Artykuł metodologiczny

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

DOI:

10.3791/58870

⸱

23 marca 2019

 ,  ,  , 
1Center for Perinatal Biology, Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Department of Biology, The College of New Jersey, 3Department of Neurosurgery, Loma Linda University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rytm wdechowy ssaków jest generowany przez sieć neuronalną w obszarze rdzenia zwanym kompleksem preBötzingera (pBC), która wytwarza sygnał napędzający rytmiczne skurcze mięśni wdechowych. Rytmiczna aktywność neuronalna generowana w pBC i przenoszona do innych pul neuronalnych w celu kierowania mięśniami oddechowymi może być badana przy użyciu różnych podejść, w tym nagrań nerwów en bloc i nagrań przekrojów poprzecznych. Jednak wcześniej opublikowane metody nie opisały dokładnie procesu rozwarstwiania pnia mózgu i rdzenia kręgowego w sposób przejrzysty i powtarzalny dla przyszłych badań. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy przegląd metody stosowanej do powtarzalnego wycinania rytmicznie aktywnych wycinków pnia mózgu zawierających niezbędne i wystarczające obwody neuronalne do generowania i przekazywania napędu wdechowego. Praca ta opiera się na wcześniejszych protokołach elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wiarygodnego uzyskania żywotnych i rytmicznie aktywnych warstw do rejestrowania wyjścia neuronalnego z pBC, podjęzykowych neuronów przedruchowych (XII pMN) i podjęzykowych neuronów ruchowych (XII MN). Prezentowana praca rozszerza poprzednio opublikowane metody, dostarczając szczegółowych, krok po kroku ilustracji sekcji, od całego szczeniaka szczura, do wycinka in vitro zawierającego korzonki XII.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć neuronowa układu oddechowego pnia mózgu stanowi żyzną dziedzinę do zrozumienia ogólnych cech rytmicznych sieci neuronowych. W szczególności zainteresowanie dotyczy rozwoju oddychania noworodków przez gryzonie i zrozumienia, jak rozwija się rytm oddychania. Można to zrobić przy użyciu podejścia wielopoziomowego, w tym pletyzmografii in vivo całych zwierząt, nagrań nerwów en bloc in vitro oraz nagrań in vitro slice, które zawierają generator rytmu oddechowego. Redukcjonistyczne zapisy in vitro en bloc i slice są korzystną metodą do wykorzystania podczas badania mechanizmów stojących za rytmogenezą oddechową i obwodami neuronalnymi w obszarze pnia mózgu i rdzenia kręgowego rozwijających się gryzoni. Rozwijający się układ oddechowy obejmuje około 40 typów komórek, charakteryzujących się wzorcem zapłonu, w tym komórki centralnego układu oddechowego1,2. Centralna sieć oddechowa obejmuje grupę rytmicznie aktywnych neuronów zlokalizowanych w rdzeniu rostralnym brzuszno-bocznym1,3. Rytmogeneza oddechowa ssaków jest generowana przez autorytmiczną sieć interneuronów nazwaną kompleksem preBötzingera (pBC), która została zlokalizowana eksperymentalnie za pomocą zarówno warstwowych, jak i en bloc preparatów rdzenia mózgowo-rdzeniowego noworodków ssaków3,4,5,6,7,8. Region ten pełni podobną funkcję do węzła zatokowo-przedsionkowego (SA) w sercu i generuje wdechowy system pomiaru czasu do napędzania oddychania. Z pBC rytm wdechowy jest przenoszony do innych obszarów pnia mózgu (w tym do jądra ruchowego podjęzykowego) i rdzeniowych pul motorycznych (takich jak przeponowe neurony ruchowe, które napędzają przeponę)9.

Aktywność rytmiczną można uzyskać za pomocą preparatów en bloc rdzenia kręgowego pnia mózgu lub wycinków z różnych populacji komórek, w tym korzonków nerwowych C3-C5, korzeni nerwowych XII, jądra ruchowego podjęzykowego (XII MN), neuronów przedruchowych podjęzykowych (XII pMN) oraz pBC3,10,11,12. Chociaż te metody gromadzenia danych odniosły sukces w kilku laboratoriach, wiele protokołów nie jest przedstawionych w sposób, który byłby w pełni odtwarzalny dla nowych badaczy wkraczających w tę dziedzinę. Uzyskanie żywotnych i rytmicznie aktywnych preparatów en bloc i plastrów wymaga szczególnej dbałości o szczegóły na wszystkich etapach protokołu rozwarstwiania i krojenia plastrów. Poprzednie protokoły obszernie opisywały różne procedury rejestracji i elektrofizjologii, ale brakowało im szczegółów w najbardziej krytycznej części uzyskania żywej preparatyki tkankowej: wykonaniu sekcji pnia mózgu i rdzenia kręgowego oraz procedury cięcia.

Efektywne uzyskanie rytmicznie aktywnego i zdolnego do wykonywania en bloc lub slice zapisów elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego wymaga, aby wszystkie kroki były wykonywane poprawnie, ostrożnie i szybko (zazwyczaj cała procedura związana tutaj może być wykonana w około 30 minut). Punkty krytyczne protokołu elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego, które nie zostały wcześniej dobrze opisane, obejmują preparację korzonków nerwowych i procedurę krojenia wibratomu. Protokół ten jest pierwszym, który krok po kroku wizualnie komunikuje sekcję pnia mózgu i rdzenia kręgowego zarówno dla nowych badaczy, jak i ekspertów w tej dziedzinie. Protokół ten dokładnie wyjaśnia również techniki chirurgiczne, punkty orientacyjne i inne procedury, aby pomóc przyszłym badaczom w standaryzacji plastrów i preparatów en bloc, aby zawierały dokładnie takie obwody, jakie są pożądane w każdym eksperymencie. Przedstawione tutaj procedury mogą być stosowane zarówno u nowonarodzonych szczeniąt szczurów, jak i myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został zaakceptowany i zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Loma Linda. Wytyczne NIH dotyczące etycznego traktowania zwierząt są przestrzegane we wszystkich eksperymentach na zwierzętach przeprowadzanych w laboratorium. Wszystkie standardy etyczne były przestrzegane przez osoby wykonujące ten protokół.

1. Rozwiązania

  1. Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF).
    1. Przygotować świeży płyn CSF wieczorem przed eksperymentem w partiach o pojemności 1 l, stosując następującą recepturę: 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO3 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0,247 gMgSO4 • 7H2O (1,0 mM), i 5,410 g D-glukozy (30 mM), 0,221 g CaCl2 • 2H2O (1,5 mM). Zawsze dodawaj CaCl2 • 2H2O na końcu.
    2. Rozpuść składniki w 1 l wody dejonizowanej. Mieszaj przez 20 - 30 min.
    3. Zmierz pH aCSF i dostosuj do 7,40 ± 0,02 przy użyciu małych objętości (zwykle <0,5 ml) rozcieńczonego NaOH, KOH lub HCl.
      nuta: Przygotowany płyn CSF można przechowywać w lodówce (4 °C, pH 7,40 ± 0,02) do trzech dni przed tym, jak rozwój bakterii wpłynie na żywotność tkanki podczas eksperymentu. Użyj filtrów 0,2 μm, aby zmniejszyć zanieczyszczenie grzybami lub bakteriami obecnymi w laboratorium, ponieważ eksperymenty mogą trwać do 36 godzin. W celu zwiększenia wydajności, opisana receptura aCSF może być skalowana do 4 litrów partii zgodnie z tym samym protokołem, a objętość ta wystarczy na maksymalnie trzy dni eksperymentów.

2. Przygotowanie zestawu do sekcji i wibratomu

  1. Skonfiguruj ostrze.
    1. Użyj świeżych, obosiecznych żyletek do cięcia tkanki na wibratomie. Umyj ostrze 100% etanolem i spłucz wodą dejonizowaną przed przecięciem lub złamaniem ostrza na pół i włożeniem ostrza do mocowania clamp na wibratomie.
    2. Wymieniaj ostrze za każdym razem, gdy nowy preparat tkankowy jest montowany na wibratomie do krojenia lub jeśli wcina się w płytę parafinową podczas krojenia. Wszelkie pozostałości parafiny sprawią, że prawie niemożliwe będzie czyste przecięcie tkanki nerwowej noworodka.
  2. Ułóż płytę parafinowy.
    1. Użyj dowolnego wosku parafinowego w stylu zatapiania. Umieść 10 g podłoża do zatapiania w szklanej zlewce odpornej na wysoką temperaturę i na małym ogniu stopić kulki wosku parafinowego do cieczy.
    2. Dodać około 0,5 g proszku grafitowego i dokładnie i równomiernie wymieszać roztwór z ciekłą parafiną.
    3. Użyj małego plastikowego talerza jako podłoża dla parafiny. Wytnij mały (0,5 - 1 cm grubości i około2 x 2 cm 2 szerokości) kawałek plastiku (można również użyć poliwęglanu lub aluminium). Użyj pilnika operatora, aby wydrapać rowki w plastiku, ponieważ zapewni to przyleganie parafiny do plastiku.
      nuta: Alternatywnie, użyj podgrzanej igły podskórnej 18 G, aby umieścić kątowe otwory w arkuszu, aby upewnić się, że mieszanina parafiny i grafitu przylega do tworzywa sztucznego.
    4. Użyj tylnej części aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nanieść mieszaninę parafiny i grafitu na plastik, wielokrotnie zanurzając aplikator w stopionej mieszaninie parafiny i grafitu, kapiąc zawiesinę na plastikowy blok i budując parafinę grafitową do grubości około 1.5 cm na wierzchu plastiku.
    5. Gdy wystarczająco gruba warstwa mieszanki parafiny i grafitu zostanie osadzona na bloku, odłóż blok na bok do ostygnięcia, a następnie uformuj tak, aby pomieścić rdzeń mózgowo-rdzeniowy.

3. Rozwarstwienie i izolacja układu nerwowego

  1. Wykonaj wstępną sekcję i znieczulenie.
    UWAGA:     Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu mogą mieć różną wielkość od 18. dnia embrionalnego (E18) do 10-20 dnia po urodzeniu u myszy lub szczurów od E18 do 5/6. dnia po urodzeniu. Można stosować szczury lub myszy dowolnego szczepu, leczenia lub płci, w zależności od projektu eksperymentalnego. Wykonać znieczulenie i wstępną sekcję pod wyciągiem, ponieważ stosuje się izofluran (0,25 ml w komorze o pojemności 25 ml).
    1. Zważ szczenię, a następnie umieść je w komorze anestezjologicznej zawierającej 0,25 ml izofluranu umieszczonego na kawałku gazy o wymiarach 2 x 2 cale. Po tym, jak zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (weryfikowaną przez uszczypnięcie palca u nogi bez odruchu wycofania), przypnij zwierzę do szalki Petriego wypełnionej parafiną lub elastomerem silikonowym.
      nuta: Nowonarodzone gryzonie mogą być również znieczulone za pomocą krioanestezjologii13,14, parowanie izofluranu15, lub iniekcja16 zrównoważone tlenem.
    2. Ułóż zwierzę brzuszną stroną do dołu i wykonaj nacięcie w linii środkowej od tuż za oczami do środkowego odcinka lędźwiowego kręgosłupa za pomocą ostrza skalpela numer 10 lub 11 lub nożyczek chirurgicznych. Odbić skórę i odgrodzić zwierzę na poziomie szwu ciemieniowego/potylicznego (patrz Rysunek 1) i usunąć skórę przenikającą zwierzę poniżej przepony. Następnie usuń ramiona, przecinając staw barkowy nożyczkami lub skalpelem.
    3. Po usunięciu skóry przenieś zwierzę do komory perfuzyjnej z elastomeryną silikonową na dnie w celu dalszej sekcji i przygotowania pnia mózgu i rdzenia kręgowego.
    4. Pęcherzykować zbiornik aCSF (butelka o pojemności 500 ml z bocznym portem) w sposób ciągły schłodzonym (4 °C, pH 7,40 ± 0,02) aCSF i natlenić mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 (zwaną również "karbogenem"). Podczas sekcji należy użyć schłodzonego aCSF do okresowego przepłukiwania komory, dostarczając świeży natleniony aCSF przez cały czas izolacji pnia mózgu i rdzenia kręgowego.
      nuta: Czerwone krwinki można zobaczyć w pozostałych tętnicach i żyłach, a gdy są wystarczająco natlenione, są one jaskrawoczerwone.
    5. Stosować perfuzję grawitacyjną za pomocą rurki i kranu odcinającego, aby okresowo lub w sposób ciągły perfundować tkankę natlenionym aCSF (objętość bolusa lub przez powolne kroplowanie za pomocą kranu odcinającego, około 0,5 - 1,0 ml / min). To dotlenia tkankę i utrzymuje czyste pole operacyjne.
    6. W razie potrzeby usuń nadmiar płynów za pomocą systemu filtracji próżniowej.
    7. Wykonaj sekcję za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Preferowany jest model z ciągłym zoomem, aby umożliwić precyzyjną regulację powiększenia i optymalną wizualizację obszaru zainteresowania podczas każdego etapu sekcji.
      nuta: Zalecane narzędzia mikrochirurgiczne obejmują szereg kleszczyków do tkanek zębatych, kleszczy, kleszczy #5, kleszczy do tkanek pod kątem, szereg nożyczek do mikropreparowania (nożyczki sprężynowe) oraz zwykłe szpilki do owadów i mikropreparacji.
    8. Odsłoń mózg przez przekrój czaszki w linii środkowej wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie przygwoźdź odbite płaty za pomocą szpilek do mikropreparowania i przypnij kręgosłup na końcu ogonowym do pokrytego silikonem dna komory rozwarstwiania za pomocą igły 27 G.
      nuta: Pozostała część sekcji wymaga mikroskopu preparacyjnego, aby zapewnić jak najwyraźniejszy widok tkanki i punktów orientacyjnych użytych w celu zapewnienia maksymalnego prawdopodobieństwa uzyskania rytmicznego fikcyjnego wyjścia na korzonkach czaszki pnia mózgu i korzonkach rdzeniowych. Wykonaj te etapy sekcji za pomocą średnich nożyczek sprężynowych lub nożyczek do tęczówki i cienkich kleszczy.
  2. Natychmiast przenieś odizolowany pień zwierzęcia do napowietrzonej komory rozbiorowej. Umieść tkankę grzbietową stroną do góry, tak aby koniec rostralny (mózg) był skierowany do przodu komory. Przypnij tkankę na ramionach i najbardziej ogonowym końcu rdzenia kręgowego.
    1. Wykonaj nacięcie w połowie strzałki przez czaszkę po szwie ciemieniowym, aby uniknąć uszkodzenia kory i pnia mózgu leżącego pod czaszką.
      nuta: Tkanka kostna noworodka nie jest w pełni zwapniała i jest bardzo krucha. Kość/tkanka będzie do pewnego stopnia elastyczna, ale twardsza niż otaczająca ją tkanka łączna i mięśniowa.
    2. Użyj średnich nożyczek sprężynowych lub tęczówki, aby przeciąć szwy potyliczne czaszki, zaczynając od szwu strzałkowego i pracując bocznie. Spowoduje to powstanie "płatów" czaszki, które mogą zostać odbite i przypięte, aby zakotwiczyć rostralną część czaszki i zapewnić pewną stabilność tkance (patrz Rysunek 2A).
    3. Po odbiciu płatów czaszki odetnij resztę kory mózgowej, pozostawiając ogonową część móżdżku (robaka) względnie nienaruszoną (Ryc. 2B).
  3. Wykonaj laminektomię grzbietową.
    1. Usuń mięśnie otaczające czaszkę i kręgosłup za pomocą mikro nożyczek sprężynowych i kleszczy. Usuń tkankę wzdłuż grzbietowej strony klatki piersiowej, pozostawiając klatkę piersiową nienaruszoną, ponieważ zostanie ona później przypięta, aby zakotwiczyć tkankę podczas brzusznej laminektomii, minimalizując ryzyko uszkodzenia rdzenia kręgowego.
    2. Ostrożnie odetnij boczne wyrostki blaszek kręgowych za pomocą średnich nożyczek sprężynowych lub cienkich nożyczek do tęczówki. Odetnij wszelkie tkanki pokrywające most i rdzeń. Robak, móżdżek, most i początek rdzenia kręgowego będą teraz wyraźnie widoczne (Rysunek 2C).
  4. Wykonaj laminektomię brzuszną.
    1. Odwróć tkankę grzbietową stroną do dołu i przypnij klatkę piersiową i najbardziej ogonowy koniec kręgosłupa. Przypnij rostralną stronę tkanki za pomocą płatów czaszki (Rysunek 3A).
    2. Usuń brzuszną połowę klatki piersiowej, w tym mostek i wszystkie narządy jamy brzusznej, używając tych samych nożyczek i kleszczy. Wypreparuj tkankę miękką przyczepioną do klatki piersiowej, odsłaniając żebra i rdzeń kręgowy (Rysunek 3B).
    3. Usuń język, przełyk, tchawicę, krtań i wszystkie inne tkanki miękkie i mięśnie pokrywające podstawę czaszki i kręgosłup (jak widać na Rysunek 3C).
    4. Wypreparuj tkankę leżącą na twardej palecie. Zidentyfikuj podniebienie twarde, umieszczając prostokątną płytkę kostną u podstawy czaszki z wgłębieniem w kształcie litery V (Rysunek 3C). Przetnij wzdłuż linii środkowej podniebienia, ostrożnie unieś je do góry i wykonaj cięcie poprzeczne, aby je usunąć (Rysunek 4A).
    5. Rozpocznij laminektomię brzuszną od usunięcia blaszek odsłaniających brzuszną powierzchnię pnia mózgu i rdzeń kręgowy od pierwszego kręgu szyjnego do około kręgu piersiowego 7 (T7), jak widać w Rysunek 4B.
    6. Na tym etapie widoczne będą korzonki brzuszne. Używając małych mikropreparacji lub nożyczek sprężynowych, należy uważać, aby nacięcia wykonywać jak najbliżej blaszek i jak najdalej od początku korzeni w rdzeniu kręgowym; Unikaj rozciągania korzeni.
    7. Snip 5 - 10 mm po obu stronach kręgosłupa na blaszkach. Nie tnij zbyt blisko rdzenia kręgowego ani do kręgów. Ten krok umożliwia usunięcie kręgów szyjnych w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego. Unikaj przycinania korzonków.
    8. Korzonki tnące należy wyciąć około 20 - 25 mm (obustronnie) wzdłuż kręgosłupa (około T7). Podczas tej procedury unikaj nacinania rdzenia kręgowego i manipulowania krawędziami kręgów, jak widać na Rysunek 4C.
    9. Usuń C1, C2 i C3, ostrożnie podnosząc krawędź rostralną każdego z kręgów i przecinając ją ściśle pod kością. Im bliżej kości wykonuje się cięcie, tym dłuższy korzonek. Użyj haczykowatych lub zgiętych kleszczy, aby pomóc w uzyskaniu mocnego uścisku każdego kręgu szyjnego podczas wykonywania cięć (Rysunek 4C).
    10. Po wyizolowaniu i wycięciu pożądanej długości rdzenia kręgowego z kręgosłupa, wykonaj poprzeczne cięcie, aby usunąć rdzeń kręgowy (Rysunek 5A i Rysunek 5B).
  5. Usuń oponę twardą
    UWAGA:     Izolowany rdzeń kręgowy pnia mózgu może być używany do rejestracji en bloc in vitro, jak to zostało wcześniej opisane3,7. Po usunięciu pnia mózgu i rdzenia kręgowego z kręgosłupa, opona twarda musi zostać usunięta, aby zapewnić optymalny dostęp elektrom ssącym do wykonywania nagrań z przeciętych korzeni czaszkowych i rdzeniowych. Dodatkowo usunięcie opony twardej umożliwia czyste przecięcie pnia mózgu i uzyskanie rytmicznie aktywnych cienkich plastrów do zapisu in vitro.
    1. Ostrożnie przypnij izolowaną tkankę pnia mózgu i rdzenia kręgowego grzbietową stroną do góry, aby umożliwić dostęp do opony twardej otaczającej korzonki czaszki (Ryc. 5B). Szpilki należy nakładać przez boczny brzeg pnia mózgu, rostralnie do XII korzonków.
    2. Usuń oponę twardą z grzbietowej powierzchni pnia mózgu, podnosząc oponę twardą cienkimi kleszczami (#4) na grzbietowym brzegu opony twardej i przeciąć od bocznej do przyśrodkowej wzdłuż pnia mózgu cienkimi nożyczkami sprężynowymi. Uważaj, aby nie wciąć się w sam pień mózgu. Delikatnie unieś naczynia krwionośne z powierzchni pnia mózgu i przetnij, aby uniknąć utrudnienia działania ostrza wibratomu podczas cięcia pnia mózgu.
    3. Ostrożnie wypreparuj oponę twardą od przyśrodkowej i bocznej części pnia mózgu, ponieważ korzonki nerwów czaszkowych przechodzą przez oponę twardą i łatwo się rozrywają, gdy opona twarda jest podniesiona. Zminimalizuj prawdopodobieństwo oderwania korzonków, delikatnie przycinając je małymi nożyczkami sprężynowymi.
    4. Odwróć rdzeń kręgowy pnia mózgu tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry, a korzonki czaszki były wyraźnie widoczne. Wypreparuj oponę twardą od grzbietowej strony pnia mózgu, delikatnie unosząc oponę twardą bezpośrednio nad obszarem postrema, przecinając od rostralnego do ogonowego. Obszar postrema będzie wyglądał na lekko różowy ze względu na dużą liczbę mikronaczyń włosowatych przenikających ten obszar.
    5. Użyj cienkiej szpilki do owadów, aby usunąć pozostałą oponę twardą i usunąć pozostałe naczynia krwionośne w bliskiej odległości od korzonków czaszki i szyjki macicy.

4. Protokół Slice

  1. Po usunięciu opony twardej umieść pień mózgu w środku platformy parafinowej na plastikowym bloku (zwanym dalej "blokiem tnącym"). Przypnij ogonowy koniec pnia mózgu przez dystalny rdzeń kręgowy za pomocą cienkich szpilek do owadów, które zostały przycięte do długości nie większej niż 1 cm, jak pokazano na Rysunek 5C.
  2. Wyrównaj pokryty parafiną blok tnący z przypiętym pniem mózgu w uchwycie bloku wibratomu tak, aby ostrze cięło prostopadle do powierzchni rostralnej pnia mózgu.
  3. Zrób początkowy plasterek, aby usunąć nierówną, obcą tkankę na najbardziej rostralnym końcu. To początkowe cięcie może mieć zazwyczaj 200 - 300 μm, ale ostrożnie unikaj usuwania korzonków czaszki IX, X i XII. Ten krok zazwyczaj ujawnia ogonowy zasięg jądra twarzowego (VII) i korzonków językowo-gardłowych oraz umożliwia ustawienie pnia mózgu tak, aby jego twarz była równoległa do ostrza wibratomu. W razie potrzeby dokonaj niewielkich korekt, aby zapewnić równomierność i wykonaj małe nacięcia, aby usunąć nierówną tkankę.
    nuta: Korzonki językowo-gardłowe (IX) będą widoczne na bocznej krawędzi pnia mózgu podczas cięcia każdego kolejnego wycinka, a te stanowią punkt orientacyjny dla odległości rostro-ogonowej do obwodów nerwowych pnia mózgu niezbędnych do generowania rytmu. Po brzusznej stronie pnia mózgu korzonki podjęzykowe (XII) powinny być również widoczne lekko ogonowo w stosunku do przeciętej powierzchni, na której widoczne są korzonki IX. Ostatnim punktem orientacyjnym będzie zasuwka (punkt w ludzkim mózgu, w którym czwarta komora zwęża się, stając się centralnym kanałem rdzenia kręgowego) na grzbietowej powierzchni pnia mózgu. Mając widoczne te trzy punkty odniesienia, ustalana jest prawidłowa płaszczyzna cięcia (patrz Rysunek 6A) i niezawodnie uzyskuje się rytmicznie aktywny wycinek.
  4. Kontynuuj cięcie rostralne do ogonowego, aż korzonki IX znajdą się blisko powierzchni przeciętej powierzchni pnia mózgu.
  5. Zapoznaj się z Rysunek 6, aby zapoznać się z punktami orientacyjnymi i prawidłową orientacją. Wyreguluj warstwę parafinową w wibratomie clamp tak, aby następny kąt przecięcia utworzył bardzo lekki kształt "klina" do ciętego plastra i ciętych plastrów o wielkości około 100 - 200 μm, aż opisane punkty orientacyjne będą wyraźnie widoczne (Rysunek 6A).
    nuta: Przecięcie tego niewielkiego klina zwiększa liczbę neuronów ruchowych XII wychwyconych w wycinku i maksymalizuje prawdopodobieństwo uzyskania rytmicznej aktywności podczas nagrywania. Korzystanie z opisanych punktów orientacyjnych (korzonki rostralne z pęczka nerwu językowo-gardłowego, korzonki z pęczka nerwu podjęzykowego, zasuwka) zapewni, że wycinek w powtarzalny sposób zawiera co najmniej dużą część pBC (Rysunek 6B).
  6. Wytnij wycinek pnia mózgu o grubości 300 - 500 μm z tych rostralnych markerów neuroanatomicznych, aby uchwycić pBC i związane z nim obwody transmisyjne.
    nuta: "Idealny" wycinek będzie zawierał najbardziej rostralny korzeń wiązki korzonka podjęzykowego, aby niezawodnie uzyskać aktywność wdechową bez uciekania się do nagrań powierzchniowych za pomocą elektrody ssącej nad miejscami generującymi rytm / transmitującymi w pniu mózgu.

5. Procedury nagrywania

  1. Umieść plasterek w komorze rejestracyjnej, wykonuj w sposób ciągły za pomocą aCSF (0,5 - 1,0 ml / min) i użyj elektrod ssących lub zewnątrzkomórkowych do zarejestrowania aktywności populacji z korzonków XII lub z pBC, XII PMN lub XII motoneuronów. Szczegółowe procedury rejestrowania można znaleźć w poprzednich publikacjach na temat elektrofizjologii pnia mózgu i rdzenia kręgowego oraz zaciskania łatek10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda pozwala badaczowi zainteresowanemu uzyskaniem rytmicznie aktywnych wycinków pnia mózgu na powtarzalne i niezawodne wycięcie trwałego, solidnego kawałka, który pozwoli rejestrować fikcyjną moc motoryczną przez wiele godzin. Wszystkie minimalnie niezbędne elementy obwodu neuronowego do generowania i przekazywania rytmu wdechowego można uchwycić w cienkim plasterku za pomocą tej metody. Do elementów tych należą: kompleks preBötzingera, neurony przedruchowe rzutując...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptacja przedstawionego tutaj protokołu do przepływu pracy en bloc lub slice jest korzystna dla laboratoriów i badań, które chciałyby wykorzystać preparaty en bloc rdzenia kręgowego pnia mózgu i/lub cienkie plasterki do zapisów elektrofizjologicznych. Przedstawiona metoda preparacji i plasterków, w połączeniu z metodami opisanymi wcześniej przez innych 17,18,19, pozwoli na powtarzalne przygotowanie wytrzymałej i żywotnej tkanki, którą można szeroko dostosować do szeregu eksperymentów z wykorzystaniem tyłomózgowia gryzo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.B.P jest laureatem letniego stypendium badawczego Uniwersytetu Loma Linda.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClFisher ScientificS271-500
KClSigma AldrichP5405-1KG
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1
NaH2PO4 i byk; H2OSigma AldrchS9638-25G
CaCl2• 2H2OSigma AldrichC7902-500G
MgSO4• 7H2OSigma AldrichM7774-500G
D-GlucoseSigma AldrichG8270-1KG
Źródło zimnego światła Lampa halogenowa 150 WAmScopeH2L50-AY
Mikroskop preparacyjnyLeicaM-60
Vibratome 1000 PlusVibratomeW3 69-0353
Podstawa magnetycznaKaneticMB-B-DG6C
Izofluran, USPPatterson VeterinaryNDC 14043-704-06
Miecz Klasyczne ostrza o podwójnej krawędziWilkinson97573
HistoclearSigma-AldrichH2779
Dumont #5 KleszczeNarzędzia do nauki11254-20
Dumont #5/45 KleszczeNarzędzia do nauki11251-35
Ostrza skalpela #10Narzędzia do nauki10010-00
Skalpel Handel #3Narzędzia do nauki o sztuce10003-12
Nożyczki sprężynowe proste Fine Science Tools15024-10
Kleszcz o wąskim wzorze Ząbkowany/prostyFine Science Tools11002-12
Castroviejo Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania; Prostenożyczki RobozRS-5650
Vannas 3" ZakrzywioneRobozRS-5621
Szpilki do owadów, 0Narzędzia do nauki pięknej/884060426000-35 
Szpilki do owadów, 0, SSNarzędzia do nauki26001-35
Szpilki do owadów, 00Narzędzia do nauki o26000-30
Szpilki do owadów, 00, SSNarzędzia do nauki26001-30
Szpilki do owadów, 000Narzędzia do
SSNarzędzia do nauki o26001-25
Minutien szpilki, 0,10 mmFine Science Tools26002-10
Szpilki Minien, 0,15 mmFine Science Tools26002-15
Szpilki Minimien, 0,2 mmFine Science Tools26002-20
Fisher Tissue prep Parafin fisherT56-5
Grafitowy rybak G67-500
Tworzywo sztuczne Delrin Grainger3HMT2
18 Gauge Igła podskórnaBD305195
o owadach owadach o owadach nauki o owadach, 000, owadach

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
  2. Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6(2000).
  3. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
  4. Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
  5. Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
  6. Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
  7. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
  8. Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
  9. Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113(2000).
  10. Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071(2015).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  12. Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
  13. Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
  14. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
  15. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
  16. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
  17. Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
  18. Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
  19. Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
  20. Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
  21. Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
  22. Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
  23. Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
  24. Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
  25. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
  26. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zesp PreB tzingerarytm inspiracyjnypreparat skrawkowyrejestracje elektrofizjologicznelaminektomia brzusznaizolacja korzeni nerwowychtechnika dysekcjiaktywno rytmiczna

Powiązane artykuły