Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58930

⸱

22 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Streszczenie

Szczepionki to medyczny cudXX wieku. Radykalnie zmniejszyły one zachorowalność i śmiertelność spowodowaną chorobami zakaźnymi i przyczyniły się do uderzającego wzrostu średniej długości życia na całym świecie. Niemniej jednak określenie skuteczności szczepionki pozostaje wyzwaniem. Pojawiające się dowody sugerują, że obecna szczepionka bezkomórkowa (aPV) przeciwko Bordetella pertussis (B. pertussis) indukuje nieoptymalną odporność. Dlatego głównym wyzwaniem jest zaprojektowanie szczepionki nowej generacji, która indukuje odporność ochronną bez niepożądanych skutków ubocznych szczepionki pełnokomórkowej (wPV). Tutaj opisujemy protokół, który zastosowaliśmy do przetestowania skuteczności obiecującego, nowatorskiego adiuwantu, który wypacza odpowiedzi immunologiczne na ochronny fenotyp Th1 / Th17 i sprzyja lepszemu usuwaniu prowokacji B. pertussis z mysich dróg oddechowych. W tym artykule opisano protokół immunizacji myszy, inokulacji bakteryjnej, pobierania tkanek i analizy odpowiedzi immunologicznej. Korzystając z tej metody, w ramach naszego modelu, udało nam się wyjaśnić kluczowe mechanizmy wywoływane przez obiecującą bezkomórkową szczepionkę przeciw krztuścowi nowej generacji. Metodę tę można zastosować do dowolnego modelu choroby zakaźnej w celu określenia skuteczności szczepionki.

Wprowadzenie

Szczepionki stanowią jedno z największych osiągnięć zdrowia publicznego XX wieku, jednak nadal nie rozumiemy w pełni mechanizmów, za pomocą których skuteczne szczepionki stymulują odporność ochronną. Identyfikacja sygnatur molekularnych (np. markerów aktywacji komórek, ekspansji podtypów komórkowych i wzorców ekspresji genów) indukowanych po szczepieniu dostarcza mnóstwa informacji do przewidywania i generowania skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Złożoność odpowiedzi gospodarz-patogen nie może być odpowiednio odtworzona przy użyciu systemów hodowli komórkowych in vitro1. Modele szczepionek in vivo są przeznaczone do jednoczesnej oceny wielu typów komórek odpornościowych w organizmie gospodarza. Daje to przewagę przy charakteryzowaniu przetwarzania i prezentacji antygenu szczepionkowego, różnicowego wydzielania cytokin i ekspansji komórek odpornościowych. Opisany tutaj protokół zawiera szczegółową metodę określania skuteczności szczepionki poprzez ocenę ogólnoustrojowej i miejscowej odpowiedzi immunologicznej oraz ilościowe określenie obciążenia patogenami w tkankach będących przedmiotem zainteresowania. Podany tutaj przykład testuje skuteczność eksperymentalnej szczepionki przeciwko patogenowi Bordetella pertussis (B. pertussis).

B. krztusiec to bakteria Gram-ujemna, która jest czynnikiem etiologicznym choroby układu oddechowego krztuśca (krztuśca)2,3. Bliski kontakt z osobami zakażonymi (objawowymi lub bezobjawowymi) prowadzi do przenoszenia, kolonizacji i choroby. Pomimo znacznego globalnego zasięgu szczepień4, krztusiec jest uważany za chorobę odradzającą się w wielu krajach na całym świecie i jest główną przyczyną możliwych do uniknięcia zgonów w dzieciństwie5,6,7,8. W 2015 r. B. pertussis i krztusiec zostały wpisane na listę pojawiających się zakaźnych patogenów/chorób Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), podkreślając potrzebę opracowania lepszej szczepionki, która zapewni długotrwałą odporność ochronną.

Obecnie, aktywnym obszarem badań mających na celu kontrolowanie nawrotu krztuśca jest opracowanie nowej generacji bezkomórkowej szczepionki przeciw krztuścowi (aPV) z optymalną kombinacją nowych adiuwantów i antygenów, aby naśladować odpowiedź immunologiczną wywołaną przez całokomórkową szczepionkę przeciw krztuścowi (wPV)9. Korzystając z opisanego protokołu, niedawno informowaliśmy, że modyfikacja obecnie zatwierdzonego przez FDA aPV poprzez dodanie nowego adiuwantu, czynnika kolonizacji Bordetella A (BcfA), spowodowała bardziej efektywną redukcję obciążenia bakteryjnego B. pertussis z płuc myszy10,11. Tej zwiększonej ochronie towarzyszyło wypaczenie indukowanej przez ałun odpowiedzi immunologicznej Th1/Th2 na bardziej ochronny profil immunologiczny Th1/Th1710. Protokół ten jest szczegółowy i kompleksowy, umożliwiając badaczowi uzyskanie maksymalnych informacji poprzez jednoczesną ocenę odpowiedzi gospodarza i układu odpornościowego na różne patogeny.

Opisany tutaj protokół jest zgodny z reprezentatywnym schematem szczepień, pokazanym w Rysunek 1, aby zapewnić optymalną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na żywych zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC Uniwersytetu Stanowego Ohio zgodnie z wytycznymi IACUC. Myszy C57BL/6 były używane we wszystkich szczepieniach i infekcjach. Zarówno samce, jak i samice myszy są używane w każdej grupie zgodnie z wytycznymi NIH. Liczbę zwierząt w grupie określono za pomocą obliczeń mocy opartych na przewidywanych różnicach w wynikach między grupami eksperymentalnymi. Na przykład 8 myszy na grupę uzyska 80% mocy przy α = 0,05 (2-stronne) dla testu t dla 2 prób w celu wykrycia różnic w interesującym wyniku 1,33 odchylenia standardowego (SD).

1. Uodpornienie myszy

  1. Przygotować główną mieszankę szczepionek w sterylnym buforze fizjologicznym, takim jak sól fizjologiczna lub DPS.
    UWAGA: Całkowita objętość w mieszance powinna zawierać o 10% więcej niż wymagana do uodpornienia całej grupy. Stężenia w składzie szczepionki są szczegółowo opisane poniżej w krokach 1.1.1 i 1.1.2. Przetransportuj przedmioty do wiwarium na lodzie.
    1. W przypadku badań nad B. pertussis należy uwzględnić następujące grupy szczepionek: aPV i aPV + BcfA. Ponadto należy stosować ałun, same antygeny szczepionkowe (FHA i Prn) oraz myszy nieleczone (niezaszczepione) jako grupy kontrolne.
      UWAGA: aPV to 1/5 dawki ludzkiej zatwierdzonego przez FDA aPV, który składa się z toksoidu tężcowego, zredukowanego toksoidu błoniczego, toksoidu krztuścowego (PT), hemaglutyniny nitkowatej (FHA) i pertaktyny (Prn) zaadsorbowanej na solach glinu. Jedna dawka ludzkiego obecnego krztuśca aPV wynosi 0,5 ml, dlatego 1/5 dawki wynosi 0,1 ml. Objętości aPV + BcfA wynoszą 0,1 ml aPV (1/5 dawki ludzkiej) + 0,046 ml BcfA (30 μg) na mysz. Maksymalna objętość, która może być bezpiecznie dostarczona do jednego mięśnia, wynosi 0,1 ml. Ponieważ objętość szczepionki aPV + BcfA jest większa niż 0,1 ml, szczepionka musi być podawana do obu ramion, podzielonych mniej więcej po równo, aby mogła być bezpiecznie podawana.
    2. Aby przygotować szczepionkę eksperymentalną, dla jednej dawki należy połączyć 1 μg FHA i 0,5 μg Prn z 50 μg żelu wodorotlenku glinu w sterylnym PBS. Pozostawić eksperymentalny aPV do mieszania na walcu laboratoryjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie wirować probówkę o masie 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić zawartość w 1 ml sterylnego PBS.
  2. W wiwarium ustaw aparat do znieczulenia (Rysunek 2).
    UWAGA: Przed użyciem upewnij się, że w odpowiednich zbiornikach jest odpowiedni poziom tlenu i izofluranu. Zważyć pojemnik z izofluranem i wymienić, gdy jego waga wzrośnie o 50 g.
  3. Dokładnie wyczyść szafę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i umieść czystą komorę indukcyjną wewnątrz BSC. Podłącz przewody anestezjologiczne i zmiatające z aparatu anestezjologicznego do komory indukcyjnej. Otwórz zbiornik tlenu za pomocą regulatora, aby upewnić się, że tlen przepływa i ustaw poziom na 1,5-2 l/min.
  4. Umieść myszy w pożądanym wieku (6-12 tygodni) w komorze indukcyjnej. Włącz izofluran do 2,5-3%, aby lekko znieczulić myszy. Monitoruj zwierzęta do momentu, gdy przestaną się poruszać w komorze, a ich oddech zwolni.
  5. Przetestuj poziom indukcji, ściskając palce u stóp, obserwując, czy nie ma odruchowych ruchów. Jeśli go nie ma, myszy są gotowe do wstrzyknięcia.
    UWAGA: W tym eksperymencie cała klatka zwierząt została znieczulona na raz. Można zdecydować się na znieczulenie zwierząt indywidualnie do wstrzyknięcia lub wstrzyknięcie zwierząt bez znieczulenia. Każda z tych metod jest odpowiednia.
  6. W międzyczasie należy przygotować strzykawki insulinowe o pojemności 1 ml (28G1/2) z 0,1 ml szczepionki każda. Gdy zwierzęta są już w pełni indukowane, wyjmij jedno zwierzę z komory i połóż mysz brzusznie na ręczniku lub podkładce na ławkę.
  7. Szczepionkę należy podawać domięśniowo. Trzymając strzykawkę pod kątem 45° i skosem skierowanym do góry, wprowadzić strzykawkę ~5 mm do mięśnia naramiennego myszy i wstrzyknąć szczepionkę.
    UWAGA: Tylna ćwiartka/bok może być używana jako miejsce wstrzyknięcia zamiast naramiennego.
  8. Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę wbitą w mięsień przez ~5-10 s. Po dostarczeniu objętości należy obrócić strzykawkę o 180° tak, aby skos był skierowany na zewnątrz, aby utworzyć uszczelnienie i zapobiec wyciekowi szczepionki. Następnie należy powoli wyciągnąć igłę z miejsca wstrzyknięcia.
  9. Umieść mysz z powrotem w klatce. Powtórz procedurę ze wszystkimi zwierzętami w wyznaczonej grupie.
  10. Wyłącz izofluran i przepłucz komorę indukcyjną tlenem przed znieczuleniem następnej klatki myszy.
  11. Monitoruj zwierzęta, dopóki wszystkie nie będą czujne i nie poruszają się w klatce. Umieść klatkę z powrotem w miejscu obudowy.
  12. Monitoruj zwierzęta co 12 godzin po szczepieniu, do 48 godzin, pod kątem klinicznych objawów chorobowości, takich jak szorstka/zaniedbana sierść, powolny chód lub trudności w oddychaniu. Jeśli objawy utrzymują się, skonsultuj się z weterynarzem instytucjonalnym i w razie potrzeby usuń myszy z badania.
  13. Cztery tygodnie po początkowym szczepieniu wzmocnij myszy, znieczulając i podając zastrzyki domięśniowe do prawego mięśnia naramiennego myszy za pomocą tego samego preparatu szczepionki, który był wcześniej podawany.
  14. Ponownie monitoruj zwierzę pod kątem jakichkolwiek objawów klinicznych. Zwierzęta domowe przez dodatkowe 2 tygodnie, a następnie kontynuuj infekcję.

2. Wzrost szczepów B. pertussis i przygotowanie inokulum infekcyjnego

  1. Z zamrożonych wywarów [kriokonserwowanych w temperaturze -80 °C w 15% glicerolu, zamrożonych z planktonowego wzrostu w pożywce Stainer-Scholte (SS) class12], smugi B. pertussis na Bordet-Gengou (BG) agar13 uzupełnionych 10% zdefibrynowaną krwią owczą i 100 μg/ml streptomycyny (10% BG + Sm) do selekcji. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4 dni.
  2. Wybierz ~ 8-10 pojedynczych kolonii szczepu (szczepów) z płytki i zaszczep 3 ml pożywki SS uzupełnionej 22,8 mM L-cysteiny, 3,6 mM siarczanu żelazawego, 3,3 mM niacyny, 48,8 mM glutationu, 227 mM kwasu askorbinowego, 1 mg / ml heptakis i 100 μg / ml streptomycyny. Kulturę należy uprawiać w temperaturze 37 °C w bębnie rolkowym przy 60 obr./min przez 16-24 godziny.
  3. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę pierwotną w stosunku 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30 i 1:15 w 3 ml uzupełnionej pożywki SS. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w bębnie rolkowym przy 60 obr./min przez 16-24 godziny.
  4. Wykonać pomiary gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) dla kultur bakteryjnych. Używając kuwet spektrofotometru, rozcieńczyć kultury w stosunku 1:10, dodając 0,1 ml płynnych kultur do 0,9 ml sterylnego PBS.
  5. Wybierz kulturę o OD600≈ 0,8-1,2. Oblicz objętość potrzebną do uzyskania 1 OD (Rysunek 3). Odwirować objętość w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 6000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek bakteryjnych w 1 ml sterylnego PBS do uzyskania gęstości 1 OD/ml [1-3 x 109 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml].
  6. Aby przygotować inokulum ~5 x 105 do 1,5 x 106 CFU/mysz w 40-50 μL, zwiruj i seryjnie rozcieńcz roztwór bakteryjny (od kroku 2.5) 100-krotnie w 1 ml sterylnego PBS, aby uzyskać ~1-3 x 107 CFUs/ml (Rysunek 4A). Przetransportować inokulum do wiwarium na lodzie.

3. Mysi model infekcji donosowej

  1. W wiwarium ustaw warunki tlenu i znieczulenia zgodnie z opisem w krokach 1.3 i 1.4. Jak opisano w kroku 1.5, umieść myszy w komorze w celu znieczulenia. Monitoruj zwierzęta, aż zacznie działać znieczulenie.
  2. Kiedy myszy są znieczulane, wyjmuj jedno zwierzę na raz z komory indukcyjnej. Podnieś mysz za kark grzbietowej klatki piersiowej, za łopatkami i szyją. Ustaw mysz pionowo, aby uzyskać dostęp do nosa.
  3. Używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl, powoli nałóż 40-50 μl inokulum bakteryjnego na nozdrzy myszy (20-25 μl w każdym norze). Przytrzymaj mysz, aż całe inokulum zostanie wdychane przez zwierzę. Jeśli część inokulum wydostanie się na zewnątrz, zbierz bąbelki i ponownie wkropl do nozdrzy. Dostarczyć równą ilość sterylnego PBS jednej grupie myszy jako kontrolę negatywną.
  4. Tak jak w krokach 1.10-1.12, należy umieścić zaszczepione zwierzęta z powrotem w klatce i monitorować je, dopóki nie staną się czujne i nie będą się poruszać. Przywróć klatkę z powrotem do pierwotnej przestrzeni obudowy na stojaku. Przepłukać komorę indukcyjną tlenem, aby usunąć pozostałości izofluranu przed znieczuleniem następnej grupy zwierząt. Monitoruj zwierzęta przez 48 godzin po zakażeniu.
  5. W laboratorium seryjne rozcieńczenia inokulum na płytkach, w sterylnym PBS, w celu sprawdzenia rzeczywistych CFU dostarczonych myszom. Płytka 0,1 ml rozcieńczeń na 10% płytkach BG + Sm (Rysunek 4A). Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i rosnąć przez 4 dni. Policz i oblicz CFU z inokulum dostarczonego myszy (Rysunek 4B).

4. Pobieranie tkanek zwierzęcych po zakażeniu

  1. Przygotuj się do sekcji myszy i pobrania tkanek.
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia (nożyczki grube i cienkie, nożyczki zakrzywione, drobne kleszcze, tłuczki do granulek i rozsiewacze trójkątne) potrzebne do przetwarzania tkanek w autoklawie. Zamknij narzędzia w woreczkach do sterylizacji. Zawiń homogenizatory szklane, zanurz je w folii i dodaj taśmę autoklawową, aby wskazać sterylność.
    2. Przygotuj płytki agarowe na 1 lub 2 dni przed pobraniem tkanek, aby upewnić się, że płytki zestalają się przed użyciem. W przypadku B. pertussis należy użyć 10% BG + Sm. Płytki etykietowe do przegrody nosowej, tchawicy i płuc dla każdej myszy z pożądanymi rozcieńczeniami, określonymi empirycznie dla każdego eksperymentu.
    3. Napełnij i oznacz probówki do rozcieńczania CFU. Dodaj 0,9 ml sterylnego PBS do sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w oparciu o liczbę narządów do przetworzenia i rozcieńczenia na narząd.
    4. Napełnianie i etykietowanie probówek do pobierania tkanek:
      1. Przegroda nosowa i tchawica: napełnij sterylną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml 0,3 ml sterylnej 1% kazeiny w PBS (bez Ca2+ i Mg2+). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. Płuca: dodać 2 ml sterylnej 1% kazeiny z PBS do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby pobrać płuca do badania histologicznego, dodaj 2 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF) i przechowuj w temperaturze pokojowej.
      3. Śledziona: dodać 3 ml RPMI + 5% FBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      4. Krew: oznaczyć dwa zestawy sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, jeden na krew pełną, a drugi na surowicę.
    5. Świeży 70% etanol powinien być przygotowany do napełniania zlewek i butelek z rozpylaczem do sekcji.
  2. Wszystkie materiały do wiwarium należy przewieźć na wózku w dniu zbiorów. Wyczyść BSC i ustaw aparat do znieczulania jak w krokach 1.3 i 1.4.
  3. Umieść myszy przeznaczone do sekcji w komorze indukcyjnej i przy przepływie tlenu włącz izofluran do 5% i poczekaj, aż zwierzęta stracą przytomność. Usuwaj myszy pojedynczo i zwichnij zwierzę szyjką macicy jako drugorzędną metodę zapewniającą śmierć. Po zwichnięciu szyjki macicy eutanazja powinna być potwierdzona przez brak częstości oddechów i/lub brak odruchu wycofania (test szczypania palca
    4. ).
  4. Umieść mysz brzuszną stroną skierowaną do góry na desce preparacyjnej i otwórz ręce i nogi. Spryskaj korpus myszy 70% etanolem.
  5. Za pomocą kleszczy zaciśnij skórę poniżej brzucha, na środku miednicy. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj pionowe cięcie aż do żuchwy. Następnie odetnij skórę od ściany otrzewnej, rozsuwając dwie warstwy, wykonując małe ruchy z zamkniętymi nożyczkami. Ułóż skórę na bokach tuszy, aby stworzyć niezakłócone pole do sterylnego pobierania narządów.
  6. Chwyć nienaruszoną otrzewną poniżej klatki piersiowej na lub wokół wątroby i rozetnij ją, przesuwając się w kierunku klatki piersiowej. Odsłoń dolny przewód pokarmowy i przesuń okrężnicę w lewo, odsłaniając śledzionę. Za pomocą zakrzywionych kleszczy chwyć śledzionę i wypreparuj tkankę łączną nożyczkami. Umieść śledzionę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml RPMI + 5% FBS i umieść probówkę na lodzie.
  7. Użyj kleszczy, aby ustabilizować klatkę piersiową w wyrostku mieczykowatym i rozciąć przeponę. Płuca powinny opróżnić się i opaść w kierunku kręgosłupa. Rozetnij klatkę piersiową po bokach, aby zdjąć napierśnik.
  8. Wyizoluj i usuń górny płat prawego płuca14, przecinając tętnice płucne i żyły. Umieść płatek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10% NBF i umieść probówkę w temperaturze pokojowej na co najmniej 24 godziny, aby utrwalić tkankę. Odizoluj pozostałe płaty prawego płuca i lewego płuca. Umieść płatki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml 1% kazeiny w PBS i umieść ją na lodzie.
  9. Po przecięciu żył płucnych i tętnic w celu wypreparowania płuc, pozwól, aby jama klatki piersiowej wypełniła się krwią, gdy mysz wykrwawia się. Za pomocą pipetara o pojemności 1 ml z końcówką zebrać krew i przenieść ją do wstępnie oznaczonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść rurkę na lodzie.
  10. Następnie z szyi usuń tkankę miękką (ślinianki przyuszne, podjęzykowe i podszczękowe oraz węzły chłonne) pokrywającą tchawicę. Otwórz i usuń błony ochronne otaczające tchawicę. Delikatnie, za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek, oddziel tchawicę od przełyku i wszelką inną tkankę łączną od górnej części obojczyków do dolnej części żuchwy.
  11. Za pomocą kleszczy przytrzymaj tchawicę i przetnij tchawicę w górnej części obojczyka. Pociągnij tchawicę w dół, aby zmaksymalizować elastyczność i przeciąć tchawicę na dole żuchwy tuż nad krtanią, izolując jak najbardziej (~1 cm). Umieść narząd w wstępnie oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 0,3 ml 1% kazeiny w PBS i umieść go na lodzie.
  12. Odepnij mysz i połóż ją brzusznie, tak aby mysz była skierowana w stronę badacza, aby uzyskać wyraźny dostęp do nosa. Spryskaj głowę myszy 70% etanolem i rękami chwyć mysz bezpośrednio za czaszką.
  13. Za pomocą nożyczek odetnij miękki miąższ pyska, zaczynając od dołu nosa i przesuwając się w górę. Ponadto usuń sierść, skórę i wąsy wokół nosa. Następnie za pomocą kleszczy i zakrzywionych nożyczek włóż końcówki nożyczek do nozdrzy z krzywiznami skierowanymi na zewnątrz i rozetnij przewód nosowy w kierunku oczu, tworząc formację przypominającą literę V.
  14. Za pomocą cienkich kleszczy zbierz przegrodę nosową i tkankę miękką w utworzonej formacji. Umieść tkankę we wstępnie oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 0,3 ml 1% kazeiny w PBS i umieść ją na lodzie.
  15. Wyrzuć tuszę do worka na zagrożenie biologiczne. Przed sekcją następnego zwierzęcia opłucz narzędzia wodą dejonizowaną, a następnie umieść w zlewce wypełnionej 70% etanolem. Wyjmij narzędzia, strząśnij nadmiar etanolu, a następnie przystąp do następnego rozbioru
  16. Przeanalizuj każdą mysz zgodnie z krokami 4.3-4.14.
  17. Przetwarzaj tkanki zgodnie z poniższym opisem.

5. Przetwarzanie śledziony

  1. Aby dysocjować śledzionę, umieść sitko o wielkości 70 μm w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Wlać śledzionę i towarzyszące jej podłoże do filtra, używając tłoka strzykawki o pojemności 3 ml. Ostrożnie rozgnieć narząd, aż zostanie całkowicie zdysocjowany i przefiltrowany przez sitko komórkowe.
  2. Przepłucz filtr 3 ml RPMI + 5% FBS do naczynia do hodowli tkankowej. Zebrać zawiesinę komórek i umieścić ją w oryginalnej probówce o pojemności 15 ml. Odwirować probówki o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
  3. Odessać lub zdekantować supernatant i poddać lizie krwinki czerwone poprzez ponowne zawieszenie osadu w 2 ml buforu chlorku amonu i potasu (ACK) (150 mM chlorek amonu, 10 mM wodorowęglan potasu, 0,1 mM EDTA sodu). Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (25 °C).
  4. Napełnij probówki do 8 ml RPMI + 5% FBS i probówki wirówkowe o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Odessać lub zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić granulki komórek w 5 ml RPMI + 5% FBS i policzyć splenocyty za pomocą hemocytometru i mikroskopu.
  5. Oblicz objętość komórek potrzebnych do stymulacji 2,5 x 106 komórek na dołek. Na 48-dołkowej płytce wysiewaj komórki w 0,5 ml pożywki z komórek T (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 μg/ml gentamycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu) na dołek.
  6. Na podstawie powyższych obliczeń umieścić wymaganą objętość zawiesiny komórek w świeżej probówce i granulkach o sile 450 x g na 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Ponownie zawiesić osad w wymaganej objętości pożywki z komórek T. W przypadku modelu zakażenia B. pertussis należy przetestować odpowiedź cytokiny specyficznej dla antygenu na antygeny szczepionkowe: pertaktynę (Prn) i nitkowatą adhezję hemaglutyniny (FHA). Dlatego potrzebne są 3 zabiegi: 1) brak stymulacji (NS, jako kontrola ujemna), 2) Prn i 3) FHA. Do testu wymagane jest 7,5 x 106 komórek w 1,5 ml pożywki z limfocytów T (2,5 x 106 komórek na 0,5 ml).
  8. Podaniec 0,5 ml zawiesiny komórek na płytkę 48-dołkową.
  9. Aby stymulować komórki, wymieszaj antygeny w stężeniu 2 razy większym niż pożądane w pożywce dla komórek T. Końcowe stężenia Prn i FHA = odpowiednio 1 μg/ml i 0,5 μg/ml. Dlatego zmieszaj 2 μg/ml Prn lub 1 μg/ml FHA w 0,5 ml. Następnie podwielokrotność 0,5 ml pożywki stymulacyjnej do każdej wyznaczonej studzienki, rozcieńczając działanie antygenem do 1x w końcowej objętości 1 ml w każdym dołku.
  10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Zebrać supernatanty w dniu 7 i podać podwielokrotność 0,5 ml supernatantów do wstępnie znakowanych probówek do mikrowirówek. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do badania cytokin specyficznych dla antygenu za pomocą testu ELISA (Rysunek 6).

6. Przetwarzanie płuc

  1. Przenieś płuca (w 2 ml 1% kazeiny w PBS) do sterylnego homogenizatora o pojemności 15 ml. Użyj tłuczka do homogenizacji tkanki. Dysocjuj, aż nie pozostaną żadne duże cząstki tkanki. Umieścić homogenizowaną zawiesinę z powrotem w oryginalnej probówce o pojemności 15 ml.
  2. Pobrać 0,3 ml porcji do posiewu CFU i odwirować homogenat o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać i podzielić na porcje supernatant w podwielokrotnościach o objętości 0,5 ml do wstępnie znakowanych probówek do mikrowirówek. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy cytokin metodą ELISA.
  3. Przygotować wybrane rozcieńczenia, seryjnie rozcieńczając 0,1 ml homogenizowanej zawiesiny płucnej w probówkach rozcieńczających (0,9 ml jałowego PBS). Umieść 0,1 ml empirycznie wybranych rozcieńczeń na wstępnie znakowanych płytkach 10% BG + Sm i rozprowadź za pomocą sterylnego rozsiewacza trójkątnego.
  4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym przez 4 dni.
  5. Policz i oblicz CFU/płuco (Rysunek 6). Krótko mówiąc, pomnóż odzyskane liczby CFU przez współczynnik rozcieńczenia płytki, a następnie również przez całkowitą objętość, w której narząd został przetworzony. Obliczenia CFU są następnie przekształcane w wartości Log10 dla każdego zwierzęcia i przedstawiane na wykresie.
    1. Płytki z 30-300 koloniami można łatwo i dokładnie policzyć. Płytki z mniej niż 6 koloniami nie powinny być używane do obliczeń, ponieważ tak niska liczba kolonii wprowadza błąd15. Aby uzyskać dolną granicę wykrywalności, całkowitą objętość, w której narząd był homogenizowany, dzieli się przez objętość użytą do naznaczenia na płytce z nierozcieńczonego homogenatu (np. 2 ml całkowitej objętości podzielone przez 0,1 ml nierozcieńczonego homogenatu równa się dolnej granicy 20 wykrywalnych jtk
      2. ).

7. Przetwarzanie przegrody nosowej i tchawicy

  1. Homogenizować tkankę w 0,3 ml 1% PBS/kazeinę za pomocą homogenizatorów z silnikiem akumulatorowym z tłuczkiem do granulek. Homogenizuj tkankę przez 0,5-1 minutę, aż tkanka zostanie w znacznym stopniu zdysocjowana. Bakterie powinny zostać wydalone do zawiesiny.
  2. Przygotować wybrane 10-krotne rozcieńczenia przez seryjne rozcieńczenie 0,1 ml homogenizowanej zawiesiny w probówkach z rozcieńczeniami zawierających 0,9 ml sterylnego PBS. Nanieś 0,1 ml każdego rozcieńczenia na wstępnie oznakowane płytki 10% BG + Sm i rozprowadź zawiesinę za pomocą trójkątnego rozsiewacza, który został wysterylizowany przez przemycie 70% etanolem i płomień.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym przez 4 dni.
  4. Policz i oblicz CFU/narząd jak w kroku 6.5 (Rysunek 6). Aby uzyskać dolną granicę wykrywalności, całkowitą objętość, w której narząd został zhomogenizowany, dzieli się przez objętość użytą do nastawienia kropki na płytce z nierozcieńczonego homogenatu (np. 0,3 ml całkowitej objętości podzielonej przez 0,1 ml nierozcieńczonego równa się dolnej granicy 3 wykrywalnych CFU).

8. Przetwarzanie krwi

  1. Odwirować probówki zawierające wyizolowaną krew pełną o stężeniu 18 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia krwinek czerwonych.
  2. Ostrożnie zdjąć supernatant surowicy i odpipetować do wstępnie znakowanej probówki do mikrowirówki surowicy. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą gotowe do dalszej analizy (tj. całkowitego i swoistego testu Ig ELISA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany model przedstawia metodę oceny skuteczności szczepionki oraz odpowiedzi immunologicznych podczas oddziaływań między gospodarzem a patogenem. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny harmonogram szczepień stosowany do immunizacji i zakażania myszy oraz pobierania tkanek do analizy. Rysunek 2 prezentuje konfigurację systemu znieczulenia wykorzystywanego do indukcji u myszy, co umożliwia badaczom podanie szczepionek oraz inokul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj kompleksowy protokół badania odporności wywołanej szczepionką na zakażenie B. pertussis pozwoli również na ocenę odpowiedzi gospodarza na wiele innych patogenów. W protokole omówiono metody dostarczania szczepień, określania skuteczności szczepionki po prowokacji patogenem i równoległej sekcji funkcji immunologicznej. Dostosowując protokół w celu zbadania innych patogenów, konieczne byłoby zmodyfikowanie kilku parametrów. Należą do nich między innymi sposób znieczulenia zwierząt, skład szczepionki,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez 1R01AI125560-01 oraz fundusze start-up z Uniwersytetu Stanowego Ohio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora indukcyjna 2LVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017dowolnej marki jest odpowiednia
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
KazeinaSigmaC-7078
CasaminokwasyVWRJ851-500GFiltr siatkowy Scholte (SS) składniki podłoża
Kwas L-glutaminowyProdukty Badawcze IntG36020-500
L-ProlinaBadawcze IntP50200-500
Chlorek soduFisherBP358-10
Fosforan potasu jednozasadowyFisherBP362-1
Chlorek potasuFisherP217-500
Chlorek magnezu sześciowodnyFisherM2670-500G
Chlorek wapniaFisherC75-500
Tris baseFisherBP153-1
L-cysteina HClFisherBP376-100SS suplementy mediów
Siarczan żelazawy siedmiowodnySigmaF-7002
Produkty Badawcze NiacynyIntN20080-100
GlutationProdukty Badawcze IntG22010-25
Kwas askorbinowyProdukty Badawcze IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  dowolne źródło amerykańskie, nieinaktywowana termicznie
gentamycynaThermoFisher Scientific15710064
B-merkaptoetanolFisher BP176-100
15mL młynek do tkanekWheaton357544każda podobna marka jest odpowiednia
Bezprzewodowy homogenizator ręcznyKontes/Sigma Z359971-1EAkażda podobna marka jest odpowiednia
Instrumenty - nożyczki, nożyczki krzywe, kleszcze, kleszcze drobnoziarniste, rozpieraczekażda marka jest odpowiednia
Strzykawki 3 mlBD bioscience309657
Probówki stożkowe 15 mlFisher 
1,5 ml probówki do mikrofugeDenvilleC2170
70um sitka komórkoweFisher 
Płytki 60 mmThermoFisher Scientific130181
48-dołkowe płytki do hodowli tkankowychThermoFisher Scientific08-772-1C
1mL strzykawka insulinowa 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Mysz IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! ZestawInvitrogen / eBioscience50-173-21
Mysz IL-17 ELISA Ready-SET-Go! ZestawInvitrogen / eBioscience50-173-77
Mysz IL-5 ELISA Ready-SET-Go! ZestawInvitrogen / eBioscience50-172-09
Produkty trójkątów 33965122363548

Bibliografia

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odpowiedź gospodarz-patogenimmunizacja myszyinokulacja bakteryjnapobieranie tkanekwyznaczanie CFUcytometria przepływowaanaliza ELISpotBordetella pertussispolaryzacja Th1 Th17
Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.