Tutaj opisane są testy biologiczne przeznaczone do monitorowania rozwoju patogenu grzybowego, Colletotrichum fioriniae, w obecności ekstraktów z kwiatów borówki lub żurawiny na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Techniki ekstrakcji kwiatów na bazie wody, chloroformu i wody deszczowej są szczegółowe, a także wgląd w to, jak można zastosować te informacje.
Artykuł metodologiczny
Colletotrichum fioriniae Rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby dokładnie monitorować fenologię okresu kwitnienia i czasową dynamikę chemicznych sygnałów kwiatowych na patogeny gnijące owoce grzybów, opracowano metody ekstrakcji kwiatów i testy biologiczne szkiełek nakrywkowych przy użyciu Colletotrichum fioriniae. W borówce amerykańskiej i żurawinie patogen ten jest optymalnie zwalczany poprzez stosowanie fungicydów w okresie kwitnienia ze względu na rolę, jaką kwiaty odgrywają w początkowych stadiach infekcji. Szczegółowy tutaj protokół opisuje, w jaki sposób ekstrakty kwiatowe (FE) zostały uzyskane przy użyciu metod na bazie wody, chloroformu i polowej wody deszczowej w celu późniejszego wykorzystania w odpowiednich testach biologicznych szkiełka nakrywkowego. Każdy FE służył do dostarczenia innego zestawu informacji: reakcji C. fioriniae na zmobilizowane sygnały chemiczne kwiatów w wodzie (na bazie wody), odpowiedzi patogenów na woski na powierzchni kwiatów i owoców (na bazie chloroformu) oraz monitorowania w terenie zebranej wody deszczowej z kwiatów, przenosząc obserwacje in vitro do środowiska rolniczego. FE jest szeroko opisywany jako oparty na wodzie lub chloroformie, z opisanym odpowiednim testem biologicznym w celu skompensowania nieodłącznych różnic między tymi dwoma materiałami. Woda deszczowa, która spływała z kwiatów, była zbierana w unikalnych urządzeniach dla każdej uprawy, co nawiązuje do elastyczności i zastosowania tego podejścia w innych systemach upraw. Testy biologiczne są szybkie, niedrogie, proste i zapewniają możliwość generowania informacji czasoprzestrzennych i specyficznych dla danego miejsca na temat obecności stymulujących związków kwiatowych z różnych źródeł. Informacje te ostatecznie przyczynią się do lepszego opracowania strategii zarządzania chorobą, ponieważ FE skracają czas potrzebny do wystąpienia infekcji, zapewniając w ten sposób wgląd w zmieniające się ryzyko infekcji patogenami w okresie wegetacji.
Wprowadzenie
Colletotrichum fioriniae powoduje zgniliznę owoców zarówno borówki wysokiej (Vaccinium corymbosum L.), jak i dużej żurawiny amerykańskiej (V. macrocarpon Aiton)1,2. Patogen ten został niedawno wyodrębniony z kompleksu gatunków C. acutatum3,4,5,6 i jest czynnikiem sprawczym antraknozy borówki amerykańskiej oraz członkiem kompleksu zgnilizny owoców żurawiny, a także powoduje wiele innych chorób roślin na całym świecie7. C. fioriniae prowadzi utajony, hemibiotroficzny tryb życia8, przy czym infekcje występują podczas kwitnienia, a rozwój objawów nie staje się widoczny, dopóki owoce nie znajdą się w końcowym stadium dojrzewania9. W przypadku borówki amerykańskiej i żurawiny zgnilizna owoców jest odpowiednio zwalczana tylko za pomocą fungicydów stosowanych w okresie kwitnienia. Patogen zimuje w uśpionych pąkach kwiatowych borówki scales10 i zarodnikuje podczas kwitnienia. Konidia są przenoszone po całym baldachimie poprzez rozpryskiwanie deszczu11,12, a nagromadzenie inokulum jest silnie skorelowane z okresem kwitnienia13. Reakcja gatunku Colletotrichum na kwiaty żywiciela nie jest unikalna dla Vaccinium, ponieważ kwiaty są ważnymi składnikami owoców cytrusowych po kwitnieniu (PFD)14, a także antraknozy truskawkowej15, w obu przypadkach powodując zarodnikowanie patogenu. Wszystkie te przypadki podkreślają potrzebę skutecznych metod oceny czasowej dynamiki chemicznych kwiatów na C. fioriniae i inne patogeny, które infekują podczas kwitnienia. Wglądy dostarczane przez opisane tutaj metody stają się coraz bardziej wartościowe.
Ten protokół szczegółowo opisuje metody pozyskiwania ekstraktu kwiatowego (FE) i prowadzi do oceny odpowiedzi C. fioriniae na FE za pomocą testów biologicznych szkiełka nakrywkowego15,16. Techniki ekstrakcji kwiatów dzielą się na dwa główne typy; ekstrakcje na bazie wody (aktywne-FE, pasywne (pass-FE) i na bazie polowej wody deszczowej (rw-FE)) oraz ekstrakcje na bazie chloroformu (ch-FE)17. Ekstrakcje na bazie wody pozwalają na kontrolę mobilizowanych przez wodę kwiatowych sygnałów chemicznych. Te zmobilizowane sygnały są prawdopodobnie ważnymi składnikami sądu ds. infekcji, ponieważ FE znacznie zwiększa szybkość infekcji16, a także zapewnia wilgoć wymaganą do wystąpienia infekcji. Ponadto reprezentują one bardziej naturalne warunki, ponieważ stymulacja kwiatowa może być zmywana w całym baldachimie podczas zwilżania, co wcześniej zaobserwowano w borówkach i innych systemach uprawowych14,16. Ekstrakcje kwiatowe na bazie chloroformu (ch-FE) dostarczają również cennych informacji dotyczących odpowiedzi patogenów na woski powierzchniowe gospodarza17,18, wyjaśniając wczesne etapy wzrostu konidiów po zdeponowaniu się na podatnych narządach gospodarza (tj. kwiatach, jajnikach i rozwijających się owocach). Za pomocą tego protokołu można również monitorować reakcję patogenu na sezonowe zmiany wosków na powierzchni gospodarza. W związku z tym testy biologiczne są dostosowane do pracy z FE na bazie wody lub FE na bazie chloroformu, aby złagodzić nieodłączne różnice między tymi dwoma materiałami.
Dane wygenerowane z testów biologicznych wykazały, że ekstrakcje na bazie wody stymulują wyższy poziom wtórnego konidiacji niż ekstrakcje na bazie chloroformu, gdzie wystąpiła ostateczna odpowiedź apresoryjna, co sugeruje obecność wielu związków w FE. Co ciekawe, obie te reakcje wzrostu zaobserwowano przy użyciu wody deszczowej, która spłynęła z kwiatów borówki i żurawiny, co wskazuje, że wiele związków stymulujących może zostać zmytych z powierzchni kwiatów. W związku z tym monitorowanie stymulacji kwiatów zapewni wgląd w prawdopodobieństwo sukcesu patogenów w systemie rolniczym.
Ostatecznym celem tego protokołu jest dostarczenie metodologii generowania podstawowych informacji biologicznych na temat patogenów grzybów roślinnych w odpowiedzi na sygnały chemiczne kwiatów, a także zainicjowanie metodologii, które mogą wykorzystać te informacje o kwiatach, aby pomóc w zarządzaniu chorobami specyficznymi dla danego miejsca i procesach decyzyjnych.
Protokół
1. Izolaty grzybów i zawiesiny zarodników
- Wyizoluj Colletotrichum fioriniae od naturalnie zakażonego gospodarza19. Następnie przechowuj czyste kultury na skosach z agaru z mączki kukurydzianej (CMA). Umieść zatyczkę hodowli (ze skosu CMA) na standardowym plastikowym naczyniu do hodowli komórkowych (średnica 9 cm) zawierającym albo oczyszczony agar z sokiem V8 (cV8A) (zmodyfikowany z Millera 1955), albo nieklarowany agar z sokiem V8 (V8A)20. Kiedy kolonie zaczynają zarodnikować, należy umieścić konidia (pomarańczowe masy konidialne) na innym naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym cV8A lub V8A (ze standardową sterylną pętlą), aby uzyskać kulturę zarodnikującą o dużej gęstości.
UWAGA: Wszelkie kroki protokołu z grzybami powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby zmniejszyć możliwość skażenia kultur grzybów i/lub testów biologicznych. - Po 7 dniach wzrostu, za pomocą standardowej sterylnej pętli, zbierz niewielką ilość konidiów z kultury o dużej gęstości (lekko dotykając pętli do masy konidialnej) i wymieszaj ją z 15 ml probówką wirówkową zawierającą 10 ml sterylnej wody dejonizowanej (SDW). Wiruj tę próbkę przez 10 sekund, a następnie za pomocą standardowej pipety zanurzaj wielokrotnie w górę i w dół, aby dalej mieszać próbkę.
- Następnie umieść kroplę wirowanej próbki na hemocytometrze i oszacuj stężenia zarodników. Policz 5-10 pól na hemocytometrze, uzyskaj średnią i pomnóż średnią przez odpowiedni współczynnik rozcieńczenia (tj. 10 000), uzyskując w ten sposób stężenie konidialne na ml SDW.
- Następnie za pomocą równania objętość (V)/stężenie (C) (V1● [C1] = V2 ● [C2]) dostosuj (z SDW) do 1,0 X 105 konidiów na ml SDW z 5 ml objętości końcowej. Jest to określane jako zawiesina zarodników i jest wykonywana tylko bezpośrednio przed użyciem w dowolnym teście biologicznym.
2. Aktywne, wodne ekstrakty kwiatowe (active -FE)15,16
Uwaga: Zobacz Rysunek Uzupełniający 1, Rysunek Uzupełniający 2, Rysunek Uzupełniający 3 i Film Uzupełniający 1.
- Ostrożnie zbieraj ręcznie kwiaty borówki (kwiecień-maj) i żurawiny (czerwiec-lipiec) podczas ich szczytowego kwitnienia na polu (rysunek uzupełniający 1). Nosić i zmieniać rękawice nitrylowe między miejscami pobierania próbek (odmiany/odmiany fizyczne) w celu zahamowania zanieczyszczenia olejem ze skóry ludzkiej, a także zanieczyszczenia krzyżowego między odmianami kwiatów. Umieść kwiaty borówki lub żurawiny (z jednego źródła) w plastikowych torebkach (napełnij worek 100 x 150 mm) i natychmiast wstaw do lodówki w temperaturze 4 ° C po zebraniu kwiatów.
UWAGA: Aktywna ekstrakcja jest modyfikowana z Leandro i wsp. (2003)16. - Przed ekstrakcją usuń wszelkie zniszczone, uszkodzone, chore kwiaty, a następnie za pomocą zdrowych kwiatów usuń jajniki, działki kielicha i szypułki za pomocą zakrzywionych kleszczy (pęseta 45°) i wyrzuć. Do aktywnych ekstrakcji należy używać tylko pozostałych narządów (korony, znamienia, stylu i pręcika). Pokrój gazę (150 x 150 mm) i umieść w lejku o wymiarach 7 x 7 mm, umieść w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odstaw na bok.
- Połącz 1 część przetworzonych kwiatów z 9 częściami SDW (1 wag. : 9 obj.) w moździerzu. Delikatnie miel tłuczkiem przez 30 s (uważaj, aby próbki nie uległy całkowitemu sproszkowaniu). Powstałą miazgę przecedzić przez przygotowaną gazę/lejek i zebrać do probówki wirówkowej (50 ml). Wyczyść lub użyj nowego moździerza/tłuczka między każdą ekstrakcją z 95% EtOH i ciepłą bieżącą wodą.
- Przygotuj aparat do filtracji próżniowej: zbierz lejek Buchnera, kolbę Erlenmeyera z filtrem próżniowym (o pojemności do 1 000 ml), bibułę filtracyjną o średnicy 55 mm i wąż/źródło podciśnienia. Dodaj bibułę filtracyjną do lejka Buchnera o odpowiedniej wielkości i umieść na kolbie, a następnie podłącz urządzenie do źródła wody/ssania za pomocą węża próżniowego i odłóż na bok.
- Dalej klarować ekstrakty z kwiatów borówki przez odwirowywanie przez 10 minut przy 8,055 x g. Odlać supernatant do przygotowanego próżniowego aparatu filtracyjnego, włączyć źródło podciśnienia, przefiltrować supernatant, a następnie wlać zawartość kolby do nowej probówki wirówkowej (50 ml). Wyczyść wszystkie elementy aparatury między każdą filtracją 95% EtOH i ciepłą bieżącą wodą. Następnie przefiltrować przez strzykawkę przystosowaną do wielkości porów 0,22 μm, sterylizację octanem, przefiltrować do nowej probówki wirówkowej (50 ml).
- W przypadku ekstraktów z kwiatów żurawiny należy tylko przefiltrować próżniowo przez bibułę filtracyjną i wlać zawartość kolby do nowej probówki wirówkowej (50 ml).
- Otrzymany preparat określany jest mianem aktywnego ekstraktu kwiatowego (active-FE). Wszystkie ekstrakty kwiatowe na bazie wody (aktywne, pasywne, deszczowe) należy przechowywać w temperaturze -20°C w porcjach o pojemności 5-50 ml do czasu użycia eksperymentalnego. Powtórzyć ekstrakcje z wieloma próbkami (co najmniej 3 ekstrakcje na typ próbki) w celu uzyskania kontrprób.
3. Pasywne, wodne ekstrakty kwiatowe ( pass -FE) 16
Uwaga: Zobacz film uzupełniający 2.
- Zbieraj ręcznie całe kwiaty borówki (50 g) jak wyżej, a po zebraniu wstaw do lodówki. Przed ekstrakcją należy usunąć wszelkie zniszczone, uszkodzone, chore kwiaty i usunąć tylko szypułki z nienaruszonego kwiatu. Przygotowane próbki należy przechowywać w lodówce do momentu zastosowania opisanego poniżej systemu ekstrakcji pasywnej.
- Przed użyciem wypłucz wszystkie elementy 95% etanolem (EtOH) i ciepłą bieżącą wodą, aby zapobiec zanieczyszczeniu (plastikowy arkusz siatki, dwa plastikowe kosze z siatki, szklana forma do chleba i butelka z mgłą z pompką). Przygotuj również 4-warstwową gazę/lejek/probówkę wirówkową o pojemności 50 ml do każdej ekstrakcji, jak opisano powyżej (w kroku 2.2) i odłóż na bok.
- Przygotuj sito: umieść arkusz siatki z tworzywa sztucznego (inaczej przezroczystą matę prętową) w jednym koszu z siatki z tworzywa sztucznego (114 x 102 mm). Umieść drugi, identyczny, siatkowy kosz do góry nogami (odwrócony) w szklanej formie do pieczenia chleba (127 x 229 mm) (aby kwiaty nie leżały w SDW) i umieść na nim arkusz siatki zawierający kosz. Na sito dodać 50 g przygotowanych kwiatów.
UWAGA: Alternatywnie, małe kosze do probówek [czyszczących] mogą być używane zamiast oryginalnie używanych plastikowych koszy siatkowych (stare, zielone, truskawkowe kosze na kufle są często trudne do zdobycia). - Równomiernie rozpylić kwiaty o pojemności 250 ml za pomocą butelki z pompką i uchwyć spływ w szklanej formie do pieczenia chleba. Następnie przecedzić filtrat przez przygotowaną gazę/lejek do czystej probówki wirówkowej. Otrzymany preparat określa się mianem ekstraktu pasywno-kwiatowego (pass-FE); Przechowuj zgodnie z powyższym (krok 2.6).
- Wyczyść wszystkie składniki między każdą ekstrakcją 95% EtOH i ciepłą bieżącą wodą. Powtórzyć ekstrakcje z wieloma próbkami, aby uzyskać kontrpróby (co najmniej 3 na typ próbki).
4. Ekstrakty kwiatowe na bazie chloroformu (ch-FE) 17
- Zbierz kwiaty borówki i żurawiny jak powyżej (krok 2.1) i przygotuj kwiaty do ekstrakcji (krok 2.2, bez przygotowania gazy/lejka). Przygotowane kwiaty przechowuj w lodówce do czasu przed użyciem.
- Ze względów bezpieczeństwa wszelkie prace wykonywane z chloroformem muszą być wykonywane pod wyciągiem. Obejmuje to przygotowanie materiałów / wyrobów szklanych, procedury ekstrakcji i prowadzenie testu biologicznego (etapy z użyciem ch-FE).
- Wyczyść wszystkie składniki 95% EtOH dwa razy, a następnie dwukrotnie chloroformem, aby zapobiec zanieczyszczeniu przy każdej ekstrakcji: gwintowane szklane probówki hodowlane, 2 szklane zlewki, małe sitko ze stali nierdzewnej i [szklany] cylinder z podziałką. Odstawić do wyschnięcia do góry nogami. Nasadki wyłożone politetrafluoroetylenem (PTFE) należy dwukrotnie przepłukać tylko 95% EtOH (chloroform uszkodzi zewnętrzne materiały nasadki) i odstawić do wyschnięcia.
- Połącz 1 część przetworzonych kwiatów z 9 częściami chloroformu (1 wag. : 9 obj.) w zlewce (kwiaty, a następnie chloroform), delikatnie mieszaj przez 30 s i przecedź przez sitko ze stali nierdzewnej do drugiej zlewki. Wlać ch-FE z drugiej zlewki do szklanej probówki hodowlanej (10 - 15 ml) i założyć nasadkę z PTFE. Owiń nakrętkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu.
- Preparat ten to ekstrakt kwiatowy na bazie chloroformu (ch-FE). Przechowywać próbkę w ciemności (w celu zmniejszenia degradacji światła) w temperaturze 4 ° C do czasu użycia eksperymentalnego. Powtórzyć ekstrakcje z wieloma próbkami, aby uzyskać kontrpróby (co najmniej 3 na typ próbki).
5. Zbieranie wody deszczowej z kwiatów borówki (BB rw-FE)16
UWAGA: Urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki składa się z jednorazowego kubka do spryskiwania farbą z pistoletu pneumatycznego z adapterem przyłączeniowym (kubek: gwint wewnętrzny, adapter: gwint męski na męski), probówek wirówek o pojemności 50 ml (polipropylen), parafilmu i drutów powlekanych tworzywem sztucznym (standardowy przewód telefoniczny, indywidualna zawartość żyły wewnętrznego drutu).
- Wybierz wiele miejsc w krzaku borówki, aby przechwycić wodę deszczową spływającą z kwiatów przed utworzeniem urządzeń zbierających. Należą do nich bezpośrednio pod kwiatostanami (kwiatem) do samej podstawy krzewu (korony). Rekordowa średnica trzpieni (w zakresie od 1 do 5 cm) w wybranych miejscach, ponieważ będzie to dyktować wielkość otworów używanych do mocowania urządzenia, opisanych poniżej.
- Dla każdej wybranej lokalizacji utwórz urządzenie do zbierania. Najpierw wywierć otwór w dolnej części kubka z rozpylaczem (w miejscu, w którym kubek zakrzywia się w kierunku gwintowanego otworu) do odpowiedniej średnicy trzpienia, za pomocą końcówki schodkowej przymocowanej do wiertarki. Następnie wytnij linię prostą od górnej części otworu do wylotu kubka z rozpylaczem. Wywierć 4 jednakowo odległe otwory (wystarczająco duże, aby przewlec drut pokryty tworzywem sztucznym) u wylotu kubka rozpylającego i przymocuj jeden koniec drutów pokrytych tworzywem sztucznym, pozostawiając jeden koniec wolny.
- Wywierć otwór wystarczająco duży, aby wkręcić adapter kubka rozpylacza farby w pokrywę nasadki wirówki o pojemności 50 ml. Uszczelnij gwinty adaptera za pomocą parafilmu, aby zapobiec wyciekom. Przymocuj go zarówno do nasadki wirówki, jak i gwintowanej części kubka opryskiwacza. Podłącz dopasowaną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml.
- Powtórz kroki 5.3-5.4, aby utworzyć wiele urządzeń zgodnie z wybranymi lokalizacjami, co najmniej 4 urządzenia zbierające na lokalizację próbkowania.
- Rozmieść urządzenia w wybranych miejscach, zginając kubki opryskiwacza, aby pasowały do łodyg. Ustaw odciętą stronę kubka z rozpylaczem do góry za pomocą drutów pokrytych tworzywem sztucznym przymocowanych do innych łodyg (aby zapewnić przechwytywanie wody przepływającej po kwiatach). Przyklej parafilm wszelkie otwory, z których mogłaby wyciekać woda deszczowa. (Rysunek uzupełniający 3, Rysunek uzupełniający 4, Rysunek uzupełniający 5 i Rysunek uzupełniający 6).
- Etykietuj probówki zbiorcze z datą / godziną wdrożenia. Po opadach deszczu wyjmij i załóż dolną część (probówkę) probówki wirówki (data / godzina pobrania na etykiecie). Wprowadzić do środka zbieranie spływów (określane jako ekstrakt z kwiatów borówki deszczowej (BB rw-FE)) i filtrować próżniowo (filtracja opisana w krokach 2.4-2.5). Przechowywać jak powyżej (krok 2.6), do czasu użycia w teście biologicznym na bazie wody.
6. Zbieranie wody deszczowej z kwiatów żurawiny (CB rw-FE)
- Urządzenie do zbierania kwiatowej wody deszczowej w żurawinie składa się z lejka polipropylenowego o wymiarach 7 x 7 cm, probówek wirówkowych o pojemności 50 ml (polipropylen), parafilmu i 4 standardowych, powlekanych tworzywem sztucznym opasek zaciskowych (na urządzenie).
- Najpierw nakłuj termicznie 8 równoodległych otworów (średnica opasek zaciskowych) wokół wylotu lejka za pomocą metalowej sondy. Włóż opaski zaciskowe do 4 otworów. Przymocuj drugie końce do przeciwległego miejsca tych otworów, tworząc zgrabny wzór skrzyżowania. Owinąć lejek w dół łodygi parafilmem i odstawić na bok.
- Wywierć otwór wystarczająco duży, aby włożyć lejek w dół trzpienia do nasadki wirówki o pojemności 50 ml za pomocą wiertła schodkowego. Włóż przygotowany lejek do nasadki wirówki. Powtórz kroki 6.2-6.3, aby utworzyć wiele urządzeń, co najmniej 4 urządzenia do zbierania próbek na lokalizację próbkowania.
- Wdróż urządzenia oznaczone etykietami (data/godzina) na wybranych torfowiskach żurawinowych. Starannie wsuń dwa kwiatostany z kwiatami (znane jako piony) pod skrzyżowanymi plastikowymi opaskami skręcanymi. Następnie ustaw urządzenie w pionie, wbijając probówkę wirówkową w baldachim żurawinowy (rysunki uzupełniające 7-8, film uzupełniający 3).
- Po opadach deszczu lub nawadnianiu górnym należy zdjąć i wymienić dolną część (probówkę) probówki wirówki (data / godzina pobrania na etykiecie). Wprowadzić spływ (określany jako ekstrakt z kwiatów żurawiny deszczówki (CB rw-FE)) do środka i przefiltrować próżniowo (filtracja opisana w krokach 2.4-2.5). Przechowywać jak powyżej (krok 2.6), do czasu użycia w teście biologicznym na bazie wody.
7. Test biologiczny z wykorzystaniem ekstraktów kwiatowych na bazie wody15,16 (active-FE, pass-FE, rw-FE)
Uwaga: Zobacz Rysunek 1.
- Ten test biologiczny jest przygotowywany w okapie z przepływem laminarnym. Przygotuj materiały: trzykrotnie spłucz szklane szkiełka nakrywkowe z 95% EtOH i wysusz na powietrzu, a następnie odstaw na bok. Przytnij krążki ręcznika papierowego do wewnętrznej średnicy standardowej plastikowej naczyń do hodowli komórkowych (9 cm). Umieść 2 warstwy papierowych krążków w szalkach hodowlanych i namocz w 2 ml SDW.
- Przygotować co najmniej 5 ml 1,0 X 105 konidiów na ml zawiesiny zarodników SDW (C. fioriniae) jak powyżej (kroki 1.2-1.4), odstawić na bok. Następnie wymieszaj równe objętości SDW i ekstraktu kwiatowego na bazie wody w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Następnie dodać równą objętość zawiesiny zarodników do przygotowanych 2 ml probówek do mikrowirówek (SDW plus FE); Otrzymany preparat określa się mianem wodnej mieszaniny do obróbki. W przypadku kontroli pomiń część FE i zastąp ją SDW, aby utrzymać stałe stężenia konidialne.
UWAGA: wielkość porcji zależy od liczby powtórzeń i punktów czasowych. Zazwyczaj porcje nie przekraczają 500 μL. Po połączeniu konidiów i FE rozpoczyna się test biologiczny, 0 godzin po inokulacji. - Umieść wstępnie oczyszczone szklane szkiełka nakrywkowe na nasączonych ręcznikach papierowych w naczyniu do hodowli komórkowych. Umieścić 40 μl kropli wodnej mieszaniny do zabiegania na środku szkiełka nakrywkowego. Powtórz dla pożądanych zabiegów, w tym kontroli, zamknij naczynie do hodowli komórkowych. Powtórz w oddzielnych szalkach do hodowli komórkowych dla replikacji (co najmniej 3) i punktów czasowych (każda szalka jest na 1 punkt czasowy). Po dozowaniu wszystkich substancji poddanych działaniu substancji i powtórzeń umieścić wszystkie zreplikowane szalki do hodowli komórkowych w szczelnie zamkniętym pojemniku z tworzywa sztucznego (30 x 13 x 7 mm) i inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności.
- W określonych punktach czasowych dodaj 10 μl utrwalacza, takiego jak laktofenol bawełniany-niebieski (20,0 g kryształów fenolu, 20,0 ml 2,5% kwasu mlekowego, 40,0 ml glicerolu, 0,05 g błękitu bawełnianego) do kropel, zatrzymując wzrost i częściowo zachowując mocowanie.
- Odczekaj 2 godziny, aby zebrać punkt czasu 0 godzin, ponieważ umożliwia to przyleganie konidialne do powierzchni szkła, ale nie jest wystarczająco długie do kiełkowania konidialnego. Dla wszystkich innych punktów czasowych dodaj utrwalacz w odpowiednim czasie.
- Po dodaniu utrwalacza ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe, umieszczając je kropelką do dołu na szklanym szkiełku mikroskopowym, aby ułatwić badanie mikroskopowe (1 szkiełko nakrywkowe na szkiełko). Gdy wszystkie szkiełka nakrywkowe znajdą się na szklanych szkiełkach mikroskopowych, pozostaw je do osadzenia i częściowego wyschnięcia w kapturze przepływowym przez 20 minut.
- Policz wszystkie konidia (konidia całkowite) obecne na szkiełku nakrywkowym (konidia pierwotne, konidia kiełkujące i nowo utworzone konidia wtórne), a także appressoria w powiększeniu 400X (licząc 16 pól) lub 200X (licząc 4 pola), co daje łączną powierzchnię 3,808 mm2. Powtórz cały test biologiczny do analizy statystycznej. W przypadku testów z użyciem FE na bazie wody należy przeanalizować dane zgodnie z opisem w Waller i wsp. 201716, zazwyczaj wyświetlane jako średnia liczba/mm2 (suma konidiów lub appressorii).
8. Test biologiczny z wykorzystaniem ekstraktów kwiatowych na bazie chloroformu (ch-FE)17
Uwaga: Zobacz Rysunek 2.
- Przygotuj materiały i naczynia do hodowli komórkowych zgodnie z powyższymi krokami (kroki 7.1). Dodatkowo przepłukać równą liczbę komórek Van Tieghema (komórki VanT.) (8 mm OD, 6 mm ID) do szkiełek nakrywkowych, a także szklaną pipetą (1 ml z przyrostem 1 μl) w dygestoriach (dwa razy z 95% EtOH, a następnie dwukrotnie z chloroformem) i odstawić na bok.
- W kapturze z przepływem laminarnym, za pomocą probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, dodać dwie równe objętości (co najmniej 500 μl) SDW i 1 objętość zawiesiny zarodników, a następnie odstawić na bok. Jest to wodna mieszanina do uzdatniania wody do testów biologicznych ch-FE.
- W dygestorium umieścić komórkę VanT. na szklanym szkiełku nakrywkowym w przygotowanym plastikowym naczyniu do hodowli komórek. Dozuj (szklaną pipetą) 33 μl żądanego ch-FE do środka kuwety Van T. (nie dotykaj ścianek VanT. Komórka; W celu kontroli należy dodać chloroform z pierwszego tłoczenia) i pozostawić do wyschnięcia. Powtórzyć w oddzielnych szalkach do hodowli komórkowych w celu powtórzeń (co najmniej 3).
- Po wyschnięciu ch-FE należy dozować 99 μl przygotowanej wodnej mieszaniny do leczenia za pomocą standardowej pipety do środka komórki VanT., a następnie zamknąć wszystkie szalki do hodowli komórkowych. Gdy wodna mieszanina do traktowania wejdzie w kontakt z wysuszonymi zabiegami ch-FE, rozpoczyna się test biologiczny, 0 godzin po inokulacji.
- Po dozowaniu wszystkich substancji poddanych działaniu substancji i powtórzeń umieścić wszystkie (zamknięte) szalki do hodowli komórkowych w szczelnie zamkniętym pojemniku z tworzywa sztucznego (30 x 13 x 7 mm) i inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności.
- W określonych punktach czasowych dodaj 15 μl utrwalacza (laktofenol bawełniany-niebieski) do komórki VanT. i pozostaw na co najmniej 5 minut, aby zapewnić odpowiednie zabarwienie grzybami. Po tym czasie ostrożnie wyjmij VanT. komórki i postępuj zgodnie z powyższymi krokami odwrócenia szkiełka nakrywkowego i akwizycji danych (kroki 7.5-7.6). W celu analizy danych postępuj zgodnie z metodami opisanymi w Gager 201517, zwykle wyświetlając dane jako tworzenie appressorium, co jest stosunkiem całkowitych konidiów do apresorii zliczonych w obserwowanym obszarze (3,808 mm2).
9. Ekstrakcje oparte na fenologii żurawiny17
- Ręcznie zbieraj kwiaty żurawiny (w czerwcu; 100 g), niedojrzałe owoce (dwukrotnie; lipiec i sierpień; 200 g) i dojrzałe owoce żurawiny podczas zbioru (październik; 200 g), umieścić w odpowiedniej wielkości torebkach foliowych i wstawić do lodówki w temperaturze 4 ° C bezpośrednio po zebraniu. Stosować środki ostrożności dotyczące zanieczyszczenia opisane powyżej (krok 2.1).
UWAGA: Za każdym razem będzie pobierany dodatkowy materiał roślinny, ale te ilości zapobiegają ekstrakcji jajników i owoców ewidentnie zakażonych grzybem (wykazujących objawy i oznaki choroby). - Przed ekstrakcją usuń wszelkie zniszczone, uszkodzone, chore kwiaty, a następnie używając tylko zdrowych kwiatów, usuń działki, szypułki, korony, znamiona, style i pręciki za pomocą zakrzywionych kleszczy (pęseta 45 °) i wyrzuć wszystko oprócz jajników. Po pobraniu jajników należy przeprowadzić ekstrakcję na bazie chloroformu w stosunku 1 wag. do 9 obj. (szczegółowo w krokach 4.2-4.4, używając tylko jajników). Próbki należy przechowywać do czasu zakończenia wszystkich pozostałych ekstrakcji, tj. do czasu przewodności testu biologicznego.
- Po zebraniu owoców należy przeprowadzić ekstrakcję na bazie chloroformu (kroki 4.2-4.4, używając zebranych owoców zamiast kwiatów), ale dodać 10 g owoców do 90 ml chloroformu, a po wyekstrahowaniu pozostawić roztwór do odparowania do 9 ml (co daje 10 g: 9 ml wt: vol roztworu).
- Wykonuj ekstrakcje owoców natychmiast po zebraniu w lipcu, sierpniu i październiku. Przechowywać zgodnie z powyższymi krokami (krok 4.4) do momentu zebrania wszystkich ekstraktów. Po ostatniej ekstrakcji owoców na bazie chloroformu, wszystkie ekstrakty chloroformowe na bazie penolu zebrane do tego testu należy poddać testowi biologicznemu na bazie chloroformu i odpowiednio przeanalizować (kroki 8.1-8.6).
Wyniki
Przedstawione tutaj wyniki są przykładami wielu testów, które można przeprowadzić przy użyciu tej metodologii. Rysunek 1 stanowi ilustracyjny przewodnik po bioanalizie FE w środowisku wodnym, a uzupełnia go Rysunek 2, który odnosi się do bioanalizy FE w środowisku chloroformowym. Rysunek 3 stanowi wizualny przewodnik po tym, czego można spodziewać się podczas oceny mikroskopowej C. fioriniae po 24 h, zarówno w bioanalizach opartych na wodzie, jak i na chloroformie (w porównaniu do kontroli SDW). Rysunek 4 szczegółowo opisuje badanie przebiegu czasowego w ciągu 24 h z udziałem C. fioriniae w obecności ch-FE odmiany żurawiny „Stevens” i stanowi wizualny punkt odniesienia dla istotnego wyniku tych badań: FE skróciło czas potrzebny na utworzenie struktur infekcyjnych w porównaniu z SDW. Rysunek 5 przedstawia przykład danych zebranych podczas bioanalizy na szkiełkach nakrywkowych z wykorzystaniem spływu wody deszczowej z kwiatów żurawiny (CB „Flower” rw-FE). Rysunek 6 reprezentuje kolejny istotny wynik: ch-FE z zalążni kwiatowej działało znacznie silniej stymulująco niż ch-FE z owoców, co wskazuje na znaczenie kwitnienia w cyklu życiowym C. fioriniae. Uzupełniające zdjęcia i filmy zawierają ważne materiały wizualne dotyczące kwiatów użytych do ekstrakcji oraz urządzeń/sposobów rozmieszczenia do zbierania deszczówki z kwiatów, a także filmy wizualizujące procesy ekstrakcji aktywnej i pasywnej (w środowisku wodnym).
Rycina 1Ogólny przegląd bioanalizy z wykorzystaniem wodnego ekstraktu z kwiatów (FE). Analizę tę zastosowano w odniesieniu do wodnych ekstraktów z kwiatów borówki oraz żurawiny: aktywny-ekstrakty z kwiatów (aktywny-FE), pasywny-ekstrakty z kwiatów (Przejdź-FE) oraz spływ wód opadowych z kwiatów (rw-FE). Część -FE zazwyczaj stanowi czynnik eksperymentalny/zmienną. Z kolei część -FE może pozostać stała, a oceniane mogą być punkty czasowe/godziny po inokulacji. Wybrano analizę 4 pól widzenia przy powiększeniu 20X. Skróty: sterylna woda dejonizowana, SDW; powierzchnia pola widzenia, A. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2Ogólny opis bioanalizy z wykorzystaniem ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu (ch-FE). Analizę tę zastosowano zarówno w przypadku borówki ogrodowej, jak i żurawiny (kwiaty, zalążki i owoce). W badaniu wykorzystano tylko jeden rodzaj wodnej mieszaniny traktującej: 1 część zawiesiny zarodników na 2 części SDW (aby zachować stałe stężenie konidiów ze względu na odparowywanie ch-FE). Analizę tę można wykorzystać do porównania wielu ch-FE (wosków z różnych powierzchni roślinnych) lub wielu punktów czasowych/godzin po inokulacji przy użyciu jednego ch-FE. Skróty: sterylna woda dejonizowana, SDW; komórki [szklane] Van Tieghema, VanT. cell. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3Porównanie wizualne Colletotrichum fioriniae w obecności wodnego FE oraz ch-FE. W niniejszym teście zastosowano borówkę 'Bluecrop' (aktywny-FE, na bazie wody) (izolat grzyba: BB#10) oraz kwiatowe ekstrakty z żurawiny 'Stevens' na bazie chloroformu (ch-FE) (izolat grzyba: CB-PMAP182) porównano z kontrolnymi próbami SDW. Gwałtowny wzrost wtórnego konidiowania (pierścienie) oraz tworzenia apliktoriów (groty strzałek) zaobserwowano podczas porównania konidiów w obecności SDW (kontrola) (A) Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aktywny-FE (B) w 24 godzinie po inokulacji. Jednakże wtórna konidiacja była mniej wyraźna w porównaniu z kontrolą SDW w bioanalizie z użyciem chloroformu (C) to ch-FE (D)lecz; *C. fioriniae* wzrost przesunął się w stronę tworzenia apresoriów. Przedstawiono typową odpowiedź dla każdego rodzaju ekstrakcji – na bazie wody oraz na bazie chloroformu – niezależnie od opisanych gatunków roślin żywicielskich lub kwiatowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 4Badanie przebiegu czasowego (24 h) z Colletotrichum fioriniae w obecności ch-FE. W niniejszym badaniu jako kontrolę zastosowano sterylną wodę destylowaną (SDW) (A-D) or żurawina 'Stevens' ch-FE (E-F) poddano ocenie wizualnej w 0, 6, 12 i 24 h po inokulacji (przykład zmiennych punktów czasowych zamiast porównywania wielu FE). Tworzenie aprezoriów (groty strzałek) rozpoczęło się w 6 h w ch-FE i sukcesywnie zwiększało się w kolejnych punktach czasowych. Wyniki te wskazują na istotny czynnik biologii patogenu w okresie kwitnienia: kwiaty skracają czas potrzebny do sformowania struktur infekcyjnych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 5Graficzna prezentacja danych zebranych za pomocą rw-FE w bioanalizie. Woda opadowa spływająca z kwiatów żurawiny (CB „Flower” rw-FE) oraz czysta woda opadowa, która nie miała kontaktu z żadnymi tkankami rośliny żurawiny („Ground” rw-FE), pochodzące z pojedynczego zdarzenia zwilżania, oraz standard aktywny, wodny ekstrakt kwiatowy z żurawiny (CB aktywny-FE) (kontrola pozytywna) oraz SDW (kontrola negatywna) poddano wodnemu bioanalizie z użyciem szkiełek cover-slip i oceniono pod kątem C. fioriniae wzrostu. CB „Flower” rw-FE wykazywało taki sam poziom wtórnego konidiowania i tworzenia apresoriów, jak standardowy szczep CB aktywny-FE w 24 h po inokulacji, co wskazuje, że urządzenia zbierające były skuteczne w wychwytywaniu stymulantów kwiatowych uwalnianych podczas zdarzenia nawodnienia. Całkowita liczba konidiów składa się z konidiów pierwotnych (osadzonych) oraz nowo powstałych konidiów wtórnych. Litery oznaczają istotne różnice przy p < 0,05 zgodnie z testem najmniejszej istotnej różnicy (LSD) Fischera; wielkie litery – całkowita liczba konidiów; małe litery – apresoria. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6Bioanaliza ch-FE oparta na fenologii żurawiny, inspekcja wizualna. Zwalczanie grzybów powodujących gnicie owoców często obejmuje stosowanie fungicydów w okresie kwitnienia. W niniejszej pracy przeprowadzono wizualną ocenę ekstraktów z żurawiny ('Stevens') sporządzonych na bazie chloroformu (ch-FE), pozyskanych z wielu etapów wzrostu rośliny, w celu zbadania wpływu wosków powierzchniowych na C. fioriniae w 24 h po inokulacji. Jajniki pobrane w czerwcu (A), niedojrzałe owoce zebrane w lipcu i sierpniu (B, C), zebrane owoce zebrane w październiku (D)or kontrolę z użyciem sterylnej wody destylowanej (SDW) (E) sprawdzono pod kątem tworzenia apliktoriów (groty strzałek). W przypadku jajników ch-FE odnotowano największą skalę tworzenia apliktoriów, co wskazuje, że ta faza fenologiczna rośliny (kwitnienie) ma krytyczne znaczenie dla cyklu życiowego C. fioriniae. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek dodatkowy 1: Kwiatostan borówki. Kwiaty borówki zebrano do ekstrakcji w okresie pełnego kwitnienia (kwiecień-maj w New Jersey, USA) (odmiana „Bluecrop”). Zwrócono uwagę na nakładanie się koroli/zalążni sąsiednich kwiatów oraz ogólną architekturę kwiatostana w porównaniu do Rycina dodatkowa 2 (żurawina w pozycji pionowej). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek dodatkowy 2: Żurawina w pozycji pionowej. Kwiaty żurawiny do ekstrakcji zbierano w czasie pełnego kwitnienia (czerwiec–lipiec w New Jersey, USA) (odmiana „Stevens”). Zwrócono uwagę na zróżnicowane stadia rozwoju kwiatów w obrębie jednego kwiatostanu żurawiny (pozycja pionowa) oraz na haczykowaty kształt koroli, zatrzymujący krople wody. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek dodatkowy 3: Rozmieszczenie deszczówki na borówce (kwiat). Gotowe urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki, umieszczone bezpośrednio pod gronem kwiatostanów. Zwróć uwagę na drut w plastikowej izolacji, użyty do pionowej orientacji urządzenia. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina dodatkowa 4: rozmieszczenie wody deszczowej dla borówek (łodyga). Gotowe urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki, umieszczone w połowie wysokości łodygi, pomiędzy kwiatostanem a koroną krzewu. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina dodatkowa 5: Aplikacja wody deszczowej na borówkę (korona). Gotowe urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki, umieszczone u podstawy krzewu (w koronie). Uwaga: plastikowe powłoki na drutach można usunąć, jeśli nie są one wymagane. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek dodatkowy 6: Rozmieszczenie deszczówki borówkowej (grunt). Gotowe urządzenie do zbierania pierwotnej wody deszczowej, umieszczone obok krzewów borówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 7: Rozmieszczenie deszczówki z żurawiną (zbliżenie). Gotowe urządzenie do zbierania deszczówki z kwiatów żurawiny, z dwoma wspornikami wsuniętymi pod starannie skrzyżowane wiązania druciane. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina dodatkowa 8: Rozmieszczenie deszczówki z żurawiną. Wiele ukończonych urządzeń do zbierania wody deszczowej z kwiatów żurawiny rozmieszczonych na torfowisku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Film uzupełniający 1: Aktywne wodne ekstrakty kwiatowe (aktywnyFE). Dodatkowe wsparcie wideo dla kroków 2.3–2.5.1. Wykorzystano kwiaty borówki wysokiej odmiany 'Bluecrop'. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Film uzupełniający 2: Bierna, wodne ekstrakty z kwiatów (Przejdź-FE). Pomocniczy materiał wideo do kroków 3.3–3.4. Wykorzystano kwiaty borówki gardennej 'Bluecrop'. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Film uzupełniający 3: Rozmieszczenie urządzeń do zbierania deszczówki z kwiatów żurawinyDodatkowe wsparcie wideo po kroku 6.4. Prosimy o kliknięcie tutaj w celu wyświetlenia tego filmu. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Dyskusja
Testy biologiczne wykrywające reakcję C. fioriniae na ekstrakty kwiatowe (FE) zostały opracowane dla patosystemów zgnilizny owoców borówki i żurawiny, ale można je łatwo dostosować do innych upraw ogrodniczych. Protokół opisany powyżej był cenny w pozyskiwaniu wielu ważnych zestawów danych, w tym między innymi: wpływu FE na wiele izolatów wielu patogenów, informacji o przebiegu czasowym dotyczących etapów wzrostu grzybów w obecności różnych FE, porównania technik ekstrakcji, kontroli poszczególnych substancji chemicznych pod kątem wzrostu i różnicowania C. fioriniae , oceny ekstraktów z poszczególnych organów kwiatowych, wpływ temperatury na C. fioriniae w obecności FE, wpływ zależnej od fenologii ekstrakcji wosku i wpływ kwiatowej wody deszczowej. Dzięki zastosowaniu tych technik uzyskane dane pozwoliły również na znacznie lepsze zrozumienie etapów życia C. fioriniae i częściowo wyjaśniają, dlaczego okres kwitnienia jest tak ważny dla zwalczania wielu patogenów gnijących owoce.
Początkowo wszystkie kwiaty były przetwarzane identycznie jak aktywny-FE, ale proces ekstrakcji przesunął się w kierunku wykorzystania całych kwiatów. Sekcja kwiatowa była czasochłonna i miała bardzo mały wpływ na bioaktywność otrzymanych FE. Jednak poszczególne organy kwiatowe mogą być i były oceniane przy użyciu tego protokołu, ale należy zachować szczególną ostrożność, aby nie ulec całkowitej maceracji tkanek kwiatowych (film uzupełniający 1, ze środkami ostrożności wyszczególnionymi w kroku 2.3), ponieważ może to spowodować uwolnienie do FE toksycznych dla grzybów/związków statycznych, które mogą zniekształcić oceny mikroskopowe. Mniej inwazyjne ekstrakcje, takie jak pass-FE (film uzupełniający 2) i rw-FE, są teraz korzystniejsze ze względu na łatwość ich pozyskiwania. Ponadto te techniki ekstrakcji wymagają jedynie filtracji próżniowej, aby uzyskać biologicznie aktywne kwiatowe sygnały chemiczne.
Kwiaty wykorzystywane we wszystkich ekstrakcjach były zazwyczaj przechowywane w lodówce przez 0-3 dni przed przygotowaniem ekstraktu. Wyzwaniem tego protokołu jest zarządzanie czasem obrotu FE (zbieranie w terenie poprzez przechowywanie ekstraktów). Sytuację pogorszyły liczne próbki z wielu źródeł i dat. Zamrożone kwiaty nie zostały ocenione w żadnym realnym stopniu, ponieważ rozmrożone kwiaty wydają się zepsute i odbarwione. Jednak po przygotowaniu FE na bazie wody, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie wykazało wpływu na bioaktywność FE, o ile FE są szybko ponownie zamrażane po przygotowaniu do testu biologicznego (żywotne 3-letnie FE).
Ekstrakcja na bazie chloroformu umożliwia badanie reakcji patogenów na trójwymiarowe woski z powierzchni kwiatów/owoców w płaszczyźnie dwuwymiarowej poprzez odparowywanie ch-FE na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Jest jednak mało prawdopodobne, aby rzeczywiste struktury krystaliczne wosków zdeponowanych z ch-FE były identyczne z powierzchnią, z której zostały zebrane. Oznacza to, że techniki uzupełniające powinny być stosowane, jeśli głównym celem badań jest reakcja grzybów na określone struktury wosku in vivo . Ekstrakty na bazie chloroformu wymagają więcej konserwacji podczas przechowywania niż ekstrakcje na bazie wody. Oprócz utrzymywania ekstraktów ch-FE w ciemności, nasadki probówek do hodowli komórkowych wyłożone PTFE i folia uszczelniająca parafilm muszą być regularnie sprawdzane pod kątem wycieków parowania i wymieniane w razie potrzeby.
Koncepcja monitorowania spływu wody deszczowej z kwiatów jest zakorzeniona w idei rozwoju narzędzi do monitorowania chorób specyficznych dla danego miejsca. Urządzenia do zbierania wody deszczowej można dostosować do wielu innych architektur roślinnych, o ile urządzenie do zbierania wychwytuje wodę deszczową, która spływa z kwiatów. Takie podejście dostarcza informacji o tym, czy stymulacja kwiatów jest obecna na polu w danym momencie i może być monitorowana przez cały sezon. Alternatywnie, urządzenia zbierające mogą być rozmieszczone w wielu miejscach baldachimu, aby określić, jak daleko zostały zmyte wskazówki kwiatowe podczas danego zdarzenia zwilżania. W przyszłych eksperymentach rw-FE będzie dyktować, kiedy należy rozpocząć stosowanie fungicydów i kiedy można je bezpiecznie zakończyć. Dodatkowo, dzięki monitorowaniu ekstrakcji wosku zależnej od fenologii (sekcja 9 protokołu), znaczenie okresu zakwitu dla biologii patogenów stało się jeszcze bardziej oczywiste. Sekcja ta została również dołączona, aby zademonstrować elastyczność tych testów biologicznych, zapewniając metody, które pozwalają na bezpośrednie porównanie wosków na powierzchni gospodarza, które są czasowo oddzielone. Dane wygenerowane przy użyciu technik ekstrakcji kwiatów i testów biologicznych reprezentują namacalne wskaźniki stymulacji patogenów, określone klasy chemiczne ważne dla biologii patogenów oraz cele dla przyszłych strategii kontroli.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Williamowi S. Hainesowi, Sr. Endowed Cranberry Research Fund oraz New Jersey Blueberry and Cranberry Research Council, Inc. za wsparcie. Dziękujemy również Jennifer Vaiciunas (wskazówki i przygotowania kwiatowe), Christine Constantelos (hodowla grzybów i preparaty kwiatowe), Davidowi Jonesowi (preparaty kwiatowe i ekstrakcje), Langley Oudemans (preparaty kwiatowe, filmowanie/fotografia), Jesse Lynch (przygotowania kwiatowe), Roxanne Tumnalis (ogólne wsparcie) oraz licznym studentom/stażystom letnim.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mikro; m wielkość porów, filtr sterylizujący octan | VWR | 101102-280 | Oczyszczanie ekstraktu z kwiatów borówki (FE) |
| 200-1000 i mikro; l pipeta z końcówkami | - | sprzęt, każda marka w zakresie będzie odpowiednia | |
| 40-200 i mikro; l pipeta z końcówkami | - | sprzęt, każda marka w zakresie będzie odpowiednia | |
| 5-40 i mikro; l pipeta z końcówkami | - | Sprzęt, każda marka w zasięgu będzie odpowiednia | |
| Jednorazowy kubek na spray do pistoletu natryskowego z adapterem połączeniowym | Fracht portowy | 97098 | Kolekcja borówki deszczowej (rw-)FE |
| Autoklaw | Amsco | 3011 | Sprzęt, przygotowanie podłoża |
| Mata siatkowa prętowa (arkusz siatki z tworzywa sztucznego) | Winco | BL-240 | Kolekcja pasywna (pass)-FE |
| Zegar stołowy | Fisher Scientific | 06-662-47 | Sprzęt, przygotowanie MES |
| wąż ciśnieniowo-podciśnieniowy | VWR | 62994-795 | Element filtra próżniowego |
| Lejek Buchnera | Coors USA | 60240 | Element filtra próżniowego, akceptuje krążki z bibuły filtracyjnej 55 mm |
| Palnik Bunsena | - | - | Sprzęt |
| Węglan wapnia | Fisher Scientific | C64-500 | Składnik mediów |
| Wirówka | Sorvall | Sprzęt RC 5B Plus | |
| Probówki wirówkowe (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Sprzęt |
| Probówki wirówkowe (50 ml) | VWR | 10025-694 | Sprzęt, kolekcja rw-FE |
| Gaza (klasa 50) | Fisher Scientific | AS240 | Sprzęt do przygotowania MES |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemiczny, trichlorometan: klasa testu, ≥ 99% czysty, dla biologii molekularnej, wolny od nadtlenków |
| agar z mączki kukurydzianej (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Podłoże do wstępnego mieszania, izolowanie przechowywania na skosach |
| Bejca bawełniano-niebieska | Sigma-Aldrich | 61335 | Laktofenol bawełniano-niebieska bejca |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Komponent medialny |
| Wiertarka | Delta-Equipment, kolekcja rw-FE | ||
| EASYpure LF Woda ultraczysta | Barnstead | D738 | Sprzęt, źródło wody dejonizowanej |
| Etanol (95%) | - | - | Filtr chemiczny |
| kolba (500 ml) | Pyrex | nr 5340 | Element filtra próżniowego |
| Dygestoria | Hamilton-Equipment | , użycie chloroformu | |
| Lejek (7 X 7 cm) | Kolekcja VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE, przygotowanie FE |
| Prowadnica szklana ogólna | Fisher Scientific | 22-038-101 | Przewodność testu biologicznego |
| Ogólna plastikowa butelka z rozpylaczem z pompką | VWR | 16126-454 | kolekcja pass-FE, pojemność co najmniej 250 ml |
| Probówki do hodowli komórek szklanych | - | ||
| szkiełek nakrywkowych ch-FE (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Test biologiczny przewodność |
| Szklane komórki Van Tieghema (ręcznie cięte szklane rurki) | - | - | Test biologiczny chloroformu (ch)-FE, (8 mm OD, 6 mm ID) |
| Szklana pipeta (1-100 &mikro; l) | Hamilton Co., Inc. | #710 | test biologiczny ch-FE |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Laktofenol bawełniano-niebieska plama |
| Hemocytometr | Bright-Line | 5971R10 | Sprzęt |
| Kwas mlekowy | Sigma-Aldrich | W261106 | Laktofenol bawełniano-niebieska bejca |
| Kaptur z przepływem laminarnym | Labconco | 3730400 | Sprzęt, sterylne środowisko pracy |
| Sonda metalowa (ogólny) | - | - | Sprzęt |
| Probówki do mikrowirówek (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Przechowywanie i przygotowanie mieszaniny do uzdatniania wody |
| Mikroskop, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Sprzęt |
| Zaprawa (ceramiczna) | Coors USA | 60313 | Element filtra próżniowego |
| Rękawice nitrylowe | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Kolekcja kwiatów |
| Krążki papierowe (cięte ręczniki papierowe) | Podstawy biurowe | KCC01510 | kontroli wilgotności w teście biologicznym |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Folia parafinowa z tworzywa sztucznego |
| Tłuczek (ceramiczny) | Coors USA | 60314 | Element filtra próżniowego |
| Kryształy fenolu | Fisher Scientific | A92-100 | Bejca bawełniana z laktofenolem |
| Worki foliowe (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Sprzęt do chłodzenia kwiatów |
| Plastikowe naczynia do hodowli komórkowych (średnica 9 cm) | Fisher Scientific | FB0875712 | (szalka Petriego), |
| nasadki wyłożone politetrafluoroetylenem (PTFE) do testów biologicznych wyłożone politetrafluoroetylenem (PTFE) | VWR | 60927-228 | ch-FE |
| Pyrex (100 ml) | Pyrex | nr 1000 | |
| formy do chleba ch-FE Pyrex | - | - | pass-FE kolekcja |
| Cylinder z podziałką Pyrex | - | - | Wyposażenie, przygotowanie MES |
| Szczelny pojemnik z tworzywa sztucznego (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Przewodność testu biologicznego |
| Ostre zakończone nożyczki preparacyjne | Fisher Scientific | 8940 | Sprzęt do cięcia gazy serowej i krążków papierowych |
| Sitko siatkowe ze stali nierdzewnej | VWR | 470149-756 | |
| wiertła stopniowego ch-FE (wiertło stopniowe) | Dewalt-Equipment | , kolekcja rw-FE | |
| Sterylna pętla (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Przygotowanie kultury |
| Przewód telefoniczny (przewody wewnętrzne) | - | - | Blueberry rw-FE kolekcja |
| Kosz na probówki | VWR | 470137-792 | Łatwo dostępny zamiennik plastikowego kosza siatkowego [truskawkowego] |
| V8 Sok | Campbell's Soup | Company-Składnik | podłoża grzybowego |
| Kosze z siatki plastikowej w stylu vintage [truskawka] Zbiórka | Donation-pass-FE | , może zastąpić kosz na probówki (470137-792) | |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Preparat zawiesiny zarodników |
| Whatman No. 1 Jakościowe koła 55 mm | Whatman | 1001-055 | Element filtra próżniowego |
| Białe plastikowe opaski zaciskowe (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
Bibliografia
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167(2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86(2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
Przedruki i uprawnienia
