Artykuł metodologiczny

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/58913

⸱

19 marca 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry and Molecular Genetics, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Public Health Research Institute, Rutgers, The State University of New Jersey

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędnymi organellami dla metabolizmu komórkowego i przetrwania. W mitochondriach zachodzi wiele kluczowych zdarzeń, takich jak oddychanie komórkowe, metabolizm oksydacyjny, transdukcja sygnału i apoptoza. W związku z tym doniesiono, że dysfunkcja mitochondriów odgrywa ważną rolę w tolerancji leków przeciwgrzybiczych i zjadliwości grzybów chorobotwórczych. Ostatnie dane doprowadziły również do uznania znaczenia mitochondriów jako ważnego czynnika przyczyniającego się do patogenezy grzybów. Pomimo znaczenia mitochondriów w biologii grzybów, ustandaryzowane metody zrozumienia ich funkcji są słabo rozwinięte. W tym miejscu przedstawiamy procedurę badania podstawowego wskaźnika zużycia tlenu (OCR), miary oddychania mitochondrialnego i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), miary funkcji glikolitycznej w szczepach C. albicans. Opisana w niniejszym dokumencie metoda może być stosowana do dowolnych szczepów Candidaspp. bez konieczności oczyszczania mitochondriów z nienaruszonych komórek grzybów. Co więcej, protokół ten można również dostosować do badań przesiewowych pod kątem inhibitorów funkcji mitochondriów w szczepach C. albicans.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inwazyjne infekcje grzybicze zabijają ponad 1,5 miliona ludzi rocznie na całym świecie. Liczba ta rośnie ze względu na wzrost liczby osób żyjących z obniżoną odpornością, w tym osób starszych, wcześniaków, biorców przeszczepów i pacjentów z rakiem1. C. albicans jest oportunistycznym ludzkim patogenem grzybiczym, który jest częścią ludzkiej mikroflory. Zamieszkuje również powierzchnie błon śluzowych i przewód pokarmowy jako organizm komensalny. C. albicans powoduje poważną chorobę ogólnoustrojową u osób z niedoborami odporności, które przeszły operację lub były leczone długimi cyklami antybiotyków. Gatunek Candida plasuje się wśród trzech do czterech głównych przyczyn szpitalnych chorób zakaźnych (NID) u ludzi2,3,4,5,6,7. Szacuje się, że roczna globalna liczba zakażeń krwią Candida wynosi ~ 400 000 przypadków, z towarzyszącą śmiertelnością 46-75%1. Roczna śmiertelność z powodu kandydozy wynosi około 10 000 w samych Stanach Zjednoczonych. Zasięg NID powodowanego przez grzyby znajduje również odzwierciedlenie w astronomicznych wydatkach pacjentów5. W Stanach Zjednoczonych roczne wydatki na leczenie inwazyjnych infekcji grzybiczych przekraczają 2 miliardy dolarów, co stanowi ogromne obciążenie dla i tak już przeciążonego systemu opieki zdrowotnej. Obecnie dostępne standardowe terapie przeciwgrzybicze są ograniczone ze względu na toksyczność, coraz bardziej rozpowszechnioną lekooporność i interakcje między lekami. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych celów dla leków przeciwgrzybiczych, które zaowocują lepszymi opcjami leczenia dla pacjentów wysokiego ryzyka. Jednak odkrycie nowych leków działających na cele grzybów jest skomplikowane, ponieważ grzyby są eukariontami. To znacznie ogranicza liczbę celów leków specyficznych dla grzybów.

Ostatnie badania wykazały, że mitochondria są kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do zjadliwości grzybów i tolerancji na leki przeciwgrzybicze, ponieważ mitochondria są ważne dla oddychania komórkowego, metabolizmu oksydacyjnego, transdukcji sygnału i apoptozy8,9,10,11. Zarówno metabolizm glikolityczny jak i nieglikolityczny są niezbędne do przetrwania C. albicans u ssaków host12,13,14,15,16. Ponadto wykazano, że kilka mutantów C. albicans pozbawionych białek mitochondrialnych, takich jak Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 itp., jest wadliwych w filamentacji, co jest ważnym czynnikiem wirulencji C. albicans17,18,19,20,21,22. Ponadto wykazano również, że mutanty te są atenuowane pod kątem zjadliwości w mysim modelu rozsianej kandydozy17,18,19,20,21,22. W związku z tym mitochondria grzybów stanowią atrakcyjny cel dla odkrywania leków. Jednak badanie funkcji mitochondriów u C. albicans jest trudne, ponieważ C. albicans jest drobno ujemny23, co oznacza, że nie może przetrwać bez genomu mitochondrialnego.

Tutaj opisujemy protokół, który może być wykorzystany do badania funkcji mitochondriów i glikolitycznych u C. albicans bez potrzeby oczyszczania mitochondriów. Metodę tę można również zoptymalizować w celu zbadania wpływu manipulacji genetycznej lub modulatorów chemicznych na szlaki mitochondrialne i glikolityczne u C. albicans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Szczegółowy protokół etapowy testu jest opisany poniżej, a schematyczny protokół jest pokazany w Rysunek 1.

1. Szczepy C. albicans i warunki wzrostu

  1. Szczepy C. albicans należy hodować w płynnym podłożu z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) w temperaturze 30 °C w wytrząsarce inkubatora przez noc.
    UWAGA: Utrzymuj szczepy Candida jako zamrożone zapasy i rosną na agarze YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy i 2% agaru).

2. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować pożywkę do oznaczania w następujący sposób:
    1. W celu oznaczenia funkcji mitochondriów rozpuścić 1,04 g proszku Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 i 2 g glukozy (2%) w 90 ml sterylnej wody i ogrzać pożywkę do 37 °C. Dostosować pH do 7,4 za pomocą 5 M NaOH i uzupełnić objętość do 100 ml sterylną wodą.
    2. W przypadku testu stresu glikolitycznego rozpuścić 1,04 g samego proszku RPMI 1640 w 90 ml sterylnej wody, ogrzać pożywkę do 37 °C i dostosować pH do 7,4. Uzupełnić objętość do objętości 100 ml sterylną wodą. Proszek RPMI 1640 nie zawiera wodorowęglanów, co ma kluczowe znaczenie dla monitorowania zmiany pH jako miary glikolizy podczas testu.
  2. Związki iniekcyjne.
    1. Przygotować 1 M bulion glukozy w sterylnej wodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować 100 mM zapasu oligomycyny w dimetylosulfotlenku (DMSO), podwielokrotność w małych objętościach i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować 100 mM antymycyny A w DMSO, porcję w małych objętościach i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotować 100 mM zapasu SHAM (kwasu salicylohydroksaminowego) w etanolu w dniu oznaczenia.
    5. Przygotować 1 M KCN w sterylnej wodzie w dniu testu.

3. Powlekanie płytki testowej poli-D-lizyną (PDL)

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w okapie laminarnym.

  1. Rozpuść poli-D lizynę w wodzie klasy do hodowli tkankowej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg / ml. Dobrze wymieszać i podwielokrotność porcji do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez długi czas.
    UWAGA: Potrzeba 50 μl na studzienkę, a na 24 dołki wymagane jest 1,2 ml. W związku z tym należy podać co najmniej 1,3 ml na probówkę do mikrowirówki.
  2. Dodać 50 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze pokojowej pod przykryciem przez 1-2 godziny.
  3. Odessać roztwór i spłukać jednorazowo 500 μl sterylnej wody do hodowli tkankowych.
  4. Otwórz pokrywę i pozostaw studzienki do wyschnięcia na powietrzu. Płytkę należy zużyć tego samego dnia lub przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2-3 dni.

4. Nawodnienie wkładu czujnika

UWAGA: Wykonaj ten krok dzień przed eksperymentem.

  1. Otwórz dodatkowy zestaw do oznaczania topnika i usuń zawartość. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki znamionowej (Rysunek 2).
  2. Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej 1 ml kalibru i umieść wkład czujnika z powrotem. Upewnij się, że czujniki zawierające fluorofory (do pomiaru tlenu i pH) są zanurzone w kalibrze.
  3. Inkubować wkład czujnika przez noc w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C.

5. Uprawa i wysiewanie komórek na płytkach pokrytych PDL

  1. Zaszczepić C. albicans w bulionie YPD i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min.
    UWAGA: W oparciu o projekt testu i zainteresowanie, C. albicans może być również uprawiany w YPG lub na minimalnym podłożu.
  2. W dniu badania rozcieńczyć odpowiednią liczbę komórek w pożywce do oznaczania, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek na 100 μl.
  3. Dodaj 100 μl rozcieńczonych komórek do każdego dołka płytki testowej, z wyjątkiem studzienek A1, B4, C3 i D6, do których dodaje się tylko 100 μl pożywki do oznaczania w celu korekcji tła (Rysunek 3).
  4. Przenieść płytkę do inkubatora niezawierającegoCO2 w temperaturze 37 °C i inkubować przez 60 minut, co pozwoli komórkom przylgnąć do powierzchni płytki.

6. Protokół testu

UWAGA: Opisany tutaj protokół dotyczy formatu 24-dołkowego instrumentu. Woluminy będą musiały zostać dostosowane, jeśli używany jest inny format.

  1. Test funkcji mitochondriów
    1. Przygotowanie związków
      1. Przygotuj związki o stężeniu 10x do oznaczania funkcji mitochondriów: Przygotuj 20 mM SHAM, 100 μM oligomycyny, 100 mM KCN i 20 μM antymycyny A w odpowiednim podłożu testowym.
      2. Dodaj 50 μl SHAM do portu A, 55 μl oligomycyny do portu B, 62 μl KCN do portu C i 68 μl antymycyny A do portu D (Rysunek 4).
  2. Test stresu glikolitycznego
    1. Przygotowanie związków
      1. Przygotuj związki o stężeniu 10x do testu stresu glikolitycznego. Przygotować 100 mM glukozy, 100 μM oligomycyny, 500 mM 2-deoksyglukozy (2DG) i 20 μM antymycyny A w odpowiednim pożywce do oznaczania.
      2. Dodaj 50 μl glukozy do portu A, 55 μl oligomycyny do portu B, 62 μl 2-DG do portu C i 68 μl antymycyny A do portu D.
  3. Zastosuj dodatkowy analizator strumienia, który mierzy wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) żywych komórek w formacie 24-dołkowej płytki. Przygotuj protokół testu z wyprzedzeniem.
  4. Otwórz dodatkowy analizator strumienia i skonfiguruj szablon testu za pomocą karty kreatora testu, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby wypełnić wszystkie informacje, które pojawią się podczas instalacji. Wygeneruj układ grupy w sposób podobny do pokazanego w Rysunek 5. Skonfiguruj protokół, jak pokazano w Tabeli 1. Skonfiguruj te układy z dużym wyprzedzeniem przed testem i zapisz je w komputerze. W momencie testu przywróć zapisany protokół, otwierając odpowiedni plik w opcji otwórz plik w zakładce kreatora testu (Rysunek 5).
  5. Załaduj 10x związki do odpowiednich portów uwodnionego wkładu czujnika zawierającego kalibert i załaduj do tacy nośnej dodatkowego analizatora strumienia. Rozpocznij kalibrację, naciskając przycisk Start na ekranie.
  6. Delikatnie dodać 350 μl pożywki do oznaczania na płytkę komórkową wzdłuż boku studzienek, aby zminimalizować zakłócenia komórek i doprowadzić końcową objętość do 450 μl.
  7. Zastąp tabliczkę użytkową zawierającą kaliber płytką testową i kontynuuj.
  8. Wyjmij wkład czujnika i płytkę po zakończeniu testu. Zapisz plik w odpowiednim folderze docelowym.

7. Analiza danych

  1. Użyj obszaru pod zakładką analizy krzywej wariancji (AUC-ANOVA) w oprogramowaniu, aby obliczyć istotną różnicę między grupami, wybierając odpowiednie parametry (OCR lub ECAR), jak pokazano na Rysunek 6.
  2. Wybierz grupy, które chcesz porównać.
  3. Dodaj do grup analiz dla ANOVA i kliknij przycisk Ok.
    UWAGA: Ta analiza AUC ANOVA doda nowy arkusz do pliku, w którym AUC jest obliczane dla każdej grupy i porównywane między nimi przez ANOVA. Spowoduje to wyświetlenie tabeli wartości p, aby pokazać istotność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest określenie funkcji bioenergetycznych C. albicans ocenianych za pomocą dodatkowego analizatora strumienia. Mutant C. albicans pozbawiony białka mitochondrialnego Mam33 jest również uwzględniony wraz ze szczepem dopełniacza, mam33Δ/Δ::MAM33 w celu zbadania wpływu delecji białka mitochondrialnego na OCR i ECAR. MAM33 koduje przypuszczalne mitochondrialne białko macierzy kwasowej, a jego funkcja w Candida nie jest znana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test dodatkowego strumienia bioenergetycznego służy jako doskonałe narzędzie do odczytywania funkcji mitochondriów poprzez pomiar zużycia tlenu zależnego od fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w czasie rzeczywistym. Ponadto funkcja glikolityczna, która jest mierzona jako szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (zmiana pH zewnątrzkomórkowego), może być również badana w tym samym czasie w analizie w czasie rzeczywistym.

Pomyślne posiew C. albicans na płytce testowej jest jednym z krytyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w laboratorium NC są wspierane przez grant National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 oraz grant New Jersey Health Foundation (NJHF), #PC40-18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640CorningMT50020PB
Antymycyna ASigmaA8674
KCN
Zestaw naprężeń MitoAgilent103015-100
OligomycynaCalbiochem495455
pH-metrAccumetAR20
Czerwień fenolowaSigmaP5530
Poli-D lizynaSigmaP6407
RotenonSanta Cruz203242
Seahorse XF24 FluxPakAgilent100850-001
SHAM
Chlorek soduAmresco 241
Granulki wodorotlenku soduJ.T Baker3722
Woda klasy kultur tkankowychGibco1523-0147
Roztwór kalibru do oznaczania XFAgilent100840-000
Ekstrakt drożdżowy Pepton DekstrozaFisher scientific,BP2469
Ekstrakt drożdżowy Pepton Dekstroza AgarSigmaA1296
Ekstrakt drożdżowy Pepton GlicerolSigmaG2025

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
  4. Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
  5. Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
  6. Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
  7. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
  8. Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
  9. Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
  10. Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
  11. Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  12. Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
  13. Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
  14. Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
  15. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
  16. Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
  17. Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
  18. Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
  19. Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
  20. Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
  21. Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).
  22. Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
  23. Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
  24. Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
  25. Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
  26. de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddychanie mitochondrialnefunkcja glikolitycznaszybko zu ycia tlenuszybko zakwaszenia zewn trzkom rkowegoinhibitory mitochondrialnepatogeneza grzybicznaanaliza bioenergetycznakartrid z sensorem

Powiązane artykuły