Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowa przenośna kaseta do naświetlania in vitro do pobierania próbek aerozoli

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58916

⸱

22 lutego 2019

 ,  , 
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzania przenośnych ekspozycji aerozoli komórkowych i mierzenia odpowiedzi komórkowej. W metodzie wykorzystuje się komórki hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, naśladując fizjologię in vivo. Odpowiedź komórkową na aerozole z nanocząstek miedzi obserwowano jako stres oksydacyjny poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i cytotoksyczność jako uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej.

Streszczenie

Ten protokół wprowadza nowy system ekspozycji in vitro, który może być noszony, łącznie z jego charakterystyką i wydajnością. Systemy narażenia na działanie promieni powietrza i cieczy (ALI) in vitro są często duże i nieporęczne, co utrudnia transport w teren i eksploatację u źródła emisji lub w strefie oddychania. Dzięki miniaturyzacji tych systemów, laboratorium może zostać przeniesione w teren, co przyspiesza czas przetwarzania i zapewnia bardziej odpowiednią metodę ekspozycji, która nie zmienia aerozolu przed kontaktem z komórkami. Przenośna kaseta do ekspozycji in vitro (PIVEC) dostosowuje kasetę filtrującą o średnicy 37 mm, aby umożliwić badanie toksyczności in vitro poza tradycyjnymi warunkami laboratoryjnymi. PIVEC scharakteryzowano przy użyciu trzech rozmiarów nanocząstek miedzi w celu określenia wydajności osadzania na podstawie analizy grawimetrycznej i koncentracji liczby cząstek. Wstępne eksperymenty cytotoksyczności przeprowadzono na odsłoniętych komórkach płuc w celu określenia zdolności systemu do osadzania cząstek przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności komórek. PIVEC zapewnia podobną lub zwiększoną wydajność osadzania w porównaniu z dostępnymi urządzeniami do naświetlania in vitro z przepływem prostopadłym. Pomimo mniejszej przepustowości próbki, niewielki rozmiar daje pewne zalety obecnym systemom naświetlania ALI in vitro. Obejmują one możliwość noszenia do osobistego monitorowania, mobilność z laboratorium do źródła emisji oraz możliwość skonfigurowania wielu systemów w celu uzyskania rozdzielczości przestrzennej przy zachowaniu niższych kosztów użytkowania. PIVEC jest systemem zdolnym do zbierania aerozoli w terenie i w strefie oddychania na model in vitro z interfejsem powietrznym.

Wprowadzenie

Osobiste pobieranie próbek przy użyciu technik in vitro może dostarczyć wyczerpujących informacji na temat biologicznych skutków aerozoli w miejscu pracy. 1 Narażenie na zanieczyszczenia w powietrzu obejmuje narażenie na samą substancję chemiczną, na pobrane próbki powietrza, w warunkach zanurzenia, gdzie gaz jest wprowadzany do zawiesiny ogniwa, przerywane narażenie za pomocą urządzenia takiego jak kołyska, lub bezpośrednie narażenie na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). 2 Wiele z tych technik jest wykonywanych na komórkach hodowanych w zawiesinie lub pobieraniu próbek przed ekspozycją, z których każda może mieć wpływ na badanie toksykologiczne ze względu na potencjalne zmiany w aerozolu. 3 Aby uniknąć tych zmian, laboratorium można przenieść w teren za pomocą kilku systemów ekspozycji na hodowle in vitro ALI, które są używane w literaturze,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13 Jednak niewiele z nich jest dostępnych na rynku. 8,9,12 Systemy te są często nieporęczne, zwłaszcza gdy zawierają przyrządy do regulacji temperatury i wilgotności środowiska komórkowego oraz natężenia przepływu próbki aerozolu. Dzięki zastosowaniu PIVEC ekspozycja na aerozole może być wykonywana poza tradycyjnymi warunkami laboratoryjnymi lub w strefie oddychania, naśladując warunki inhalacji.

Określenie osadzania aerozoli in vitro jest ważne dla badania skutków zdrowotnych spowodowanych wdychaniem. Strefa oddychania, obszar w promieniu 30 cm od ust i nosa,14 ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia narażenia na nanocząstki i powiązania z efektami biologicznymi w płucach. 2 Często osadzanie na komórkach jest definiowane jako efektywność osadzania, cząstki zdeponowane i wchłonięte przez komórki podzielone przez cząstki podawane do systemu6,15 lub na podstawie masy tych samych ilości. 4,16 Obecne metody pomiaru aerozoli w strefie oddychania są oparte na filtrach, wychwytują cząstki w danym okresie próbkowania i wykorzystują filtry do przeprowadzania dalszych testów. 17 Monitorowanie osobiste wymaga małego systemu, który wiąże się z kompromisem w postaci mniejszej liczby próbek.

Istnieje wiele podejść do określania skutków zdrowotnych wynikających z ekspozycji na aerozol. Model ALI pozwala na podawanie aerozolu bezpośrednio do komórek drogą powietrzną, tak jak w rzeczywistym scenariuszu narażenia, ale jest bardziej opłacalny i mniej czasochłonny niż badania in vivo, naśladując bariery powietrze-ciecz, takie jak oczy, skóra i płuca. Komórki płuc hodowane w ALI mają zdolność generowania spolaryzowanej warstwy barierowej, 18,19, która wytwarza cechy fizjologiczne przypominające nabłonek płuc in vivo, w tym produkcję śluzu i środków powierzchniowo czynnych w określonych liniach komórkowych oskrzelowych lub pęcherzyków płucnych, bicie rzęsek,19 ścisłe połączenia,19,20 i polaryzacja komórek. 18 Zmiany takie jak te mogą wpływać na odpowiedź komórkową mierzoną w badaniach toksyczności. 21 Ponadto, wyniki modelu ALI in vitro są często bardziej czułe niż komórki narażone za pomocą modeli zawiesinowych22 i są w stanie modelować ostrą toksyczność inhalacyjną in vivo. 23,24 Dlatego naturalnym kolejnym krokiem jest system ekspozycji ALI, który jest w stanie wykonywać pomiary w strefie oddychania.

Poprzez wystawienie komórek na działanie aerozolu bezpośrednio w miejscu emisji, następuje badanie skutków wszystkich gazów, związków półlotnych i cząstek wchodzących w skład mieszaniny. Gdy mieszanina jest zbierana na filtrze, gazy i związki lotne nie są wychwytywane i nie można zbadać całej mieszaniny. Ponadto rozpuszczenie cząstek w zawiesinie w postaci proszku lub cieczy może prowadzić do agregacji lub interakcji cząstka-płyn, takich jak rozpuszczenie, w ciekłej zawiesinie. 25,26 Gdy do cieczy dodawane są cząsteczki aerozolu, istnieje większy potencjał aglomeracji,25,27 tworzenie się korony białkowej,28 lub interakcji ze związkami w cieczy, które mogą wpływać na osadzanie się i wpływać na odpowiedź biologiczną. 29,30

Ekspozycja w ALI opiera się na trzech głównych profilach aerozolu: osiadaniu chmur, przepływie równoległym i przepływie prostopadłym. Osadzanie się chmur, używane przez ekspozycję komórek na interfejs powietrze-ciecz (ALICE),4 to system wsadowy, w którym cząstki osadzają się poprzez osiadanie grawitacyjne i dyfuzyjne, gdy aerozol jest traktowany jako jedna jednostka. Przepływ równoległy, używany przez system ekspozycji na aerozol elektrostatyczny in vitro (EAVES)5 i komorę do ekspozycji wielokulturowej (MEC) II,6 pozwala na osadzanie poprzez dodawanie ruchów Browna przez profil przepływu. Przepływ prostopadły, używany przez mikrorozpylacz 7 Nano Aerosol Chamber for In-Vitro Toxicity (NACIVT),11 i komercyjne systemy ALI8,9,10,12, dodaje impakcję cząstek w obszarze osadzania. Wiele z tych systemów ekspozycji jest dużych i nieporęcznych, co wymaga nadmiarowych systemów do wstępnego kondycjonowania aerozoli, pomp do przepływu, a nawet komór grzewczych do inkubacji komórek. Ten duży rozmiar zmniejsza przenośność systemu. Zamiast pobierania próbek bezpośrednio u źródła emisji, systemy te często mają próbki dostarczane do laboratorium lub modelowane aerozole generowane do analizy. Złożoność emitowanego aerozolu może zostać utracona podczas przenoszenia z terenu do laboratorium. PIVEC jest mniejszy niż obecne systemy, o powierzchni zewnętrznej około 460cm2 i wadze zaledwie 60 gramów, z wbudowaną w system kontrolą temperatury i wilgotności, co pozwala na uzyskanie wysoce przenośnego urządzenia. Zmniejszone rozmiary i waga pozwalają na noszenie systemu lub zabranie go do źródła narażenia, co pozwala na bezpośrednie pobieranie próbek.

Duży rozmiar obecnych systemów ekspozycji również zmniejsza możliwość pobierania próbek w celu zbadania przestrzennych gradientów stężeń. Rezolucja ta ma kluczowe znaczenie przy określaniu skutków toksykologicznych wielu potencjalnych zagrożeń środowiskowych i zawodowych, takich jak spaliny samochodowe, cząstki stałe lub czynności w miejscu pracy, w których występuje aerozolowanie. Bezpośrednio po emisji dochodzi do przestrzennej zmienności stężenia cząstek. Zjawisko to rośnie z czasem, gdy cząsteczki rozpraszają się w atmosferze, a efekty te mogą się zmieniać w zależności od warunków otoczenia, takich jak temperatura, ciśnienie, wiatr i słońce. Cząstki mogą również zacząć się starzeć i utleniać po wyemitowaniu31,32, a na tempo dyspersji ma wpływ topografia; Wyższe stężenia można znaleźć w kanionach i tunelach, gdzie efekty dyspersji są spowolnione, a niższe stężenia można znaleźć tam, gdzie jest duży obszar do dyspersji. 33 Te zmiany w wskaźnikach dyspersji mogą mieć znaczący wpływ na zdrowie ludzi i można je zaobserwować, porównując liczbę dorosłych chorych na astmę mieszkających w miastach i na wsi. 34 Podczas gdy wiele systemów naświetlania dostarcza wiele próbek jednocześnie, wiele systemów jest koniecznych przy dużej ilości dużego sprzętu do wykonywania rozdzielczości przestrzennej.

Przenosząc laboratorium w teren, czas analizy można skrócić, używając całej komórki jako czujnika. Śledzenie znanych mechanizmów biologicznych i punktów końcowych może pomóc w określeniu składu i wielkości aerozolu. Ze względu na metody powolnego usuwania, w tym klirens śluzowo-rzęskowy, fagocytozę i translokację, cząsteczki te często oddziałują z komórkami przez około dni do tygodni3, generując stres oksydacyjny, stan zapalny, a nawet śmierć komórki. Te biologiczne punkty końcowe mogą być punktami wyjścia dla szlaków niekorzystnych skutków dla chorób sercowo-naczyniowych lub przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. Ponadto Wiemenn i wsp. przeprowadzili szereg testów in vitro w celu porównania z wartościami literaturowymi dotyczącymi krótkotrwałej toksyczności inhalacyjnej in vivo. 35 Odpowiedź in vivo została przewidziana z dwoma z czterech pozytywnych wyników testów cytotoksyczności poprzez uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej, stresu oksydacyjnego spowodowanego redukcją glutationu oraz tworzeniem i uwalnianiem nadtlenku wodoru oraz potencjału zapalnego z genu czynnika martwicy nowotworu alfa. Spośród dziesięciu badanych tlenków metali o rozmiarach nano, sześć przetestowano jako aktywne (tlenek tytanu, tlenek i cztery różne tlenki ceru) przy użyciu ekspozycji in vitro z potwierdzeniem in vivo.

Aby zbadać wpływ aerozoli w środowisku zawodowym, nasze laboratorium opracowało PIVEC do ekspozycji w terenie. Dodatkowo, PIVEC może być noszony do osobistego pobierania próbek w celu monitorowania i badania narażenia na wdychanie, np. kaseta filtra 37 mm36 lub wiele systemów może być używanych do osiągnięcia rozdzielczości przestrzennej na danym obszarze. W niniejszym protokole omówiono charakterystykę i zastosowanie PIVEC. Po narażeniu skutki biologiczne obserwuje się za pomocą testów cytotoksyczności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Operatorzy muszą stosować osobistą ochronę indywidualną (np. fartuch laboratoryjny, rękawiczki, gogle) podczas wykonywania kroków 1, 2, 3, 5 i 6.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotuj materiały do montażu układu i ekspozycji, aby zapewnić powtarzalność wyników.
    1. Do montażu układu należy użyć nowych lub oczyszczonych w 70% etanolu przewodzących rurek o średnicy wewnętrznej ¼” oraz złączy o średnicy zewnętrznej ¼”.
    2. Przechowuj materiały testowe, w tym filtry, komponenty PIVEC, pęsety i proszki z cząsteczkami, w kontrolowanym środowisku pod kątem temperatury i wilgotności przez co najmniej 24 h przed eksperymentem.
      UWAGA: Temperatura powinna być zbliżona do temperatury pokojowej, około 20 °C, przy wilgotności względnej poniżej 35%. Jest to kluczowe dla zapewnienia powtarzalności pomiędzy eksperymentami.
    3. Przygotuj liczniki cząstek, używając izopropanolu do czyszczenia części, i pozwól na rozgrzanie się systemu zgodnie z zaleceniami producenta, w tym analizatora wielkości cząstek z mobilnością skanowaną (SMPS) oraz optycznego analizatora wielkości cząstek (OPS) służących do pomiarów.

2. Generowanie suchego aerozolu

UWAGA: Operatorzy powinni przeprowadzać generowanie aerozolu w dygestorium.

  1. Zmontowanie układu do generowania suchych aerozoli
    UWAGA: Zawiesina cząstek w gazie lub cieczy powinna być odpowiednia dla modelowanego zastosowania i hodowli komórkowej. Poniższa metoda może być przeprowadzona z użyciem aerozolu na bazie cieczy. Projekt systemu suchych aerozoli pochodzi od Tiwari et al.37 Schemat systemu rozprzestrzeniania suchego przedstawiono na Rysunku 1.
    1. Podłączyć zawór kulowy do każdego końca gwintowanej rury o rozmiarze 4” 1/8, która będzie służyć jako zasobnik na cząstki. Do jednego zaworu podłączyć rurę o rozmiarze 2” 1/8.
    2. Odważyć nanocząstki miedzi; w niniejszym badaniu stężenie masowe dla każdego rozmiaru cząstek pozostawano stałe podczas wyznaczania wydajności depozycji. Na jedną ekspozycję należy użyć około 7,5 mg nanocząstek miedzi o rozmiarze 40 nm, 7 mg nanocząstek miedzi o rozmiarze 100 nm oraz 13 mg nanocząstek miedzi o rozmiarze 800 nm. Wprowadzić nanocząstki miedzi do zasobnika przez otwarty koniec.
      UWAGA: Odważona ilość nanocząstek miedzi będzie służyć jako podane stężenie oparte na masie.
    3. Założyć fragment rurki o długości 3” i średnicy zewnętrznej (OD) ½” wokół 2-calowej rury i umieścić wewnątrz tej krótkiej rurki filtr HEPA w taki sposób, aby kierunek przepływu prowadził przez zawór kulowy.
    4. Podłączyć generator próżni do drugiego zaworu kulowego za pomocą gwintu. Połączyć generator próżni ze zbiornikiem powietrza, wprowadzając rurkę o średnicy zewnętrznej 5/16” do złącza zaciskowego. Użyć rurki o średnicy zewnętrznej ¼” do połączenia wylotu generatora próżni z zestawem eksperymentalnym, nakładając rurkę na wylot generatora próżni.
  2. Wykorzystanie systemu aerozoli suchych do generowania suchego aerozolu
    1. Otworzyć zbiornik powietrza, przekręcając główny zawór, i doprowadzić przepływ powietrza do układu. Otworzyć zawór regulatora przepływu w zbiorniku powietrza i ustawić go tak, aby przepływ przez system był równy pożądanym ustawieniom pompy próżniowej.
    2. Otworzyć zawór kulowy znajdujący się najbliżej filtra HEPA, a następnie otworzyć zawór kulowy znajdujący się najbliżej generatora próżni. Pozostawić je otwarte przez około 3 s, aby cząstki zostały wciągnięte do strumienia powietrza.
    3. Zamknąć zawór kulowy najbliższy generatorowi próżni, a następnie zamknąć zawór kulowy najbliższy filtrowi HEPA. Pozostawić przepływ powietrza ze zbiornika na czas trwania eksperymentu, zgodnie z potrzebami.
    4. Zamknąć główne zawory i zawory regulatora w zbiorniku powietrza, aby zatrzymać przepływ. Oczyścić zawory kulowe i generator próżni za pomocą 70% etanolu. Poddać metalowe rury autoklawowaniu w celu sterylizacji.

3. Pomiar wydajności osadzania przy użyciu PIVEC

UWAGA: Operatorzy powinni przeprowadzać ekspozycje aerozolowe w dygestorium.

  1. Zmierz depozycję, zbierając aerozol nanocząsteczek miedzi wygenerowany w kroku 2.2 na uprzednio zważonym filtrze. Wykorzystaj dawkę zdeponowaną, zmierzoną na podstawie masy zebranej na filtrze, oraz dawkę podaną, zmierzoną na podstawie ilości zważonych cząsteczek miedzi, aby określić wydajność depozycji.
    1. Przechowuj szklane filtry z włókna o porach 1,00 µm w warunkach niskiej wilgotności, opisanych w 1.1.2, przez co najmniej 24 h przed pomiarami ekspozycji. Zważ nieużywany filtr trzy razy i zapisz wartości masy filtra. Umieść nieużywany filtr w wkładzie do hodowli komórkowej.
    2. Wybierz odpowiedni adapter do wkładu do hodowli komórkowej (6-dołkowy lub 24-dołkowy) dla PIVEC, aby podtrzymać wkład do hodowli komórkowej z filtrem. Umieść element adaptera na górze podstawy PIVEC, osadzając go tak, aby podstawa elementu adaptera była szersza niż jego góra.
    3. Za pomocą pęsety umieść wkład do hodowli komórkowej z filtrem w elemencie adaptera. Umieść górny element na górze adaptera, osadzając go tak, aby podstawa górnego elementu była szersza niż jego góra. Owiń PIVEC jedną warstwą taśmy naprawczej.
    4. Połącz 37 mm elementy kasety na górze i na dole PIVEC, dociskając je na miejsce. Włóż adaptery z kolcami ¼” do wlotu i wylotu kasety.
    5. Owiń grzałkę rezystancyjną wokół PIVEC tak, aby przewody znajdowały się u podstawy. Zabezpiecz taśmą.
    6. Owiń PIVEC ok. 8 warstwami folii aluminiowej w celu izolacji. Zabezpiecz taśmą.
    7. Podłącz 2” odcinek elastycznego wężyka o średnicy zewnętrznej 1/2” do adaptera na górze PIVEC. Wyjmij porowaty wężyk z wody sterylnej i umieść go w wężyku na górze PIVEC.
    8. Umieść PIVEC w zacisku na statywie pierścieniowym i zabezpiecz. Dokończ konfigurację, podłączając pompę próżniową, liczniki cząstek i zestaw do aerozoli.
      UWAGA: Dawkę zdeponowaną opartą na liczbie cząstek można określić tylko wtedy, gdy liczniki cząstek są umieszczone przed PIVEC i po PIVEC w oddzielnych cyklach.
    9. Poddaj filtry ekspozycji zgodnie z krokiem 2.2 protokołu, stosując pożądany czas ekspozycji i natężenia przepływu; w niniejszym badaniu zastosowano czas ekspozycji 10 min przy przepływie 0,5 LPM. Wyjmij PIVEC z układu. Wyjmij wkład do hodowli komórkowej i umieść naświetlony filtr w uchwycie do filtrów w warunkach niskiej wilgotności przez co najmniej 24 h przed pomiarami.
    10. Oczyść PIVEC 70% etanolem. Sterylizuj światłem ultrafioletowym przez co najmniej 30 min przed kolejnym eksperymentem.
    11. Zważ naświetlony filtr trzy razy i zapisz wartości masy filtra. Umieść naświetlony filtr w oznakowanym uchwycie do filtrów w celu przechowywania.

4. Obliczenie dawki zdeponowanej i wydajności depozycji

UWAGA: Znajomość procesu depozycji jest istotna dla podawania aerozoli oraz interpretacji odpowiedzi komórkowej.

  1. Obliczanie depozycji na podstawie pomiarów masy
    1. Oblicz masę osadzoną na filtrach jako różnicę między średnią wagą przed ekspozycją a średnią wagą po ekspozycji. Wartość ta stanowi dawkę osadzoną w jednostkach masy dla danego eksperymentu.
    2. Wykorzystaj masę podaną, madmin, oraz dawkę osadzoną w jednostkach masy wyznaczoną w punkcie 4.1.1, mdep, aby obliczyć wydajność depozycji masy, ηm, dla danego eksperymentu.
      figure-protocol-1
    3. Wyciągnij średnią z wartości uzyskanych w punktach 4.1.1 i 4.1.2 z co najmniej 3 eksperymentów, aby określić depozycję i wydajność depozycji dla PIVEC dla danej wielkości cząstek.
  2. Obliczanie depozycji na podstawie pomiarów liczby cząstek
    1. Upewnij się, że pomiary licznikami cząstek zostały wykonane po przejściu przez PIVEC oraz w celu określenia stężenia cząstek przed PIVEC. Całkuj stężenie cząstek w czasie dla licznika cząstek, a następnie całkuj po średnicy cząstek, aby określić całkowitą liczbę zmierzonych cząstek.
    2. Oblicz liczbę osadzonych cząstek jako różnicę między liczbą cząstek podanych a liczbą cząstek zmierzonych po PIVEC. Wartość ta stanowi dawkę osadzoną w jednostkach liczbowych dla danego eksperymentu.
    3. Wykorzystaj liczbę podanych cząstek, nadmin, dawkę osadzoną w jednostkach liczbowych, ndep, natężenie przepływu objętościowego, V, oraz czas, t, aby obliczyć wydajność depozycji liczbowej, ηn, dla danego eksperymentu.
      figure-protocol-2
    4. Wyciągnij średnią z wartości uzyskanych w punktach 4.2.2 i 4.2.3 z co najmniej 3 eksperymentów, aby określić depozycję i wydajność depozycji dla PIVEC dla danej wielkości cząstek.

5. Ekspozycja komórek na aerozol

UWAGA: W kwestii hodowli komórkowej na granicy faz powietrze-ciecz odsyłamy czytelnika do pracy Blank et al.38 Załadowanie wkładów do hodowli komórkowej (kroki 5.1.2-5.1.4) powinno być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ekspozycje na aerozol należy przeprowadzać w dygestorium.

  1. Hodowla komórek na granicy faz powietrze-ciecz
    1. Odczepić komórki A549 z kolby hodowlanej poprzez dodanie trypsyny-EDTA (3 ml dla kolby T75 lub 1 ml dla kolby T25) i inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °CDo kolby dodaj 7 ml pożywki kompletnej (dla kolby T75) lub 4 ml pożywki kompletnej (dla kolby T25), a następnie opłucz ścianki kolby zawiesiną komórkową, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych komórek. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml, a następnie odwiruj komórki przy 800 x g przez 3 min.
    2. Usunąć nadsącz zawierający trypsynę-EDTA i resuspendować osad komórkowy w 10 ml pożywki kompletnej. Usunąć 10 µL zawiesiny komórkowej i nanieść na komorę countingową. Policz komórki za pomocą komory countingowej w celu określenia stężenia oraz całkowitej liczby komórek.
    3. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej należy wlać 0,5 ml pełnej pożywki. W dołkach należy umieścić nieużywane wkładki do hodowli komórkowej. Komórki należy wysiać na stronę apikalną wkładki z gęstością bliską 1 x 105 komórek/cm2 dla typów komórek, których szybkość wzrostu wynosi niemal podwojenie populacji na dobę. Aby zasiać komórki A549 w wkładce 24-dołkowej, należy zasiać komórki z gęstością 1 x 105 komórki/cm2 poprzez dodanie 35 000 komórek do wkładki do hodowli komórkowej.
      UWAGA: Komórki o wolniejszym tempie wzrostu można wysiewać z większą gęstością.
    4. Dodać pełną pożywkę po stronie apikalnej wkładki do hodowli komórkowej, aby osiągnąć objętość końcową (dla płytki 24-dołkowej objętość końcowa wynosi 0,25 ml).
    5. Kultury hodowano przez 7 dni w warunkach zanurzenia, wymieniając pożywkę co 1-2 dni. Po 7 dniach usunięto pożywkę z komory apikalnej i hodowano przez co najmniej 1 dzień w warunkach ALI, wymieniając wyłącznie pożywkę w komorze bazolateralnej.
  2. Montaż PIVEC
    1. Należy pozwolić komórkom na wyrównanie stanu równowagi na granicy faz powietrze-ciecz przez co najmniej 24 h przed ekspozycją.
    2. Wybierz odpowiedni adapter do wkładu do hodowli komórkowej dla PIVEC, aby zapewnić podparcie wkładu do hodowli komórkowej z filtrem. Umieść element adaptera na górnej części podstawy PIVEC, ustawiając go w taki sposób, aby podstawa adaptera była szersza od jego górnej części. Do dołka w podstawie PIVEC dodaj 4 ml pożywki do hodowli komórkowej.
    3. Za pomocą pęsety umieść wkład do hodowli komórkowej w elemencie adaptera umieszczonym w kroku 5.2.3. Na elemencie adaptera umieść część górną, osadzając ją tak, aby podstawa części górnej była szersza od jej górnej krawędzi. Ostrożnie owiń PIVEC pojedynczą warstwą taśmy klejącej.
    4. Połączyć elementy kasety o rozmiarze 37 mm na górze i na dole urządzenia PIVEC, dociskając je do miejsca osadzenia. Umieścić ¼adaptery z karbami do wlotu i wylotu kasety.
    5. Owiń grzałkę rezystancyjną wokół PIVEC w taki sposób, aby przewody znajdowały się u podstawy. Przymocuj za pomocą taśmy.
    6. Owiń PIVEC około 8 warstwami folii aluminiowej w celu izolacji. Zabeziecz taśmą.
    7. Podłącz krótki odcinek elastycznej rurki o średnicy zewnętrznej 1/2 cala do adaptera na górnej części urządzenia PIVEC. Wyjmij rurkę porowatą z wody sterylnej i umieść ją w rurce na górze PIVEC.
    8. Umieść PIVEC w zacisku na statywie i zabezpiecz. Dokończ konfigurację, podłączając pompę próżniową oraz zestaw do aerozoli.
  3. Ekspozycja komórek na interfejs powietrze-ciecz (ALI) przy użyciu PIVEC
    1. Wykorzystaj wydajność depozycji wyznaczoną w kroku 2, aby obliczyć masę cząstek do aerozolizacji. Odważ odpowiednią masę i dodaj ją do systemu aerozolowego przygotowanego zgodnie z krokiem 2 wewnątrz dygestorium.
    2. Naświetl komórki zgodnie z krokiem 2.2; w niniejszym badaniu punktów końcowych biologicznych komórki poddano działaniu około 3,5 mg nanocząsteczek miedzi przy natężeniu przepływu 0,5 LPM i czasie ekspozycji wynoszącym 10 min. W badaniach kontrolnych zastosowano nawilżone powietrze, aby określić wpływ samego powietrza. Usuń PIVEC z układu. Wyjmij wkładkę z hodowlą komórkową, umieść ją w sterylnej płytce wielodołkowej i przenieś z powrotem do CO22 inkubator (37°C, 5% CO₂2, 90% RH).
    3. Odssać pożywkę z PIVEC. W przypadku przeprowadzania dodatkowych eksperymentów przemyć dno PIVEC roztworem soli fosforanowej, a następnie powtórzyć kroki 5.1 i 5.2.
    4. Po zakończeniu pracy oczyścić PIVEC 70% etanolem. Przed kolejnym eksperymentem wysterylizować światłem ultrafioletowym przez co najmniej 30 min.
  4. Procedury analiz biologicznych
    UWAGA: W niniejszym badaniu przeprowadzono testy generowania stresu oksydacyjnego za pomocą analizy DCFH-DA oraz testy cytotoksyczności poprzez pomiar uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH).
    1. Rozpuścić 24,4 mg DCFH-DA w 50 ml metanolu, aby przygotować 1 mM roztwór DCFH-DA. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20°C przez okres do 4 miesięcy. Rozcieńczyć roztwór DCFH-DA o stężeniu 1 mM, mieszając 0,1 ml roztworu DCFH-DA 1 mM z 9,9 ml HBSS, aby przygotować 10 ml 10 µM DCFH-DA.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć wkładkę do hodowli komórkowych około 1 ml PBS. Dodać 0,5 ml 10 µM roztwór DCFH-DA do każdej studzienki, wymieniając wkładki po zakończeniu procesu. Przykryć płytkę folią aluminiową, aby zapobiec fotoaktywacji barwnika, a następnie przenieść do 37°C inkubator przez 1 h.
    3. Wyjąć komórki z inkubatora i odessać roboczy roztwór DCFH-DA z dołków. Do dołków dodać 0,5 ml HBSS i ponownie umieścić inserty do hodowli komórkowej.
    4. Włóż płytkę pomiarową do czytnika płytek i zmierz fluorescencję bazową, stosując długości fal wzbudzenia/emisji 485/530 nm. Wyjmij płytkę z czytnika i umieść wkład w systemie PIVEC w celu ekspozycji.
    5. Naświetlaj komórki przez pożądany czas ekspozycji. Wyjmij wkład z PIVEC i przenieś go z powrotem do płytki wielodołkowej. Usuń 50 µL płyn z przestrzeni bazolateralnej z płytki wielodołkowej i przenieść do białej płytki 96-dołkowej. Pomiar fluorescencji DCF należy przeprowadzić przy długościach fal wzbudzenia/emisji 485/530 nm co 30 min po ekspozycji przez 2 h.
    6. Pozostawić płyn bazolateralny do wyrównania temperatury z temperaturą pokojową przez 20–30 min. Dodać 50 µL roztworu do analizy LDH, przygotowanego zgodnie z protokołem producenta, do płynu podstawnobocznego z płytki wielodołkowej i pozostawić na 10 min w celu zajścia reakcji. Dodać 25 µL roztworu stopującego do dołka. Odczytać fluorescencję produktu w postaci rezorufiny, stosując długości fal wzbudzenia/emisji 560/590 nm.
    7. Usunąć nadmiar płynu bazolateralnego i powtórzyć krok 5.4.6 w 4. i 24. godzinie po ekspozycji.

6 Metody statystyczne

  1. Analiza danych z testów biologicznych
    1. Produkcję ROS należy przedstawić jako wzrost intensywności fluorescencji w komórkach traktowanych w stosunku do pomiarów bazowych. Aktywność LDH należy przedstawić jako wzrost intensywności fluorescencji w komórkach traktowanych w stosunku do komórek nietraktowanych.
    2. Należy przeprowadzić jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) w celu określenia różnic statystycznych między zestawami danych. W stosownych przypadkach należy przeprowadzić testy t Studenta przy poziomie istotności 0,05. Dane należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe z co najmniej trzech pomiarów ekspozycji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Toksykologia zawodowa in vitro polega na utrzymaniu żywotności komórek podczas ekspozycji na aerozol. System PIVEC przedstawiono na Rysunku 2, wraz z kontrolą temperatury i wilgotności oraz założonym PIVEC. Temperaturę utrzymywano za pomocą zasilanego bateryjnie grzałki rezystancyjnej, a aerozol nawilżano poprzez zwiększoną naturalną humidyfikację za pomocą porowatej, zwilżonej rurki. W kontrolowanych warunkach aerozolowych w laboratorium system PIVE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kasety filtracyjne zapewniają prostą i niedrogą metodę zbierania aerozoli w strefie oddychania; Próbki aerozoli pobrane z filtrów nie reprezentują jednak całego aerozolu (tj. gazów, substancji lotnych i cząstek stałych) i w związku z tym ograniczają ocenę powiązanych skutków biologicznych. Wykorzystując pierwotną konstrukcję kasety filtracyjnej o średnicy 37 mm, PIVEC został zaprojektowany tak, aby zachować przenośność i naśladować osadzanie się in vivo cząstek z wdychania. PIVEC jest znacznie mniejszy niż obecn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Afiliacja autorów jest pokazana na stronie tytułowej. Autorzy są wspierani finansowo przez Virginia Commonwealth University, gdzie prace zostały ukończone w Richmond w stanie Wirginia. Autorzy ponoszą wyłączną odpowiedzialność za napisanie i treść tego artykułu. Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Borisowi Solomonovowi i Virginia Commonwealth Innovation Machine Shop za pomoc w szybkim prototypowaniu urządzenia. Autorzy chcieliby również podziękować Cristianowi Romero-Fuentesowi z Grupy Lewinski, dr Vitaliyowi Avrutinowi, dr Dmitrijowi Pestovowi oraz Virginia Commonwealth Nanomaterials Core Characterization Facility za pomoc w charakteryzowaniu cząstek. Prace te były wspierane przez fundusze startowe przekazane dr Lewinskiemu przez College of Engineering na Virginia Commonwealth University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skaner do pomiaru wielkości cząstek (SMPS)TSI, Inc.3910NanoSMPS
Optyczny miernik wielkości cząstek (OPS)TSI, Inc.3330
Rura ze stali nierdzewnej, 4" długaMcMaster-Carr4830K116standardowościenna 304/304L, gwintowana na obu końcach,
mosiężny zawór kulowy 1/8 rozmiaru rury z uchwytem dźwigniowymMcMaster-Carr4112T12Kompaktowe wysokie ciśnienie, 1/8 NPT Żeńska
rura stalowa, 2" długaMcMaster-Carr7753K121standardowa ścianka, gwintowana na jednym końcu, 1/8 rozmiar rury
HEPA filtrGE Healthcare09-744-12HEPA-Cap Jednorazowy generator podciśnienia w kapsułce do filtracji powietrza
PISCO USAVCH10-018C
PIVECVCUW celu zaprojektowania prosimy o kontakt z autorami
Grzałka
Złącza kolczaste 1/4"Zefon International, Inc.
Rurki porowateScientific Commodities, Inc.BB2062-1814AHydrofilowe pory 10 um
Power bank
baterii Wkładka do hodowli komórkowychFisherbrand35309524-dołkowa wkładka
Kleszcze filtracyjneFisherbrand09-753-50
Pipeta transferowaThermoScientific13-711-27
Filtry z włókna szklanegoSKC225-7Typ bez spoiwa Filtr AE 37 MM 1,00 um porów
Ultra Micro BalanceA& DBM-22Umieszczony w komorze środowiskowej
Kaseta filtracyjna 37 mmSKC225-3250Kaseta filtracyjna Pusta, 37 mm, przezroczysty styren
Pompa próżniowa o zmiennym przepływieSKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 do 5000 mL/min
Cząstki miedziU.S. Research Materials, Inc.US109040 nm
Cząstki miedziU.S. Research Materials, Inc.US1088100 nm
Cząstki miedziU.S. Research Materials, Inc.US1117M800 nm
rezystancyjna459743

Bibliografia

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32(2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31(2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8(2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20(2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514(2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33(2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16(2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interfejs powietrze cieczdepozycja nanocz stekekspozycja kom rek p ucanaliza grawimetrycznakoncentracja liczby cz steknanocz stki miedzitoksyczno in vitrosystem ekspozycji polowej
Nowa przenośna kaseta do naświetlania in vitro do pobierania próbek aerozoli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.