Artykuł metodologiczny

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58871

⸱

11 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit

.

Streszczenie

Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) stanowi najpoważniejsze powikłanie, z jakim borykają się pacjenci przechodzący wcześniej allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (allo-HCT) i często wiąże się ze słabym wynikiem klinicznym. Chociaż, na przykład, objawy GvHD na skórze zwykle reagują na uznane terapie immunosupresyjne i dlatego nie mają śmiertelnego przebiegu, obecność i intensywność jelitowej GvHD, zwłaszcza środkowej i dolnej części jelita, silnie wpływają na wynik i całkowite przeżycie pacjentów z ostrą GvHD. Opcje terapeutyczne są zasadniczo ograniczone do klasycznych środków immunosupresyjnych, które dają jedynie umiarkowane efekty łagodzące przebieg. W związku z tym pilnie potrzebna jest szczegółowa wiedza na temat kaskady immunologicznej rezydującej w tkankach, zmian w mikrobiocie jelitowej oraz odpowiedzi zrębu przed, w trakcie i po wystąpieniu jelitowej GvHD, aby zrozumieć zdarzenia i mechanizmy leżące u podstaw jej patogenezy oraz opracować innowacyjne opcje terapeutyczne. Mysie modele GvHD są często wykorzystywane do identyfikacji i funkcjonalnej oceny cząsteczek i szlaków przypuszczalnie napędzających jelitową GvHD. Jednak zasadniczo brakuje środków do specyficznego monitorowania i oceny stanu zapalnego jelit w czasie, ponieważ ustalone wyniki do oceny i oceny ostrej GvHD rutynowo składają się z różnych parametrów, które raczej odzwierciedlają ogólnoustrojowe objawy GvHD. Szczegółowa ocena jelitowej GvHD została ograniczona do badań z wykorzystaniem myszy poddanych eutanazji, co zasadniczo wyklucza analizy podłużne (tj. kinetyczne) przedziału okrężnicy w danych warunkach eksperymentalnych (np. Blokada cytokiny prozapalnej za pośrednictwem przeciwciał) u żywych myszy (tj. in vivo). Opisana tutaj mini-endoskopowa ocena in situ dystalnej części jelita grubego u myszy leczonych allo-HCT pozwala a) na szczegółową makroskopową ocenę różnych aspektów zapalenia jelit oraz b) możliwość pobierania próbek tkanek do dalszych analiz w różnych punktach czasowych w trakcie okresu obserwacji. Ogólnie rzecz biorąc, podejście miniendoskopowe stanowi istotny postęp w przedklinicznym nieinwazyjnym monitorowaniu i ocenie jelitowej GvHD.

Wprowadzenie

Nowotwory układu krwiotwórczego bezpośrednio wynikające z przedziału krwiotwórczych komórek macierzystych oraz niekontrolowane, szybko postępujące i ciężkie zaburzenia o podłożu immunologicznym są często wskazaniami do przeprowadzenia allo-HCT1,2. Jednakże, chociaż uwzględnia się występowanie korzystnej prognostowo odpowiedzi przeszczep przeciwko nowotworowi, limfocyty dawcy często indukują i promują niepożądany atak za pośrednictwem układu immunologicznego zdrowych składników tkankowych w biorcy allo-HCT, proces ten nazywa się chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi3. Objawy w jelitach, tak zwane jelitowe GvHD, stanowią najbardziej przerażające powikłanie ostrej GvHD, której ciężkie formy są rutynowo związane z wysoką śmiertelnością1,2,4.

Ogólnie rzecz biorąc, mysie modele allo-HCT okazały się nieocenionymi narzędziami do identyfikacji i badania mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw patogenezy GvHD5. Jednak kinetyczna ocena, na przykład, korzystnych efektów nowych interwencji terapeutycznych w czasie u żywych myszy jest rutynowo oparta na określeniu klinicznych wyników GvHD6. Podczas gdy wyniki te są odpowiednie do odzwierciedlenia, na przykład, ogólnego obciążenia chorobą (tj. ogólnoustrojowej GvHD), wyniki kliniczne nie są wystarczająco czułe, aby wiarygodnie odzwierciedlić objawy specyficzne dla narządu (np. w jelitach). W związku z tym wnioski, na przykład w odniesieniu do działania ochronnego jelit danej interwencji terapeutycznej, które opierają się na tych systemach punktacji, zwykle są niewystarczające.

Pomimo znacznych postępów dzięki wynalazkowi nowatorskich metod obrazowania całego ciała w połączeniu z użyciem bioluminescencyjnych lub fluorescencyjnych genetycznych modeli myszy myszy7,8, brakuje metodologii do bezpośredniej i szczegółowej oceny jelitowej manifestacji GvHD u żywych myszy. W związku z tym uzasadnieniem protokołu endoskopowej oceny fenotypu jelitowego GvHD opisanego w następnym rozdziale jest pokonanie tej przeszkody. Co więcej, motywacją jest również zmniejszenie liczby myszy eksperymentalnych, ponieważ, jak dotąd, szczegółowa ocena cech komórkowych, morfologicznych i molekularnych (np. za pomocą histopatologii lub biologii molekularnej) objawów jelitowej GvHD ostatecznie wymagała poświęcenia myszy eksperymentalnej.

Nasza instytucja wcześniej informowała o metodologii mini-endoskopowej oceny objawów okrężnicy w trakcie modeli syngenicznego zapalenia jelita grubego9. W przedstawionym tutaj protokole udoskonaliliśmy i dostosowaliśmy kolonoskopową matrycę punktacji dla zapalenia jelita grubego wywołanego alloodpowiedzią u żywych myszy z jelitowym GvHD po przeszczepieniu alloreaktywnych HCT i limfocytów dawcy w całkowicie niedopasowanym MHC klasy I. Zidentyfikowaliśmy cztery parametry odpowiednie do odzwierciedlenia zmian w jelitach grubych związanych z GvHD. Co więcej, opracowaliśmy system, który pozwala na precyzyjną ocenę dowolnego pojedynczego wyznacznika, co skutkuje nowym wynikiem, który łatwo informuje czytelnika o nasileniu jelitowego GvHD obecnego u danej myszy w danym punkcie czasowym. Analizy histopatologiczne potwierdziły, że wynik endoskopowy powyżej pewnego progu wiarygodnie przewiduje stan zapalny tkanek o umiarkowanym lub wysokim stopniu nasilenia. W związku z tym mini-endoskopowa ocena wydaje się stanowić działający substytut złotego standardu histopatologii, który rutynowo wymaga poświęcenia myszy eksperymentalnych. Co ważne, protokół ten może być stosowany praktycznie w dowolnym momencie i może być wielokrotnie stosowany w przebiegu choroby10,11. Ponadto, w przeciwieństwie do stosowania podejść zależnych od bioluminescencji, nie są wymagane żadne pracochłonne i czasochłonne środki, takie jak krzyżowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy, a zatem metodologia może być stosowana na praktycznie każdej linii myszy.

Podsumowując, biorąc pod uwagę szkodliwą perspektywę kliniczną pacjentów allo-HCT z ciężką GvHD jelitową, pilnie potrzebny jest szybki postęp naukowy i więcej wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogenezy immunologicznej. Podobnie, ważne względy etyczne wymagają, aby zdobywanie wiedzy odbywało się przy użyciu minimalnej liczby myszy doświadczalnych. W związku z tym, oba uznane twierdzenia w społeczności badawczej badającej jelitową GvHD mogą być rozwijane poprzez implementację seryjnych mini-endoskopowych ocen jelita grubego w eksperymentalnym łańcuchu roboczym w celu monitorowania i oceny jelitowej GvHD w żywych eksperymentalnych modelach mysich, zgodnie z opisem i walidacją w przedstawionym tutaj protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj metody eksperymentalne zostały zatwierdzone przez rząd Mittelfranken, Bawaria, Niemcy.

1. Indukcja GvHD

  1. Dzień 0: Napromienianie całego ciała myszy biorcy
    1. Jako biorców należy użyć samic myszy CD45.2+ H2kd+ BALB/c, które mają co najmniej 10 tygodni.
    2. Zważ i zapisz wagę myszy biorcy przed indukcją GvHD.
      nuta: Upewnij się, że odbiorca ma minimalną masę ciała wynoszącą 20 g. Wyjściowa masa ciała posłuży jako wartość referencyjna do obliczenia utraty masy ciała przez pojedynczą mysz w trakcie indukcji i progresji GvHD.
    3. Umieść do pięciu myszy w pojemniku promiennika rentgenowskiego.
    4. Napromienić myszy przez napromieniowanie całego ciała pojedynczą dawką 8 Gy promieniowania rentgenowskiego. Użyj Cs137 jako źródła promieniowania.
  2. Dzień 1: Rekonstytucja napromienianych myszy ze szpikiem kostnym zubożonym w limfocyty T
    nuta: Przeszczepienie allogenicznych komórek szpiku kostnego, zgodnie z opisem i szczegółami w punkcie 1.2, powinno odbyć się w ciągu 24 godzin po napromienianiu. Wykonaj opisane poniżej procedury w sterylnym kapturze do hodowli tkanek i użyj przefiltrowanych odczynników. Użyj allogenicznego CD45.1/Ly5.1 B6. Myszy SJL-Ptprca Pepcb / BoyCrl jako dawcy szpiku kostnego zubożonego w limfocyty T.
    1. Eutanazja CD45.1/Ly5.1 B6. Myszy SJL, które oddadzą allogeniczne komórki szpiku kostnego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, 12-24 godziny po napromieniowaniu myszy biorcy BALB/c. W tym celu znieczulij CD45.1/Ly5.1 B6. Myszy SJL przez inhalację 5% izofluranu. Kontynuuj ekspozycję na izofluran przez 1 minutę po zatrzymaniu oddechu i potwierdź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Dokładnie zdezynfekuj sierść i skórę myszy 70% etanolem.
    3. Umieść mysz na czystej osłonie roboczej, tak aby mysz znajdowała się w pozycji leżącej, z tylnymi kończynami skierowanymi w stronę eksperymentatora. Podnieś futro na pięcie Achillesa za pomocą końcówki kleszczy Semken o długości 13 cm i ząbkowanych zakrzywionych końcówkach. Naciąć skórę między kleszczami a piętą utwardzonymi cienkimi nożyczkami o długości 8,5 cm z prostymi końcówkami.
    4. Wydłuż nacięcie czaszkowo (tj. od pięty przez dolną część nogi i udo do okolicy bioder). Usuń skórę i sierść z tylnej kończyny za pomocą kleszczy.
    5. Wykonaj tę samą procedurę na drugiej tylnej kończynie.
    6. Usuń tylne kończyny, przecinając sąsiednie stawy biodrowe.
    7. Odetnij tylne łapy. Przeciąć staw kolanowy. Udo i trzon każdej kończyny tylnej przechowywać razem na szalce Petriego o średnicy 92 mm wypełnionej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.
    8. Dokładnie oczyść kości udowe i piszczelowe, usuwając jak najwięcej tkanki mięśniowej z każdego uda i podudzia. Przenieś kości udowe i piszczelowe do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej sterylnym podłożem RPMI 1640 i umieść ją na mokrym lodzie, aż wszystkie kości piszczelowe i udowe zebrane w kroku 1.2.7 zostaną oczyszczone z tkanki mięśniowej.
    9. Aby wyizolować szpik kostny, należy przenieść jedną kość udową lub piszczelową na raz (która została oczyszczona w sposób opisany w kroku 1.2.8) z probówki o pojemności 50 ml na szalkę Petriego (o średnicy 92 mm) wypełnioną pożywką RPMI 1640. Odetnij końce kości udowej lub piszczelowej skalpelem, aby uzyskać dostęp do jamy kości zawierającej szpik kostny.
    10. Przygotować probówkę zbiorczą o pojemności 50 ml z 5 ml pożywki RPMI 1640. Wprowadzić igłę 26 G dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 1 ml pożywki RPMI 1640 do jamy kostnej i wypłukać szpik kostny z jamy do probówki zbiorczej, naciskając tłok.
    11. Powtarzaj krok 1.2.10, aż kość stanie się jasna i błyszcząca (tj. jama kostna będzie widocznie pozbawiona czerwonawego szpiku kostnego). Wyrzuć pustą kość.
    12. Powtórz kroki 1.2.9 - 1.2.11, używając wszystkich kości udowych i piszczelowych z kroku 1.2.8 i zbierz wszystkie odzyskane kawałki szpiku kostnego do tej samej probówki o pojemności 50 ml z kroku 1.2.10. Probówkę do pobierania próbek należy przechowywać na mokrym lodzie do czasu, aż wszystkie kości z kroku 1.2.8 zostaną odpowiednio przetworzone.
    13. Zawiesinę jednokomórkową należy stworzyć, delikatnie pipetując przepłukane, kruche kawałki szpiku kostnego w górę i w dół. Przefiltrować zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego przez siatkowy sitko o wielkości 40 μm umieszczone na nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml.
    14. Odwirować probówkę zbiorczą o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    15. Zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego ACK (1 mM Na2EDTA; 10 mM KHCO3; 144 mM NH4Cl; pH 7,2) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować zawiesinę komórkową przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie natychmiast dodaj 10 ml roztworu PBS do zawiesiny komórek.
    16. Odwirować zawiesinę o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml roztworu PBS.
    17. Policz komórki szpiku kostnego za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 6 x 106 komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości komórek po oczyszczeniu komórek (patrz krok 1.2.20).
    18. W celu zmniejszenia ilości limfocytów T w zawiesinie jednokomórkowej szpiku kostnego należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek. Magnetycznie zubożyć komórki CD90.2+ (tj. limfocyty) z całkowitej liczby komórek szpiku kostnego, postępując zgodnie z protokołem producenta.
    19. Policz komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T, które zostały wyizolowane zgodnie z opisem w kroku 1.2.18, za pomocą hemocytometru. Zachowaj podwielokrotność 1 x 106 komórek do analizy cytometrii przepływowej, która ma być przeprowadzona później, jak opisano w kroku 1.2.20.
      nuta: Średnia wydajność komórek pochodzących od jednej myszy dawcy wynosi zwykle od 2 x 10 7 do 3,4 x 107 komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T.
    20. Potwierdź pomyślne wyczerpanie limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Zabarwić 1 x 106 komórek, zakonserwowanych z etapów 1.2.17 (komórki szpiku kostnego przed magnetycznym oddzieleniem komórek) i 1.2.19 (komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T po magnetycznym oddzieleniu komórek), następującymi przeciwciałami: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) i α-CD8α (53-6,7). Użyj pozostałych komórek z kroku 1.2.17 jako niebarwionej kontroli i do kontroli pojedynczego barwienia, aby skonfigurować cytometr przepływowy.
      1. Przenieść 1 x 106 komórek z każdej próbki do dołka na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V, aby przeprowadzić procedurę barwienia metodą cytometrii przepływowej.
      2. Odwirować komórki w 96-dołkowej płytce (etap 1.2.20.1) w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS (PBS uzupełniony 3% przefiltrowaną surowicą bydlęcą).
      3. Odwirować komórki znajdujące się na 96-dołkowej płytce przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      4. Dodać odpowiednią ilość wybranego przeciwciała (porównać z krokiem 1.2.20) do próbek do pojedynczego barwienia w 100 μl buforu FACS.
      5. Przygotować mieszaninę wszystkich przeciwciał (mieszanina wzorcowa) zawierającą odpowiednie ilości wystarczające do oddzielnego wybarwienia podwielokrotności komórek szpiku kostnego zachowanych po wcześniejszym (patrz etap 1.2.17) i po (patrz etap 1.2.19) wyczerpaniu magnetycznych limfocytów T. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do obu podwielokrotności.
      6. Do niebarwionej próbki dodać tylko 100 μl buforu FACS.
      7. Inkubować komórki na 96-dołkowej płytce przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
      8. Dodać 100 μl buforu FACS i odwirować komórki znajdujące się na 96-dołkowej płytce o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS.
      9. Odwirować komórki przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS.
      10. Przenieść próbki do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml i przeanalizować je za pomocą cytometru przepływowego, który jest w stanie wykryć cząsteczki fluorescencyjne, które zostały użyte do znakowania przeciwciał użytych do scharakteryzowania próbek komórek (patrz krok 1.2.20).
      11. Porównaj skład komórek przed i po magnetycznym rozdzieleniu komórek.
        nuta: Zwykle uzyskuje się czystość około 95% komórek CD45.1 + CD3- (tj. szpiku kostnego zubożonego w limfocyty T) w żywej bramie.
    21. Przemyć zawiesiny komórek szpiku kostnego zubożone w limfocyty T 2x roztworem PBS (450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), a na koniec ponownie zawiesić komórki w roztworze PBS, dostosowując stężenie komórek do 5 x 10 7 komórek/ml. Komórki należy trzymać na mokrym lodzie do czasu wstrzyknięcia.
    22. Należy wstrzyknąć komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T myszom biorcom, które zostały napromienione dzień wcześniej (patrz punkt 1.1).
      1. Umieść eksperymentalną mysz w szczelnej komorze i wywołaj znieczulenie poprzez wdychanie do 4% izofluranu, aż mysz straci przytomność. Potwierdź analgezję i utratę przytomności, testując utratę odruchu prostowania i późniejszą utratę odruchu wycofania pedału.
      2. Wstrzyknąć 5 x 106 komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T (tj. 100 μl z 5x107 komórek/ml) zawierających roztwór PBS za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G dożylnie do przestrzeni zagałkowej zawierającej zatokę żylną.
  3. Dzień 2: Transfer limfocytów T<br /> nuta: Wykonaj opisane poniżej procedury w sterylnym kapturze do hodowli tkanek i użyj przefiltrowanych odczynników. Użyj CD45.2 C57Bl/6 (typ dziki; WT) myszy jako dawcy alloreaktywnych limfocytów T. Zastosowanie systemów markerów kongenicznych pozwala na rozróżnienie typów komórek krwiotwórczych biorcy (myszy CD45.2+ H2kd+ Balb/c) i dawcy (komórki szpiku kostnego: CD45.1+ H2kb+ B6). myszy SJL; allogeniczne limfocyty T: myszy CD45.2 + H2kb + C57 / Bl6).
    1. Poddaj eutanazji myszy C57Bl/6 zgodnie z obowiązującymi wytycznymi i władzami instytucjonalnymi. Dlatego myszy należy znieczulać przez inhalację o stężeniu 5% izofluranu. Kontynuuj ekspozycję na izofluran do 1 minuty po zatrzymaniu oddechu i potwierdź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Dokładnie zdezynfekuj sierść i skórę myszy 70% etanolem.
    2. Umieść sitko z sitkiem o oczkach 40 μm na probówce zbiorczej o pojemności 50 ml. Usuń śledzionę i umieść ją na sitku.
    3. Za pomocą tłoka strzykawki rozdrobnić śledzionę w sitku. Umyć sitko i tłok strzykawki PBS, aby zebrać wszystkie splenocyty.
    4. Odwirować komórki w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
    5. Ponownie zawiesić splenocyty w 3 ml buforu lizującego ACK w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować zawiesinę komórkową przez 3 minuty. Następnie dodać 10 ml PBS i odwirować komórki przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić splenocyty w PBS.
    6. Policz komórki śledziony za pomocą hemocytometru. Przekierować podwielokrotność 6 x 106 komórek do analizy cytometrii przepływowej, aby ocenić wielkość oczyszczania w kroku 1.3.9.
    7. Aby uzyskać całkowitą izolację limfocytów T CD3 + z całkowitej liczby splenocytów, użyj dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek. Wyizolować limfocyty T śledziony, postępując zgodnie z protokołem producenta.
    8. Policz limfocyty T CD3 + śledziony wyizolowane zgodnie z opisem w kroku 1.3.7 za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 1 x 106 limfocytów T do analizy cytometrii przepływowej.
      nuta: Średnia wydajność limfocytów T śledziony na mysz dawcę wyizolowaną przez magnetyczną separację komórek waha się od 1,3 x 107 do 2 x 107 komórek.
    9. Potwierdź powodzenie izolacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Aby uzyskać szczegółowy opis protokołu barwienia, zapoznaj się z krokami 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Wybarwić 1 x 106 splenocytów w krokach 1.3.6 (przed magnetycznym oddzieleniem komórek) i 1.3.8 (po magnetycznym oddzieleniu komórek) następującymi przeciwciałami: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) i α-CD8α (53-6,7).
      2. Pozostałe komórki z kroku 1.3.6 należy wykorzystać jako niebarwioną kontrolę i do pojedynczego barwienia odpowiednimi przeciwciałami, aby ustawić cytometr przepływowy.
      3. Porównaj skład komórek przed i po magnetycznym oddzieleniu komórek.
        nuta: Należy osiągnąć czystość ≥95% limfocytów T CD45.2 + CD3 + w żywej bramie limfocytów.
    10. Przemyć limfocyty T 2x PBS (450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i na koniec ponownie zawiesić komórki w roztworze PBS, dostosowując stężenie komórek do 7 x 106 komórek/ml. Komórki należy przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
    11. Wstrzyknąć alloreaktywne limfocyty T śledziony (patrz krok 1.3.10) napromieniowanym myszom BALB/c, które wcześniej otrzymały komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T CD45.1 + (patrz krok 1.2.22).
      1. Wywołaj znieczulenie, umieszczając eksperymentalną mysz w szczelnej komorze, w której jest ona narażona na działanie do 4% izofluranu, aż straci przytomność. Potwierdź analgezję i utratę przytomności, testując utratę odruchu prostowania i późniejszą utratę odruchu wycofania pedału.
      2. Wstrzyknąć 0,7 x 106 alloreaktywnych limfocytów T CD3+ za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G (tj. 100 μl z 7 x 106 komórek/ml) zawierającą roztwór PBS (patrz krok 1.3.10), dożylnie do przestrzeni zagałkowej myszy, w celu wywołania GvHD. Oznacz te myszy jako grupę eksperymentalną.
      3. Wstrzyknij innej grupie myszy 100 μl samego PBS dożylnie do przestrzeni zagałkowej i oznacz tę grupę jako grupę kontrolną, zwaną następnie "myszami bez przeszczepu komórek T (noT)".

2. Ocena ogólnoustrojowej GvHD

UWAGA: Wykonaj tę procedurę w półsterylnym otoczeniu w pomieszczeniu eksperymentalnym licencjonowanym i wyposażonym do obsługi żywych myszy w obiekcie dla zwierząt.

  1. Śledź przebieg kliniczny GvHD u poszczególnych myszy, a w szczególności oceniaj i oceniaj myszy eksperymentalne 3 razy w tygodniu pod kątem obecności klinicznych objawów GvHD, w oparciu o system punktacji opisany poniżej i zaadaptowany z systemu punktacji ustalonego wcześniej przez Cooka i wsp.6.
    1. Zważ każdą mysz indywidualnie, zapisz wagę i oblicz określony ubytek masy ciała w odniesieniu do masy ciała, która została określona przed rozpoczęciem eksperymentu (odpowiadająca 100%) w dniu 0 (krok 1.1.2). Uzyskaj utratę masy ciała o mniej niż 10% masy początkowej ze stopniem 0, utratę masy ciała od 10% do 25% ze stopniem 1 i utratę masy ciała o więcej niż 25% ze stopniem 3.
    2. Oceń poziom aktywności każdej myszy, odróżniając myszy o normalnym poziomie aktywności (wynik = 0) od myszy o umiarkowanie obniżonym poziomie aktywności (wynik = 1) i myszy o zachowaniu stacjonarnym, chyba że są stymulowane zewnętrznie (wynik = 2).
    3. Oceń teksturę futra, odróżniając w ten sposób normalne, lśniące i zadbane futro (wynik = 0) od umiarkowanie potarganego futra (wynik = 1) i obecność łysych plam (wynik = 2).
    4. Oceń teksturę skóry, odróżniając normalną skórę (wynik = 0) od sporadycznych plam łuszczącej się skóry (np. na ogonie i łapach) (wynik = 1) oraz widocznych łuszczenia się i obolałych obszarów skóry (wynik = 2).
    5. Przeanalizuj konsystencję wydzielanych frakcji stolca. Stolec o normalnej (tj. twardej konsystencji) należy ocenić jako stolec 0, stolec z odkształcalnym i miękkim stolcem o stopniu 1 oraz stolec o stałej konsystencji, a co za tym idzie z ciężką biegunką o stopniu 2.
    6. Zsumuj wszystkie oddzielnie oceniane parametry, aby uzyskać maksymalny wynik kliniczny 12 na mysz.
  2. Rozważ i oceń kryteria zaprzestania eksperymentu ze względu na obecny poziom nasilenia choroby u danej myszy, zgodnie z obowiązującymi wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzonym protokołem zwierzęcym.

3. Ocena jelitowej GvHD

  1. Ocena zmian związanych z GvHD za pomocą miniendoskopii dystalnego odcinka jelita grubego
    nuta: Wykonaj to w półsterylnym otoczeniu w pomieszczeniu eksperymentalnym licencjonowanym i wyposażonym do pracy z żywymi myszami w obiekcie dla zwierząt. Użyj mini-endoskopowej stacji roboczej, która jest dopuszczona do użytku z małymi zwierzętami.
    1. Przygotuj aparat endoskopowy, przykrywając teleskop (o średnicy 1,9 mm i długości 10 cm) osłoną do badania endoskopowego. Wyczyść i wysterylizuj endoskop wodą i etanolem.
    2. Włącz komputer, regulowane ksenonowe źródło światła i moduł kamery i ustaw ostrość w taki sposób, aby obiekty znajdujące się blisko obiektywu dawały wyraźny obraz.
    3. Podłącz pompę powietrza do osłony endoskopowej. Aby zobrazować strumień powietrza, zanurz końcówkę endoskopu w szklance ze zlewką wypełnioną wodą. Wyreguluj strumień powietrza, regulując zawór między pompą powietrza a osłoną endoskopową. Dostosuj go do powolnego, stałego strumienia powietrza, odbitego przez kilka stale wznoszących się pęcherzyków.
    4. Umieść mysz w szczelnej komorze. Wywołać znieczulenie przez wdychanie do 4% izofluranu, aż mysz straci przytomność. Potwierdź analgezję i brak stanu odruchów, testując utratę odruchu prostowania i późniejszą utratę odruchu wycofania pedału.
    5. Używaj odpowiedniego weterynaryjnego urządzenia do znieczulenia zgodnie z zastosowanym protokołem dla zwierząt. Przenieś mysz z komory do przestrzeni roboczej kolonoskopii. Tutaj umieść znieczuloną mysz, z nosem w stożku nosowym (który jest połączony z instrumentem anestezjologicznym), na czystej osłonie roboczej, tak aby mysz znajdowała się w pozycji leżącej, zwrócona tylnymi kończynami w stronę eksperymentatora.
    6. Aby utrzymać znieczulenie podczas zabiegu kolonoskopii, należy zmniejszyć stężenie izofluranu do około 2%. Monitoruj oddech myszy i reakcję na stymulację podczas kolonoskopii i w razie potrzeby dostosuj stężenie izofluranu w waporyzatorze. Przykryj oczy myszy maścią, aby zapobiec ich wysuszeniu.
    7. Kontroluj skuteczność znieczulenia, ściskając między palcami myszy. W przypadku braku reaktywności należy przejść do kroku 3.1.8.
    8. Jedną ręką podnieś ogon tuż nad korzeniem ogona i ostrożnie włóż endoskop, umieszczony w drugiej ręce, przez odbyt do odbytnicy.
    9. Podczas gdy strumień powietrza napełnia światło jelita grubego, powoli i ostrożnie przesuwaj endoskop do przodu w kierunku aboralnym.
    10. Umieść endoskop na środku światła okrężnicy i utrzymuj tę pozycję, aby zminimalizować kontakt ze ścianą okrężnicy i uniknąć zadrapań, głębszych urazów związanych ze ścianą (np. skutkujących krwawieniem), a nawet perforacji ściany (patrz krok 3.1.17). Kontroluj ten krok, stale obserwując strumień wideo (tj. pod ciągłą wizualizacją przedziału okrężnicy).
    11. Jeśli kał zasłania widok, wyjmij endoskop i wykonaj lewatywę, przepłukując doodbytniczo do 2 ml soli fizjologicznej za pomocą miękkiej pipety Pasteura. Używaj jak najmniejszej ilości płynu, aby zapobiec niezamierzonemu rozcieńczeniu kału i innym skutkom ubocznym negatywnie wpływającym na charakterystykę powierzchni błony śluzowej i ostatecznie na wyniki punktacji.
    12. Staraj się regularnie umieszczać endoskop w określonym (tj. wyraźnym) miejscu anatomicznym w dystalnej części okrężnicy, aby ustandaryzować punktację zapalenia okrężnicy i zoptymalizować porównywalność wyników punktacji między myszami i między eksperymentami.
      nuta: Zwykle w przypadku sztywnego endoskopu można osiągnąć maksymalną głębokość 4 cm drogą doodbytniczą. Między 2 a 4 cm bez przerwy okrężnica regularnie zamienia się w zgięcie, którego nie można przekroczyć za pomocą sztywnego kolonoskopu. Użyj obszaru okrężnicy dystalnie przylegającego do zgięcia jako domyślnego miejsca punktacji.
    13. Rozpocznij nagrywanie strumienia wideo i zacznij od oceny stanu zapalnego.
    14. Oceń stan zapalny jelita grubego związany z GvHD, oceniając parametry wyjaśnione i przedstawione w Tabeli 1 i Rysunek 3.
      1. Delikatnie i lekko przesuń endoskop w miejsce nacinania do tyłu i do przodu, aby ocenić różne parametry.
      2. Oceń parametr "przezierność", a także "konsystencję stolca", ustawiając endoskop w większej odległości w stosunku do ściany okrężnicy.
      3. Oceń parametry "ziarnistości" i "unaczynienia", umieszczając endoskop w bliskiej odległości od ściany okrężnicy. W tym celu ostrożnie przyłóż dobrze dozowane napięcie do ściany okrężnicy za pomocą końcówki endoskopu.
    15. Po zakończeniu procesu oceniania zatrzymaj nagrywanie.
      nuta: Następnie nagrany klip wideo może być wykorzystany w całości lub wykorzystany do wygenerowania reprezentatywnych obrazów (tj. zrzutów ekranu) mini-endoskopowo ocenianych kryteriów, które ogólnie przyczyniają się do zapalenia okrężnicy.
    16. Ostrożnie wyjmij endoskop.
    17. Należy przerwać ekspozycję na izofluran, przenosząc mysz do oddzielnej klatki, w której jest ona wystawiona na działanie powietrza otoczenia. Ogrzej mysz lampą światła czerwonego i obserwuj mysz, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu i odzyska pełną przytomność.
      nuta: Ze względu na nadmuchiwanie powietrza przez okrężnicę podczas endoskopii, obszar brzucha myszy może wydawać się nadęty bezpośrednio po tym. Chociaż jest to normalne i ma charakter przejściowy, przedłużające się oznaki masywnego, a nawet postępującego naprężenia brzucha i niepowodzenie w powrocie do zdrowia myszy mogą wskazywać na niezamierzoną perforację okrężnicy (w takim przypadku mysz musi zostać natychmiast poddana eutanazji).
    18. Po całkowitym wyzdrowieniu umieść mysz z powrotem w odpowiedniej klatce.
    19. Podejście opcjonalne: Możliwe jest również wykonanie biopsji tkanek pod kontrolą wzroku. Wykonaj następujące czynności.
      nuta: Kolonoskopia zostanie wykonana w taki sam sposób, jak opisano w krokach 3.1.1 - 3.1.18, z następującymi modyfikacjami.
      1. W kroku 3.1.1 do zakrycia teleskopu należy użyć osłony do badania endoskopowego z wbudowanym kanałem roboczym, zamiast prostej osłony do badania bez kanałów roboczych. Wprowadź kleszczyki do biopsji do kanału roboczego, aż ich końcówka będzie widoczna przed endoskopem na ekranie wideo, ponieważ w dużej mierze zapobiega to niezamierzonemu uszkodzeniu jelita.
      2. Wykonaj kroki 3.1.2 - 3.1.11. Włóż endoskop do jelita grubego i ostrożnie popchnij go do przodu do interesującego Cię miejsca.
      3. Skorzystaj z pomocy drugiego eksperymentatora do wykonania biopsji tkanki okrężnicy. Poproś drugiego eksperymentatora, aby przesunął czubek kleszczyków do biopsji do wybranego obszaru okrężnicy, powoli popychając kleszcze w kanale roboczym do przodu, aż szczęki kleszczy będą mogły zostać otwarte. Podczas tej procedury należy stale oglądać strumień wideo, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia ściany okrężnicy.
      4. Odzyskaj próbkę tkanki ściany okrężnicy, ostrożnie otwierając i zamykając szczęki kleszczyków do biopsji.
        nuta: Rób to ostrożnie, aby zapobiec perforacji ściany okrężnicy. W rzadkim przypadku perforacji okrężnicy należy natychmiast poświęcić dotkniętą chorobą mysz, stosując pomiary zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i przy ciągłym podawaniu środków znieczulających.
      5. Odciągnij i wyjmij zamknięte kleszcze z kanału roboczego. Wyjmij próbkę ze szczęk kleszczyków do biopsji, zanurzając i ostrożnie potrząsając otwartymi kleszczami w sterylnym roztworze PBS. Następnie należy wybrać odpowiednie warunki przechowywania próbki tkanki, zgodnie z zaplanowanymi dalszymi analizami. Po dezynfekcji 70% etanolem kleszcze mogą być ponownie wykorzystane do wykonania dalszych biopsji.
      6. Po wykonaniu biopsji należy zdjąć endoskop i zakończyć kolonoskopię zgodnie z opisem w krokach 3.1.16 - 3.1.18.
  2. Analiza histopatologiczna
    1. Między 26 a 30 dniem po napromienianiu rentgenowskim należy poddać eutanazji myszy biorcy allo-HCT zgodnie z obowiązującymi wytycznymi i władzami instytucjonalnymi. W tym celu znieczulij myszy przez inhalację 5% izofluranu. Kontynuuj ekspozycję na izofluran przez 1 minutę po zatrzymaniu oddechu i potwierdź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Dokładnie zdezynfekuj sierść i skórę myszy 70% etanolem.
    2. Otwórz jamę brzuszną i usuń okrężnicę. Przenieść go na szalkę Petriego (o średnicy 92 mm) z PBS.
    3. Napełnij końcówkę dozownika o pojemności 5 ml PBS. Za pomocą kleszczyków Semken o długości 13 cm i ząbkowanych zakrzywionych końcówkach nasuń dystalną część jelita grubego (około 5 mm) na końcówkę końcówki dozownika. Ostrożnie przymocuj okrężnicę kleszkami do końcówki dozownika i przepłucz okrężnicę PBS, naciskając tłok końcówki dozownika, aby usunąć kał z jelita.
    4. Wytnij segment okrężnicy znajdujący się około 5 mm od odbytu za pomocą skalpela.
    5. Utrwal wyciętą próbkę jelita w 4,5% formaldehydzie przez noc. Przed zatopieniem w parafinie należy ułożyć tkankę w pozycji pionowej.
    6. Wyciąć 3 μm przekroje tkanki okrężnicy zatopionej w parafinie i wybarwić je hematoksyliną i eozyną (HE), stosując standardowe protokoły barwienia.
    7. Przygotować wybarwione HE przekroje poprzeczne próbek tkanki jelita grubego.
    8. Na podstawie macierzy punktacji zgłoszonej przez Kaplana i wsp.12, histopatologicznie oceniaj aktywność zapalną półilościowo, z wynikami od 0-3: brak stanu zapalnego (wynik = 0), łagodne zapalenie (wynik = 1), umiarkowane zapalenie (wynik = 2) i ciężkie zapalenie (wynik = 3).
      nuta: Najlepiej wykorzystać do tego zadania wiedzę patologa, który ma doświadczenie w ocenie GvHD w jesim jelicie jelitowym i jest ślepy na naturę grupy eksperymentalnej i kontrolnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół, opisujący miniendoskopową ocenę zmian w końcowym odcinku okrężnicy związanych z GvHD jelit, został opracowany i zwalidowany u myszy poddanych uprzednio systemowej indukcji ciężkiego modelu ostrej GvHD. W tej badaniu zastosowano model z pełnym niedopasowaniem MHC klasy I, w którym myszy BALB/c poddano irradiation śmiertelnej, po czym wykonano transplantację allogenicznego szpiku kostnego pozbawionego limfocytów T oraz podano alloreaktywne limfocyty T CD3+ z m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole opisano metodykę indukcji i miniendoskopowej oceny fenotypu jelita grubego obserwowanego w przebiegu jelitowej GvHD. Służy to szerszemu celowi, jakim jest umożliwienie naukowcom badania jelitowego GvHD podłużnie i nieinwazyjnie przez cały przebieg choroby (tj. od początku manifestacji i progresji okrężnicy do maksymalnej aktywności choroby).

Istnieją jednak pewne krytyczne kroki i ważne ograniczenia nieodłącznie związane z prezentowanymi metodologiami, których eksperymentator musi ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Collaborative Research Centers (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; project B03) (do K.H.) i CRC 1181 (CRC-DFG, project B05) (do K.H.), oba finansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BIOBEAM 2000 Gamma IrradiatorGamma-Service Meical GmbH
Solanka buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich Co., LLC.D8662-6x500ML
Kleszcze Semken (długość: 13 cm; ząbkowane, zakrzywione końcówki)Fine Science Tools11009-13
Hartowane drobne nożyczki (długość: 8,5 cm; proste końcówki; krawędź tnąca: 24 mm)Fine Science Tools14090-09
RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich Co. LLC.Przekaźnik R8758-500ML 
Igła podskórna (26 G)B. Braun Melsungen AG4657683
strzykawka 1 mlB. Braun Melsungen AG9166017V
50 ml probówkaSarstedt Ag & Co.KG62,547,254
Sitko do komórek z 40 &mikro; m siatka kratowaBD Falcon352340
Chlorek amonu (NH4Cl)Sigma-Aldrich Co., LLC.11209składnik buforu lizującego ACK
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (Na2EDTA)Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2składnik buforu lizującego ACK
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Merck KGaA1,048,540,500składnik buforu lizującego ACK
CD90.2 MicroBeads, myszMiltenyi Biotec GmbH130-049-101separacja komórek magnetycznych w celu wyizolowania komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T
Zestaw do izolacji komórek Pan T Cell Isolation II, myszMiltenyi Biotec GmbH130-095-130separacja komórek magnetycznych w celu wyizolowania limfocytów T śledziony
Alexa Fluor 700 anty-mysie przeciwciało CD45.2 (klon: 104; partia: B252126; RRID: AB_493731)Biolegend109822
Pacific Blue przeciwciało anty-mysie CD3 (klon: 17A2; partia: B227246; RRID: AB_493645)Biolegend100214
FITC przeciwciało anty-mysie CD4 (klon: GK1.5; partia: B225057; RRID: AB_312691)Biolegend100406
PE/Cy7 przeciwciało anty-mysie CD45.1 (klon: A20; partia: B217246; RRID: AB_1134168)Biolegend110730
APC/Cy7 przeciwciało anty-mysie CD8a (klon: 53-6,7, partia: B247008; RRID: AB_312753)Biolegend100714
Filtrowana surowica bydlęca Pan BiotecP40-47500składnik buforu FACS 
96-dołkowe płytki z dnem polistyrenu w kształcie litery VGreiner Bio-One651201
polistyrenowa rurka okrągłodenna (5 ml)Falcon352052
BD LSRFortessa II cytometr przepływowyBD Bioscience Co.
Strzykawka insulinowa ze sterylnym wnętrzem (30 G)BD324826
Oxy Vet Oxymat 3Koncentrator tlenu Eickemeyer  do znieczulenia
NarkoVet Eickemeyer213062
Komora z pleksi Eickemeyer214620
Teleskop prostyKARL STORZ SE & Co KG64301 AAczęść eksperymentalnego zestawu do kolonoskopii
Osłona ochronna i badawczaKARL STORZ SE & Co KG61029 Cczęść zestawu eksperymentalnego do kolonoskopii
Osłona badawcza z kanałem roboczymKARL STORZ SE & Co KG61029 Dczęść zestawu doświadczalnego do kolonoskopii
Kleszcze do biopsjiKARL STORZ SE & Co KG61071 ZJ Część zestawu doświadczalnego do kolonoskopii
  175 Watt SCB XenonLight Źródło światłaKARL STORZ SE & Co KG20132120częścią eksperymentalnego zestawu do kolonoskopii
Światłowód światłowodowyKARL STORZ SE & Co KG495 NLczęść eksperymentalnego zestawu do kolonoskopii
Obraz 1 S3 Głowica kameryKARL STORZ SE & Co KG22220030częścią eksperymentalnej konfiguracji do kolonoskopii
Image 1 SCB Camera Control UnitKARL STORZ SE & Co KG22200020częścią zestawu eksperymentalnego do kolonoskopii
LCDOlympusOEV181Hczęścią zestawu eksperymentalnego do kolonoskopii
Forane / IsofluranAbbVie Inc. B506
Roztwór formaldehydu 37 %Carl Roth GmbH & Co.KG7398.1
5,0 ml Końcówka dozownika Eppendorf AG30089456

Bibliografia

  1. Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
  2. Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
  3. Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
  4. Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
  5. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
  6. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  7. Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697(2012).
  8. Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
  9. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
  10. Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138(2018).
  11. Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
  12. Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Prze sadnicza GvHDallogeniczne HCTizolacja szpiku kostnegodeplecja limfocyt w Tanaliza cytometrycznaocena endoskopowazapalenie okr nicykorelacja histopatologicznamonitorowanie nieinwazyjne

Powiązane artykuły