mg (0,018 mmol) BDB, 1012 mg (4,25 mmol) wolnego od inhibitorów PFPA i 0,7 ml bezwodnego anizolu do kolby Schlenka o pojemności 20 ml.
   3. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka i odgazować mieszaninę w co najmniej trzech cyklach zamrażania, pompowania i rozmrażania. Krótko mówiąc, zamrozić mieszaninę reakcyjną w kąpieli ciekłego azotu. Zastosuj podciśnienie, aby usunąć gaz z przestrzeni nad głową. Uszczelnić kolbę, a następnie usunąć z dala od ciekłego azotu, aby umożliwić rozmrożenie zawartości w temperaturze pokojowej.
   4. Umieścić kolbę w łaźni olejowej o temperaturze 70 °C i reagować przez 4 godziny pod wpływem przedmuchiwania_N2.
   5. Aby zakończyć reakcję, należy wyjąć kolbę z kąpieli olejowej i wystawić zawartość reakcji na działanie powietrza.
   6. Wytrącić polimer w zimnym metanolu, a następnie wysuszyć odzyskany polimer w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C przez noc.
   7. Aby zmierzyć masę cząsteczkową polimeru, należy użyć chromatografii żelowej (GPC). Użyć THF jako fazy ruchomej w temperaturze 35 °C przy natężeniu przepływu 1 ml/min i skonstruować krzywą kalibracyjną przy użyciu wzorców polistyrenu monodyspersyjnego. Aby uzyskać pomiar GPC, rozpuść polimer w THF (1-2 mg/ml) i przefiltruj przez jednorazowy filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE) 0,2 μm. Wstrzyknąć 100 μl próbki do przyrządu GPC. Przelicz zmierzony czas retencji próbki na masę cząsteczkową za pomocą krzywej kalibracyjnej polistyrenu.

2. Przygotowanie poli(PFPA) funkcjonalizowanych kulek SiO₂

1. Obróbka kulek SiO₂ za pomocą APTMS
   1. Cząsteczki SiO₂ są dostępne w postaci 5% (w/v) zawiesiny wodnej. Połączyć 0,8 ml zawiesiny SiO₂ z 40 mg APTMS i 8 ml metanolu w 20 ml fiolce scyntylacyjnej wyposażonej w mieszadło.
   2. Pozostawić reakcję w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, energicznie mieszając.
   3. Przenieś roztwór do stożkowej rurki. Aby wyizolować kulki SiO₂ funkcjonalizowane przez APTMS, należy odwirować roztwór o sile 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Umyj kulki, ponownie dyspergując je w 3 ml świeżego metanolu. Potrząśnij probówką ręcznie w celu wymieszania, ale jeśli to konieczne, popraw dyspersję poprzez sonikację w łaźni wodnej przez kilka sekund. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.
   4. Połącz płukane metanolem kulki SiO₂ z 3 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Potrząśnij mieszaniną ręcznie lub, jeśli to konieczne, sonikuj przez kilka sekund, aż kulki zostaną całkowicie rozproszone w DMSO. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok, aby zapewnić pełną wymianę rozpuszczalnika z metanolu na DMSO.
      UWAGA: Końcowa zawiesina zawiera funkcjonalizowane przez APTMS kulki SiO₂ rozproszone w 4 ml DMSO.
   5. Aby sprawdzić rozkład wielkości cząstek, wykonaj analizę DLS. Pobrać jedną kroplę zawiesiny przygotowanej w kroku 2.1.4 i umieścić w jednorazowej kuwecie UV. Rozcieńczyć próbkę, napełniając kuwetę świeżym DMSO, aż będzie wypełniona w 2/3. Włóż próbkę do uchwytu komórki, aby rozpocząć akwizycję danych. Do pomiaru wielkości cząstek należy użyć następujących parametrów konfiguracji: Temperatura: 25 °C; Czas równowagi: 120 s; Czas trwania pomiaru: Automatyczny.
   6. Aby sprawdzić skład powierzchni, należy przeprowadzić analizę XPS. Wysuszyć małą próbkę z zawiesiny przygotowanej w kroku 2.1.4 w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C przez noc. Pobrać wysuszony polimer i równomiernie zapakować w uchwyt na próbkę o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm. Załaduj próbkę do komory wysokiej próżni (^10-8 torów) i rozpocznij akwizycję danych. Dla konkretnego użytego instrumentu XPS, wygeneruj fotoelektrony za pomocą monochromatycznego promieniowania rentgenowskiego Al Kα działającego przy napięciu 15 kV i 6,7 mA i zbieraj je przy użyciu powiększenia w trybie hybrydowym za pomocą analizatora przy energii przejścia 50 eV dla widm o wysokiej rozdzielczości i energii przejścia 100 eV dla badań pierwiastków.
2. Szczepienie poli(PFPA) do kulek SiO₂ funkcjonalizowanych APTMS
   1. Przygotować roztwór poli(PFPA) rozpuszczając 20 mg poli(PFPA) w 2 ml DMSO w 20 ml fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
      UWAGA: W tym badaniu stosuje się poli(PFPA) o stosunkowo niskiej masie cząsteczkowej (20 kg/mol). Tak więc, pomimo wysokiego stężenia polimeru (10 mg/ml), nie obserwuje się dowodów na sieciowanie polimerów. Jeśli używany jest polimer o wyższej masie cząsteczkowej, może być konieczne dostosowanie stężenia roztworu polimeru, aby uniknąć możliwego sieciowania.
   2. Dodać 1 ml funkcjonalizowanych APTMS kulek SiO₂ zawieszonych w DMSO (z kroku 2.1.4) do roztworu poli(PFPA). Reagować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, energicznie mieszając.
   3. Wyizolować poli(PFPA) szczepione kulki SiO₂ przez odwirowanie w stężeniu 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Umyj kulki, dodając 3 ml DMSO i wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórzyć mycie kulek SiO₂ szczepionych poli(PFPA) dwukrotnie DMSO.
   4. Umyj koraliki jeszcze dwa razy wodą potrójnie destylowaną (TDW). Na tym etapie połącz kulki z 3 ml TDW, a następnie wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
   5. Aby sprawdzić rozkład wielkości cząstek, wykonaj DLS zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.1.5. Aby sprawdzić skład chemiczny powierzchni, wykonaj XPS zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.1.6.

3. Przygotowanie kulek SiO₂ szczepionych poli(PFPA) podstawionym PEG

1. Aby przygotować roztwór poli(PFPA), należy rozpuścić 20 mg poli(PFPA) w 2 ml DMSO w 20 ml fiolki scyntylacyjnej.
2. Aby przygotować roztwór PEG, rozpuść PEG funkcjonalizowany aminami w 1 ml DMSO. Dokładna ilość użytego PEG zależy od pożądanego stopnia podstawienia PFP, określonego za pomocą równania pokazanego poniżej:
   Ilość aminokwasów PEG (g/g-poli(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % PEG-Sub) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA))
   gdzie N_poly(PFPA) = poli(PFPA) stopień polimeryzacji
   % PEG-Sub = procent podstawienia PEG
   MW_PEG = masa cząsteczkowa amino-PEG
   MW_ poli(PFPA) = masa cząsteczkowa poli(PFPA)
3. Przenieść roztwór PEG do roztworu poli(PFPA). Reagować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, energicznie mieszając.
4. Aby przygotować funkcjonalizowane przez APTMS kulki SiO₂ zawieszone w DMSO, wykonaj te same czynności, które pokazano w kroku 2.1. Przenieść 1 ml zawiesiny kulek do roztworu poli(PFPA) podstawionego PEG przygotowanego w kroku 3.3. Pozwól, aby szczepienie między kulkami SiO₂ funkcjonalizowanymi poli(PFPA) i APTMS przebiegało w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z energicznym mieszaniem.
5. Wyizolować kulki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Umyj kulki, dodając 3 ml DMSO i wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórz pranie DMSO dwukrotnie.
6. Umyj koraliki jeszcze dwa razy za pomocą TDW. Na tym etapie połącz kulki z 3 ml TDW, a następnie wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
7. Kulki suszyć przez noc w temperaturze 40 °C w piekarniku próżniowym.

4. Immobilizacja przeciwciał na poli(PFPA) szczepionych kulkach SiO₂

UWAGA: Ta sama procedura jest stosowana niezależnie od procentowego podstawienia PEG na poli(PFPA). Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), rozpuszczając tabletkę PBS w TDW. Przygotować 0,1% (v/v) buforowaną solą fizjologiczną z fosforanem Tween-20 (PBST), dodając 1/1000 Tween-20 do PBS.

1. Dodać 5 mg kulek SiO₂ szczepionych poli(PFPA) do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
2. Umyj kulki, dodając 800 μl PBS i dobrze wymieszaj, wirując. Odwirować kulki o sile 10 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Usunąć supernatant i powtórzyć etap mycia trzy razy.
3. Dodać 350 μl świeżego PBS, 50 μl 0,1% (v/v) PBST i 6,67 μg przeciwciała. Inkubować ~20 h na rotatorze w temperaturze 4 °C.
4. Umyj kulki, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Odwirować kulki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do lizy. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół przez pięć razy.
   UWAGA: Bufor do lizy używany do płukania kulek powinien być taki sam, jak używany podczas lizy komórek i IP, z wyjątkiem tego, że dodanie ditiotreitolu i inhibitora proteazy jest opcjonalne (patrz krok 5).
5. Powtórz ten krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu usuń supernatant w jak największym stopniu.

5. Liza komórek i immunoprecypitacja

1. Przygotowanie buforu do lizy i buforu do przemywania
   1. Przygotować bufor do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,5% (v/v) NP-40, 10% (v/v) glicerol, 1 mM ditiotreitol (DTT) i koktajl inhibitorów proteazy).
   2. Przygotować bufor do przemywania (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,1 % (v/v) NP-40 i 10% (v/v) glicerolu).
   3. Przechowywać roztwory buforowe w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie komórek
   1. Zasiaj komórki (komórki HeLa) na jeden lub dwa dni przed eksperymentem IP i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
   2. Zebrać około 1,4 x 10⁷ komórek za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy ciśnieniu 380 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 1 ml zimnego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
   3. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Usunąć dokładnie supernatant. Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po usunięciu supernatantu.
3. Przygotowanie lizatów komórkowych
   1. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 400 μl buforu do lizy. Sonikować komórki za pomocą ultradźwięków.
   2. Po sonikacji należy krótko zmieszać i odwirować lizat w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   3. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Immunoprecypitacja
   1. Przenieść 300 μl lizatu komórkowego do wcześniej przygotowanych inkubowanych kulek SiO₂ szczepionych poli(PFPA) przeciwciałami. Zachować 30 μl lizatu komórkowego jako próbkę wejściową w nowej probówce do mikrowirówki. Przechowywać wsadową próbkę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Całkowita ilość białka w lizacie komórkowym powinna wynosić około 4 mg.
   2. Inkubować mieszaninę lizatu i kulek przez 3 godziny na rotatorze w temperaturze 4 °C.
   3. Odwirować mieszaninę w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do przemywania wody. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół około pięć razy.
   4. Powtórz ten krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu usuń supernatant w jak największym stopniu.
   5. Przygotuj 2x dodecylosiarczanu sodu (SDS) barwnik ładujący (25% (v/v) glicerolu, 0,1% (w/v) błękitu bromofenolowego (BPB), 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% (w/v) SDS i 2,75 mM 2-merkaptoetanolu). Przechowywać 2x barwnik ładujący SDS w temperaturze -20 °C. Dodać 30 μl barwnika ładującego 2x SDS do kulek i przechowywanej próbki wejściowej i podgrzewać je przez 10 minut w temperaturze 95 °C.
   6. Po podgrzaniu przeanalizować próbkę za pomocą Western blotting²⁷ lub przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Schemat przygotowania poli(PFPA) szczepionych kulek SiO₂, z lub bez podstawiania PEG, jest pokazany w Rysunek 1. Aby monitorować proces szczepienia APTMS i poli(PFPA), gołe kulki SiO₂, kulki SiO₂ funkcjonalizowane APTMS i kulki SiO₂ szczepione poli(PFPA) charakteryzują się zarówno DLS (Rysunek 2), jak i XPS (Rysunek 3). Wydajność IP kulek jest określana przez Western blot.

Dyskusja

Syntezę kulek SiO₂ szczepionych poli(PFPA) zilustrowano na rysunku 1. Dzięki zastosowaniu APTMS jako cząsteczki łącznikowej, szczotki poli(PFPA) kowalencyjnie szczepione na substracie SiO₂ można przygotować w prostym dwuetapowym procesie. Chociaż niektóre jednostki PFP są poświęcane do reakcji z APTMS, oczekuje się, że duża liczba jednostek PFP pozostanie dostępna do późniejszej reakcji z amino-PEG lub przeciwciałami. Wiadomo, że grupy PFP tworzą powierzchnie o niskiej ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,2-Azobisisobutyronitryl, 99%	Daejung Chemicals	1102-4405
Alkohol metylowy do HPLC, 99,9%	Duksan Pure Chemicals	d62
Bromek fenylomagnezu, roztwór 1,0  M w THF	Sigma-Aldrich	331376
Dwusiarczek węgla bezwodny, ≥ 99%	Sigma-Aldrich	335266
Bromek benzylu, 98%	Sigma-Aldrich	B17905
Eter naftowy, 90%	Samchun Chemicals	P0220
Eter etylowy, 99%	Daejung Chemicals	4025-4404
Siarczan magnezu bezwodny, proszek,  99%	Daejung Chemicals	5514-4405
Akrylan pentafonenylu	Santa Cruz Biotechnology	sc-264001	zawiera inhibitor
Tlenek glinu, aktywowany, zasadowy, Brockmann I	Sigma-Aldrich	199443
Chlorek sodu (NaCl)	Daejung Chemicals	7548-4400
Anizol bezwodny, 99,7%	Sigma-Aldrich	296295
Nanocząstki krzemionki	Microparticles GmbH	SiO2-R-0,7	5% w/v zawiesina wodna
3-aminopropylotrimetoksysilan, >96,0%	Tokyo Chemical Industry	T1255
Dimetylosulfotlenek do HPLC, ≥ 99,7%	Sigma-Aldrich	34869
Aminozakończony eter metylowy poli(glikolu etylenowego)	Źródło	polimeru P16082-EGOCH3NH2
Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami	Takara	T9181
Tween-20	Calbiochem	9480
Tris-HCl (pH 8,0)	Invitrogen	AM9855G
KCl	Invitrogen
NP-40	VWR	E109-50ML
Glicerol	Invitrogen	15514-011
Ditiothreitol	Biosesang	D1037
Inhibitor proteazy	Merck	535140-1MLCN
Bromo fenol niebieski	Sigma-Aldrich	B5525-5G
Tris-HCl (pH 6,8)	Bioroztwór	BT033
Bioroztwór dodecylosiarczanu sodu		BS003
2-merkaptoetanol	Gibco	21985-023
Technologia sygnalizacji komórkowej	przeciwciał PKR	12297S Przeciwciało
GAPDH	Cruz Biotechnology	sc-32233
technologia sygnalizacji komórek	IgG królika	2729S
HeLa	Korea Cell Line Bank	10002
Sonicator	DAIHAN Scientific	WUC-D10H
Ultradźwiękowy	wirówka BMBio	BR2006A
I	Eppendorf	5424 R
Wirówka II	LABOGENE	1736R
Rotator	FINEPCR	ROTATOR/AG
Piec próżniowy	DAIHAN Naukowa	termostabilna chromatografia żelowa OV-30
(THF)	Agilent Technologies	1260 Spektrometr
	Thermo VG Scientific	Sigma Probe
Dynamiczne rozpraszanie światła	Malvern Instruments	ZEN 3690