Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Streszczenie

Acetylocholina (ACh) działa poprzez receptory, modulując różne procesy neuronalne, ale trudno było powiązać funkcję receptora ACh z subkomórkowym położeniem w komórkach, w których ta funkcja jest realizowana. Aby zbadać subkomórkową lokalizację nikotynowych receptorów ACh (nAChR) w natywnej tkance mózgowej, opracowano metodę optyczną precyzyjnego uwalniania nikotyny w dyskretnych miejscach w pobliżu błon neuronalnych podczas zapisów elektrofizjologicznych. Neurony zaciśnięte w plasterkach mózgu są wypełniane barwnikiem, aby uwidocznić ich morfologię podczas 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, a odblokowanie nikotyny odbywa się za pomocą błysku światła poprzez skupienie wiązki laserowej 405 nm w pobliżu jednej lub więcej błon komórkowych. Mierzone są odchylenia prądu komórkowego i tworzony jest trójwymiarowy (3D) obraz zarejestrowanego neuronu o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić pogodzenie odpowiedzi nAChR z morfologią komórkową. Metoda ta pozwala na szczegółową analizę dystrybucji funkcjonalnej nAChR w złożonych preparatach tkankowych, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia neuroprzekaźnictwa cholinergicznego.

Wprowadzenie

Sygnalizacja cholinergiczna moduluje liczne procesy zachodzące w mózgu, w tym kontrolę uwagi, ruchy wolicjonalne i nagrodę^1,2. Leki, które zwiększają przekaźnictwo acetylocholiny (ACh) są stosowane w leczeniu zaburzeń poznawczych związanych z chorobą Alzheimera, co sugeruje ważną rolę układów cholinergicznych w funkcjach poznawczych³. Lepsze zrozumienie receptorów i obwodów cholinergicznych w stanach zdrowych i chorych może prowadzić do lepszych podejść terapeutycznych w przypadku kilku chorób/zaburzeń neurologicznych.

Nikotynowe receptory ACh (nAChR) to rodzina kanałów jonowych bramkowanych ligandem, które przepływają kationy w odpowiedzi na endogenne ACh lub egzogenną nikotynę z wyrobów tytoniowych. Biorąc pod uwagę fakt, że były to jedne z pierwszych receptorów neuroprzekaźników, które zostały opisane⁴, farmakologia nAChR i lokalizacja we włóknach mięśniowych jest dobrze poznana dla receptorów typu mięśniowego. W przeciwieństwie do tego, stosunkowo niewiele wiadomo na temat farmakologii i subkomórkowej dystrybucji natywnych nAChR w mózgu. Ta luka w wiedzy została niedawno wypełniona poprzez opracowanie nowej sondy chemicznej, która pozwala na przestrzennie ograniczoną i szybką aktywację nAChR w tkance mózgowej podczas obrazowania komórkowego i zapisu elektrofizjologicznego⁵. W tym miejscu opisano kluczowe kroki metodologiczne związane z tym podejściem, którego ogólnym celem jest zwiększenie zdolności do łączenia funkcji nAChR ze strukturą neuronalną.

5^,6. Przed rozpakowaniem, PA-Nic jest stabilny w roztworze i nie wykazuje żadnych niepożądanych cech farmakologicznych lub fotochemicznych⁵. Po fotolizie uwolniona nikotyna w przewidywalny sposób aktywuje nAChR, a produkty uboczne odklejania są farmakologicznie obojętne⁵. Jako źródło światła do fotolizy stosuje się laser o fali ciągłej o mocy wyjściowej >1 mW mierzonej na próbce. W przypadku lokalizacji, ukierunkowana fotostymulacja jest połączona ze zdolnością do lokalizacji błon komórkowych za pomocą 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (2PLSM), a dwie kluczowe zalety tego podejścia są w pełni zrealizowane: szybkość fotolizy i precyzja przestrzenna.

Pod wieloma względami, fotoliza PA-Nic jest lepsza od innych metod dostarczania ligandów nAChR do receptorów w wycinkach mózgu. Takie podejścia obejmują aplikację w kąpieli⁷ i miejscowe podawanie leku za pomocą pipety puffer⁸. Podczas gdy pierwsze podejście ma tendencję do nadmiernego podkreślania długoterminowych skutków stosowanego leku, drugie podejście może cierpieć z powodu zmienności kinetyki odpowiedzi między badaniami i między komórkami. Żadne z tych alternatywnych podejść nie jest w stanie odpowiednio odróżnić aktywności receptorów w różnych lokalizacjach komórkowych od tego samego neuronu. Optogenetycznie aktywowane uwalnianie ACh zostało wykorzystane do badania natywnych lokalizacji nAChRs < sup class="xref">9^,10,11, ale nie okazało się przydatne do mapowania subkomórkowych lokalizacji nAChR. Co więcej, większość badań wykorzystujących to podejście opierała się na transgenicznej myszy bakteryjnej z ekspresją ChR2 z ekspresją ChR2 z nieprawidłową transmisją cholinergiczną^{12,13,14,15,16,17}.

PA-Nic fotoliza nie jest jedynym optycznym podejściem do badania receptorów cholinergicznych. Karbachol w klatce został użyty do funkcjonalnego mapowania aktywności receptora ACh w hodowanych komórkach¹⁸ i brain slices¹⁹, ale nie był komercyjnie dostępny do badań porównawczych podczas opracowywania PA-Nic. Doniesiono, że kompleks rubinowy bis(bipirydyna)-nikotyna (RuBi-nikotyna) pozwala na odtworzenie nikotyny²⁰, ale komercyjne preparaty RuBi-nikotyny okazały się gorsze od PA-Nic w bezpośrednim badaniu porównawczym⁵. Przydatne może być powtórzenie takich eksperymentów porównawczych z niekomercyjną, wysoce oczyszczoną RuBi-nikotyną, ponieważ jej widoczna absorpcja może uzupełniać cechy PA-Nic, aby prowadzić badania cholinergiczne. Wreszcie, nAChR zostały również optycznie zmanipulowane przy użyciu kombinacji fotoprzełączalnych ligandów i genetycznie zmodyfikowanych receptorów²¹. Podejście to jest komplementarne do fotolizy PA-Nic w tkance mózgowej, przy czym zdolność/wymóg genetycznego celowania zmodyfikowanego nAChR jest postrzegany zarówno jako zaleta, jak i wada.

Należy zwrócić uwagę na kilka kluczowych wymagań tego podejścia. Po pierwsze, potrzebna jest odpowiednia metoda wizualizacji, aby dokładnie zlokalizować błonę neuronalną. Obrazowanie za pomocą konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej może być wystarczające podczas badania hodowanych komórek, ale do rejestracji z neuronów w wycinkach mózgu lub innych preparatach z grubych tkanek wymagane jest 2PLSM lub mikroskopia konfokalna. Po drugie, potrzebna jest odpowiednia metoda pozycjonowania wiązki lasera fotolizy. Podejście to wykorzystuje głowicę skanującą z podwójnym galwanometrem z dwoma niezależnymi lustrami x-y do skanowania rastrowego wiązki obrazowania i fotoaktywacji punktowej za pomocą wiązki laserowej do odblokowywania ^22,23,24. Możliwe są inne, bardziej ograniczone rozwiązania, takie jak (1) pojedyncza głowica skanująca galwanometru, która na przemian skanuje raster wiązki obrazowania i wiązki nieklatkowej, lub (2) po prostu skierowanie wiązki odblokowującej na środek pola widzenia, tak aby komórka została doprowadzona do tej pozycji w celu fotolizy błyskowej. Po trzecie, system do jednoczesnej rejestracji elektrofizjologicznej jest wymagany, jeśli ktoś chce zbierać sygnały fizjologiczne podczas eksperymentów. Powyższe wymagania można spełnić za pomocą odpowiedniej techniki obrazowania w pełni optycznego, jak niedawno opisano⁵. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół, który opisuje kluczowe kroki tego podejścia.

Protokół

Praca dotycząca przygotowania wycinków mózgu została przejrzana i zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern (protokół #IS00003604).

>UWAGA: Lasery używane do punktowej fotostymulacji to widzialne lasery klasy IIIb, które mogą potencjalnie zaszkodzić oczom. 2PLSM wymaga lasera bliskiej podczerwieni (NIR) klasy IV (>500 mW), który może spowodować poważne uszkodzenie oczu, a nawet oparzenia innych tkanek. Aby zapewnić bezpieczną pracę sprzętu laserowego, wymagane jest odpowiednie ograniczenie wiązki laserowej, blokady systemowe oraz kontrole inżynieryjne i administracyjne. Podczas pracy z laserami należy zawsze kontaktować się z lokalnym personelem zajmującym się bezpieczeństwem laserów.

1. Kalibracja i weryfikacja lasera (laserów) do rozłączania

1. Określ ilościowo moc lasera, która ma być dostarczona do próbki.
   1. Włącz laser 405 nm (maksymalna moc 100 mW z sygnałem sterującym 5 V) i pozwól systemowi laserowemu rozgrzać się przez około 10 minut
      nuta: Laser jest nadal przesłonięty (z napędem 0 V) i nie ma mocy wyjściowej, dopóki do lasera nie zostanie wysłane napięcie sterujące w celu modulacji mocy wyjściowej.
   2. Umieść miernik mocy w płaszczyźnie próbki tkanki lub w miejscu soczewki kondensatora. Ręcznie wyśrodkuj miernik względem ścieżki optycznej/soczewki obiektywu.
   3. Ustaw miernik na prawidłowy zakres długości fali (400-1100 nm). Wyzeruj miernik, naciskając odpowiedni przycisk.
   4. Korzystając z elementów sterujących oprogramowania, wybierz 100 (z maksimum 1000; 1000 = 5 V) dla mocy lasera 405 nm, co ustawia laser na 10% pełnej mocy. W razie potrzeby napięcie sterujące laserem może być również wprowadzone do systemu PrairieView za pośrednictwem VoltageRecord, aby zapewnić cyfrowy zapis czasu sygnału sterującego i poziomu mocy.
   5. Zapisz odczyt z miernika mocy.
   6. Wybierz 150 (15% z maks. 1000) dla mocy wyjściowej lasera 405 nm i zapisz odczyt z miernika mocy. Powtórz to dla następujących mocy wyjściowych, aby zebrać krzywą mocy lasera: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 i 1000.
2. Skalibruj galwanometry laserowe do odłączania. Poniższe kroki należy wykonywać za każdym razem, gdy następuje zmiana elementów optycznych systemu, gdy istnieje obawa o dokładne pozycjonowanie punktowe lub regularnie co miesiąc.
   1. Zainstaluj soczewkę obiektywową mikroskopu zanurzającego się w wodzie 60x, która będzie używana w eksperymentach fotostymulacji i obrazowania. W oprogramowaniu do akwizycji/obrazowania wybierz soczewkę obiektywu 60x i ustawienie zoomu optycznego na 1 (patrz krok 3.1.4.2.).
   2. Zaznacz wypełnione kółko na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym za pomocą czerwonego markera permanentnego. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, markerem skierowanym w stronę obiektywu.
   3. Ustaw ostrość mikroskopu na obszarze czerwonego znacznika za pomocą obiektywu 4x lub 10x. Dodaj 1-2 ml wody na górę czerwonej kropki/plamki znacznika, a następnie przełącz się na obiektyw 60x i zanurz obiektyw w wodzie. Ustaw ostrość soczewki obiektywu na cienkim obszarze czerwonego markera.
   4. Przełącz się na 2-fotonowe skanowanie laserowe. W przypadku większości systemów przesuń wieżyczkę do pozycji #1, przesuń pryzmat trójokularowy z drogi światła, przesuń lustro głowicy skanującej do przodu i ustaw długość fali lasera na ~900 nm. Wybierz opcję pola 512 x 512 pikseli dla parametrów akwizycji obrazu, która jest domyślnym elementem piksela dla procedury kalibracji lustra stymulacyjnego.
   5. Rozpocznij skanowanie systemu z mocą lasera obrazowania większą niż minimalna i dostosuj ostrość obiektywu do cienkiej warstwy fluorescencji czerwonego markera. Wybierz pole w polu fluorescencji wolne od zanieczyszczeń i równomiernie pokryte markerem.
      nuta: Konfiguracja w tym protokole korzysta z oprogramowania do akwizycji/obrazowania PrairieView 5.4.
   6. Otwórz funkcję Uncaging Galvo Calibration w menu Narzędzia – Kalibracja/Wyrównanie oprogramowania. Zapoznaj się z samouczkiem dotyczącym miejsc oparzenia, aby uzyskać informacje na temat kalibracji przestrzennej drugiej pary luster galwanometru.
      1. W samouczku dotyczącym oparzeń wybierz laser 405 nm, wybierz moc stymulacji laserowej 400 i czas trwania stymulacji 20 ms. Powinno to spowodować powstanie małych (~1-5 μm średnicy) otworów w czerwonym markerze.
         nuta: Zwykle używane są ustawienia takie jak ~2-4 mW i 1-10 ms, ale ustawienia są określane przez próbkę. Ustawienia mocy fotostymulacji PA-Nic będą prawdopodobnie znacznie niższe niż moc wymagana podczas kalibracji do ablacji widocznego otworu w czerwonym szkiełku znacznikowym. Ta procedura kalibracji jest przydatna do lokalizowania miejsc fotostymulacji, ale nie powinna być używana do wnioskowania o bezwzględnych objętościach fotostymulacji podczas reakcji fizjologicznych.
      2. Wybierz opcję Aktualizuj, aby stymulować i odświeżać obraz po wypaleniu środkowego punktu i przesunąć okrągły czerwony wskaźnik do rzeczywistej lokalizacji punktu. Zrób to dla punktu środkowego, prawego punktu środkowego, dolnego punktu środkowego, a na końcu dla siatki dziewięciu punktów (wszystkie rogi i krawędzie oraz środek obrazu).
         nuta: Środkowe, prawe i dolne skorygowane lokalizacje plamek określają napięcia galwanometru stymulacji w celu zdefiniowania rzeczywistego środka oraz współczynników skalowania X i Y w celu dopasowania pary lustra stymulacji do pary zwierciadła obrazowania. Oprogramowanie będzie skalować i aktualizować wszystkie kolejne eksperymenty MarkPoints wykonywane przy ustawieniach powiększenia innych niż powiększenie kalibracji przestrzennej.
   7. Przetestuj kalibrację, otwierając okno MarkPoints i ręcznie aktywując parametry stymulacji w zdefiniowanym miejscu (miejscach) w nowym obszarze próbki. Upewnij się, że poprawny, najnowszy plik kalibracyjny został załadowany do okna MarkPoints. Aktywuj funkcję MarkPoints/Group lub MarkPoints Series w zdefiniowanym miejscu (miejscach) lub skorzystaj z funkcji Live/Ablation, aby kliknąć prawym lub lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu obrazu podczas skanowania na żywo, aby zastosować impuls testowy i zweryfikować poprawność kalibracji.
      nuta: Punkt oparzenia lasera powinien być teraz idealnie wyśrodkowany na wskaźniku MarkPoints.
   8. Monitoruj i rejestruj aktywację mocy impulsu laserowego i czas trwania, wyłączając napięcie napędu w programie VoltageRecord (patrz krok 1.1.4). Podobnie, zarejestruj położenie każdego miejsca stymulacji za pomocą skalowanego sygnału napięciowego z sygnałów zwrotnych pochodzących z pary luster galwanometru fotostymulacji.

2. Przygotowanie fotoaktywowanej nikotyny (PA-Nic)

1. Pobrać z magazynu porcję liofilizowanego leku aktywowanego fotoaktywowalnie.
   nuta: Następujący protokół jest specyficzny dla PA-Nic; Dostosuj w razie potrzeby do innych leków fotoaktywowanych. Chociaż PA-Nic wykazuje wyjątkową stabilność⁵, podejmij rozsądne środki ostrożności, aby chronić go przed ekspozycją na jasne światło podczas przygotowań i/lub eksperymentów. Można to osiągnąć, po prostu pracując w słabym świetle; Ograniczanie się do światła filtrowanego na czerwono nie jest konieczne.
2. Wykonaj lokalną aplikację PA-Nic.
   1. Wyciągnij szklaną mikropipetę o średnicy otworu 20-40 μm za pomocą programowalnego ściągacza do pipet.
   2. Przefiltruj ~1 ml roztworu nagrywającego z filtrem 0,22 μm. Zawiesić pewną ilość PA-Nic w przefiltrowanym roztworze do nagrywania, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Na przykład rozpuść liofilizowaną podwielokrotność o stężeniu 100 nmol w 50 μl przefiltrowanego roztworu do nagrywania.
      nuta: Sugerowany skład roztworu rejestrującego można znaleźć w najnowszych publikacjach^5,6 wykorzystujących fotolizę PA-Nic.
   3. Napełnij pipetę do aplikacji lokalnej 50 μl 2 mM PA-Nic.
   4. Zamocuj pipetę do aplikacji miejscowej w uchwycie na pipety zamontowanym na mikromanipulatorze. Podłącz uchwyt pipety za pomocą odpowiedniego przewodu do systemu wyrzutu ciśnienia zdolnego do długotrwałego stosowania niskiego ciśnienia (1-2 psi).
   5. Za pomocą mikromanipulatora wmanewruj pipetę do aplikacji miejscowej w zewnątrzkomórkowym roztworze rejestrującym i umieść końcówkę pipety nieco powyżej tkanki mózgowej myszy znajdującej się ~50 μm od interesującej nas komórki. Zapoznaj się z poprzednim raportem, aby uzyskać szczegółowy protokół przygotowania wycinków mózgu myszy i nagrań z zaciskami łatek⁸.
   6. Sprawdź parametry aplikacji, krótko wywierając nacisk (1-2 psi). Przemieszczenie komórki będącej przedmiotem zainteresowania powinno być minimalne lub żadne. W przypadku wystąpienia znacznego ruchu, należy umieścić pipetę do aplikacji miejscowej dalej (w kierunku bocznym i/lub osiowym) od celi będącej przedmiotem zainteresowania.
   7. Po osiągnięciu stabilnego zacisku krosowego całego ogniwa (szczegóły dotyczące tego są zawarte we wcześniejszej publikacji⁸), włącz aplikację niskociśnieniową (1-2 p.s.i.) za pomocą odpowiedniego przełącznika ręcznego na urządzeniu do wyrzucania ciśnienia. Nasycić tkankę otaczającą komórkę PA-Nic przez 1-2 minuty przed przejściem do następnego kroku.
3. Wykonaj kąpiel (superfuzję) PA-Nic do wycinka mózgu.
   1. Rozpuścić ilość PA-Nic w objętości roztworu rejestrującego odpowiedniej do ciągłej recyrkulacji, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM. Na przykład, rozpuścić podwielokrotność 1 μmol w 10 ml roztworu rejestrującego za pomocą standardowej probówki o pojemności 15 ml.
   2. Rozpocząć recyrkulację roztworu PA-Nic z szybkością 1,5-2 ml/min, otwierając odpowiedni regulator przepływu w systemie perfuzyjnym. Recyrkulacja zachodzi na czas trwania nagrania. Aby oszczędzać cenny lek, należy zminimalizować objętość recyrkulacji, stosując rurki o minimalnej średnicy wewnętrznej i/lub skracając całkowitą długość rurki używanej w systemie perfuzyjnym.
      nuta: Wykonując te czynności, objętość do recyrkulacji kąpieli można zmniejszyć do 5 ml roztworu PA-Nic. Roztwory PA-Nic mogą być często używane przez dwa kolejne dni nagrywania w ciągu tego samego tygodnia, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C przed światłem.
   3. Podczas recyrkulacji roztworu należy w sposób ciągły bąbelkować karbogenem (5%_O2, 95% CO_{2 )} i utrzymywać temperaturę kąpieli na poziomie 32 °C.
   4. Zachowaj wycinek mózgu w roztworze nagrywającym podczas pracy z PA-Nic w warunkach słabego oświetlenia.

3. Obrazowanie neuronów za pomocą 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej

1. Wykonaj wizualizację komórki na żywo.
   1. Zidentyfikuj/zwizualizuj neuron przyśrodkowy habenula (MHb) za pomocą optyki światła przechodzącego lub kontrastu różnicowego interferencji podczerwieni (IR/DIC) i kamery wideo i ustal stabilny zapis z klamrą krosową całej komórki. Zapoznaj się z poprzednim protokołem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat nagrań zacisków łatek z neuronów w starannie przygotowanych wycinkach mózgu myszy⁸.
   2. Po ustaleniu konfiguracji ogniwa o wysokiej rezystancji (>1 GΩ), ale przed włamaniem, przełącz konfigurację i oprogramowanie w tryb skanowania laserowego.
   3. Po włamaniu użyj skaningu laserowego, aby sprawdzić, czy barwnik obrazujący (rozcieńczony do końcowego stężenia 100-200 μM w standardowym roztworze pipety wewnątrzkomórkowej opisanym wcześniej⁸) pasywnie (przez dyfuzję) wypełnia neuron. Pozwól barwnikowi (np. Alexa Fluor 488 w zielonym kanale fotopowielacza [PMT], PMT 2; lub Alexa Fluor 568 lub 594 w czerwonym kanale PMT, PMT 1) wypełnić przedziały komórkowe przez co najmniej 20-30 minut przed przystąpieniem do eksperymentów, które wymagają wizualizacji jakichkolwiek przedziałów komórkowych poza somą.
      nuta: Przedziały dystalne (struktury dendrytyczne, kolce, aksony itp.) mogą wymagać 30-40 minut na pełne wypełnienie²⁵.
   4. Użyj funkcji Live Scan w oprogramowaniu, aby zobrazować interesujący neuron i przedział subkomórkowy. Wybierz parametry obrazowania, które pozwolą na dokładną wizualizację cech neuronalnych na żywo. Manipuluj różnymi ustawieniami, aby wpłynąć lub zmienić wizualizację wyświetlania (kontrast), rozdzielczość, stosunek sygnału do szumu (S/N) i czas akwizycji klatki obrazu:
      1. Tabela przeglądowa (LUT). Otwórz okno LUT za pomocą odpowiedniej ikony z boku dowolnego okna obrazu. Po otwarciu dostosuj ustawienie podłogi (min) i sufitu (maks.) LUT dla określonego kanału obrazu, aby poprawić wizualizację kontrastu sygnału wyświetlanego na ekranie. Zmniejsz maksymalną wartość do ~1000 (z 4096, wykrywanie 12-bitowe), co pomoże wyciągnąć sygnały ściemniacza podczas pierwszego wyszukiwania komórek, sygnału i struktury.
         UWAGA: Te ustawienia mają wpływ tylko na wyświetlany sygnał, a nie na wykryte/zarejestrowane wartości. Ludzkie oko zazwyczaj jest w stanie dostrzec kontrast tylko z ~50 poziomami szarości²⁶.
      2. Zoom optyczny. Użyj oprogramowania sterującego, aby wybrać 1-krotny zoom optyczny i użyj elementów sterujących przesuwaniem, aby zlokalizować żądany obszar w tkance. To ustawienie powiększenia daje największe kwadratowe, zeskanowane pole widzenia i wysyła największe napięcia/kąty skanowania do luster galwanometru.
         nuta: Domyślna konfiguracja to pole widzenia 12 mm x 12 mm wewnątrz głowicy skanującej, co przekłada się na 12 mm podzielone przez powiększenie obiektywu wewnątrz próbki. Dlatego obiektyw o powiększeniu 60x zapewnia zeskanowane obrazy o wielkości 200 μm z każdej strony przy 1-krotnym zoomie optycznym. Wyższe wartości zoomu optycznego skanują mniejszy obszar. 2-krotny zoom optyczny jest często najbardziej użytecznym ustawieniem do wizualizacji całych neuronów. 4x może być przydatny do wizualizacji subkomórkowych aspektów neuronów.
      3. Liczba pikseli. Aby uzupełnić 1-krotny zoom optyczny, wybierz 1024 x 1024 pikseli na linię za pomocą elementów sterujących oprogramowania. Ustaw liczbę pikseli na linię w przechwyconym i wyświetlanym obrazie, aby nie stracić szczegółów, które są możliwe z soczewki obiektywu. W przypadku obiektywu z aperturą numeryczną (NA) 60x/1,0 należy użyć następujących praktycznych wartości pikseli: 1024 x 1024 dla zoomu 1, 512 x 512 dla zoomu 2 i 256 x 256 dla zoomu 4. Końcowy rozmiar piksela (~0,17 μm; 12 mm/powiększenie/zoom/piksele) powinien wynosić połowę lub mniej rozdzielczości bocznej zdefiniowanej przez soczewkę obiektywu.
         nuta: Rozdzielczość obrazu jest definiowana tylko przez długość fali lasera i obiektyw NA (rozdzielczość 0,4 μm z wzbudzenia dwufotonowego [2PE] przy 920 nm i obiektywie 1,0 NA)²⁷. Kryteria pełnego wzbudzenia NA, jak podano na soczewce, są takie, że intensywność 1/e² średnicy wiązki laserowej odpowiada (lub "wypełnia") źrenicy wejściowej (ogniskowa soczewki 2 x tubus x NA / powiększenie) soczewki obiektywu. Obiektyw tubusu w opisywanym tu układzie ma ogniskową 180 mm.
      4. Czas przebywania pikseli. Użyj kontrolek programowych, aby wybrać 4 μs jako czas przebywania pikseli, przydatną wartość domyślną.
         nuta: Zmiana czasu przebywania piksela nie zmienia średniej wykrywanego sygnału; wpływa tylko na uśrednianie wewnątrz pikseli, a zmiany te można zobrazować poprzez jakość obrazu za pomocą sygnału / szumu. Czas przebywania piksela obrazu jest zawsze wielokrotnością jednostki 0,4 μs, a w przypadku większych czasów zatrzymania 12-bitowa ograniczona wartość intensywności każdego piksela obrazu jest średnią z próbek 0,4 μs. Ponieważ stosunek sygnału do szumu poprawia się jako pierwiastek kwadratowy z liczby próbek na piksel czasu przebywania (4 μs równa się dziesięciu próbkom, czyli 3,16-krotna poprawa sygnału / szumu), poprawa jakości obrazu osiąga malejące zwroty dla wartości znacznie większych niż 12 μs.
      5. Rotacja skanowania i obszar zainteresowania (ROI). Ustaw kąt obrotu obrazu na 0° za pomocą programowych elementów sterujących (może nie być wymagane żadne działanie, ponieważ obrót o 0° jest ustawieniem domyślnym dla większości systemów obrazowania). Jeśli próbka jest umieszczona w orientacji "do góry nogami", wybierz obrót o 180°, aby "odwrócić" obraz.
         nuta: Obracanie obrazu pod dowolnym kątem może zapewnić lepsze dopasowanie do całego obszaru zainteresowania wypełnionej komórki. Rotacja może również stanowić wyraźniejszą podstawę do wyrównania zmian strukturalnych i przeprowadzenia późniejszej analizy. Wybranie obszaru zainteresowania w zeskanowanym obrazie przy danym ustawieniu powiększenia (krok 3.1.4.2) powoduje zachowanie natywnej liczby pikseli (krok 3.1.4.3), ale ograniczenie całkowitej liczby obszarów i pikseli może znacznie zwiększyć liczbę klatek na sekundę, zapewniając lepszą rozdzielczość czasową zmian sygnału.
      6. Uśrednianie klatek. Wybierz ustawienie początkowej średniej klatek wynoszące 2 klatki za pomocą sterowania programowego.
         nuta: Ostateczny kontrast obrazu (S/N) jest definiowany przez całkowitą liczbę fotonów zebranych/wykrytych w pikselach sygnałowych obrazu. Uśrednianie wielu klatek obrazu może poprawić stosunek sygnału do szumu, pod warunkiem, że próbka nie porusza się ani nie jest wybielana podczas obrazowania. Interesujący sygnał pozostaje ten sam podczas uśredniania klatek, podczas gdy szum w obrazie jest redukowany przez pierwiastek kwadratowy z liczby uśrednionych klatek. Małe struktury na obrazach fluorescencyjnych często wymagają uśredniania między pikselami, łączenia pikseli w obrazie (często nazywanych ROI) i/lub uśredniania klatek. Uśrednianie klatek wydłuża czas skanowania o liczbę obrazów, które wybiera się do uśrednienia.
   5. Użyj narzędzi Panoramowanie obrazu, Obrót skanowania i Zoom optyczny, aby zorientować położenie próbki podczas skanowania. Jeśli do ustawienia próbki konieczna jest manipulacja stopniem silnikowym, należy unikać dużych rozmiarów kroków do osi X, Y i Z, aby zapobiec kolizjom obiektywu/kondensatora, wibracjom lub narażeniu wiązki laserowej na powierzchnie odbijające.
2. Zbierz stos Z. Za pomocą narzędzia Seria Z wybierz pozycję początkową i końcową, która zawiera interesującą Cię komórkę. Wybierz rozmiar kroku (1 μm), a następnie kolejno zobrazuj neuron w każdej płaszczyźnie Z, która zawiera komórkę.
   nuta: Ustawienia akwizycji Z-stack będą się różnić w zależności od typu neuronu i barwnika wypełniającego. Optymalne parametry akwizycji Z-stack powinny być określane niezależnie od parametrów stosowanych do obrazowania na żywo. Akwizycję Z-stack można przeprowadzić przed i/lub po eksperymentach optofarmakologicznych. Jeśli to możliwe, wykonaj akwizycję Z-stack po optofarmakologii, aby uniknąć uszkodzeń komórkowych wywołanych przez 2PLSM i umożliwić optymalne wypełnienie barwnikiem małych przedziałów komórkowych.

4. Laserowa fotoliza błyskowa podczas nagrań elektrofizjologicznych

UWAGA: Zastosowanie mocy lasera 405 nm lub 473 nm ≥ 1 mW powoduje fosforescencję wewnątrz szkła obiektywu i soczewki kondensatora. To generowane światło jest bezpośrednio związane z mocą oświetlenia laserowego; Emisja jest obecna w zielonym i czerwonym oknie widmowym i ma czasy życia w stanie wzbudzonym w zakresie MS. Ten artefakt stymulacji tła jest widoczny we wszystkich testowanych soczewkach oraz w soczewkach obiektywowych zanurzanych w wodzie wszystkich głównych producentów soczewek obiektywowych. Soczewki kondensacyjne wytwarzają znacznie wyższą fosforescencję niż soczewki obiektywowe. Ten "sygnał" motywuje do stosowania mechanicznego szalunkowania w celu ochrony wrażliwych katod PMT z fosforku arsenku galu (GaAsP) podczas zdarzeń fotostymulacji. Użycie normalnie zamkniętej migawki mechanicznej (zamkniętej, gdy nie skanuje aktywnie) stanowi najlepsze rozwiązanie do ochrony chłodzonych PMT GaAsP.

1. W przypadku geometrii wiązki fotostymulacji typu klepsydry należy usunąć wszelkie soczewki skupiające w optyce ścieżki światła, które w przeciwnym razie zwężałyby wiązkę laserową, gdy wchodzi ona do źrenicy wejściowej obiektywu.
2. Korzystając z funkcji MarkPoints, wybierz ustawienie pojedynczego miejsca.
   nuta: Inne ustawienia fotostymulacji (wiele punktów, siatka plam, skanowanie spiralne) są możliwe w MarkPoints. Pojedynczy punkt jest najprostszy. Cele eksperymentalne i różnice biologiczne mogą wymagać innego ustawienia.
3. Zaktualizuj obraz, korzystając z opcji Live Scan (Skanowanie na żywo), aby na krótko zobrazować i zlokalizować subkomórkowy obszar zainteresowania. Okresowo aktualizuj obraz, aby zidentyfikować wszelkie potencjalne małe odchylenia ostrości.
4. Użyj programowych elementów sterujących, aby zwiększyć zoom optyczny (tj. wybierz wyższe ustawienie zoomu optycznego niż bieżące), jeśli to konieczne, aby uwidocznić małe struktury (np. kolce lub dystalne dendryty).
5. Umieść pojedynczy punkt celownika MarkPoints bezpośrednio przylegający (~0,5 μm) do błony komórkowej. Nie umieszczaj miejsca fotostymulacji bezpośrednio nad elementem komórkowym, ponieważ może to prowadzić do fotouszkodzenia.
6. Ustaw parametry fotostymulacji za pomocą kontrolek oprogramowania w MarkPoints. Zastosuj początkowe wskazówki w następujący sposób: czas trwania 1-50 ms, moc lasera 1-4 mW i próba ≥1.
7. Wybierz opcję Uruchom MarkPoints, aby zainicjować protokół MarkPoints i obserwować pozyskiwanie danych elektrofizjologicznych w czasie rzeczywistym.
8. Powtórzyć kroki 4.2-4.7 kilka razy, aby ocenić spójność i stabilność, lub ich brak, amplitudy i kinetyki odpowiedzi.

Wyniki

Dla stymulacji fotolizy kluczowymi zmiennymi są dawka ekspozycji (intensywność i czas), lokalizacja ekspozycji oraz geometria wiązki. System opisany w tym artykule jest zdolny do dwóch różnych wiązek fotostymulacji, regulowanych poprzez przesuwanie soczewki do środka/z drogi światła fotostymulacji, zanim wiązka wejdzie do systemu galwanometru. Bez tej soczewki wiązka fotostymulacji wypełnia źrenicę wejściową obiektywu zanurzającego w wodzie 60x/1,0 NA [60x WD], wytwarzając plamkę sub-μm ograniczoną dyfrakcją w płaszczyźnie ogniskowej wewnątrz próbki. Jest to związane ze światłem fotostymulacyjnym o kształcie klepsydry, rozciągającym się powyżej i poniżej ogniska symetrycznie do osi optycznej. Po umieszczeniu soczewki w ścieżce, światło lasera fotostymulacyjnego jest skupiane w źrenicy wejściowej soczewki obiektywu, a następnie wychodzi jako wiązka przypominająca ołówek. Ta wiązka, która ma mieć średnicę ~10 μm dla obiektywu 60x, rozciąga się równomiernie/pionowo w całej próbce. W tym trybie natężenie światła w dowolnym miejscu w miejscu stymulacji będzie wynosić ~1% intensywności małej plamki ograniczonej niemal dyfrakcją. W związku z tym przy stosowaniu stymulacji punktowej ~10 μm zwykle wymagane są wyższe moce lasera. We wszystkich eksperymentach opisanych w tym artykule zastosowano wiązkę fotostymulacji typu klepsydry.

Dostarczoną moc próbki można wykreślić w stosunku do ustawienia napięcia wejściowego, po zmierzeniu mocy lasera na próbce za pomocą miernika mocy. W badaniach tych wykorzystuje się obiektyw WD o powiększeniu 60x i odległości roboczej 2 mm, ale nie jest on zanurzany w wodzie do pomiarów mocy, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia elementu detektora. Gdy obiektywy o podanej wartości NA > 0,95 są mierzone w powietrzu (bez płynu zanurzeniowego), mogą wystąpić całkowite straty odbicia wewnętrznego w przedniej części obiektywu ze względu na niższy indeks (powietrze). W takim przypadku, aby uzyskać dokładniejszy pomiar mocy próbki (w celu skorygowania całkowitych strat odbicia wewnętrznego), zwiększ zmierzoną moc o obiektyw 1,0 NA (1,0/0,95)² mierzony w powietrzu. Rysunek 1a pokazuje typowy wykres wejścia/wyjścia dla widocznych laserów 405 nm i 473 nm, które są włączone do systemu startu lasera w tym badaniu. Te systemy laserowe są idealne do kontroli dawki ekspozycji fotostymulacji z następujących powodów: (1) są wstępnie skalibrowane, aby zapewnić bezpośrednio liniową moc wyjściową w stosunku do napięcia wejściowego (0-5 V), (2) zapewniają cichą pracę migawki (bez mocy lasera) oraz (3) mają szybką kontrolę czasu trwania impulsu o intensywności poniżej ms (odpowiedź 0,1 ms). W przypadku korzystania z fotostymulacji punktowej za pomocą systemu laserowego/galvo, rutynowa kalibracja punktów MarkPoints jest niezbędnym zadaniem. Rysunek 1b (lewy panel) pokazuje system, który nie jest skalibrowany (pożądany punkt do fotostymulacji nie powoduje dokładnej stymulacji tego punktu, na co wskazuje lokalizacja otworu w spaleniu), z powrotem do dokładnego pozycjonowania miejsca po kalibracji (Rysunek 1b, prawy panel).

PA-Nic jest umiarkowanie fluorescencyjny (szczyt emisji przy ~510 nm), wykazując efektywne wzbudzenie między 350-450 nm (wzbudzenie 1-fotonowe) lub 700-900 nm (wzbudzenie 2-fotonowe)⁵. Aby uwidocznić PA-Nic podczas aplikacji miejscowej, PA-Nic (1 mM) zastosowano w pobliżu tkanki mózgowej, a następnie jednoczesne obrazowanie (1) kontekstu transmisji optycznej w tkance mózgowej za pomocą kontrastu Dodt i (2) emitowanej fluorescencji ze wzbudzenia (900 nm) PA-Nic. Fluorescencja PA-Nic 2PE była łatwo wykrywalna podczas wyrzutu ciśnienia z pipety do aplikacji lokalnej (Rysunek 2a). Nikotyna i monoalkilokumaryna, 7-karboksymetyloamino-4-metylo kumaryna, są głównymi produktami fotochemicznymi reakcji fotolizy PA-Nic⁵. Korzystając z tych samych ustawień/parametrów obrazowania, które zostały użyte do obrazowania PA-Nic, tkankę zobrazowano podczas dostarczania nikotyny (1 mM) lub 7-karboksymetyloamino-4-metylkumaryny (1 mM). Nie wykryto sygnału fluorescencyjnego (Rysunek 2a, środkowy i dolny panel), co świadczy o swoistości wyników PA-Nic. Na koniec PA-Nic zastosowano w tkance mózgowej i zobrazowano emisję fluorescencji PA-Nic (Rysunek 2b). Takie podejście potwierdza, że PA-Nic jest obecny w odległości 100-200 μm od lokalnej pipety aplikacyjnej. Łącznie dane te potwierdzają, że PA-Nic jest skutecznie dostarczany do tkanki mózgowej za pośrednictwem aplikacji lokalnej.

Zapisy elektrofizjologiczne z jednoczesnym 2PLSM do wizualizacji struktur komórkowych wymagają od badacza zrównoważenia rozważań dla obu składników eksperymentu, a często dostępne jest wąskie okno czasowe (~20 min) dla prawidłowego pozyskiwania danych próbki z załatanej komórki. Nie biorąc pod uwagę wizualizacji komórkowej, najlepszą praktyką jest rozpoczęcie nagrywania tak szybko, jak to możliwe po włamaniu, ponieważ stabilność nagrywania ma tendencję do zmniejszania się z czasem. Jednakże, gdy obrazowanie jest wymagane, względy elektrofizjologiczne muszą zapewnić odpowiedni czas na wzrost stężenia fluorescencji w małych/odległych strukturach. Przykładem może być badanie krzywej wypełnienia stężenia barwnika²⁸, która jest czasami przydatna do wyprowadzenia podczas obrazowania nowego typu komórki. Rysunek 3 pokazuje kilka przykładowych neuronów zobrazowanych jako stosy Z za pomocą 2PLSM i zwiniętych do projekcji maksymalnej intensywności dla celów prezentacji. Rysunek 3a pokazuje wysokiej jakości obrazy, na których morfologia neuronów wydaje się być kompletna, szum jest zminimalizowany, a szczątki nie przeszkadzają w interpretacji morfologii komórek. Rysunek 3b pokazuje obrazy o niższej jakości, ze względu na niższy stosunek sygnału do tła i znaczne ilości odłamków. Szczątki te często pojawiają się jako kuliste kieszenie o intensywnej fluorescencji, powstające w wyniku wyrzucania barwnika obrazującego z pipety plastrowej podczas zbliżania się do komórki. Warto zauważyć, że włączenie 100 μM PA-Nic do kąpieli (podczas aplikacji w kąpieli) ma tendencję do zmniejszania stosunku sygnału do tła i prowadzi do nieoptymalnego kontrastu obrazu. Alexa Fluor 568 lub 594 jest często bardzo przydatna w lokalnych eksperymentach aplikacyjnych jako barwnik szukający lub jako normalizujący sygnał odniesienia/normalizacji 2PE. Efektywna długość fali dla dwufotonowego wzbudzenia tych barwników wynosi ~780 nm²⁷, co pozwala na jednoczesną wizualizację PA-Nic i identyfikację przedziałów komórkowych. Ta długość fali nie pozwala jednak w pełni uniknąć fotolizy dwufotonowej PA-Nic⁵. Alexa Fluor 488 jest korzystna w eksperymentach z aplikacją kąpieli PA-Nic; po wzbudzeniu odpowiednią długością fali ≥900 nm, można uniknąć fotolizy dwufotonowej PA-Nic⁵, zachowując przy tym odpowiednią wizualizację przedziałów komórkowych.

Rysunek 4 pokazuje przykładowe dane dla zlokalizowanej fotolizy laserowej PA-Nic w neuronach MHb w wycinkach mózgu. Rysunek 4a (górne panele) pokazuje przykład obrazu "referencyjnego", który jest zrzutem ekranu ostatniego obrazu 2PLSM wykonanego przed uruchomieniem protokołu MarkPoints, z nałożonym miejscem fotostymulacji. Rysunek 4a (dolne panele obrazu) pokazuje powiększony widok miejsca fotostymulacji nałożonego na morfologię komórki. Odpowiednia, skorelowana w czasie odpowiedź elektrofizjologiczna na fotolizę PA-Nic jest pokazana w dolnych panelach Rysunek 4a. Wcześniejsze prace wykazały, że prądy te są wrażliwe na antagonistów nAChR⁵. Rysunek 4b pokazuje reprezentatywne dane z różnych komórek, w których przeprowadzono fotolizę pojedynczego punktu w odstępie 1 s lub 10 s. Podczas gdy interwał 10 s zapewniał wystarczający czas odzyskiwania podstawowego prądu podtrzymania, krótszy interwał 1 s prowadził do stopniowego wzrostu prądu podtrzymania w miarę postępu protokołu. Rosnący prąd sugeruje, że nikotyna nie miała wystarczająco dużo czasu, aby rozproszyć się z systemu w interwale 1 Hz²⁹. Takie analizy odpowiedzi czasowej muszą być przeprowadzane de novo na każdym nowym typie badanej komórki, ponieważ neurofarmakologia nAChR może się różnić w zależności od typu komórki.

Rysunek 1: Kalibracja lasera fotostymacyjnego. (a) Moc wyjściowa lasera fotostymulacyjnego. Moc na płaszczyźnie próbki (przez obiektyw zanurzający w wodzie 60x/1,0 NA) mierzono dla laserów fotostymulacyjnych 405 nm i 473 nm przy wskazanym ustawieniu wyjściowym. (b) Kalibracja lasera fotostymulacji. Obrazy zrzutów ekranu pokazują relację przestrzenną między zamierzonym miejscem fotostymulacji a odpowiadającym mu miejscem, w którym nastąpiła fotostymulacja (burn-hole) przed (po lewej) i po (prawej) kalibracji w MarkPoints. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Aplikacja lokalna PA-NIC. (a) Wykrywanie PA-Nic za pomocą lokalnej pipety aplikacyjnej. 1 mM PA-Nic, produkt uboczny fotolizy lub nikotynę rozpuszczono w ACSF, załadowano do lokalnej pipety aplikacyjnej i dozowano na tkankę mózgową podczas obrazowania 2PLSM (wzbudzenie 900 nm) przy użyciu tych samych ustawień obrazowania dla każdego leku. Skaning laserowy Obraz transmisji kontrastu Dodt pokazuje tkankę/pipetę, podczas gdy katoda GaAsP PMT została użyta do uchwycenia emisji fluorescencji. (b) PA-Nic (1 mM) został perfundowany do tkanki mózgowej i zobrazowany za pomocą 2PLSM, jak w (a), aby pokazać boczne rozprzestrzenianie się PA-Nic przy użyciu jego wewnętrznej fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Akwizycja obrazów z 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej. (a) Optymalne stosy Z 2PLSM. Pokazano dwa przykłady projekcji maksymalnej intensywności stosu Z 2PLSM dla neuronów MHb z dobrze rozdzielonymi dendrytami i niewielkimi lub żadnymi zanieczyszczeniami zakłócającymi. (b) Nieoptymalne stosy Z 2PLSM. Pokazano dwa przykłady projekcji maksymalnej intensywności stosu Z 2PLSM dla neuronów MHb otoczonych szczątkami (barwnik wydalany z pipety podczas zbliżania się do komórki). Takie obrazy są trudniejsze do zinterpretowania niż obrazy takie jak te pokazane w punkcie (a). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Laserowa fotoliza PA-Nic. (a) Obrazy referencyjne MarkPoints i prądy wewnętrzne wywołane przez fotolizę PA-Nic. Dla jednego neuronu MHb pokazano surowe obrazy referencyjne dla prób fotostymulacji MarkPoints w pojedynczej (wskazanej) lokalizacji komórkowej. Zauważ, że w przypadku niektórych miejsc fotostymulacji (skrajny prawy obraz w tej serii) struktura dendrytyczna jest wyostrzona, ale soma i proksymalny dendryt nie. Pod każdym obrazem referencyjnym wykreślany jest prąd wewnętrzny wywołany uwolnieniem nikotyny. (b) Interwały między bodźcami dla fotolizy PA-Nic. Przykładowe zapisy są pokazane dla neuronów MHb, w których nikotyna była wielokrotnie wyjmowana z klatki w tym samym miejscu perymatycznym z interwałem między bodźcami wynoszącym 1 s lub 10 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wybór metody aplikacji/dostarczania PA-Nic jest najbardziej krytycznym krokiem w tej zlokalizowanej technice fotostymulacji. Obie metody, aplikacja w kąpieli i perfuzja miejscowa, mają różne zalety i ograniczenia. Na wybór duży wpływ ma poziom funkcjonalnej ekspresji nAChR w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Często preferowane jest stosowanie kąpieli, gdy poziomy ekspresji funkcjonalnej są wysokie, ponieważ aplikacja w kąpieli pozwala na uzyskanie równomiernego stężenia sondy wokół zarejestrowanej komórki, ułatwiając interpretację danych. Aplikacja w kąpieli eliminuje również potrzebę stosowania drugiej pipety perfuzyjnej w tkance, co ułatwia cały proces. Jednak stosowanie drogich związków w kąpieli kosztuje więcej w jednym eksperymencie.

Zwykle rozwiązywanie problemów polega na próbie zrozumienia, dlaczego po fotolizie błysku nie obserwuje się aktywacji nAChR. Podczas pracy z typem komórki, który nie był wcześniej badany za pomocą PA-Nic, badacz powinien przeprowadzić miejscowe zaciągnięcie ACh lub nikotyny, aby określić, czy funkcjonalnie^wyrażają się wystarczające receptory5. Aby sprawdzić, czy system jest zdolny do wykrywania reakcji fotolizy, należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne na przyśrodkowych neuronach habenula, które wyrażają duże ilości receptora³⁰. W tym obszarze mózgu możliwe jest zastosowanie kąpieli PA-Nic, która jest preferowana w przypadku eksperymentów walidacyjnych. Dopiero po przeprowadzeniu tych eksperymentów walidacyjnych należy przejść do niebadanego typu komórki. Jeśli system eksperymentalny został zwalidowany, a odpowiedzi pozostają bardzo małe lub niewykrywalne, może być uzasadnione zwiększenie stężenia PA-Nic, zwiększenie intensywności błysku lub czasu trwania impulsu, dodanie dodatniego modulatora allosterycznego nAChR w celu zwiększenia aktywności nAChR⁶ lub pewna kombinacja powyższych.

Czasami reakcje odblokowania są zbyt duże, ze znaczną aktywacją nAChR, co skutkuje pośrednią aktywacją kanału Na⁺ bramkowanego napięciem i niezaciśniętymi prądami wewnętrznymi z powodu słabego zacisku przestrzennego. Te artefakty, które całkowicie zasłaniają prądy wewnętrzne nAChR i uniemożliwiają interpretację danych, można wyeliminować poprzez włączenie QX-314 (2 mM) do pipety rejestrującej. Można je również wyeliminować poprzez zmniejszenie stężenia PA-Nic lub zmniejszenie intensywności błysku lub czasu trwania impulsu. We wszystkich eksperymentach fotostymulacji światłem widzialnym należy zachować ostrożność przy wyborze miejsc stymulacji, aby uniknąć niezamierzonej stymulacji/fotolizy powyżej lub poniżej pożądanej płaszczyzny ogniskowej. Dodatkowo, w stosownych przypadkach, moc lasera musi być zawsze miareczkowana, aby odtworzyć reakcje fizjologiczne. Szczególnie ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z fotostymulacji osi Z podczas pracy z ligandami w klatkach, ponieważ ligandy, które są aktywowane powyżej/poniżej ogniska, mogą nadal dyfundować i wchodzić w interakcje z badanym systemem biologicznym (tj. receptorami).

Laserowa fotoliza błyskowa PA-Nic może nie być odpowiednia dla wszystkich badaczy, ponieważ istnieje kilka ograniczeń. Pierwszym z nich jest stosunkowo wysoki koszt odpowiedniej konfiguracji. Podczas pracy z nienaruszonymi wycinkami mózgu, odtworzenie w klatkach w pobliżu struktur o małej średnicy, takich jak dendryty, wymaga zaawansowanego systemu wizualizacji, takiego jak mikroskop 2-fotonowy. Oprócz wysokich kosztów Ti:sapphire, przestrajalnego lasera impulsowego w podczerwieni do wykonywania mikroskopii 2-fotonowej, system z podwójnym galwanometrem zdolny do niezależnego pozycjonowania dwóch wiązek laserowych dodatkowo zwiększa koszt systemu. Całkowite koszty systemu można zmniejszyć, korzystając z systemu zbudowanego w domu, jeśli badacz ma wystarczającą wiedzę i czas na budowę, rozwiązywanie problemów i konserwację takiego systemu. Drugie ograniczenie często wiąże się z niską ekspresją funkcjonalną nAChR, którą można częściowo złagodzić, podejmując kroki jak wspomniano powyżej, ale może to nie gwarantować sukcesu. Zazwyczaj, jeśli nie można zmierzyć prądów aktywowanych ligandem po zaciągnięciu agonistów, fotoliza błyskowa PA-Nic pod cęgami napięciowymi może nie dać akceptowalnych wyników. Trzecie ograniczenie dotyczy wewnętrznej fluorescencji PA-Nic. PA-Nic pochłania światło o długości fali ~405 nm i emituje w podobnym zakresie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) czy Alexa 488⁵. Gdy stężenia PA-Nic przekraczają ~1 mM, ta właściwość fluorescencji może utrudnić jednoczesną wizualizację struktur neuronalnych. Aby temu zapobiec, bardzo ważne jest, aby móc łatwo kontrolować przepływ PA-Nic z pipety perfuzyjnej. Okresowo przepływ PA-Nic był zatrzymywany, aby umożliwić dyfuzję cząsteczek fluorescencyjnych. Pozwoliło to na ponowne zobrazowanie neuronu w celu sprawdzenia pozycji punktowej wiązki odłączającej się od klatkowni. Czwartym potencjalnym ograniczeniem, o którym należy wspomnieć, jest wykorzystanie światła o długości fali 405 nm do fotolizy. Krótsze fale, takie jak 405 nm, są bardziej podatne na rozpraszanie w złożonych tkankach, takich jak wycinek mózgu. Tak więc, przy danej intensywności i czasie trwania błysku, amplitudy odpowiedzi na odblokowanie i kinetyka zaniku mogą być różnie zależne od głębokości ogniska uncageingu w przekroju. Wnioski dotyczące biologicznych aspektów nAChR powinny uwzględniać to ważne zastrzeżenie.

Ta zlokalizowana technika laserowej fotolizy błyskowej została niedawno wykorzystana do odkrycia nowych szczegółów na temat neurobiologii nAChR. Na przykład przewlekła ekspozycja na nikotynę poprawia perysomatyczną i dendrytyczną funkcję nAChR w przyśrodkowych neuronach habenula⁵. Wykorzystano go również do wykazania, po raz pierwszy, że neurony glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki wyrażają funkcjonalne nAChR w swoich perymatycznych i dendrytycznych przedziałach komórkowych⁶. Istnieje wiele potencjalnych przyszłych zastosowań tej techniki, a podejście to można zastosować do innych kluczowych typów neuronów, o których wiadomo, że wyrażają nAChR, takich jak neurony piramidowe kory mózgowej³¹ lub interneurony w korze mózgowej³², prążkowiu³³ i hipokampie¹⁹. Technikę tę można również połączyć z farmakologią i/lub edycją genów nAChR³⁴ w celu zlokalizowania określonych podtypów receptorów w różnych przedziałach neuronalnych. Podejście to można łatwo dostosować do innych związków umieszczanych w klatkach kumarynowych, w tym między innymi do tych opracowanych równolegle z PA-Nic⁵. Wreszcie, fotoliza błyskowa PA-Nic może pewnego dnia zostać wykorzystana u obudzonego / zachowującego się zwierzęcia do badania działania nikotyny w nowych paradygmatach farmakologii behawioralnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instruments, materiały eksploatacyjne i różne chemikalia
Multiclamp 700B	Molecular Devices Corp.		Wzmacniacz zacisków krosowych
Pneumatyczna pompa Picopump	World Precision Instruments	Ściągacz do mikropipet PV820
	Regulator temperatury Sutter Instrument Co	P-97
Warner	Instruments	TC-324C
Mikrotom z ostrzem wibracyjnym	Filtr
Ultrafree-MC	MilliporeSigma	UFC30GV0S	wewnętrzny filtr roztworu
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments	1B150F-4	łatka i aplikacja miejscowa pipeta
(-) -Sól wodorowinianu nikotyny	Glentham	GL9693	sól nikotynowa
7-karboksymetyloamino-4-metylo kumaryna	Janelia Research Campus		PA-Nic produkt
uboczny1-[7-[bis(karboksymetylo)-amino]kumaryno-4-ylo]metylo-nikotyna	Janelia Research Campus		PA-Nic
Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodowa)	Virbac	ANADA #200-071
Alexa FluorTM 488 Hydrazide	ThermoFisher	A10436	zielony barwnik wypełniający
Alexa FluorTM 568 Hydrazide	ThermoFisher	A10437	czerwony barwnik wypełniający
6- karboksyl-AF594 (Alexa Fluor 594)	Janelia Research Campus		czerwony barwnik
wypełniający QX 314 chlorek	Tocris	2313	bramkowany napięciem bloker kanałów sodowych
Miernik mocy	ThorLabs	S120C
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Chemicals for Solutions
N-Methyl-D-glucamine	Sigma	M2004
Chlorek potasu	Sigma	P3911
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny	Sigma	S9638
Wodorowęglan sodu	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
D-(+)-Glukoza	Sigma	G5767
(+)-L-askorbinian sodu	Sigma	A4034
Tiomocznik	Sigma	T8656
Pirogronian sodu	Sigma	P2256
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma	230391
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma	223506
Chlorek sodu	Sigma	S9625
Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′ Kwas -tetraoctowy	Sigma	E3889
Sól magnezowa adenozyno-5&trifosforanu	Sigma	A9187
Sól sodowa guanozyny 5′-trifosforanu	Sigma	G8877
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Comments
Elementy mikroskopu 2-fotonowego
Skaner laserowy Ultima do mikroskopu Olympus BX51	Bruker Nano, Inc.		Oprogramowanie do obrazowania i galvos
Galwanometry obrazowania X-Y	Cambridge Technology
Mai Tai HP1040	Spectra-Physics		Dostrajalny laser na podczerwień
Ogniwo Pockels M350-80-02-BK z M302RM Driver	Conoptics, Inc.		do tłumienia lasera IR
Integracja czujnika mocy fotodiody sferycznej	Thorlabs, Inc		fotodioda laserowa do odbierania energii
Galwanometry X-Y Uncaging	Cambridge Technology
Wprowadzenie na rynek 2-liniowego lasera Helios	Bruker Nano, Inc.		Odblokowywanie elementów lasera
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)	Coherent, Inc.
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)	Coherent, Inc.
Punktowy moduł fotoaktywacji / wejścia światłowodowego do wózka bocznego limuzyny - Uncaging	Bruker Nano, Inc.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Mikroskop pionowy	Olympus	BX51WIF	Pionowa obudowa mikroskopu
Cel: Olympus M Plan FL 10x; NA 0,3 WD 11 mm	Obiektyw Olympus		10x
Obiektyw: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR	Olympus		60x, obiektyw do zanurzania w wodzie
X-Cite 110, czterodiodowe źródło światła epi-fluorescencji LLG	Źródło światła LED	Excelitas Technologies
Filtr Epi-Fluorescencyjny: ET-GFP (FITC/CY2) do Epi-Turret	Chroma Technologies		Filtr LED do wzbudzenia światła niebieskiego
Filtr Epi-Fluorescencyjny: ET-DsRed (TRITC/CY3) do Epi-Turret	Chroma Technologies		Filtr LED do wzbudzenia światła zielonego
B& Kamera CCD W; Watec, 0,5 cala B/W CCD	Watec Co., LTD.		Kamera CCD do nagrywania z zaciskiem krosowym
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Detektory zewnętrzne - Podwójna emisja odbita - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)	Bruker Nano, Inc.
Multi-alkaliczny boczny PMT	Hamamatsu	R3896	czerwony kanał PMT
Filtr	spalinowy czerwonokanałowy	Chroma Technologies
Rozdzielacz	wiązki dichroicznej	Chroma Technologies
GaAsP end-on PMT	Hamamatsu	7422PA-40	zielony kanał PMT
Filtr	emisji spalin zielonokanałowy	Chroma Technologies
Szybka migawka do Hamamatsu H7422 PMT	Vincent Associates / Bruker	517329	PMT montaż migawki
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Dodt Moduł detekcji transmisji kontrastu gradientowego	Bruker Nano, Inc.
Wieloalkaliczny PMT z boku	Hamamatsu	R3896	Dodt PMT