Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

18.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58874

⸱

11 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biotechnology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, 2Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, 3Department of Biology, ACECR Institute of Higher Education

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Streszczenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) są multipotencjalne i mogą dać początek trzem głównym typom komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Hodowla in vitro i ekspansja NSC stanowią odpowiednie źródło komórek dla neurobiologów do badania funkcji neuronów i komórek glejowych wraz z ich interakcjami. Istnieje kilka doniesień o technikach izolacji nerwowych komórek macierzystych z mózgów dorosłych lub zarodków ssaków. Podczas operacji mikrochirurgicznej mającej na celu wyizolowanie NSC z różnych regionów embrionalnego OUN bardzo ważne jest zmniejszenie uszkodzeń komórek mózgowych, aby uzyskać jak największy stosunek żywych i ekspandowalnych komórek macierzystych. Możliwą techniką redukcji stresu podczas izolacji tych komórek z mózgu zarodka myszy jest skrócenie czasu operacji. Tutaj demonstrujemy opracowaną technikę szybkiej izolacji tych komórek z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13. Zabiegi chirurgiczne obejmują pobranie zarodków myszy E13 z macicy, przecięcie ciemiączka czołowego zarodka za pomocą zgiętej końcówki igły, ekstrakcję mózgu z czaszki, mikrodysekcję izolowanego mózgu w celu pobrania wyniosłości zwojowej, dysocjację pobranej tkanki w pożywce NSC w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, a na koniec posiew komórek w hodowli zawiesinowej w celu wytworzenia neurosfer.

Wprowadzenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) znajdują się w różnych regionach mózgu dorosłego i embrionalnego i mają tendencję do generowania różnych typów neuronów i komórek glejowych1. Strefy podkomorowe w mózgu dorosłego ssaka2 i wyniosłość zwojowa w mózgu zarodka są regionami bogatymi w NSC3. W rozwijającym się mózgu wyniosłość zwojowa dostarcza większość interneuronów korowych, a w szczególności interneuronów GABA-ergicznych3. Istnieją również mniej inwazyjne metody wytwarzania nerwowych komórek macierzystych z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które zmniejszają zapotrzebowanie na wykorzystanie zwierząt. Pomimo tego, że generowanie NSC z ESC lub iPSC jest możliwe4,5, ma pewne zalety i wady w porównaniu z izolacją nerwowych komórek macierzystych z dorosłego lub zarodkowego mózgu6,7,8. Protokoły indukowania różnicowania ESC i iPSC w kierunku fenotypów neuronalnych są zawsze czasochłonne i kosztowne, a wskaźnik sukcesu (70-80% komórek Nestin dodatnich)5 jest niższy w porównaniu z bezpośrednią izolacją NSC z mózgu zwierzęcia (ponad 99% komórek Nestin dodatnich)9. Co więcej, komórki macierzyste tracą swoją genetyczną stabilność i tendencję do różnicowania po kilku przejściach10,11. Mimo, że istnieją inne nowe doniesienia o bezpośredniej konwersji komórek somatycznych do NSC, komórki te są genetycznie modyfikowane i nie są łatwo dostępne w każdym lab12. W związku z tym nadal istnieje duże zapotrzebowanie na izolację nerwowych komórek macierzystych z mózgu zwierzęcia; Możliwe jest zmniejszenie ilości zwierząt poprzez poprawę technik chirurgicznych. Skracając czas operacji i ulepszając techniki, możliwe jest utrzymanie komórek z dala od uszkodzeń i uzyskanie najwyższego wskaźnika NSC od każdego zwierzęcia.

Tutaj wprowadzamy uproszczoną i powtarzalną technikę izolacji nerwowych komórek macierzystych z mózgu zarodka myszy E13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie operacje i procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Instytutu Royan, Teheran, Iran.

1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych, buforu do płukania (HEPES-MEM), pożywki do hodowli komórkowych i płytki do hodowli komórkowych

  1. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, ostrze skalpela, rękojeść i kleszcze), sterylizując je w autoklawie zgodnie z rutynowymi wytycznymi dotyczącymi sterylizacji.
  2. Przygotuj odpowiednią objętość buforu HEPES-MEM (około 100 ml wystarcza na każdą ciężarną mysz). Dodać wysokie stężenia antybiotyków (10% penicyliny/streptomycyny) do buforu HEPES-MEM. Takie stężenie antybiotyków jest konieczne, aby zmniejszyć ryzyko skażenia mikrobiologicznego.
    1. Aby przygotować bufor HEPES-MEM, dodaj 0,5958 g proszku HEPES do 100 ml MEM (minimalna niezbędna pożywka) i dobrze wymieszaj. Dostosuj pH do 7,3-7,4 i przefiltruj pożywkę za pomocą filtra 0,22 μm.
  3. Przygotuj pożywkę NSC zawierającą pożywkę neurobazalną (NB), uzupełnioną 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1% 100x suplementu N2 lub 1% suplementu B27 (bez witaminy A), 1 U / ml heparyny, 1% L-glutaminy, 1% aminokwasu endogennego (NEAA), 1% penicyliny/streptomycyny i 0,1 mM β-merkaptoetanolu.

2. Chirurgia zwierząt i mikropreparacje

  1. Znieczulenie ciężarnej myszy w 13 dniu ciąży (tutaj należy użyć szczepu BALB/c w wieku 4 miesięcy) poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny, odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg masy ciała.
    1. Potwierdź głębokie znieczulenie, wywierając bolesny bodziec (np. uszczypnięcie kleszczami) na stopę zwierzęcia, a gdy nie ma odruchu bólowego, złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Oczyść i zdezynfekuj skórę brzucha, rozpylając 70% etanolu.
  3. Kontroluj skórę nad brzuchem, a następnie przetnij skórę i leżącą pod nią powięź nożyczkami, aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy.
    1. Usunąć rogi macicy zawierające zarodki za pomocą nożyczek i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml zimnego buforu HEPES-MEM.
    2. Umieść rurkę stożkową pod okapem z przepływem laminarnym i otwórz korek pod maską. Wyjmij rogi macicy z rurki i spłucz 3 razy wystarczającą ilością świeżego zimnego buforu HEPES-MEM, aby usunąć zanieczyszczenia i krew.
  4. Przenieś tkankę macicy na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 7-10 ml zimnego buforu HEPES-MEM. Otwórz rogi macicy za pomocą cienkich nożyczek i przenieś zarodki do nowego naczynia zawierającego 7-10 ml zimnego buforu HEPES-MEM. Teraz umieść 10-centymetrową miskę z zarodkami pod mikroskopem preparacyjnym w celu przeprowadzenia operacji mikrosekcji.
  5. Zegnij końcówkę igły strzykawkowej 25-27 G, naciskając jej końcówkę na stalowy uchwyt ostrza skalpela. Zegnij końcówkę igły, aż końcówka zostanie zgięta pod kątem 70-90°. Sprawdź końcówkę igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby zobaczyć zagięcie na końcu igły.
    UWAGA: Oczywiście zarodki mają boczną pozycję w naczyniu.
  6. Nie zmieniając ich położenia, należy przytrzymać szyję i ciało zarodka cienkimi kleszkami, a następnie wprowadzić zgiętą część końcówki igły do ciemiączka czołowego głowy zarodka. Wystąpiłoby tam małe krwawienie lub skrzep krwi.
    1. Przesunąć końcówkę igły powierzchownie. Podczas gdy zgięta część znajduje się wewnątrz wybrzuszenia w kierunku czoła, a następnie w kierunku tyłu głowy, upewnij się, że przecinasz skórę i czaszkę, aby nie uszkodzić leżącego poniżej mózgu.
    2. Popchnij skórę końcówką igły na boki, aby odsłonić mózg i wbić igłę z bocznej strony skóry do obszaru pod mózgiem. Usuń mózg z czaszki, popychając go, aby wyszedł z wypreparowanej czaszki.
    3. Przytrzymaj mózg stabilnie za pomocą zakrzywionych kleszczy i przetnij korę każdej półkuli za pomocą mikronożyczek, aby odsłonić wyniosłość zwojową.
    4. Przytrzymaj mózg i umieść wypreparowaną wyniosłość zwojową w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę z nerwowych komórek macierzystych. Wzniesienie zwojowe jest wyraźnie pokazane z jego środkową i boczną częścią.
    5. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrosekcji.
  7. Przeciąć wypreparowaną wyniosłość zwojową, przykładając końcówkę pipety do dna probówki. Pipetować zawiesinę w górę i w dół 4 do 5 razy, aby rozbić tkankę w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
    1. Odwirować zawiesinę o stężeniu 110 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
    2. Zawiesinę komórkową inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie dodać równoważną objętość inhibitora trypsyny sojowej (25 μg/ml) w celu zatrzymania aktywności trypsyny. Pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie dezaktywowana.
    3. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 110 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki NSC i policzyć liczbę komórek.
  8. Umieścić komórki (2x105 komórek/ml) na pożywce NSC w kolbie do hodowli tkankowej odpowiedniej wielkości. Przenieść 5 ml do kolb T25, 20 ml do T75 i 40 ml do kolb T175.
    UWAGA: Neurosfery pojawią się po 3-dniowej hodowli w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 . Po 6-7 dniach kule powinny mieć średnicę od 150 do 200 μm i będą gotowe do subhodowli. Hodując milion pierwotnych NSC po siedmiu dniach, liczba komórek wzrośnie do 3-4 milionów.

3. Trypsynizacja i pasażowanie neurosfer

  1. Aby przeprowadzić subkulturę neurosfer, przenieś pożywkę z zawieszonymi neurosferami do probówki wirówkowej, odwiruj przy 110 x g przez 5 minut, a następnie odrzuć supernatant. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut.
    1. Dezaktywuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny sojowej i delikatnie pipetuj neurosfery w górę iw dół, aby stały się pojedynczymi komórkami.
  2. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 110 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki NSC. Komórki te są gotowe do następnej subkultury lub hodowli na powierzchniach pokrytych laminą i poli-L-ornityną w celu przeprowadzenia zaawansowanych eksperymentów.
  3. W przypadku następnej subkultury przenieś NSC do nowej kolby (wykonaj krok 2.8) i hoduj je w pożywce NSC. Do indukcji hodowli różnicowania neuronalnego NSC w pożywce NSC przy braku bFGF i EGF na płytkach pokrytych laminą i poli-L-ornityną (Rysunek 1B).
  4. W przypadku procedury powlekania należy całkowicie pokryć powierzchnię hodowli komórkowej, dodając wystarczającą ilość rozcieńczonego roztworu poli-L-ornityny (25 μg/ml) do płytki do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    1. Odessać poli-L-ornitynę i przepłukać studzienkę 2x PBS. Dodać wystarczającą ilość lamininy 5 μg/ml, aby całkowicie pokryć powierzchnię hodowli i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Odessać lamininę przed posiewem komórek lub przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.

4. Test cytometrii przepływowej

UWAGA: Ekspresja specyficznych markerów NSC, neuronów i komórek glejowych może być mierzona za pomocą testu cytometrii przepływowej13. Protokół jest oparty na Menon et al.,13 z niewielkimi modyfikacjami.

  1. Oddziel neurosfery lub odłącz hodowane NSC od powlekanych płytek przez trypsynizację, aby stały się pojedynczymi komórkami. Dodać 500 μl buforu utrwalającego (2% paraformaldehydu (PFA) w PBS) do 100 μl zawiesiny komórkowej (około 1 miliona komórek wystarcza do barwienia każdym przeciwciałem), a następnie inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  2. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS do probówki i odwirować przy 110 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek, pozostawiając około 100 μl w probówce.
    1. Przepuszczalność komórek za pomocą Tween-20 (0,7% Tween-20 w PBS), dodając 500 μl buforu Tween-20 do 100 μl zawiesiny komórek. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
  3. Powtórzyć wirowanie i płukanie PBS. Całkowicie usunąć supernatant z probówek, pozostawiając tylko osad. Dodać 100 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych (królicze przeciwciała przeciwko mysim βtub-III, GFAP i Nestin w stężeniu 1:200) do buforu rozcieńczającego zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej, 10% surowicy (surowicy koziej) i 0,5% Tween-20 w PBS i delikatnie rozcierać, aby wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej.
  4. Umyć komórki raz PBS i całkowicie usunąć supernatant z probówek, pozostawiając tylko osad.
    1. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego (koziego anty królika FITC sprzężonego w stężeniu 1:500) w PBS do osadu komórkowego i delikatnie rozetrzeć w celu wymieszania. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce w ciemności.
    2. Przemyć próbki 2x PBS, a następnie przemyć raz buforem przepływowym. Odwirować i ponownie zawiesić komórki w około 150 μl bufora przepływowego w celu analizy cytometru przepływowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mikrodyssekcja, izolacja komórek i hodowla neurosfer. W niniejszej pracy przedstawiono szybką i efektywną metodę mikrochirurgii mózgu myszy w 13. dniu embrionalnym (E13 ) oraz izolacji neuralnych komórek macierzystych. Artykuł wykazuje, że możliwe jest usunięcie całego mózgu z czaszki embrionu myszy E13 poprzez niewielkie przerwanie ciągłości ciemiączka czołowego. Dzięki tej metodzie mózg ulega mniejszym uszkodzeniom, co umożliwia izolację komórek z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Korzystanie z odpowiedniego źródła nerwowych komórek macierzystych jest bardzo ważne dla neurobiologów. Nerwowe komórki macierzyste mogą być pobierane z różnych obszarów mózgu zarodka i mogą generować określone typy neuronów i komórek glejowych. Istnieje kilka metod indukcji różnicowania nerwowych komórek macierzystych w celu skłonienia ich do wytworzenia dojrzałych neuronów i komórek glejowych. Istnieje wiele doniesień wskazujących, że w określonych warunkach hodowli i reżimach czynników troficznych mogą generować neuro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Royan Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 15 mlFalcon352097
Probówki 50 mlFalcon352235
Adson Kleszcze, 12 cm, prosteWPI14226
B27Gibco17504-44
bFGFSigmaF0291
albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA2153
szalka 10cm Kleszcze353003
, 12,5 cm, prosteWPI15908
Pęseta Dumont, 11 cm, prostaWPI500342
EGFSigmaE9644
EtanolMerck100983 
GlutaminianSigma G3291
GlutamaxGibco35050061
koza anty królik sprzężone przeciwciało drugorzędowe FITCSigmaAP307F
surowica koziaSigmaG9023
Heparyna   Sigmah3149
HEPESSigma83264
HEPESSigma90909C
insulino-strzykawka z igłą o rozmiarze 25-27 SUPAmedyczne A1SNL127
lamininsigma     L2020
MEMSigmaM2279
N2 suplementGibco17502048
NB mediumGibco21103-31
Aminokwas endogenny (NEAA)Gibco11140050
PBS bez Ca i MgGibco20012050
Penicylina/ StreptomycynaGibco5140122
Poli-L-ornitynaSigma  P4957
królicze przeciwciało przeciwko myszom beta tubulina-IIISigmaT2200
królicze przeciwciało anty myszy GFAPSigmaG4546
królik anty myszy Nestin przeciwciałoSigmaN5413
Rękojeść skalpela #3WPI500236
Krzywa nożyczekWPI14396
Nożyczki ostre prosteWPI14192
Inhibitor trypsyny sojowejRoche10109886001 
Kolby do hodowli tkankowych, T25BD353014
Kolby do hodowli tkankowych, T75BD353024
Tween 20SigmaP1379
Nożyczki Vannas,  8 cm, Proste WPI14003
β-merkaptoetanolSigmaM6250
opatrunkowe Falcon

Bibliografia

  1. Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
  2. Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360(2018).
  3. Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
  4. Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
  5. Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
  6. Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
  7. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
  8. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
  9. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
  10. Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
  11. Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
  12. Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
  13. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241(2014).
  14. Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
  15. Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
  16. Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
  17. Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160(2018).
  18. Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
  19. Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Kupka ganglionarnaizolacja komórekhodowla w zawiesinietworzenie neurosfercytometria przepływowamarker nestynaróżnicowanie neuronalnehodowla komórkowa
Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.