Artykuł metodologiczny

Technologia skanowania 3D łącząca mikroukłady i obrazy mózgu w makroskali w nowatorskim protokole osadzania nakładania się 3D

DOI:

10.3791/58911

⸱

12 maja 2019

 ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, Kyoto University, 2Graduate School of Informatics, Kyoto University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia eksperymentalny protokół wykorzystujący technologię skanowania 3D, łączący dwie skale przestrzenne: makroskopową skalę przestrzenną anatomii całego mózgu obrazowaną przez MRI na >100 μm oraz mikroskopijną skalę przestrzenną rozkładów neuronalnych przy użyciu barwienia immunohistochemicznego i systemu wieloelektrodowego oraz innych metod (~10 μm).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki mózg, będąc systemem wieloskalowym, posiada zarówno makroskopowe sygnały elektryczne, globalnie płynące wzdłuż grubych wiązek włókien istoty białej, jak i mikroskopijne kolce neuronalne, rozchodzące się wzdłuż aksonów i dendrytów. Obie skale uzupełniają różne aspekty funkcji poznawczych i behawioralnych człowieka. Na poziomie makroskopowym rezonans magnetyczny jest obecnie standardową technologią obrazowania, w której najmniejsza rozdzielczość przestrzenna, rozmiar woksela, wynosi 0,1–1 mm3. Ponadto, na poziomie mikroskopowym, wcześniejsze badania fizjologiczne były świadome niejednorodnej architektury neuronalnej w takich wokselach. Badanie to opracowuje potężny sposób dokładnego osadzania danych mikroskopowych na mapie makroskopowej poprzez łączenie biologicznych badań naukowych z postępem technologicznym w technologii skanowania 3D. Ponieważ technologia skanowania 3D była do tej pory wykorzystywana głównie w inżynierii i projektowaniu przemysłowym, po raz pierwszy została ponownie wykorzystana do osadzenia mikrokonektomów w całym mózgu, zachowując jednocześnie naturalne impulsy w żywych komórkach mózgowych. Aby osiągnąć ten cel, najpierw opracowaliśmy protokół skanowania, aby uzyskać dokładne obrazy 3D żywych bioorganizmów, które z natury są trudne do zobrazowania ze względu na wilgotne i odbijające światło powierzchnie. Po drugie, trenowaliśmy, aby utrzymać prędkość, aby zapobiec degradacji żywej tkanki mózgowej, co jest kluczowym czynnikiem w utrzymaniu lepszych warunków i rejestrowaniu większej liczby naturalnych skoków neuronalnych z aktywnych neuronów w tkance mózgowej. Dwa obrazy powierzchni kory mózgowej, niezależnie wyodrębnione z dwóch różnych modułów obrazowania, a mianowicie MRI i obrazów powierzchni skanera 3D, zaskakująco pokazują błąd odległości wynoszący zaledwie 50 μm jako wartość modową histogramu. Dokładność ta jest porównywalna pod względem skali do mikroskopowej rozdzielczości odległości międzykomórkowych; Jest również stabilny wśród różnych pojedynczych myszy. Ten nowy protokół, 3D-NEO (3D-NEO) Novel Embedding Overlapping (3D), łączy poziomy makroskopowe i mikroskopowe uzyskane przez ten zintegrowany protokół i przyspiesza nowe odkrycia naukowe w celu badania kompleksowych architektur łączności (tj. mikrokonektomu).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Często spotyka się niejednolite wieloskalowe architektury w różnych organizacjach fizycznych i biologicznych1,2. Mózg jest również bardzo niejednolitą i wieloskalową organizacją sieciową3,4. W takich organizacjach sieciowych kodowane są różne funkcje poznawcze, które utrzymują czasowe zmiany wzorców elektrycznych impulsów populacji neuronów w submilisekundowych rozdzielczościach czasowych. Historycznie rzecz biorąc, złożone sieci między neuronami były strukturalnie szczegółowo obserwowane przy użyciu technik barwienia Santiago Ramón y Cajal sprzed ponad 150 lat5. Aby obserwować zachowania grupowe aktywnych neuronów, naukowcy opracowali różne technologie nagrywania6,7,8, a ostatnie znaczące osiągnięcia takich technologii umożliwiły nam rejestrowanie aktywności elektrycznej z ogromnej liczby neuronów jednocześnie. Co więcej, na podstawie takich działań funkcjonalnych naukowcom udało się zrekonstruować sieci interakcji przyczynowych między ogromną liczbą neuronów i ogłosili architekturę topologiczną ich złożonych interakcji "mikrokonektomem"9. Makroskopowe obserwacje mózgu pozwalają również traktować cały mózg jako organizację sieciową, ponieważ wiele obszarów mózgu jest połączonych wieloma wiązkami włókien. Osadzanie mikrokonektomów w globalnej mapie mózgu nadal ma wyraźne ograniczenia w ramach obecnego postępu technologicznego, dlatego ten protokół osadzania jest tak ważny. Istnieje jednak wiele wyzwań związanych z opracowaniem protokołu osadzania. Na przykład, aby zaobserwować aktywność żywych lokalnych obwodów neuronalnych w czysto izolowanych obszarach mózgu, należy wyprodukować wycinki mózgu do zapisów in vitro. Dodatkowo, nagrania z wycinków mózgu do nagrań in vitro są nadal ważnym wyborem z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, nadal nie jest łatwo obserwować aktywność wielu żyjących pojedynczych neuronów jednocześnie z obszarów mózgu głębszych niż ~1,5 mm i w wysokiej rozdzielczości czasowej (<1 ms). Po drugie, gdy mamy nadzieję poznać wewnętrzną architekturę lokalnego obwodu neuronalnego, musimy zatrzymać wszystkie dane wejściowe pochodzące z zewnętrznych obszarów mózgu, aby wyeliminować czynniki zakłócające. W celu zidentyfikowania kierunków i pozycji wytworzonych wycinków mózgu, konieczne będzie dalsze zintegrowanie pozycji przestrzennych tych wytworzonych wycinków mózgu za pomocą współrzędnych. Istnieje jednak kilka systematycznych i niezawodnych sposobów tworzenia wycinków mózgu w zorganizowany sposób10,11. W tym przypadku wprowadzono nowy protokół korejestracji, wykorzystujący technologię skanowania 3D do badań neuronaukowych w celu zapewnienia protokołu integracyjnego. Protokół ten służy do koordynowania mikro- i makroskal oraz osadzania mikrodanych z matrycą wieloelektrodową (MEA) class12,13 i barwienia danych w makroskopowej przestrzeni MRI za pomocą powierzchni skanowania 3D pobranych mózgów, a także nieinwazyjnie zarejestrowanych mózgów. Co zaskakujące, pokazało to błąd odległości wynoszący tylko ~50 μm jako wartość modu histogramu. W rezultacie, wartości modów minimalnych odległości między dwiema powierzchniami między powierzchnią MRI a zeskanowaną powierzchnią 3D wynosiły prawie 50 μm dla wszystkich sześciu myszy, co jest odpowiednią liczbą przy sprawdzaniu podobieństwa między osobnikami. Typowa szerokość warstwy miała zarejestrowaną aktywność kolców około 300 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Kioto.

1. Zwierzęta (Dzień 1)

  1. Przygotuj samice myszy C57BL/6J (n = 6, w wieku 3−5 tygodni).
    nuta: Protokół ten ma zastosowanie do wszystkich gatunków gryzoni
    2. .

2. Ustawienia MRI (Dzień 1)

  1. Umieść mysz w akrylowym pudełku anestezjologicznym umieszczonym na macie grzewczej ustawionej na 37 °C za pomocą sterownika maty grzewczej.
  2. Znieczulij mysz 2% izofluranem w powietrzu przepływającym przez pudełko z prędkością przepływu 1,4 l/min za pomocą systemu znieczulającego, który składa się z parownika izofluranu, przepływomierza powietrza i sprężarki powietrza.
  3. Po indukcji znieczulenia umieść mysz w podstawce zgodnej z rezonansem magnetycznym w pozycji leżącej. Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczające, przycinając palec myszy pęsetą, aby sprawdzić, czy nie odczuwa bólu.
  4. Przymocuj głowę myszy za pomocą listwy zębatej i maski na twarz wyposażonej w kołyskę. Następnie utrzymuj znieczulenie za pomocą 1%-1,5% izofluranu w powietrzu w tempie 1,4 l/min przez maskę na twarz.
  5. Włóż termistorową sondę temperatury do odbytnicy myszy i umieść czuły na nacisk czujnik oddechu z tyłu myszy.
  6. Przenieś kołyskę do otworu magnesu MRI. Dostosuj stężenie izofluranu do około 1%-1,5%, aby zapewnić stabilną i powtarzalną głębokość znieczulenia. Monitorować, czy temperatura ciała jest kontrolowana w zakresie 33-35 °C, a częstość oddechów w zakresie 0,5-1,3 Hz przez cały okres eksperymentów MRI, korzystając z systemu monitorowania (Tabela materiałów) parametrów fizjologicznych małych zwierząt za pomocą dedykowanego oprogramowania (Tabela materiałów).
  7. Na podstawie zmierzonej wartości temperatury w odbycie należy regulować temperaturę ciała, kontrolując temperaturę ciepłego powietrza dostarczanego do otworu magnesu z systemu grzewczego wyposażonego w system monitorowania.

3. Akwizycje MRI (Dzień 1)

  1. Przygotowania do wysokorozdzielczego rezonansu magnetycznego 3D T2-zależnego
    1. Zdobądź trzy obrazy rezonansu magnetycznego (MR) w trzech płaszczyznach ortogonalnych (osiowej, czołowej i strzałkowej), aby sprawdzić pozycję myszy.
    2. Odnosząc się do tych obrazów, dostosuj pozycję myszy, przesuwając kołyskę tak, aby środek mózgu myszy znajdował się w środku rezonatora, a także w środku cewek gradientowych w kierunku osiowym.
    3. Dostosuj system MRI, dostrajając rezonator, dostosowując jednorodność statycznego pola magnetycznego (podkładkowanie) i częstotliwość podstawową oraz kalibrując moc częstotliwości radiowej (RF).
    4. Uzyskuj wielowarstwowe obrazy 2D o niskiej rozdzielczości T2-ważone (T2W) o orientacji koronalnej i strzałkowej. Na podstawie tych obrazów określ pole widzenia (FOV) dla skanu MRI 3D T2W o wysokiej rozdzielczości.
    5. Wykonywanie zlokalizowanych podkładek regulacyjnych za pomocą algorytmu automatycznej podkładki regulacyjnej FASTMAP. W przypadku protokołu FASTMAP wybierz prostokątny obszar obejmujący cały mózg. Po zakończeniu miejscowego podkładkowania potwierdź niejednorodność pola B0 w regionie mózgu za pomocą zlokalizowanego widma 1H za pomocą spektroskopii punktowo-rozdzielczej (PRESS).
    6. Uzyskaj obrazy 3D T2W o niskiej rozdzielczości, aby upewnić się, że ustawienia skanowania dla rezonansu magnetycznego 3D T2W o wysokiej rozdzielczości są odpowiednie, sprawdzając odpowiednią pozycję pola widzenia, brak artefaktów zawijania (aliasingu) i skuteczne tłumienie sygnałów tłuszczu.
  2. Obrazowanie sekwencji impulsów
    1. Po przygotowaniach opisanych powyżej, uzyskaj obrazy 3D T2W o wysokiej rozdzielczości całego mózgu myszy, używając sekwencji szybkiej akwizycji ze wzmocnieniem relaksacji (RARE).
      nuta: W artykule przeprowadzono eksperymenty MRI na skanerze przedklinicznym o średnicy 7 T, 210 mm z otworem poziomym, wyposażonym w system gradientu 440 mT/m w czasie rampy 100 μs. Do wzbudzenia RF i odbioru sygnału zastosowano kwadratowy rezonator objętościowy o średnicy wewnętrznej 35 mm. Dane MRI zostały pozyskane za pomocą dedykowanego oprogramowania operacyjnego. Parametry akwizycji sekwencji impulsów 3D RARE zastosowanej w tym badaniu podsumowano w Tabeli 1.

4. Przygotowanie rozwiązań eksperymentalnych (Dzień 2)

  1. Przygotuj 500 ml lodowatego roztworu do cięcia (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2, 15 mM glukozy, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 11,6 mM askorbinianu sodu, 3,1 mM pirogronianu sodu i 100 mM chlorku choliny, bąbelkowane 95% O2 i 5% CO2 ). Dostosuj pH do 7,3−7,4.
  2. Przygotować 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 15 mM glukozy, 25 mMNaHCO3 i 2 mM CaCl2, pęcherzyków z 95% O2 i 5% CO2 ). Dostosuj pH do 7,3–7,4.

5. Przygotowanie sprzętu (Dzień 2)

  1. Przygotuj "pierścień" magnetyczny o powierzchni 6,6 cm2 i grubości 0,5 cm i najpierw umieść na nim czarną taśmę, a następnie taśmę chirurgiczną (ryc. 1c-2). Zauważ, że ten materiał nazywa się podstawą bloku mózgowego (BBB) i utrzymuj go w chłodzie na blokach lodu.
    nuta: Później taśmy zostaną przymocowane do stacji krojenia z blokami mózgowymi dla wibratomu. Kwadratowy pierścień jest używany jako dolna podstawa BBB, aby spełnić dwa cele, a mianowicie płynną migrację bloków mózgowych ze stacji skanowania 3D do wibratomu oraz dokładny pomiar wysokości bloków mózgowych na etapie skanowania.
  2. Ustaw BBB z automatycznym gramofonem. Włącz skaner i gramofon. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazu.
  3. Przed wszystkimi eksperymentami należy wykonać kalibracje kamer i podłączonego do nich gramofonu strukturalnej projekcji światła i stacjonarnego skanera 3D.
    1. Włącz projektor centralny, dwie kamery i gramofon. Następnie otwórz oprogramowanie. W oprogramowaniu kliknij opcję Optical setup (Konfiguracja optyczna) i wybierz obszar obrazu jako 100 x 80, a numery siatki jako 100 x 100. Następnie rozpoczyna się kalibracja aparatu zgodnie z poniższymi czterema krokami.
      1. Aby skonfigurować projektor, połóż arkusz kalibracyjny na biurku i połóż tablicę kalibracyjną na arkuszu kalibracyjnym, aby dostosować punkt mocowania obszaru pomiarowego do środka arkusza i orientacji do przodu. Dostosuj odległość między projektorem a tablicą do około 200 mm. Poluzuj mocujące dwa pokrętła i obróć pokrętła, aby wyregulować czułość na światło i ostrość obu kamer. Następnie kliknij strzałkę, aby przejść do następnego kroku.
      2. Aby zorientować kamery, poluzuj mocujące dwie kamery i przesuń pozycje i obroty tak, aby nakładały się na linię środkową na płytce kalibracyjnej, linię pionową i żółty krzyżyk wyświetlany z projektora. Napraw kamery i ponownie kliknij przycisk Strzałka. Następnie ekran stanie się ciemny.
      3. Aby ustawić ostrość aparatów, po poluzowaniu mocujących pokrętła, zwiększ czułość na światło i ponownie dostrój ostrość. Następnie kliknij strzałkę, aby przejść do następnego kroku.
      4. Dla wartości F i stopnia ekspozycji (aparatu) ponownie ustaw czułość na światło tuż poniżej miejsca, w którym znika czerwony obszar. Następnie ponownie kliknij przycisk Strzałka, a następnie kliknij polecenie Rozpocznij kalibrację i wybierz opcję Tak, jeśli pojawi się pytanie Czy zakończono ustawianie optyczne?
    2. Kliknij opcję Zainicjuj kalibrację i sprawdź, czy wartości pikseli są znormalizowane w zakresie od 0 do 255. Następnie kliknij przycisk Kontynuuj.
    3. Postępując zgodnie z sugerowanymi pozycjami, nagraj obrazy dziewięciu różnych kątów względnych skanera i płytki kalibracyjnej, a następnie zakończ po potwierdzeniu procesu kalibracji, a na koniec kliknij przycisk Aktualizuj kalibrację.
    4. Wymień płytkę kalibracyjną na gramofon i kliknij przycisk Kalibracja gramofonu.
      nuta: Teraz wszystkie kalibracje są zakończone.

6. Skanowanie powierzchni mózgu, krojenie i zapis MEA (Dzień 2)

  1. Znieczulij mysz 1%-1,5% izofluranem i odetnij głowę myszy. Użyj skalpela, aby otworzyć skórę i odsłonić czaszkę.
  2. Przetnij skórę głowy znieczulonej myszy wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą noża chirurgicznego i przetnij czaszkę w kierunkach ukośnych od punktu lambda do punktu nieco przed bregmą za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie delikatnie oderwij czaszkę od mózgu za pomocą zakrzywionej pęsety.
  3. Za pomocą szpatułki podnieś mózg i przenieś go na szalkę Petriego (100 mm x 20 mm) z lodowatym roztworem tnącym (przygotowanym w kroku 4.1). Przepływ powietrza zawierającego 95%O2 i 5% CO2 z zewnętrznej bomby gazowej o kontrolowanej prędkości obrotowej pompy (~4,0 obr./min) w celu wytworzenia małych pęcherzyków w lodowatym roztworze tnącym (Rysunek 1a).
  4. Po 1–2 minutach połóż mózg na ściereczce z mikrofibry, której powierzchnia jest lekko pokryta sitkiem do mąki, a następnie delikatnie zetrzyj płyn z powierzchni mózgu za pomocą ściereczki z mikrofibry (Ryc. 1b).
  5. Umieść mózg grzbietową stroną do góry na stojaku na próbki na BBB, a także umieść BBB na środku automatycznego gramofonu.
  6. Przyciemnij pomieszczenie podczas skanowania 3D i wykonaj skanowanie 3D na gramofonie. Aby sprawdzić, czy skanowanie 3D działa prawidłowo, kliknij Skanowanie 3D, wybierając kąt między dwoma ujęciami jako 22.5, kąt początkowy jako 0, a kąt końcowy jako 360 (Rysunek 1c-1).
  7. Przenieś mózg na szalkę Petriego i bąbelkuj mózg w roztworze tnącym przez około 10 sekund.
  8. Przetnij mózg na dwa bloki w środku płaszczyzny koronalnej za pomocą noża chirurgicznego i delikatnie przesuń dwa bloki mózgu na płaską powierzchnię za pomocą szpatułki chirurgicznej.
  9. Przymocuj bloki mózgowe BBB za pomocą kleju błyskawicznego i delikatnie i ostrożnie wytrzyj płyn z powierzchni mózgu w ciągu 1-2 minut, ponownie używając ściereczki z mikrofibry. Następnie ponownie wykonaj skanowanie 3D (Rysunek 1c-2).
  10. Przymocuj czarną taśmę zakrywającą środek BBB do środka stolika do cięcia dla wibratomu (Rysunek 1d).
  11. Wlej roztwór tnący do etapu cięcia i ustaw etap cięcia na wibratomie. Dostosuj prędkość i amplitudę cięcia. Zrób 2-5 plasterków koronalnych (o grubości 300 μm) z dwóch bloków mózgu. Jeśli to możliwe, utrzymuj roztwór w fazie cięcia (Rysunek 1e).
  12. Przymocuj ostrze do uchwytu ostrza wibratomu i zoptymalizuj prędkość cięcia, częstotliwość i amplitudę drgań systemu, ustawiając je na 12.7 mm/min dla prędkości, 87–88 Hz dla częstotliwości i 0.8–1.0 mm dla szerokości wychylenia. Gdy konieczne jest ostrożne cięcie, zwolnij prędkość do poziomu 2–3.
  13. Podczas cięcia wycinków mózgu zapisz pokrojoną współrzędną w formacie, w tym współrzędną przednio-tylną, półkulą i innymi warunkami (Rysunek 2c).
  14. Delikatnie przenieść plastry mózgu do zlewki wypełnionej wstępnie podgrzanym (~34 °C) ACSF za pomocą grubej plastikowej pipety i inkubować je w zlewce w temperaturze ~34 °C przez ~1 godzinę. W tym czasie wykonaj skan 3D pozostałych bloków mózgowych na etapie cięcia (Rysunek 1c-2).
  15. Ustaw chip MEA w jednostce nagrywającej. Podłącz chip do pompy perystaltycznej za pomocą dwóch rurek. Użyj jednej rurki, aby poprowadzić ten sam ACSF do chipa MEA, a drugiej rurki wyprowadzić ACSF z chipa MEA.
  16. Przymocuj dwie igły (0,60 mm x 19 mm), połączone na końcach dwóch rurek, do górnej części ścianki chipa MEA i ustal ich pozycje końcówkami podążającymi za wewnętrzną ścianką chipa MEA. Ustaw natężenie przepływu ACSF na 4.1 obr./min.
  17. Po upływie 1 godziny przesuń plasterek na chipsie za pomocą grubej plastikowej pipety i ustaw pozycję za pomocą miękkiej szczoteczki. Następnie rozpocznij proces rejestrowania aktywności neuronalnej (Rysunek 2-d).

7. Barwienie immunohistochemiczne (Dzień 3 i 4)

  1. Po zakończeniu zapisu MEA przenieś plastry do probówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych 4% paraformaldehydem (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie usuń 4% roztwór PFA i umyj plastry 3x PBS łącznie przez 5 minut.
    nuta: W razie potrzeby zanurz plastry w 20% żelatynie/PBS i ponownie wytnij plasterek, aby był cieńszy niż 50 μm, używając wibratomu.
  2. Przygotować roztwór do pobierania antygenu (10 mM cytrynian sodu, pH 6,0). Usuń PBS z ostatniego prania i dodaj roztwór do pobierania antygenu.
  3. Zagotuj wodę w elektrycznym termosie i inkubuj probówki z plastrami przez 20 minut w temperaturze ~95–98 °C w garnku, a następnie naturalnie schładzaj.
  4. Przygotować 50 mM soli fizjologicznej buforowanej Tris i dodać 1% wodorosiarczynu Na (1% roztwór wodorosiarczynu Na-Tris). Dostosuj pH do 7,5. Następnie plastry myć 1% roztworem wodorosiarczynu-Tris przez 5 minut w temperaturze pokojowej (~20–25 °C).
  5. Przygotować roztwór blokujący, dodając 4% normalnej surowicy koziej i 0,5% etoksylowanego oktylofenolu do 1% roztworu wodorosiarczynu Na-Tris.
  6. Usuń 1% roztwór wodorosiarczynu Na-Tris z probówek z plastrami i dodaj roztwór blokujący. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając 1% normalnej surowicy koziej i 0,5% Triton X-100 do 1% roztworu wodorosiarczynu-Tris Na i rozcieńczając przeciwciała pierwszorzędowe. Należy stosować następujące stężenia przeciwciał pierwszorzędowych: 1:800 mysiego anty-GAD67 i 1:500 króliczego anty-NeuN.
  8. Usuń 1% roztwór wodorosiarczynu-Tris Na z probówek z plastrami i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotować 50 mM soli fizjologicznej buforowanej Tris i dodać 8,5 g/l NaCl (roztwór Tris-NaCl). Miareczkować pH do 7,5. Następnie plastry myć 3x roztworem Tris-NaCl (~20–25 °C) łącznie przez 5 minut.
  10. Przygotuj drugi roztwór przeciwciała, dodając 3% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 do roztworu Tris-NaCl i rozcieńczając przeciwciała drugorzędowe. Stosować następujące stężenia przeciwciał drugorzędowych: 1:500 przeciwciał anty-mysich kóz i 1:500 kozich przeciwciał anty-królików.
  11. Usuń roztwór Tris-NaCl z probówek z plastrami i dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciała. Inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj plastry 3x roztworem Tris-NaCl łącznie przez 5 minut.
  12. Umieść plastry na szkiełku za pomocą małego pędzelka i nałóż podłoże montażowe oraz szkiełko nakrywkowe. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego. Zrób zdjęcia powierzchni wycinka (Rysunek 2e).

8. Przetwarzanie danych MRI w celu wyodrębnienia objętości kory mózgowej

  1. Zainstaluj bezpłatne oprogramowanie FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Przygotować obrazy MRI uzyskane w sekcji 3.
  2. Zmień format obrazu za pomocą polecenia fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ. Rozszerz obraz mózgu, aby był tak duży jak ludzki mózg za pomocą polecenia fslcreatehd i, jeśli to konieczne, zmień orientację za pomocą fslorient z opcją -setqformcode 1. Następnie odzyskaj oryginalny format pliku za pomocą fslchfiletype NIFTI_GZ. Dokładne polecenie jest następujące.
    fslchfiletype NFTI_PAIR [obraz wejściowy].nii.gz
    FSLcreateHD 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [Obraz wejściowy].hdr.gz
    fslorient –setqformmcode 1 [obraz wejściowy].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [obraz wejściowy]
  3. Wpisz fsl, aby otworzyć oprogramowanie FSL. Wydobywaj mózgi za pomocą polecenia bet z graficznego interfejsu użytkownika (GUI), ale nie obieraj zbyt mocno. Następnie dokładnie kontroluj progi intensywności ułamkowej, ... i współrzędne środka początkowej sfery powierzchni mózgu. Optymalne wartości są różne dla poszczególnych danych.
  4. Zmień rozmiar obrazu mózgu na oryginalny rozmiar mózgu myszy, korzystając z tej samej procedury, co w kroku 8.2. Dokładne polecenie jest następujące:
    fslchfiletype NFTI_PAIR [obraz wejściowy].nii.gz
    FSLCeleanHD 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [Obraz wejściowy].hdr.gz
    fslorient –setqformmcode 1 [obraz wejściowy].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [obraz wejściowy]
  5. Współrejestruj wszystkie obrazy mózgu za pomocą polecenia flirt i utwórz uśredniony obraz mózgu za pomocą opcji -add i opcji -div polecenia fslmaths.
    fslmaths [obraz mózgu 1] –dodaj ... –dodaj [obraz mózgu N] –div N [uśredniona nazwa obrazu] –odt float
  6. Uśredniony mózg jest czystszy za pomocą opcji -thr polecenia fslmaths. Następnie należy wybrać optymalną wartość progową dostosowującą się do poszczególnych obserwacji.
    fslmaths [nazwa obrazu uśrednionego] –thr [wartość thr, na przykład 5000] [obraz uśrednionej wartości progowej]
  7. Na koniec przekształć uśredniony obraz mózgu w współrzędne danej osoby, ponownie używając polecenia flirt. Następnie przygotuj w miarę czyste wyekstrahowane kory mózgowe (Rysunek 2a).
    UWAGA: Niestety, opuszka węchowa i móżdżek nie będą idealne na zrekonstruowanej powierzchni mózgu na podstawie objętości MRI ze względu na podstawowe ograniczenia oprogramowania FSL dotyczące zwijania wszystkich części mózgu, w tym opuszki węchowej i móżdżku.

9. Przetwarzanie obrazu MRI w celu zmapowania powierzchni korowych

  1. Pobierz inne darmowe oprogramowanie, 3D Slicer (https://download.slicer.org/).
  2. Otwórz obrazy MR wyodrębnionych mózgów (kliknij Plik i wybierz Dodaj dane) utworzone zgodnie z sekcją 8, korzystając z modułów Volume Rendering i Editor w 3D Slicer.
  3. Zmień tryb z Edytor na Renderowanie woluminów i kliknij przycisk celu, aby obraz mózgu znalazł się na środku ekranu.
  4. Wybierz tryb MR-T2-brain i dostosuj próg, przesuwając pasek Shift. Następnie wróć z Renderowanie objętościowe do Edytora i kliknij przycisk Efekt progu.
  5. Zastosuj etykietę 41. Kora mózgowa i zapisz dane z powierzchni mózgu jako plik .stl. Następnie zmień format pliku z .vtk na .stl i zapisz plik, sprawdzając formularz.

10. Wstępne przetwarzanie danych skanowania 3D

  1. Wykonaj automatyczną korejestrację między 8 lub 16 obrazami wykonanymi pod 8 lub 16 różnymi kątami w sekwencji skanowania, aby skorygować drobne niezgodności między nimi, klikając opcję Globalna rejestracja zawarta w opcji Wyrównanie i zintegruj je. Powtórz skany pod różnymi kątami, aby uzyskać powierzchnię całego mózgu (Rysunek 2b).
    1. Jeśli integracja między obrazami zeskanowanymi pod różnymi kątami nie powiodła się, kliknij opcję Wyrównanie ręczne i wybierz parę Obraz stały i Obraz ruchomy.
    2. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć ręczne wyrównywanie obrazów, zaznaczając trzy lub cztery wspólne punkty na różnych obrazach. Następnie kliknij przycisk OK. Algorytm optymalizacji to iteracyjny algorytm najbliższego punktu (ICP)10. Nie obejmuje odkształcenia nieliniowego.
  2. Utwórz siatkę ze wszystkich wyrównanych obrazów (tj. zestawów danych kropek), zaznaczając wszystkie obrazy i klikając przycisk Generowanie siatki. Następnie wybierz opcję Mały obiekt artystyczny, aby uzyskać siatkę w najwyższej rozdzielczości. Następnie zapisz obraz jako plik binarny .stl lub w formacie ASCII.

11. Współrejestracja powierzchni MRI i powierzchni skanowania 3D

  1. Otwórz powierzchnię MRI i połącz ją z powierzchnią skanowania 3D za pomocą oprogramowania do obróbki powierzchni. Następnie wykonaj ręczny proces wyrównywania, stosując tę samą procedurę, co opisano w krokach 10.1.1 i 10.1.2. Następnie ponownie zapisz te współzarejestrowane obrazy powierzchni (Rysunek 2a,b).
    1. W razie potrzeby wyczyść poszczególne dane powierzchniowe, na przykład usuwając drobne szumy otaczające obszar mózgu, szczególnie w przypadku danych MRI, oraz wypełniając, jeśli takie istnieją, zwłaszcza w przypadku danych ze skanowania 3D.
  2. Na koniec otwórz dane powierzchni za pomocą oprogramowania do analizy danych, na przykład MATLAB, a następnie wykonaj i oceń histogramy minimalnych odległości między dwiema powierzchniami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oceniliśmy odległości między powierzchniami korowymi, uzyskanymi przez zmniejszenie objętości MRI, a powierzchniami uzyskanymi ze skanów 3D pobranych mózgów. Wartości modów na histogramie odległości wynoszą tylko 55 μm (Rysunek 3a). Dodatkowo, podczas akumulacji histogramu od punktu, w którym odległość jest równa zero, skumulowana wartość osiąga 90% całkowitej liczby próbek przy ~300 μm (Rysunek 3b). Końcowy histogram odległości między dwiema powier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy nowy protokół o nazwie protokół 3D-NEO, aby połączyć makroskopowe i mikroskopijne skale przestrzenne poprzez nakładanie się na dwie powierzchnie mózgu dokładniej niż wcześniej. Początkowo istniały dwa wyzwania związane z tworzeniem tego protokołu, który umożliwił dokładne nakładanie się na siebie dwóch obrazów powierzchni mózgu i rejestrowanie zdrowej aktywności neuronalnej żywych organizmów. Po pierwsze, konieczne było skuteczne wytarcie roztworu tnącego otaczającego wyekstrahowany mózg po wydobyciu go z c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.S. jest wdzięczny za wsparcie od wszystkich pracowników na kursie informatyki medycznej w Graduate School of Medicine i Faculty of Medicine, i chce podziękować Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto i Doris Zakian za ich pomocne komentarze. Badanie to zostało wsparte przez Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research oraz przez program Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) dla M.S. z MEXT (Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii). Eksperymenty MRI w tej pracy zostały przeprowadzone na Wydziale Rezonansu Magnetycznego Małych Zwierząt, Centrum Wsparcia Badań Medycznych, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprężarka powietrzaKimura MedicalKA-100Preparat dla zwierząt do rezonansu magnetycznego
Mikroskop fluorescencyjny All-in-oneKEYENCEBZ-X710
Skrzynka anestezjologicznaBadań BiologicznychRIC-01Preparat dla zwierząt do
systemu anestezjologicznegoMRM ACOMA Medical IndustryNS-5000APreparat dla zwierząt do rezonansu magnetycznego
Anti-GAD67, klon 1G10.2Merk MilliporeMAB5406Do barwienia immunologicznego
Calcium Chrolidenacalai tesque06729-55aCSF
Chlorek cholinynacalai tesque08809-45aCSF
Zakrzywione kleszcze
Skalpel do utylizacjiKai10
D-PBS(-) bez Ca i Mg, płyn (10x)nacalai tesqueDo barwienia immunologicznego
D(+)-glukozyWako049-31165aCSF
Żelatynanacalai tesque16605-42resekcjonowanie
koziego przeciwciała anty-mysiego IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwciała drugorzędowego, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723Do barwienia immunologicznego
koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 555InvitrogenA32732Do barwienia immunologicznego
Mata grzewczaBadań BiologicznychHM-10Przygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
Kontroler maty grzewczejCentrum Badań BiologicznychBWT-100APrzygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
System grzewczySA Instrumentskompatybilny z MR System ogrzewania małych zwierzątPrzygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
IsofluraneAbbViePrzygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
Waporyzator izofluranuACOMA Przemysł medycznyMKIIIaiPrzygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
Krajalnica liniowaDOSAKANeo Krajalnica liniowa MT
L(+)-kwas askorbinowy Sól sodowaWako196-01252aCSF
Sześciowodny magnez ChrolideWako135-00165aCSF
MaxOne Jednodołkowy MEAMaxWell Biosystems
Metalowa szpatułka
System monitorowaniaSA InstrumentsModel 1025Przygotowanie zwierząt do MRI
Oprogramowanie do monitorowaniaSA InstrumentsPC-SAM V.5.12Przygotowanie zwierząt do MRI
Kołyska kompatybilna z MRIBruker BioSpinT12812Przygotowanie zwierząt do MRI
Cewka MRIBruker BioSpinT9988Do oprogramowania do
operacji MRI MRIBruker BioSpinParaVision 5.1Do MRI
Neo LinearSlicer MTD.S.K.NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Sygnalizacja komórkowa mAb królika24307Do barwienia immunologicznego
Normalna surowica koziaWako143-06561Do barwienia immunologicznego
Chlorek potasuWako163-03545aCSF
Glikol polietylenowy Mono-p-izooktylofenylowy eternacalai tesque12967-45Do barwienia immunologicznego
Czuły na nacisk czujnik oddechuSA InstrumentsRS-301Przygotowanie zwierząt do MRI
Przedkliniczny skaner MRIBruker BioSpinBioSpec 70/20 USRdo MRI
Kwas pirogronowy Sól sodowanacalai tesque29806-54aCSF
SKAN w PUDEŁKUOpen Technologies srl
Sito nożycowe
butelkaTIGERCROWN81Do skanowania 3D
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36937Do barwienia immunologicznego
Chlorek soduWako191-01665aCSF
Diwodorofosforan soduWako197-09705aCSF
Wodorowęglan soduWako191-01305aCSF
Wodorosiarczyn sodunacalai tesque31220-15Do barwienia immunologicznego
Termistorowa sonda temperaturySA InstrumentsRTP-101-B, PLTPC-300Przygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
Pasek zębatyBruker BioSpinT10146Preparat dla zwierząt do rezonansu magnetycznego
Skrzydlata igła dożylnaTERUMOSV-23CLKDo perfuzji
1 mol/l-Tris-HCl Roztwór buforowynacalai tesque35436-01Do barwienia immunologicznego
1 mol/l-Kwas solnynacalai tesque37314-15Do regulacji pH roztworu
16%-Paraformaldehyd Roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Nauki15710Do barwienia immunologicznego
Centrum Centrum

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
  2. Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
  3. Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
  4. Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541(2013).
  5. DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
  6. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
  7. Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
  10. Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
  11. Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
  12. Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
  13. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10(2018).
  14. Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
  15. Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
  16. Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
  17. Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
  18. Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
  19. Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
  20. Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
  21. Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
  22. Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
  23. Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D Scanning TechnologyBrain ImagingMicroconnectome EmbeddingMRI CoregistrationCortical Surface AnalysisVibratome SectioningMultielectrode Array Recording3D Novel Embedding OverlapHistogram Distance MeasurementLiving Brain Tissue Preparation

Powiązane artykuły