Artykuł metodologiczny

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58873

⸱

25 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Streszczenie

Acetylocholina (ACh) działa poprzez receptory, modulując różne procesy neuronalne, ale trudno było powiązać funkcję receptora ACh z subkomórkowym położeniem w komórkach, w których ta funkcja jest realizowana. Aby zbadać subkomórkową lokalizację nikotynowych receptorów ACh (nAChR) w natywnej tkance mózgowej, opracowano metodę optyczną precyzyjnego uwalniania nikotyny w dyskretnych miejscach w pobliżu błon neuronalnych podczas zapisów elektrofizjologicznych. Neurony zaciśnięte w plasterkach mózgu są wypełniane barwnikiem, aby uwidocznić ich morfologię podczas 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, a odblokowanie nikotyny odbywa się za pomocą błysku światła poprzez skupienie wiązki laserowej 405 nm w pobliżu jednej lub więcej błon komórkowych. Mierzone są odchylenia prądu komórkowego i tworzony jest trójwymiarowy (3D) obraz zarejestrowanego neuronu o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić pogodzenie odpowiedzi nAChR z morfologią komórkową. Metoda ta pozwala na szczegółową analizę dystrybucji funkcjonalnej nAChR w złożonych preparatach tkankowych, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia neuroprzekaźnictwa cholinergicznego.

Wprowadzenie

Sygnalizacja cholinergiczna moduluje liczne procesy zachodzące w mózgu, w tym kontrolę uwagi, ruchy wolicjonalne i nagrodę1,2. Leki, które zwiększają przekaźnictwo acetylocholiny (ACh) są stosowane w leczeniu zaburzeń poznawczych związanych z chorobą Alzheimera, co sugeruje ważną rolę układów cholinergicznych w funkcjach poznawczych3. Lepsze zrozumienie receptorów i obwodów cholinergicznych w stanach zdrowych i chorych może prowadzić do lepszych podejść terapeutycznych w przypadku kilku chorób/zaburzeń neurologicznych.

Nikotynowe receptory ACh (nAChR) to rodzina kanałów jonowych bramkowanych ligandem, które przepływają kationy w odpowiedzi na endogenne ACh lub egzogenną nikotynę z wyrobów tytoniowych. Biorąc pod uwagę fakt, że były to jedne z pierwszych receptorów neuroprzekaźników, które zostały opisane4, farmakologia nAChR i lokalizacja we włóknach mięśniowych jest dobrze poznana dla receptorów typu mięśniowego. W przeciwieństwie do tego, stosunkowo niewiele wiadomo na temat farmakologii i subkomórkowej dystrybucji natywnych nAChR w mózgu. Ta luka w wiedzy została niedawno wypełniona poprzez opracowanie nowej sondy chemicznej, która pozwala na przestrzennie ograniczoną i szybką aktywację nAChR w tkance mózgowej podczas obrazowania komórkowego i zapisu elektrofizjologicznego5. W tym miejscu opisano kluczowe kroki metodologiczne związane z tym podejściem, którego ogólnym celem jest zwiększenie zdolności do łączenia funkcji nAChR ze strukturą neuronalną.

5,6. Przed rozpakowaniem, PA-Nic jest stabilny w roztworze i nie wykazuje żadnych niepożądanych cech farmakologicznych lub fotochemicznych5. Po fotolizie uwolniona nikotyna w przewidywalny sposób aktywuje nAChR, a produkty uboczne odklejania są farmakologicznie obojętne5. Jako źródło światła do fotolizy stosuje się laser o fali ciągłej o mocy wyjściowej >1 mW mierzonej na próbce. W przypadku lokalizacji, ukierunkowana fotostymulacja jest połączona ze zdolnością do lokalizacji błon komórkowych za pomocą 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (2PLSM), a dwie kluczowe zalety tego podejścia są w pełni zrealizowane: szybkość fotolizy i precyzja przestrzenna.

Pod wieloma względami, fotoliza PA-Nic jest lepsza od innych metod dostarczania ligandów nAChR do receptorów w wycinkach mózgu. Takie podejścia obejmują aplikację w kąpieli7 i miejscowe podawanie leku za pomocą pipety puffer8. Podczas gdy pierwsze podejście ma tendencję do nadmiernego podkreślania długoterminowych skutków stosowanego leku, drugie podejście może cierpieć z powodu zmienności kinetyki odpowiedzi między badaniami i między komórkami. Żadne z tych alternatywnych podejść nie jest w stanie odpowiednio odróżnić aktywności receptorów w różnych lokalizacjach komórkowych od tego samego neuronu. Optogenetycznie aktywowane uwalnianie ACh zostało wykorzystane do badania natywnych lokalizacji nAChRs < sup class="xref">9,10,11, ale nie okazało się przydatne do mapowania subkomórkowych lokalizacji nAChR. Co więcej, większość badań wykorzystujących to podejście opierała się na transgenicznej myszy bakteryjnej z ekspresją ChR2 z ekspresją ChR2 z nieprawidłową transmisją cholinergiczną12,13,14,15,16,17.

PA-Nic fotoliza nie jest jedynym optycznym podejściem do badania receptorów cholinergicznych. Karbachol w klatce został użyty do funkcjonalnego mapowania aktywności receptora ACh w hodowanych komórkach18 i brain slices19, ale nie był komercyjnie dostępny do badań porównawczych podczas opracowywania PA-Nic. Doniesiono, że kompleks rubinowy bis(bipirydyna)-nikotyna (RuBi-nikotyna) pozwala na odtworzenie nikotyny20, ale komercyjne preparaty RuBi-nikotyny okazały się gorsze od PA-Nic w bezpośrednim badaniu porównawczym5. Przydatne może być powtórzenie takich eksperymentów porównawczych z niekomercyjną, wysoce oczyszczoną RuBi-nikotyną, ponieważ jej widoczna absorpcja może uzupełniać cechy PA-Nic, aby prowadzić badania cholinergiczne. Wreszcie, nAChR zostały również optycznie zmanipulowane przy użyciu kombinacji fotoprzełączalnych ligandów i genetycznie zmodyfikowanych receptorów21. Podejście to jest komplementarne do fotolizy PA-Nic w tkance mózgowej, przy czym zdolność/wymóg genetycznego celowania zmodyfikowanego nAChR jest postrzegany zarówno jako zaleta, jak i wada.

Należy zwrócić uwagę na kilka kluczowych wymagań tego podejścia. Po pierwsze, potrzebna jest odpowiednia metoda wizualizacji, aby dokładnie zlokalizować błonę neuronalną. Obrazowanie za pomocą konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej może być wystarczające podczas badania hodowanych komórek, ale do rejestracji z neuronów w wycinkach mózgu lub innych preparatach z grubych tkanek wymagane jest 2PLSM lub mikroskopia konfokalna. Po drugie, potrzebna jest odpowiednia metoda pozycjonowania wiązki lasera fotolizy. Podejście to wykorzystuje głowicę skanującą z podwójnym galwanometrem z dwoma niezależnymi lustrami x-y do skanowania rastrowego wiązki obrazowania i fotoaktywacji punktowej za pomocą wiązki laserowej do odblokowywania 22,23,24. Możliwe są inne, bardziej ograniczone rozwiązania, takie jak (1) pojedyncza głowica skanująca galwanometru, która na przemian skanuje raster wiązki obrazowania i wiązki nieklatkowej, lub (2) po prostu skierowanie wiązki odblokowującej na środek pola widzenia, tak aby komórka została doprowadzona do tej pozycji w celu fotolizy błyskowej. Po trzecie, system do jednoczesnej rejestracji elektrofizjologicznej jest wymagany, jeśli ktoś chce zbierać sygnały fizjologiczne podczas eksperymentów. Powyższe wymagania można spełnić za pomocą odpowiedniej techniki obrazowania w pełni optycznego, jak niedawno opisano5. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół, który opisuje kluczowe kroki tego podejścia.

Protokół

Praca dotycząca przygotowania wycinków mózgu została przejrzana i zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern (protokół #IS00003604).

>UWAGA: Lasery używane do punktowej fotostymulacji to widzialne lasery klasy IIIb, które mogą potencjalnie zaszkodzić oczom. 2PLSM wymaga lasera bliskiej podczerwieni (NIR) klasy IV (>500 mW), który może spowodować poważne uszkodzenie oczu, a nawet oparzenia innych tkanek. Aby zapewnić bezpieczną pracę sprzętu laserowego, wymagane jest odpowiednie ograniczenie wiązki laserowej, blokady systemowe oraz kontrole inżynieryjne i administracyjne. Podczas pracy z laserami należy zawsze kontaktować się z lokalnym personelem zajmującym się bezpieczeństwem laserów.

1. Kalibracja i weryfikacja lasera (laserów) do rozłączania

  1. Określ ilościowo moc lasera, która ma być dostarczona do próbki.
    1. Włącz laser 405 nm (maksymalna moc 100 mW z sygnałem sterującym 5 V) i pozwól systemowi laserowemu rozgrzać się przez około 10 minut
      nuta: Laser jest nadal przesłonięty (z napędem 0 V) i nie ma mocy wyjściowej, dopóki do lasera nie zostanie wysłane napięcie sterujące w celu modulacji mocy wyjściowej.
    2. Umieść miernik mocy w płaszczyźnie próbki tkanki lub w miejscu soczewki kondensatora. Ręcznie wyśrodkuj miernik względem ścieżki optycznej/soczewki obiektywu.
    3. Ustaw miernik na prawidłowy zakres długości fali (400-1100 nm). Wyzeruj miernik, naciskając odpowiedni przycisk.
    4. Korzystając z elementów sterujących oprogramowania, wybierz 100 (z maksimum 1000; 1000 = 5 V) dla mocy lasera 405 nm, co ustawia laser na 10% pełnej mocy. W razie potrzeby napięcie sterujące laserem może być również wprowadzone do systemu PrairieView za pośrednictwem VoltageRecord, aby zapewnić cyfrowy zapis czasu sygnału sterującego i poziomu mocy.
    5. Zapisz odczyt z miernika mocy.
    6. Wybierz 150 (15% z maks. 1000) dla mocy wyjściowej lasera 405 nm i zapisz odczyt z miernika mocy. Powtórz to dla następujących mocy wyjściowych, aby zebrać krzywą mocy lasera: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 i 1000.
  2. Skalibruj galwanometry laserowe do odłączania. Poniższe kroki należy wykonywać za każdym razem, gdy następuje zmiana elementów optycznych systemu, gdy istnieje obawa o dokładne pozycjonowanie punktowe lub regularnie co miesiąc.
    1. Zainstaluj soczewkę obiektywową mikroskopu zanurzającego się w wodzie 60x, która będzie używana w eksperymentach fotostymulacji i obrazowania. W oprogramowaniu do akwizycji/obrazowania wybierz soczewkę obiektywu 60x i ustawienie zoomu optycznego na 1 (patrz krok 3.1.4.2.).
    2. Zaznacz wypełnione kółko na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym za pomocą czerwonego markera permanentnego. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, markerem skierowanym w stronę obiektywu.
    3. Ustaw ostrość mikroskopu na obszarze czerwonego znacznika za pomocą obiektywu 4x lub 10x. Dodaj 1-2 ml wody na górę czerwonej kropki/plamki znacznika, a następnie przełącz się na obiektyw 60x i zanurz obiektyw w wodzie. Ustaw ostrość soczewki obiektywu na cienkim obszarze czerwonego markera.
    4. Przełącz się na 2-fotonowe skanowanie laserowe. W przypadku większości systemów przesuń wieżyczkę do pozycji #1, przesuń pryzmat trójokularowy z drogi światła, przesuń lustro głowicy skanującej do przodu i ustaw długość fali lasera na ~900 nm. Wybierz opcję pola 512 x 512 pikseli dla parametrów akwizycji obrazu, która jest domyślnym elementem piksela dla procedury kalibracji lustra stymulacyjnego.
    5. Rozpocznij skanowanie systemu z mocą lasera obrazowania większą niż minimalna i dostosuj ostrość obiektywu do cienkiej warstwy fluorescencji czerwonego markera. Wybierz pole w polu fluorescencji wolne od zanieczyszczeń i równomiernie pokryte markerem.
      nuta: Konfiguracja w tym protokole korzysta z oprogramowania do akwizycji/obrazowania PrairieView 5.4.
    6. Otwórz funkcję Uncaging Galvo Calibration w menu Narzędzia – Kalibracja/Wyrównanie oprogramowania. Zapoznaj się z samouczkiem dotyczącym miejsc oparzenia, aby uzyskać informacje na temat kalibracji przestrzennej drugiej pary luster galwanometru.
      1. W samouczku dotyczącym oparzeń wybierz laser 405 nm, wybierz moc stymulacji laserowej 400 i czas trwania stymulacji 20 ms. Powinno to spowodować powstanie małych (~1-5 μm średnicy) otworów w czerwonym markerze.
        nuta: Zwykle używane są ustawienia takie jak ~2-4 mW i 1-10 ms, ale ustawienia są określane przez próbkę. Ustawienia mocy fotostymulacji PA-Nic będą prawdopodobnie znacznie niższe niż moc wymagana podczas kalibracji do ablacji widocznego otworu w czerwonym szkiełku znacznikowym. Ta procedura kalibracji jest przydatna do lokalizowania miejsc fotostymulacji, ale nie powinna być używana do wnioskowania o bezwzględnych objętościach fotostymulacji podczas reakcji fizjologicznych.
      2. Wybierz opcję Aktualizuj, aby stymulować i odświeżać obraz po wypaleniu środkowego punktu i przesunąć okrągły czerwony wskaźnik do rzeczywistej lokalizacji punktu. Zrób to dla punktu środkowego, prawego punktu środkowego, dolnego punktu środkowego, a na końcu dla siatki dziewięciu punktów (wszystkie rogi i krawędzie oraz środek obrazu).
        nuta: Środkowe, prawe i dolne skorygowane lokalizacje plamek określają napięcia galwanometru stymulacji w celu zdefiniowania rzeczywistego środka oraz współczynników skalowania X i Y w celu dopasowania pary lustra stymulacji do pary zwierciadła obrazowania. Oprogramowanie będzie skalować i aktualizować wszystkie kolejne eksperymenty MarkPoints wykonywane przy ustawieniach powiększenia innych niż powiększenie kalibracji przestrzennej.
    7. Przetestuj kalibrację, otwierając okno MarkPoints i ręcznie aktywując parametry stymulacji w zdefiniowanym miejscu (miejscach) w nowym obszarze próbki. Upewnij się, że poprawny, najnowszy plik kalibracyjny został załadowany do okna MarkPoints. Aktywuj funkcję MarkPoints/Group lub MarkPoints Series w zdefiniowanym miejscu (miejscach) lub skorzystaj z funkcji Live/Ablation, aby kliknąć prawym lub lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu obrazu podczas skanowania na żywo, aby zastosować impuls testowy i zweryfikować poprawność kalibracji.
      nuta: Punkt oparzenia lasera powinien być teraz idealnie wyśrodkowany na wskaźniku MarkPoints.
    8. Monitoruj i rejestruj aktywację mocy impulsu laserowego i czas trwania, wyłączając napięcie napędu w programie VoltageRecord (patrz krok 1.1.4). Podobnie, zarejestruj położenie każdego miejsca stymulacji za pomocą skalowanego sygnału napięciowego z sygnałów zwrotnych pochodzących z pary luster galwanometru fotostymulacji.

2. Przygotowanie fotoaktywowanej nikotyny (PA-Nic)

  1. Pobrać z magazynu porcję liofilizowanego leku aktywowanego fotoaktywowalnie.
    nuta: Następujący protokół jest specyficzny dla PA-Nic; Dostosuj w razie potrzeby do innych leków fotoaktywowanych. Chociaż PA-Nic wykazuje wyjątkową stabilność5, podejmij rozsądne środki ostrożności, aby chronić go przed ekspozycją na jasne światło podczas przygotowań i/lub eksperymentów. Można to osiągnąć, po prostu pracując w słabym świetle; Ograniczanie się do światła filtrowanego na czerwono nie jest konieczne.
  2. Wykonaj lokalną aplikację PA-Nic.
    1. Wyciągnij szklaną mikropipetę o średnicy otworu 20-40 μm za pomocą programowalnego ściągacza do pipet.
    2. Przefiltruj ~1 ml roztworu nagrywającego z filtrem 0,22 μm. Zawiesić pewną ilość PA-Nic w przefiltrowanym roztworze do nagrywania, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Na przykład rozpuść liofilizowaną podwielokrotność o stężeniu 100 nmol w 50 μl przefiltrowanego roztworu do nagrywania.
      nuta: Sugerowany skład roztworu rejestrującego można znaleźć w najnowszych publikacjach5,6 wykorzystujących fotolizę PA-Nic.
    3. Napełnij pipetę do aplikacji lokalnej 50 μl 2 mM PA-Nic.
    4. Zamocuj pipetę do aplikacji miejscowej w uchwycie na pipety zamontowanym na mikromanipulatorze. Podłącz uchwyt pipety za pomocą odpowiedniego przewodu do systemu wyrzutu ciśnienia zdolnego do długotrwałego stosowania niskiego ciśnienia (1-2 psi).
    5. Za pomocą mikromanipulatora wmanewruj pipetę do aplikacji miejscowej w zewnątrzkomórkowym roztworze rejestrującym i umieść końcówkę pipety nieco powyżej tkanki mózgowej myszy znajdującej się ~50 μm od interesującej nas komórki. Zapoznaj się z poprzednim raportem, aby uzyskać szczegółowy protokół przygotowania wycinków mózgu myszy i nagrań z zaciskami łatek8.
    6. Sprawdź parametry aplikacji, krótko wywierając nacisk (1-2 psi). Przemieszczenie komórki będącej przedmiotem zainteresowania powinno być minimalne lub żadne. W przypadku wystąpienia znacznego ruchu, należy umieścić pipetę do aplikacji miejscowej dalej (w kierunku bocznym i/lub osiowym) od celi będącej przedmiotem zainteresowania.
    7. Po osiągnięciu stabilnego zacisku krosowego całego ogniwa (szczegóły dotyczące tego są zawarte we wcześniejszej publikacji8), włącz aplikację niskociśnieniową (1-2 p.s.i.) za pomocą odpowiedniego przełącznika ręcznego na urządzeniu do wyrzucania ciśnienia. Nasycić tkankę otaczającą komórkę PA-Nic przez 1-2 minuty przed przejściem do następnego kroku.
  3. Wykonaj kąpiel (superfuzję) PA-Nic do wycinka mózgu.
    1. Rozpuścić ilość PA-Nic w objętości roztworu rejestrującego odpowiedniej do ciągłej recyrkulacji, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM. Na przykład, rozpuścić podwielokrotność 1 μmol w 10 ml roztworu rejestrującego za pomocą standardowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Rozpocząć recyrkulację roztworu PA-Nic z szybkością 1,5-2 ml/min, otwierając odpowiedni regulator przepływu w systemie perfuzyjnym. Recyrkulacja zachodzi na czas trwania nagrania. Aby oszczędzać cenny lek, należy zminimalizować objętość recyrkulacji, stosując rurki o minimalnej średnicy wewnętrznej i/lub skracając całkowitą długość rurki używanej w systemie perfuzyjnym.
      nuta: Wykonując te czynności, objętość do recyrkulacji kąpieli można zmniejszyć do 5 ml roztworu PA-Nic. Roztwory PA-Nic mogą być często używane przez dwa kolejne dni nagrywania w ciągu tego samego tygodnia, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C przed światłem.
    3. Podczas recyrkulacji roztworu należy w sposób ciągły bąbelkować karbogenem (5%O2, 95% CO2 ) i utrzymywać temperaturę kąpieli na poziomie 32 °C.
    4. Zachowaj wycinek mózgu w roztworze nagrywającym podczas pracy z PA-Nic w warunkach słabego oświetlenia.

3. Obrazowanie neuronów za pomocą 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej

  1. Wykonaj wizualizację komórki na żywo.
    1. Zidentyfikuj/zwizualizuj neuron przyśrodkowy habenula (MHb) za pomocą optyki światła przechodzącego lub kontrastu różnicowego interferencji podczerwieni (IR/DIC) i kamery wideo i ustal stabilny zapis z klamrą krosową całej komórki. Zapoznaj się z poprzednim protokołem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat nagrań zacisków łatek z neuronów w starannie przygotowanych wycinkach mózgu myszy8.
    2. Po ustaleniu konfiguracji ogniwa o wysokiej rezystancji (>1 GΩ), ale przed włamaniem, przełącz konfigurację i oprogramowanie w tryb skanowania laserowego.
    3. Po włamaniu użyj skaningu laserowego, aby sprawdzić, czy barwnik obrazujący (rozcieńczony do końcowego stężenia 100-200 μM w standardowym roztworze pipety wewnątrzkomórkowej opisanym wcześniej8) pasywnie (przez dyfuzję) wypełnia neuron. Pozwól barwnikowi (np. Alexa Fluor 488 w zielonym kanale fotopowielacza [PMT], PMT 2; lub Alexa Fluor 568 lub 594 w czerwonym kanale PMT, PMT 1) wypełnić przedziały komórkowe przez co najmniej 20-30 minut przed przystąpieniem do eksperymentów, które wymagają wizualizacji jakichkolwiek przedziałów komórkowych poza somą.
      nuta: Przedziały dystalne (struktury dendrytyczne, kolce, aksony itp.) mogą wymagać 30-40 minut na pełne wypełnienie25.
    4. Użyj funkcji Live Scan w oprogramowaniu, aby zobrazować interesujący neuron i przedział subkomórkowy. Wybierz parametry obrazowania, które pozwolą na dokładną wizualizację cech neuronalnych na żywo. Manipuluj różnymi ustawieniami, aby wpłynąć lub zmienić wizualizację wyświetlania (kontrast), rozdzielczość, stosunek sygnału do szumu (S/N) i czas akwizycji klatki obrazu:
      1. Tabela przeglądowa (LUT). Otwórz okno LUT za pomocą odpowiedniej ikony z boku dowolnego okna obrazu. Po otwarciu dostosuj ustawienie podłogi (min) i sufitu (maks.) LUT dla określonego kanału obrazu, aby poprawić wizualizację kontrastu sygnału wyświetlanego na ekranie. Zmniejsz maksymalną wartość do ~1000 (z 4096, wykrywanie 12-bitowe), co pomoże wyciągnąć sygnały ściemniacza podczas pierwszego wyszukiwania komórek, sygnału i struktury.
        UWAGA: Te ustawienia mają wpływ tylko na wyświetlany sygnał, a nie na wykryte/zarejestrowane wartości. Ludzkie oko zazwyczaj jest w stanie dostrzec kontrast tylko z ~50 poziomami szarości26.
      2. Zoom optyczny. Użyj oprogramowania sterującego, aby wybrać 1-krotny zoom optyczny i użyj elementów sterujących przesuwaniem, aby zlokalizować żądany obszar w tkance. To ustawienie powiększenia daje największe kwadratowe, zeskanowane pole widzenia i wysyła największe napięcia/kąty skanowania do luster galwanometru.
        nuta: Domyślna konfiguracja to pole widzenia 12 mm x 12 mm wewnątrz głowicy skanującej, co przekłada się na 12 mm podzielone przez powiększenie obiektywu wewnątrz próbki. Dlatego obiektyw o powiększeniu 60x zapewnia zeskanowane obrazy o wielkości 200 μm z każdej strony przy 1-krotnym zoomie optycznym. Wyższe wartości zoomu optycznego skanują mniejszy obszar. 2-krotny zoom optyczny jest często najbardziej użytecznym ustawieniem do wizualizacji całych neuronów. 4x może być przydatny do wizualizacji subkomórkowych aspektów neuronów.
      3. Liczba pikseli. Aby uzupełnić 1-krotny zoom optyczny, wybierz 1024 x 1024 pikseli na linię za pomocą elementów sterujących oprogramowania. Ustaw liczbę pikseli na linię w przechwyconym i wyświetlanym obrazie, aby nie stracić szczegółów, które są możliwe z soczewki obiektywu. W przypadku obiektywu z aperturą numeryczną (NA) 60x/1,0 należy użyć następujących praktycznych wartości pikseli: 1024 x 1024 dla zoomu 1, 512 x 512 dla zoomu 2 i 256 x 256 dla zoomu 4. Końcowy rozmiar piksela (~0,17 μm; 12 mm/powiększenie/zoom/piksele) powinien wynosić połowę lub mniej rozdzielczości bocznej zdefiniowanej przez soczewkę obiektywu.
        nuta: Rozdzielczość obrazu jest definiowana tylko przez długość fali lasera i obiektyw NA (rozdzielczość 0,4 μm z wzbudzenia dwufotonowego [2PE] przy 920 nm i obiektywie 1,0 NA)27. Kryteria pełnego wzbudzenia NA, jak podano na soczewce, są takie, że intensywność 1/e2 średnicy wiązki laserowej odpowiada (lub "wypełnia") źrenicy wejściowej (ogniskowa soczewki 2 x tubus x NA / powiększenie) soczewki obiektywu. Obiektyw tubusu w opisywanym tu układzie ma ogniskową 180 mm.
      4. Czas przebywania pikseli. Użyj kontrolek programowych, aby wybrać 4 μs jako czas przebywania pikseli, przydatną wartość domyślną.
        nuta: Zmiana czasu przebywania piksela nie zmienia średniej wykrywanego sygnału; wpływa tylko na uśrednianie wewnątrz pikseli, a zmiany te można zobrazować poprzez jakość obrazu za pomocą sygnału / szumu. Czas przebywania piksela obrazu jest zawsze wielokrotnością jednostki 0,4 μs, a w przypadku większych czasów zatrzymania 12-bitowa ograniczona wartość intensywności każdego piksela obrazu jest średnią z próbek 0,4 μs. Ponieważ stosunek sygnału do szumu poprawia się jako pierwiastek kwadratowy z liczby próbek na piksel czasu przebywania (4 μs równa się dziesięciu próbkom, czyli 3,16-krotna poprawa sygnału / szumu), poprawa jakości obrazu osiąga malejące zwroty dla wartości znacznie większych niż 12 μs.
      5. Rotacja skanowania i obszar zainteresowania (ROI). Ustaw kąt obrotu obrazu na 0° za pomocą programowych elementów sterujących (może nie być wymagane żadne działanie, ponieważ obrót o 0° jest ustawieniem domyślnym dla większości systemów obrazowania). Jeśli próbka jest umieszczona w orientacji "do góry nogami", wybierz obrót o 180°, aby "odwrócić" obraz.
        nuta: Obracanie obrazu pod dowolnym kątem może zapewnić lepsze dopasowanie do całego obszaru zainteresowania wypełnionej komórki. Rotacja może również stanowić wyraźniejszą podstawę do wyrównania zmian strukturalnych i przeprowadzenia późniejszej analizy. Wybranie obszaru zainteresowania w zeskanowanym obrazie przy danym ustawieniu powiększenia (krok 3.1.4.2) powoduje zachowanie natywnej liczby pikseli (krok 3.1.4.3), ale ograniczenie całkowitej liczby obszarów i pikseli może znacznie zwiększyć liczbę klatek na sekundę, zapewniając lepszą rozdzielczość czasową zmian sygnału.
      6. Uśrednianie klatek. Wybierz ustawienie początkowej średniej klatek wynoszące 2 klatki za pomocą sterowania programowego.
        nuta: Ostateczny kontrast obrazu (S/N) jest definiowany przez całkowitą liczbę fotonów zebranych/wykrytych w pikselach sygnałowych obrazu. Uśrednianie wielu klatek obrazu może poprawić stosunek sygnału do szumu, pod warunkiem, że próbka nie porusza się ani nie jest wybielana podczas obrazowania. Interesujący sygnał pozostaje ten sam podczas uśredniania klatek, podczas gdy szum w obrazie jest redukowany przez pierwiastek kwadratowy z liczby uśrednionych klatek. Małe struktury na obrazach fluorescencyjnych często wymagają uśredniania między pikselami, łączenia pikseli w obrazie (często nazywanych ROI) i/lub uśredniania klatek. Uśrednianie klatek wydłuża czas skanowania o liczbę obrazów, które wybiera się do uśrednienia.
    5. Użyj narzędzi Panoramowanie obrazu, Obrót skanowania i Zoom optyczny, aby zorientować położenie próbki podczas skanowania. Jeśli do ustawienia próbki konieczna jest manipulacja stopniem silnikowym, należy unikać dużych rozmiarów kroków do osi X, Y i Z, aby zapobiec kolizjom obiektywu/kondensatora, wibracjom lub narażeniu wiązki laserowej na powierzchnie odbijające.
  2. Zbierz stos Z. Za pomocą narzędzia Seria Z wybierz pozycję początkową i końcową, która zawiera interesującą Cię komórkę. Wybierz rozmiar kroku (1 μm), a następnie kolejno zobrazuj neuron w każdej płaszczyźnie Z, która zawiera komórkę.
    nuta: Ustawienia akwizycji Z-stack będą się różnić w zależności od typu neuronu i barwnika wypełniającego. Optymalne parametry akwizycji Z-stack powinny być określane niezależnie od parametrów stosowanych do obrazowania na żywo. Akwizycję Z-stack można przeprowadzić przed i/lub po eksperymentach optofarmakologicznych. Jeśli to możliwe, wykonaj akwizycję Z-stack po optofarmakologii, aby uniknąć uszkodzeń komórkowych wywołanych przez 2PLSM i umożliwić optymalne wypełnienie barwnikiem małych przedziałów komórkowych.

4. Laserowa fotoliza błyskowa podczas nagrań elektrofizjologicznych

UWAGA: Zastosowanie mocy lasera 405 nm lub 473 nm ≥ 1 mW powoduje fosforescencję wewnątrz szkła obiektywu i soczewki kondensatora. To generowane światło jest bezpośrednio związane z mocą oświetlenia laserowego; Emisja jest obecna w zielonym i czerwonym oknie widmowym i ma czasy życia w stanie wzbudzonym w zakresie MS. Ten artefakt stymulacji tła jest widoczny we wszystkich testowanych soczewkach oraz w soczewkach obiektywowych zanurzanych w wodzie wszystkich głównych producentów soczewek obiektywowych. Soczewki kondensacyjne wytwarzają znacznie wyższą fosforescencję niż soczewki obiektywowe. Ten "sygnał" motywuje do stosowania mechanicznego szalunkowania w celu ochrony wrażliwych katod PMT z fosforku arsenku galu (GaAsP) podczas zdarzeń fotostymulacji. Użycie normalnie zamkniętej migawki mechanicznej (zamkniętej, gdy nie skanuje aktywnie) stanowi najlepsze rozwiązanie do ochrony chłodzonych PMT GaAsP.

  1. W przypadku geometrii wiązki fotostymulacji typu klepsydry należy usunąć wszelkie soczewki skupiające w optyce ścieżki światła, które w przeciwnym razie zwężałyby wiązkę laserową, gdy wchodzi ona do źrenicy wejściowej obiektywu.
  2. Korzystając z funkcji MarkPoints, wybierz ustawienie pojedynczego miejsca.
    nuta: Inne ustawienia fotostymulacji (wiele punktów, siatka plam, skanowanie spiralne) są możliwe w MarkPoints. Pojedynczy punkt jest najprostszy. Cele eksperymentalne i różnice biologiczne mogą wymagać innego ustawienia.
  3. Zaktualizuj obraz, korzystając z opcji Live Scan (Skanowanie na żywo), aby na krótko zobrazować i zlokalizować subkomórkowy obszar zainteresowania. Okresowo aktualizuj obraz, aby zidentyfikować wszelkie potencjalne małe odchylenia ostrości.
  4. Użyj programowych elementów sterujących, aby zwiększyć zoom optyczny (tj. wybierz wyższe ustawienie zoomu optycznego niż bieżące), jeśli to konieczne, aby uwidocznić małe struktury (np. kolce lub dystalne dendryty).
  5. Umieść pojedynczy punkt celownika MarkPoints bezpośrednio przylegający (~0,5 μm) do błony komórkowej. Nie umieszczaj miejsca fotostymulacji bezpośrednio nad elementem komórkowym, ponieważ może to prowadzić do fotouszkodzenia.
  6. Ustaw parametry fotostymulacji za pomocą kontrolek oprogramowania w MarkPoints. Zastosuj początkowe wskazówki w następujący sposób: czas trwania 1-50 ms, moc lasera 1-4 mW i próba ≥1.
  7. Wybierz opcję Uruchom MarkPoints, aby zainicjować protokół MarkPoints i obserwować pozyskiwanie danych elektrofizjologicznych w czasie rzeczywistym.
  8. Powtórzyć kroki 4.2-4.7 kilka razy, aby ocenić spójność i stabilność, lub ich brak, amplitudy i kinetyki odpowiedzi.

Wyniki

W przypadku stymulacji fotolizą kluczowymi zmiennymi są dawka ekspozycji (natężenie i czas), miejsce ekspozycji oraz geometria wiązki. System opisany w niniejszym artykule umożliwia zastosowanie dwóch różnych wiązek fotostymulacyjnych, regulowanych poprzez przesuwanie soczewki do wewnątrz lub na zewnątrz ścieżki światła fotostymulacyjnego, zanim wiązka trafi do systemu galwanometru. Bez tej soczewki wiązka fotostymulacyjna wypełnia źrenicę wejściową obiektywu wodnego 60x/1.0 NA [60x WD], tworząc w płaszczyźnie ogniskowej wewnątrz próbki plamkę o rozmiarze sub-µm, bliską granicy dyfrakcyjnej. Jest to związane ze światłem fotostymulacyjnym o kształcie klepsydry, rozciągającym się powyżej i poniżej plamki ogniskowej symetrycznie względem osi optycznej. Po wstawieniu soczewki do ścieżki, światło lasera fotostymulacyjnego jest skupiane w źrenicy wejściowej obiektywu, a następnie wychodzi w postaci wiązki przypominającej ołówek. Wiązka ta, której średnica dla obiektywu 60x powinna wynosić ~10 µm, rozciąga się jednorodnie i pionowo przez całą próbkę. W tym trybie natężenie światła w dowolnym miejscu w obrębie plamki stymulacji będzie wynosić ~1% natężenia małej plamki bliskiej granicy dyfrakcyjnej. W związku z tym przy stymulacji plamką o rozmiarze ~10 µm zazwyczaj wymagana jest wyższa moc lasera. we wszystkich eksperymentach opisanych w niniejszym artykule zastosowano wiązkę fotostymulacyjną typu klepsydra.

Dostarczoną moc próbki można przedstawić na wykresie w zależności od nastawy napięcia wejściowego, po zmierzeniu mocy lasera w miejscu próbki za pomocą miernika mocy. W badaniach tych wykorzystano obiektyw 60x WD o odległości roboczej 2 mm, jednak w celu uniknięcia potencjalnego uszkodzenia elementu detektora nie zanurzano go w wodzie podczas pomiarów mocy. W przypadku pomiarów w powietrzu (bez medium imersyjnego) obiektywów o podanej wartości NA > 0,95 mogą wystąpić straty wynikające z całkowitego wewnętrznego odbicia na przedniej soczewce ze względu na niższy współczynnik załamania (powietrze). W takim przypadku, aby uzyskać dokładniejszy pomiar mocy próbki (w celu skorygowania strat z powodu całkowitego wewnętrznego odbicia), należy zwiększyć zmierzoną moc o wartość dla obiektywu 1,0 NA (1,0/0,95)2 zmierzoną w powietrzu. Rysunek 1a przedstawia typowy wykres wejścia/wyjścia dla laserów widzialnych o długości fali 405 nm i 473 nm, które zostały włączone do systemu wprowadzania wiązki laserowej w niniejszym badaniu. Systemy laserowe te są idealne do kontroli dawki ekspozycji podczas fotostymulacji z następujących powodów: (1) są wstępnie skalibrowane tak, aby zapewnić bezpośrednio liniową moc wyjściową w stosunku do napięcia wejściowego (0-5 V), (2) zapewniają cichą pracę migawki (bez emisji lasera) oraz (3) posiadają szybką kontrolę czasu trwania impulsu intensywności w skali sub-ms (czas odpowiedzi 0,1 ms). Podczas stosowania punktowej fotostymulacji w systemie laser/galvo niezbędnym zadaniem jest rutynowa kalibracja punktów MarkPoints. Rysunek 1b (panel lewy) przedstawia system rozkalibrowany (pożądany punkt do fotostymulacji nie skutkuje dokładną stymulacją tego punktu, co wskazuje lokalizacja wypalonego otworu), a następnie powrót do dokładnego pozycjonowania punktu po kalibracji (Rysunek 1b, panel prawy).

PA-Nic wykazuje umiarkowaną fluorescencję (pików emisji przy ok. 510 nm), wykazując efektywne wzbudzenie w zakresie 350–450 nm (wzbudzenie jednofotonowe) lub 700–900 nm (wzbudzenie dwufotonowe)5Aby zwizualizować PA-Nic podczas aplikacji lokalnej, naniesiono PA-Nic (1 mM) w pobliże tkanki mózgowej, po czym przeprowadzono jednoczesne obrazowanie: (1) przekroju optycznego tkanki mózgowej w kontekście transmisyjnym przy użyciu kontrastu Dodt oraz (2) fluorescencji emitowanej na skutek wzbudzenia (900 nm) PA-Nic. Fluorescencję 2PE PA-Nic można było łatwo wykryć podczas wtrysku pod ciśnieniem z pipety do aplikacji lokalnej (Rycina 2a). Nikotyna i monoalkilokumaryna, 7-karboksymetyloamino-4-metylokumaryna, są głównymi produktami fotochemicznymi reakcji fotolizy PA-Nic5Stosując te same ustawienia/parametry obrazowania, które wykorzystano do obrazowania PA-Nic, wykonano obrazowanie tkanki podczas podawania nikotyny (1 mM) lub 7-karboksymetylamino-4-metylokumaryny (1 mM). Nie wykryto sygnału fluorescencyjnego (Rycina 2a, panele środkowy i dolny), co potwierdza specyficzność wyników PA-Nic. Na koniec zastosowano PA-Nic w tkance mózgowej i wykonano obrazowanie emisji fluorescencji PA-Nic (Rycina 2b). Podejście to potwierdza, że PA-Nic znajduje się w obrębie 100-200 µm pipety do aplikacji miejscowej. Dane te wspólnie potwierdzają, że PA-Nic jest skutecznie dostarczany do tkanki mózgowej poprzez aplikacja miejscowa

Rejestracje elektrofizjologiczne z jednoczesnym zastosowaniem 2PLSM do wizualizacji struktur komórkowych wymagają od badacza zrównoważenia kwestii dotyczących obu komponentów eksperymentu; często dostępny jest jedynie wąski przedział czasowy (~20 min) na uzyskanie prawidłowych danych z komórki poddanej patch-clampowi. Bez uwzględnienia wizualizacji komórkowej najlepszą praktyką jest rozpoczęcie rejestracji tak szybko, jak to możliwe po przerwaniu błony, ponieważ stabilność rejestracji ma tendencję do spadku w czasie. Jednakże, gdy obrazowanie jest wymagane, rozważania elektrofizjologiczne muszą uwzględniać czas niezbędny do zwiększenia stężenia fluorescencji w małych lub odległych strukturach. Przykładem jest analiza krzywej wypełniania stężeniem barwnika28, której wyznaczenie jest czasami przydatne przy obrazowaniu nowego typu komórek. Rycina 3 przedstawia kilka przykładowych neuronów obrazowanych jako stosy Z (Z-stacks) za pomocą 2PLSM, a następnie scalonych do projekcji maksymalnej intensywności w celach prezentacyjnych. Rycina 3a pokazuje wysokiej jakości obrazy, na których morfologia neuronów wydaje się być kompletna, szum jest zminimalizowany, a zanieczyszczenia nie utrudniają interpretacji morfologii komórkowej. Rycina 3b przedstawia obrazy niższej jakości ze względu na niższy stosunek sygnału do tła oraz znaczną ilość zanieczyszczeń. Zanieczyszczenia te często występują jako sferyczne obszary intensywnej fluorescencji, powstające w wyniku wyrzutu barwnika obrazującego z pipety patch podczas zbliżania się do komórki. Warto zauważyć, że dodanie 100 µM PA-Nic do kąpieli (przy aplikacji kąpielowej) ma tendencję do obniżania stosunku sygnału do tła i prowadzi do nieoptymalnego kontrastu obrazu. Alexa Fluor 568 lub 594 jest często bardzo użyteczna w eksperymentach z aplikacją lokalną jako barwnik pomocniczy (finder dye) lub jako normalizacyjny sygnał odniesienia/normalizacji 2PE. Efektywna długość fali dla dwufotonowego wzbudzenia tych barwników wynosi ~780 nm27, co pozwala na jednoczesną wizualizację PA-Nic i identyfikację przedziałów komórkowych. Ta długość fali nie pozwala jednak całkowicie uniknąć dwufotonowej fotolizy PA-Nic5. Alexa Fluor 488 jest korzystna w eksperymentach z aplikacją kąpielową PA-Nic; przy wzbudzeniu odpowiednią długością fali ≥900 nm można uniknąć dwufotonowej fotolizy PA-Nic5, zachowując jednocześnie odpowiednią wizualizację przedziałów komórkowych.

Rysunek 4 przedstawia przykładowe dane dla zlokalizowanej fotolizy błyskowej PA-Nic laserem w neuronach MHb w skrawkach mózgu. Rysunek 4a (panele górne) pokazuje przykład obrazu „referencyjnego”, który jest zrzutem ekranu ostatniego obrazu 2PLSM wykonanego przed uruchomieniem protokołu MarkPoints, z nałożonym położeniem punktu fotostymulacji. Rysunek 4a (dolne panele obrazów) przedstawia powiększony widok punktu fotostymulacji nałożony na morfologię komórkową. Odpowiadająca mu, skorelowana czasowo odpowiedź elektrofizjologiczna na fotolizę PA-Nic jest pokazana w dolnych panelach Rysunku 4a. Wcześniejsze prace wykazały, że prądy te są wrażliwe na antagonisty nAChR5. Rysunek 4b przedstawia reprezentatywne dane z różnych komórek, w których fotoliza pojedynczego punktu była przeprowadzana w odstępach 1 s lub 10 s. Podczas gdy odstęp 10 s zapewnił wystarczający czas regeneracji prądu podtrzymującego linii bazowej, krótszy odstęp 1 s doprowadził do stopniowego wzrostu prądu podtrzymującego w miarę postępu protokołu. Wzrost prądu sugeruje, że przy odstępie 1 Hz nikotyna nie miała wystarczająco dużo czasu, aby zdyfundować z układu29. Takie analizy odpowiedzi czasowej muszą być przeprowadzane de novo dla każdego nowego badanego typu komórek, ponieważ neurofarmakologia nAChR może różnić się w zależności od typu komórki.

Wykres kalibracji lasera i obrazy mikroskopowe; pokazuje skalowanie mocy i wyniki kalibracji ogniskowania wiązki.
Rycina 1: Kalibracja lasera do fotostymulacji. (a) Moc wyjściowa lasera do fotostymulacji. Moc w płaszczyźnie próbki (przez obiektyw zanurzany w wodzie 60x/1.0 NA) została zmierzona dla laserów do fotostymulacji 405 nm i 473 nm przy wskazanych ustawieniach wyjściowych. (b) Kalibracja lasera do fotostymulacji. Zrzuty ekranu pokazują relację przestrzenną między zamierzonym punktem fotostymulacji a odpowiadającą mu lokalizacją, w której nastąpiła fotostymulacja (otwór wypalony), przed (lewo) i po (prawo) przeprowadzeniu kalibracji w programie MarkPoints. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia z liczeniem fotonów pokazująca detekcję nikotyny z intensywnością GaAsP PMT, analiza schematu.
Rysunek 2: Lokalna aplikacja PA-Nic. (a) Detekcja PA-Nic z pipety do aplikacji lokalnej. 1 mM PA-Nic, produkt uboczny fotolizy lub nikotyna zostały rozpuszczone w ACSF, wprowadzone do pipety do aplikacji lokalnej i podane na tkankę mózgu podczas obrazowania 2PLSM (wzbudzenie 900 nm), stosując te same ustawienia obrazowania dla każdego związku. Skanujący obraz transmisyjny w kontraście Dodta pokazuje tkankę/pipetę, natomiast do rejestracji emisji fluorescencji wykorzystano PMT z katodą GaAsP. (b) PA-Nic (1 mM) wprowadzono do tkanki mózgu drogą perfuzji i obrazowano za pomocą 2PLSM tak jak w punkcie (a), aby wykazać lateralne rozprzestrzenianie się PA-Nic przy użyciu jego wewnętrznej fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie tworzenia kropli mikrofluidycznych; obraz mikroskopowy; dynamika płynów, rozmiar kropli.
Rycina 3: Pozyskiwanie obrazów z dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej. (a) Optymalne stosy Z 2PLSM. Przedstawiono dwa przykłady projekcji maksymalnej intensywności stosów Z 2PLSM dla neuronów MHb z dobrze rozdzielonymi dendrytami i niewielką lub żadną ilością zakłócających zanieczyszczeń. (b) Suboptymalne stosy Z 2PLSM. Przedstawiono dwa przykłady projekcji maksymalnej intensywności stosów Z 2PLSM dla neuronów MHb otoczonych zanieczyszczeniami (barwnik wydostający się z pipety podczas zbliżania się do komórki). Takie obrazy są trudniejsze do interpretacji niż obrazy pokazane w (a). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna i elektrofizjologia wykazująca aktywność neuronów wraz z pomiarami prądu.
Rysunek 4: Fotoliza błyskowa laserowa PA-Nic. (a) Obrazy referencyjne MarkPoints i prądy wewnątrzkomórkowe wywołane fotolizą PA-Nic. Dla jednego neuronu MHb pokazano surowe obrazy referencyjne dla prób fotostymulacji MarkPoints w jednej (wskazanej) lokalizacji komórkowej. Należy zauważyć, że dla niektórych lokalizacji fotostymulacji (obraz najbardziej po prawej w tej serii) struktura dendrytyczna jest w ostrości, ale soma i dendryt proksymalny nie są. Poniżej każdego obrazu referencyjnego naniesiono wykres prądu wewnątrzkomórkowego wywołanego uwalnianiem nikotyny. (b) Odstępy między bodźcami dla fotolizy PA-Nic. Pokazano przykładowe rejestracje dla neuronów MHb, w których nikotyna była wielokrotnie uwalniana w tej samej lokalizacji perisomatycznej z odstępem między bodźcami wynoszącym 1 s lub 10 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wybór metody aplikacji/dostarczania PA-Nic jest najbardziej krytycznym krokiem w tej zlokalizowanej technice fotostymulacji. Obie metody, aplikacja w kąpieli i perfuzja miejscowa, mają różne zalety i ograniczenia. Na wybór duży wpływ ma poziom funkcjonalnej ekspresji nAChR w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Często preferowane jest stosowanie kąpieli, gdy poziomy ekspresji funkcjonalnej są wysokie, ponieważ aplikacja w kąpieli pozwala na uzyskanie równomiernego stężenia sondy wokół zarejestrowanej komórki, ułatwiając interpretację danych. Aplikacja w kąpieli eliminuje również potrzebę stosowania drugiej pipety perfuzyjnej w tkance, co ułatwia cały proces. Jednak stosowanie drogich związków w kąpieli kosztuje więcej w jednym eksperymencie.

Zwykle rozwiązywanie problemów polega na próbie zrozumienia, dlaczego po fotolizie błysku nie obserwuje się aktywacji nAChR. Podczas pracy z typem komórki, który nie był wcześniej badany za pomocą PA-Nic, badacz powinien przeprowadzić miejscowe zaciągnięcie ACh lub nikotyny, aby określić, czy funkcjonalniewyrażają się wystarczające receptory5. Aby sprawdzić, czy system jest zdolny do wykrywania reakcji fotolizy, należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne na przyśrodkowych neuronach habenula, które wyrażają duże ilości receptora30. W tym obszarze mózgu możliwe jest zastosowanie kąpieli PA-Nic, która jest preferowana w przypadku eksperymentów walidacyjnych. Dopiero po przeprowadzeniu tych eksperymentów walidacyjnych należy przejść do niebadanego typu komórki. Jeśli system eksperymentalny został zwalidowany, a odpowiedzi pozostają bardzo małe lub niewykrywalne, może być uzasadnione zwiększenie stężenia PA-Nic, zwiększenie intensywności błysku lub czasu trwania impulsu, dodanie dodatniego modulatora allosterycznego nAChR w celu zwiększenia aktywności nAChR6 lub pewna kombinacja powyższych.

Czasami reakcje odblokowania są zbyt duże, ze znaczną aktywacją nAChR, co skutkuje pośrednią aktywacją kanału Na+ bramkowanego napięciem i niezaciśniętymi prądami wewnętrznymi z powodu słabego zacisku przestrzennego. Te artefakty, które całkowicie zasłaniają prądy wewnętrzne nAChR i uniemożliwiają interpretację danych, można wyeliminować poprzez włączenie QX-314 (2 mM) do pipety rejestrującej. Można je również wyeliminować poprzez zmniejszenie stężenia PA-Nic lub zmniejszenie intensywności błysku lub czasu trwania impulsu. We wszystkich eksperymentach fotostymulacji światłem widzialnym należy zachować ostrożność przy wyborze miejsc stymulacji, aby uniknąć niezamierzonej stymulacji/fotolizy powyżej lub poniżej pożądanej płaszczyzny ogniskowej. Dodatkowo, w stosownych przypadkach, moc lasera musi być zawsze miareczkowana, aby odtworzyć reakcje fizjologiczne. Szczególnie ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z fotostymulacji osi Z podczas pracy z ligandami w klatkach, ponieważ ligandy, które są aktywowane powyżej/poniżej ogniska, mogą nadal dyfundować i wchodzić w interakcje z badanym systemem biologicznym (tj. receptorami).

Laserowa fotoliza błyskowa PA-Nic może nie być odpowiednia dla wszystkich badaczy, ponieważ istnieje kilka ograniczeń. Pierwszym z nich jest stosunkowo wysoki koszt odpowiedniej konfiguracji. Podczas pracy z nienaruszonymi wycinkami mózgu, odtworzenie w klatkach w pobliżu struktur o małej średnicy, takich jak dendryty, wymaga zaawansowanego systemu wizualizacji, takiego jak mikroskop 2-fotonowy. Oprócz wysokich kosztów Ti:sapphire, przestrajalnego lasera impulsowego w podczerwieni do wykonywania mikroskopii 2-fotonowej, system z podwójnym galwanometrem zdolny do niezależnego pozycjonowania dwóch wiązek laserowych dodatkowo zwiększa koszt systemu. Całkowite koszty systemu można zmniejszyć, korzystając z systemu zbudowanego w domu, jeśli badacz ma wystarczającą wiedzę i czas na budowę, rozwiązywanie problemów i konserwację takiego systemu. Drugie ograniczenie często wiąże się z niską ekspresją funkcjonalną nAChR, którą można częściowo złagodzić, podejmując kroki jak wspomniano powyżej, ale może to nie gwarantować sukcesu. Zazwyczaj, jeśli nie można zmierzyć prądów aktywowanych ligandem po zaciągnięciu agonistów, fotoliza błyskowa PA-Nic pod cęgami napięciowymi może nie dać akceptowalnych wyników. Trzecie ograniczenie dotyczy wewnętrznej fluorescencji PA-Nic. PA-Nic pochłania światło o długości fali ~405 nm i emituje w podobnym zakresie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) czy Alexa 4885. Gdy stężenia PA-Nic przekraczają ~1 mM, ta właściwość fluorescencji może utrudnić jednoczesną wizualizację struktur neuronalnych. Aby temu zapobiec, bardzo ważne jest, aby móc łatwo kontrolować przepływ PA-Nic z pipety perfuzyjnej. Okresowo przepływ PA-Nic był zatrzymywany, aby umożliwić dyfuzję cząsteczek fluorescencyjnych. Pozwoliło to na ponowne zobrazowanie neuronu w celu sprawdzenia pozycji punktowej wiązki odłączającej się od klatkowni. Czwartym potencjalnym ograniczeniem, o którym należy wspomnieć, jest wykorzystanie światła o długości fali 405 nm do fotolizy. Krótsze fale, takie jak 405 nm, są bardziej podatne na rozpraszanie w złożonych tkankach, takich jak wycinek mózgu. Tak więc, przy danej intensywności i czasie trwania błysku, amplitudy odpowiedzi na odblokowanie i kinetyka zaniku mogą być różnie zależne od głębokości ogniska uncageingu w przekroju. Wnioski dotyczące biologicznych aspektów nAChR powinny uwzględniać to ważne zastrzeżenie.

Ta zlokalizowana technika laserowej fotolizy błyskowej została niedawno wykorzystana do odkrycia nowych szczegółów na temat neurobiologii nAChR. Na przykład przewlekła ekspozycja na nikotynę poprawia perysomatyczną i dendrytyczną funkcję nAChR w przyśrodkowych neuronach habenula5. Wykorzystano go również do wykazania, po raz pierwszy, że neurony glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki wyrażają funkcjonalne nAChR w swoich perymatycznych i dendrytycznych przedziałach komórkowych6. Istnieje wiele potencjalnych przyszłych zastosowań tej techniki, a podejście to można zastosować do innych kluczowych typów neuronów, o których wiadomo, że wyrażają nAChR, takich jak neurony piramidowe kory mózgowej31 lub interneurony w korze mózgowej32, prążkowiu33 i hipokampie19. Technikę tę można również połączyć z farmakologią i/lub edycją genów nAChR34 w celu zlokalizowania określonych podtypów receptorów w różnych przedziałach neuronalnych. Podejście to można łatwo dostosować do innych związków umieszczanych w klatkach kumarynowych, w tym między innymi do tych opracowanych równolegle z PA-Nic5. Wreszcie, fotoliza błyskowa PA-Nic może pewnego dnia zostać wykorzystana u obudzonego / zachowującego się zwierzęcia do badania działania nikotyny w nowych paradygmatach farmakologii behawioralnej.

Oświadczenia

D.L.W. pełni funkcję płatnego konsultanta w firmie Bruker Nano Fluorescence Microscopy.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom laboratorium następujących głównych badaczy z Northwestern: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy i Anis Contractor. Praca ta była wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) (granty DA035942 i DA040626 dla R.M.D.), PhRMA Foundation (stypendium dla M.C.A.) i HHMI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instruments, materiały eksploatacyjne i różne chemikalia
Multiclamp 700BMolecular Devices Corp.Wzmacniacz zacisków krosowych
Pneumatyczna pompa PicopumpWorld Precision InstrumentsŚciągacz do mikropipet PV820
Regulator temperatury Sutter Instrument CoP-97
WarnerInstrumentsTC-324C
Mikrotom z ostrzem wibracyjnymFiltr
Ultrafree-MCMilliporeSigmaUFC30GV0Swewnętrzny filtr roztworu
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B150F-4łatka i aplikacja miejscowa pipeta
(-) -Sól wodorowinianu nikotynyGlenthamGL9693sól nikotynowa
7-karboksymetyloamino-4-metylo kumarynaJanelia Research CampusPA-Nic produkt
uboczny1-[7-[bis(karboksymetylo)-amino]kumaryno-4-ylo]metylo-nikotynaJanelia Research CampusPA-Nic
Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodowa)VirbacANADA #200-071
Alexa FluorTM 488 HydrazideThermoFisherA10436zielony barwnik wypełniający
Alexa FluorTM 568 HydrazideThermoFisherA10437czerwony barwnik wypełniający
6- karboksyl-AF594 (Alexa Fluor 594)Janelia Research Campusczerwony barwnik
wypełniający QX 314 chlorekTocris2313bramkowany napięciem bloker kanałów sodowych
Miernik mocy ThorLabsS120C
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Chemicals for Solutions
N-Methyl-D-glucamineSigmaM2004
Chlorek potasuSigmaP3911
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodnySigmaS9638
Wodorowęglan soduSigmaS6014
HEPESSigmaH3375
D-(+)-GlukozaSigmaG5767
(+)-L-askorbinian soduSigmaA4034
TiomocznikSigmaT8656
Pirogronian soduSigmaP2256
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma230391
Chlorek wapnia dwuwodnySigma223506
Chlorek soduSigmaS9625
Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′ Kwas -tetraoctowySigmaE3889
Sól magnezowa adenozyno-5&trifosforanuSigmaA9187
Sól sodowa guanozyny 5′-trifosforanuSigmaG8877
NazwaCompanyNumer katalogowyComments
Elementy mikroskopu 2-fotonowego
  Skaner laserowy Ultima do mikroskopu Olympus BX51Bruker Nano, Inc.Oprogramowanie do obrazowania i galvos
      Galwanometry obrazowania X-YCambridge Technology
              Mai Tai HP1040Spectra-PhysicsDostrajalny laser na podczerwień
                      Ogniwo Pockels M350-80-02-BK z M302RM DriverConoptics, Inc.do tłumienia lasera IR
                              Integracja czujnika mocy fotodiody sferycznejThorlabs, Incfotodioda laserowa do odbierania energii
      Galwanometry X-Y UncagingCambridge Technology
              Wprowadzenie na rynek 2-liniowego lasera HeliosBruker Nano, Inc.Odblokowywanie elementów lasera
                      OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)Coherent, Inc.
                      OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)Coherent, Inc.
                      Punktowy moduł fotoaktywacji / wejścia światłowodowego do wózka bocznego limuzyny - UncagingBruker Nano, Inc.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Mikroskop pionowy  OlympusBX51WIFPionowa obudowa mikroskopu
      Cel: Olympus M Plan FL 10x; NA 0,3 WD 11 mm  Obiektyw Olympus10x
      Obiektyw: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR  Olympus60x, obiektyw do zanurzania w wodzie
      X-Cite 110, czterodiodowe źródło światła epi-fluorescencji LLGŹródło światła LEDExcelitas Technologies
              Filtr Epi-Fluorescencyjny: ET-GFP (FITC/CY2) do Epi-TurretChroma TechnologiesFiltr LED do wzbudzenia światła niebieskiego
              Filtr Epi-Fluorescencyjny: ET-DsRed (TRITC/CY3) do Epi-TurretChroma TechnologiesFiltr LED do wzbudzenia światła zielonego
      B& Kamera CCD W; Watec, 0,5 cala B/W CCDWatec Co., LTD.Kamera CCD do nagrywania z zaciskiem krosowym
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Detektory zewnętrzne - Podwójna emisja odbita - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)Bruker Nano, Inc.
      Multi-alkaliczny boczny PMTHamamatsuR3896czerwony kanał PMT
              Filtrspalinowy czerwonokanałowyChroma Technologies
                      Rozdzielaczwiązki dichroicznejChroma Technologies
      GaAsP end-on PMTHamamatsu7422PA-40zielony kanał PMT
              Filtremisji spalin zielonokanałowyChroma Technologies
                      Szybka migawka do Hamamatsu H7422 PMTVincent Associates / Bruker517329PMT montaż migawki
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Dodt Moduł detekcji transmisji kontrastu gradientowegoBruker Nano, Inc.
      Wieloalkaliczny PMT z bokuHamamatsuR3896Dodt PMT
odśrodkowy Leica Biosystems VT1200S 595/50m 565lpxr 525/70m

Bibliografia

  1. Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
  2. Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
  3. Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
  4. Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
  5. Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
  6. Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
  7. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
  8. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  9. Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
  10. Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
  11. Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
  12. Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
  13. Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
  14. Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111(2014).
  15. Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57(2014).
  16. Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
  17. Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
  18. Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
  19. Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
  20. Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
  21. Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
  22. Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
  23. Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
  24. Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
  25. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5(2004).
  26. Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
  29. Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
  30. Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
  31. Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826(2016).
  32. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
  33. Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
  34. Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektrofizjologia plastrów mózgumikroskopia dwufotonowametoda patch-clamplokalna aplikacja lekówsubkomórkowe mapowanie receptorówneurotransmisja cholinergicznakontrola czasoprzestrzenna
Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.