Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

DOI:

10.3791/58933

⸱

15 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) jest podstawą terapii białaczki i innych nowotworów od prawie pół wieku, leży u podstaw jedynego znanego lekarstwa na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV-1) i jest niezwykle obiecujący w leczeniu chorób genetycznych, takich jak beta-talasemia. Nasza grupa opracowała protokół modelowania terapii genowej HSPC u naczelnych (NHP), co pozwala naukowcom zoptymalizować wiele z tych samych odczynników i technik, które są stosowane w klinice. W tym miejscu opisujemy metody oczyszczania HSPC CD34 + i długotrwale utrzymujących się podzbiorów hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) z przygotowanego szpiku kostnego (BM). Identyczne techniki można zastosować do oczyszczania innych źródeł HSPC (np. zmobilizowanych komórek macierzystych krwi obwodowej [PBSC]). Przedstawiono 2-dniowy protokół, w którym komórki są oczyszczane, hodowane, modyfikowane lentiwirusem (LV) i przygotowywane do infuzji z powrotem do autologicznego gospodarza. Kluczowe wnioski o sukcesie obejmują czystość populacji HSPC CD34+, zdolność oczyszczonych HSPC do tworzenia morfologicznie odrębnych kolonii w pożywkach półstałych oraz, co najważniejsze, skuteczność modyfikacji genów. Kluczową zaletą terapii genowej HSPC jest zdolność do zapewnienia źródła długowiecznych komórek, które dają początek wszystkim typom komórek krwiotwórczych. W związku z tym metody te zostały wykorzystane do modelowania terapii raka, chorób genetycznych i chorób zakaźnych. W każdym przypadku skuteczność terapeutyczną ustala się poprzez wzmocnienie funkcji odrębnego potomstwa HSPC, w tym czerwonych krwinek, limfocytów T, limfocytów B i/lub podzbiorów szpiku. Metody izolacji, modyfikacji i przygotowania produktów HSPC mają bezpośrednie zastosowanie i można je przełożyć na wiele chorób u ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia genowa komórkami macierzystymi jest skutecznym sposobem na rozwiązanie szerokiego zakresu ludzkich patologii. Terapia genowa HSPC jest szczególnie atrakcyjnym podejściem ze względu na i) względną łatwość pobierania tych komórek od pacjentów, ii) bogactwo dostępnej wiedzy na temat fenotypów powierzchni komórek i parametrów hodowli ex vivo, a wraz z rozwojem tej dziedziny, ponieważ iii) daje naukowcom stale rosnący zestaw narzędzi strategii modyfikacji genów dostosowanych do różnych chorób będących przedmiotem zainteresowania. Aktywnie badamy podejścia do terapii genowej HSPC z wielu perspektyw, w tym z zakresu biologii HSPC, wszczepiania zmodyfikowanych genowo HSPC w przedklinicznych modelach in vivo oraz zastosowania w odpowiednich populacjach pacjentów. My i inni scharakteryzowaliśmy fenotyp powierzchni komórki funkcjonalnie odrębnych podzbiorów HSPC1,2,3, schematy mobilizacji i kondycjonowania, które maksymalizują wydajność i wszczepienie HSPC, jednocześnie minimalizując toksyczność4,5oraz strategie modyfikacji i edycji genów dostosowane do szerokiego zakresu chorób złośliwych, genetycznych i zakaźnych6,7,8,9,10. Funkcję i wszczepianie zmodyfikowanych genowo HSPC można ocenić w wielu modelach małych i dużych zwierząt, w tym myszy, psów i NHP. W szczególności modele NHP są korzystne, ponieważ wiele odczynników, na przykład przeciwciała specyficzne dla białek powierzchniowych komórek HSPC, takich jak CD34 i CD90, może być stosowanych zamiennie w komórkach ludzkich i NHP. Ponadto, w przeciwieństwie do myszy, duże zwierzęta, takie jak NHP, pozwalają na bliższe przybliżenie skali modyfikacji genów niezbędnej do skuteczności klinicznej. Wreszcie, NHP są złotym standardem w modelowaniu ludzkich patologii, takich jak zakażenie HIV-111 i są wyłaniającym się systemem modelowym dla potencjalnych immunoterapii przeciwnowotworowych i anty-HIV12,13.

Celem tego protokołu jest nakreślenie metod oczyszczania, genetycznego modyfikowania i przygotowywania produktów infuzyjnych NHP HSPC. Chociaż wykracza to poza zakres tego protokołu, wcześniej wykazaliśmy, że produkty te wszczepiają się w autologicznych gospodarzy NHP, dają początek wszystkim liniom krwiotwórczym i zapewniają skuteczność terapeutyczną w szerokim zakresie modeli chorób1. Scharakteryzowaliśmy również klonalność wszczepiania HSPC i zbudowaliśmy platformę do śledzenia kinetyki, transportu i fenotypu poszczególnych HSPC i ich potomstwa, po autologicznym przeszczepie1,14. Przedstawione tutaj metody zostały opracowane w następujących celach: i) wyizolowanie wysoce czystych HSPC i długoterminowych podzbiorów HSC do szczepienia, ii) utrzymanie prymitywnych HSC podczas hodowli ex vivo oraz iii) skuteczna modyfikacja genów zarówno masowych HSPC, jak i długoterminowych podzbiorów HSC. Stosujemy sortowanie komórek wspomagane magnetycznie (MACS), a także sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), aby wyizolować fenotypowo/funkcjonalnie odrębne populacje HSPC, zgodnie z metodami wielu grup2,15,16. Utrzymanie prymitywnych HSC w hodowli (tj. minimalizowanie różnicowania się tych komórek w zaangażowanych progenitorów, które dają początek w pełni zróżnicowanym podzbiorom limfoidalnym i szpikowym) jest istotnym aspektem opisanego tutaj protokołu. Chociaż wcześniej scharakteryzowaliśmy podejścia do rozszerzania HSPC przy zachowaniu prymitywnego fenotypu17,18, tutaj opisujemy protokół, który koncentruje się na utrzymaniu HSC poprzez minimalną (48 godzin) i zdefiniowaną hodowlę ex vivo.

Efektywna modyfikacja podzbiorów HSPC i HSC jest głównym celem tego protokołu. Spośród kilku opisanych przez nas podejść, dwa są zdecydowanie najlepiej zbadane w badaniach klinicznych: modyfikacja genów za pośrednictwem LV i edycja genów za pośrednictwem nukleazy1,6,19. Strategie edycji genów wykorzystują jedną z wielu platform nukleazy do specyficznej modyfikacji docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład receptora chemokiny C-C typu 5 (CCR5) do leczenia zakażenia wirusem HIV7,19 lub Bcl11A do leczenia hemoglobinopatii6. Tutaj skupiamy się na modyfikacji genów za pośrednictwem LV, w której transgeniczne ładunki integrują się półlosowo z genomem1,8,20. Kluczową zaletą podejść LV jest możliwość dostarczania dużych ilości materiału genetycznego (do 8 lub 9 kilozasad). Chociaż opracowywane są strategie edycji genów w celu ukierunkowania transgenu będącego przedmiotem zainteresowania na integrację tylko w określonym locus za pomocą homologicznej rekombinacji dawcy (HDR), metody te wymagają dalszego rozwoju in vitro i na małych modelach zwierzęcych. W przeciwieństwie do tego, wektory LV były szeroko stosowane w NHP i u pacjentów21,22. Co ważne, opisany tutaj protokół, który wykorzystuje zagruntowany BM jako początkowe źródło HSPC, może być łatwo i szeroko zaadaptowany, na przykład do izolacji PBSC. Jak opisano powyżej, wykorzystujemy wysoki stopień podobieństwa genetycznego między NHP a ludźmi, aby użyć odczynników, które mają zastosowanie do obu gatunków. Wreszcie, podejście to zostało zaadaptowane do modyfikacji innych podzbiorów układu krwiotwórczego, a mianowicie limfocytów T12,23,24; pojawienie się skutecznych podejść do immunoterapii limfocytami T opierało się w dużej mierze na tej samej platformie LV, która jest wykorzystywana w tym protokole. Metody te są odpowiednie dla każdego badacza zainteresowanego biologią HSPC lub modyfikacją genów za pośrednictwem LV. Na przykład przedstawiony tutaj protokół oczyszczania HSPC może być użyty do scharakteryzowania nowych podzbiorów wzbogaconych w HSC, jak opisano wcześniej1,15,25. Podobnie, przedstawione tutaj metody transdukcji lewej komory mogą być podobnie stosowane i dalej rozwijane w odniesieniu do wielu innych typów komórek i pytań eksperymentalnych, zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo.

Podsumowując, prezentujemy metody izolacji i genetycznej modyfikacji NHP HSPC. Metody te można łatwo dostosować do innych gatunków i innych źródeł HSPC. Ten dokładnie sprawdzony protokół jest bardzo obiecujący w modelowaniu skutecznych terapii wielu chorób u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczne przeszczepy NHP, inicjacja (mobilizacja), pobieranie komórek i modyfikacja genów są przeprowadzane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami26. Wszystkie procedury eksperymentalne są weryfikowane i zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Centrum Badań nad Rakiem Freda Hutchinsona i Uniwersytetu Waszyngtońskiego (Protokół #3235-01). Wszystkie badania są przeprowadzane w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych Narodowych Instytutów Zdrowia ("Przewodnik"); Zwierzęta zostały losowo przydzielone do badań.

1. Wzbogacenie CD34+ HSPC i nocna hodowla (Dzień -1)

  1. Zbierz BM i kondycjonuj go.
    1. Mobilizuj NHP za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF) przez 4 dni, jak opisano wcześniej26.
    2. Uspokoić zwierzęta 100 mg/kg ketaminy i 0,03 ml/kg deksmedetomidyny (0,5 mg/ml bulionu). Podać leki przeciwbólowe (np. buprenorfinę SR) w czasie losowania.
    3. Za pomocą maszynki do strzyżenia zgolić sierść zwierzęcia od bliższego końca kości ramiennej i/lub kości udowej (kości udowych) i wyszorować skórę peelingiem na bazie jodu lub podobnym roztworem antyseptycznym, naprzemiennie z alkoholem i powtórzyć 3 razy. Jako dodatkowy środek znieczulający należy podać do okostnej bupiwakainę (2 mg na miejsce, 5 mg/ml bulionu).
    4. Umieścić igłę do aspiracji szpiku kostnego (16 G) nad miejscem wejścia okostnej (jamy rdzeniowej) i przekłuć skórę, penetrując jamę szpikową ruchem obrotowym. Wyjąć trzpień z igły aspiracyjnej i odłożyć go w sterylne pole do dalszego użycia.
      nuta: Wybierz miejsce wejścia okostnej do jamy szpikowej w obszarze kości, który nie jest pokryty mięśniami i gdzie kształt/krajobraz kości jest widoczny lub może być łatwo wyczuwalny przez skórę (zwykle w kierunku bliższego lub dystalnego końca kości).
    5. Do igły BM przymocować ampułkostrzykawkę zawierającą mieszaninę antykoagulantu roztworu dekstrozy cytrynianu (ACD-A) i heparyny (20 USP/ml, 1 ml na 9 ml szpiku do pobrania).
    6. Odciągnąć tłok do tyłu, delikatnie kołysząc kończyną i obracając ją, aby poruszyć strzykawką w celu wymieszania aspiratu i antykoagulantu. Obróć igłę i przesuń ją przez cały proces aspiracji i pobierania, aby uzyskać dostęp do większego odsetka komórek w przestrzeni szpiku.
    7. Po pobraniu próbki należy wyjąć igłę i uciskać miejsce aspiracji, aż krwawienie ustanie.
      nuta: W zależności od potrzebnej objętości, podczas jednego pobrania można pobrać szpik kostny od jednej do czterech kończyn (dwie kości ramienne, dwie kości udowe). Z każdej kończyny nie należy pobrać więcej niż 20 ml, a całkowita pobrana objętość nie powinna stanowić więcej niż 10% masy ciała zwierzęcia (10 ml/kg).
    8. W przypadku odbierania przydechów z wielu kończyn, połącz i zapisz objętość.
    9. Niech NHP odzyska postanestezję.
      1. Po zabiegu należy odwrócić działanie deksmedetomidyny za pomocą 0,03 ml/kg atipamezolu (5 mg/ml zapasu). Leki przeciwbólowe (np. buprenorfina SR) należy podawać zgodnie z zaleceniami klinicznego personelu weterynaryjnego przez co najmniej 48 godzin po zabiegu lub dłużej, według uznania lekarza weterynarii klinicznego, w zależności od objawów klinicznych.
      2. Po zabiegu zwierzę należy umieścić w jego domowej klatce i monitorować je co 15 - 20 minut, aż zwierzę będzie w stanie samodzielnie usiąść. Personel weterynaryjny powinien codziennie monitorować zwierzę do momentu stwierdzenia, że miejsce aspiracji jest zagojone. Ponadto monitoruj pod kątem wszelkich oznak stanu zapalnego, infekcji lub bólu.
    10. Równolegle z przetwarzaniem komórek, kondycjonuj ten sam NHP za pomocą mieloablacyjnego napromieniania całego ciała (TBI): 1,020 cGy z szybkością 7 cGy/min. Podawaj napromienianie w dawkach frakcjonowanych przez 2 dni przed infuzją komórek.
  2. Hemoliza BM.
    1. Podziel BM na stożkowe probówki o pojemności 50 ml (10 - 12 ml na probówkę) i dodaj bufor hemolityczny, aby zwiększyć objętość do 50 ml (Tabela 1). Inkubować komórki w temperaturze pokojowej (RT) aż do lizy, ale nie dłużej niż przez 7 minut. Wirować przy 800 x g przez 5 minut i odsysać supernatant z osadu (osadów), pozostawiając 2 - 5 ml objętości na probówkę. Zawiesić granulat w pozostałej objętości.
      nuta: Pomyślnie zlizowane próbki zmieniają kolor od ciemnoczerwonego do przezroczystego jasnoczerwonego.
    2. Dodać 10 - 15 ml buforu/osadu hemolitycznego. Usuń wszelkie skrzepy krwi za pomocą sitek do komórek 70 μm. Dodać bufor hemolityczny do 50 ml, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wirować w temperaturze 800 x g przez 5 minut.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu MACS (Tabela 1). Ponownie przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm. Przepłukać probówkę i przefiltrować ją 40 ml buforu MACS do 50 ml.
  3. Wzbogać komórki CD34 + z hemolizowanych białych krwinek (WBC) przy użyciu standardowych protokołów.
    1. Obracaj komórki w temperaturze 800 x g przez 15 minut. Sprawdź probówki, aby upewnić się, że na górze/środku nie są widoczne żadne zawijasy komórek. Jeśli komórki znajdują się nad osadem, wiruj ponownie z większą prędkością (maksymalnie do 1,000 x g) i do 10 minut.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić go w 10 ml lub mniej buforu MACS, odnotowując dokładną objętość. Policz komórki w rozcieńczeniu 1:100 lub 1:1,000 za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      nuta: Ta łączna liczba WBC jest liczbą przed wzbogacaniem.
    3. Dodaj bufor MACS, aby doprowadzić stężenie komórek do 1 x 108 komórek/ml. W razie potrzeby najpierw powtórz kroki 1.3.1 - 1.3.2 (np. ze względu na małą liczbę wstępnego wzbogacenia). Zarezerwuj 5 x 106 komórek w buforze MACS do barwienia podzbioru HSC (próbka wstępnego wzbogacania).
    4. Dodać niesprzężone przeciwciało anty-CD34 (klon 12.8, tabela materiałów)27 do pozostałych komórek przed wzbogaceniem do końcowego stężenia 40 μg/ml (1 x 108 komórek/ml). Inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym (patrz tabela materiałów) przez 25-30 minut.
    5. Użyj buforu MACS, aby zwiększyć objętość do 50 ml i wiruj komórki przy 800 x g przez 5 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 50 ml buforu MACS i ponownie wirować przy 800 x g przez 5 minut.
    6. Odgazuj 100 ml buforu MACS za pomocą dwóch probówek filtracyjnych, owijając wlot powietrza papierem woskowanym, przez 25 - 30 minut lub do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
    7. Oblicz niezbędną objętość kulek magnetycznych: 1 ml koralików / 109 komórek. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki do 108 komórek/ml, po dodaniu kulek. Na przykład: 3 x 109 komórek + 3 ml kulek + 27 ml buforu MACS do 30 ml całkowitej objętości.
    8. Inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym przez 25-30 minut.
    9. Podczas pozyskiwania magnesów do kolumn; zaplanuj użycie 0,6 x 109 komórek na kolumnę. Umieść kolumny na magnesie i umieść stożkową rurkę o pojemności 50 ml pod każdą kolumną, aby zebrać przepływ. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml i tłok dla każdej kolumny do elucji (krok
    10. Po zakończeniu inkubacji w kroku 1.3.8 dodać bufor MACS do 50 ml i wirować w temperaturze 800 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w odgazowanym buforze MACS (2 ml na kolumnę). Delikatnie odpipetować, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.
    11. Nie dopuszczając do wyschnięcia kolumny, dodać 1 ml odgazowanego buforu MACS do każdej kolumny, a następnie 2 ml zawiesiny komórek. Przepłukać filtr i oryginalną rurkę odgazowanym buforem MACS i równo podzielić roztwór między kolumny (6 ml/kolumnę); następnie dodaj 7 ml odgazowanego buforu MACS do końcowego płukania.
    12. Delikatnie odciągnij kolumnę od magnesu (popchnij górną część do tyłu) i zbierz ostatnią kroplę do rurki przepływowej. Dodać 5 ml odgazowanego buforu MACS do każdej kolumny i nałożyć tłok w celu wymycia komórek do sterylnej stożkowej probówki z kroku 1.3.9. Nie zbieraj płynu po pojawieniu się bąbelków.
  4. Policz komórki zarówno w probówce zbiorczej wzbogaconej, jak i przepływowej (FT) w stosunku rozcieńczenia 1:10. Utrzymuj komórki na lodzie. Podwielokrotność 1 x 106 komórek z frakcji wzbogaconej w CD34 i 5 x 106 komórek z frakcji FT do analizy metodą cytometrii przepływowej. Frakcję FT należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia kontroli jakości (etap 2).
    nuta: Liczba komórek CD34 + wymaganych do pomyślnego wszczepienia wieloliniowego w NHP zależy od częstości podzbioru CD34 + CD90 + CD45RA- wzbogaconego w HSC. Opierając się na średniej częstości 3% - 5% i minimalnym zapotrzebowaniu 122 000 komórek CD34+CD90+CD45RA- na kilogram masy ciała1, zaleca się wykonanie co najmniej 2,5 x 106 komórek CD34+ i do 10 x 106 komórek CD34+ na kilogram masy ciała.
  5. Dodać bufor MACS do frakcji wzbogaconej CD34 + do łącznej objętości 50 ml, wirować przy 800 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki do 106 komórek/ml w pożywce HSPC (Tabela 1).
    1. Płytki komórek o gęstości 106 komórek/ml w wentylowanych kolbach T-75 poddanych hodowli tkankowej (TC), 10 - 20 ml na kolbę, i inkubować je przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Odłóż kolby wzdłuż (nie stojąc).
      nuta: W razie potrzeby dodatkowe komórki CD34 + lub CD34-FT można kriokonserwować w 90% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 1 x 106 do 5 x 106 komórek/ml, a następnie wolno schładzać w temperaturze -80 °C (np. przy użyciu pojemników do zamrażania). Średnia wydajność odzyskiwania komórek kriokonserwowanych zależy od czystości CD34+ i zwykle waha się od 50% do 80% przy żywotności >80%.

2. Kontrola jakości komórek wzbogaconych w CD34 (Dzień -1)

  1. Przygotować próbki do cytometrii przepływowej.
    1. Zawiesić próbki zarezerwowane dla każdego etapu izolacji wymienionego powyżej (wstępne wzbogacanie, frakcje FT i wzbogacone w CD34) w buforze FACS o stężeniu 10 x 106 komórek/ml i przenieść 100 μl każdej zawiesiny komórek (Tabela 1) do probówki FACS.
      nuta: Próbki kontrolne powinny zawierać niebarwione komórki z każdego etapu izolacji (np. 5 x 105 komórek) w celu dostosowania rozproszenia do przodu (FSC), rozproszenia bocznego (SSC) i autofluorescencji w każdym kanale fluorescencyjnym. Ponadto wymagane będą pojedynczo barwione kulki kompensacyjne dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, aby dostosować się do kompensacji między sąsiednimi kanałami (Tabela 2 i Tabela 3).
    2. Dodać pożądane przeciwciała (np. anty-CD45, anty-CD34, anty-CD45RA i anty-CD90), zgodnie z instrukcjami producenta, dla jednego testu (1 x 106 komórek w 100 μl) (Tabela 3). Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 3 ml buforu FACS i wirować w temperaturze 800 x g przez 5 minut, odessać supernatant, ponownie zawiesić w 100 μl buforu FACS i przeprowadzić analizę na odpowiednim cytometrze przepływowym (etap 2.2).
  2. Przygotuj cytometr przepływowy/sortownik komórek do analizy.
    UWAGA:     Zaleca się przeprowadzenie analizy na tej samej maszynie, która będzie używana do sortowania komórek w kroku 2.3.
    1. Wygeneruj protokół zawierający FSC/SSC, CD45/CD34 i CD45RA/CD90 (trzy wykresy przepływu). Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres przepływu i dodaj układ Hierarchia populacji.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy wykres FSC/SSC, wybierz funkcję bramki wielokątnej i narysuj bramkę, aby wykluczyć gruz i martwe komórki. Podświetl nową bramę i zmień jej nazwę na Scatter w oknie inspektora.
      nuta: Jest to automatycznie określane jako P1.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy środek wykresu przepływu CD45/CD34, przejdź do opcji Pokaż populacje i bramkuje wykres na rozproszeniu. Narysuj prostokątną bramę wokół komórek CD45intCD34 +, aby wykluczyć komórki inne niż CD34 i komórki niehematopoetyczne, a także resztkowe płytki krwi i erytrocyty (CD45-). Zmień nazwę bramki na CD34+.
    4. Bramkować wykres przepływu CD45RA/CD90 na populacji CD34+. Narysuj trzy niezależne podbramki wokół komórek CD90 + CD45RA- (wzbogaconych o HSC), komórek CD90-CD45RA- (wzbogaconych o komórki progenitorowe multipotencjalne i erytro-mieloidalne [MPP / EMP]) i komórki CD90-CD45RA+ (wzbogacone o komórki progenitorowe limfo-szpiku [LMP]). Zmień nazwy bramek odpowiednio na HSC, MPP-EMP i LMP.
    5. Po zakończeniu upewnij się, że hierarchia populacji zawiera sześć hierarchicznie zorganizowanych wpisów w następującej kolejności: 1) Wszystkie zdarzenia; 2) Rozproszenie; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Upewnij się, że wykresy przepływu i kształt bramki wyglądają tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 4.
    6. Uruchomić niebarwione WBC do wstępnego wzbogacania, aby dostosować napięcie dla FSC, SSC i wszystkich kanałów fluorescencyjnych (Tabela 2, próbka 5). Uruchom pojedynczo barwione koraliki kompensacyjne, aby wyregulować kompensację między sąsiednimi kanałami (Tabela 2, próbki 1 - 4). Uruchomić wszystkie pozostałe niebarwione i barwione próbki za pomocą dostosowanego i skompensowanego protokołu, aby udokumentować skuteczność wzbogacania CD34 (Tabela 2, próbki 6 - 9).
      nuta: Zachowaj próbkę końcową (tabela 2, próbka 10) do jednoczesnej analizy przepływu i sortowania komórek w kroku 2.4.
  3. Skonfiguruj sortownik komórek do sortowania i oczyszczania podzbiorów CD34 do testów komórek tworzących kolonie (CFC).
    UWAGA:     Jeśli do analizy użyto innej maszyny (krok 2.2), skonfiguruj protokół w sortowniku komórek, jak opisano wcześniej w krokach 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Dostosuj kąt/napięcie dla strumieni po lewej i prawej stronie w oprogramowaniu do sortowania komórek, aby umieścić komórki w probówkach o pojemności 15 ml zawierających pożywkę CFC. Skonfiguruj kąt strumienia bocznego, aby zapobiec niewspółosiowości. Krok po kroku dostosuj kąt odchylonego strumienia bocznego, aż posortowane komórki uderzą w podłoże CFC, a nie w bok rury, ponieważ sortowanych jest bardzo niewiele komórek.
    2. W przeglądarce otwórz folder Arkusze globalne i utwórz nowy układ sortowania za pomocą przycisku w górnym menu okna przeglądarki. Zmień wpis w menu rozwijanym Urządzenie zbierające na 2 probówki, wpis w menu rozwijanym Precyzja na czystość 4-kierunkową lub Pojedyncza komórka i ustaw Zdarzenia docelowe na 800 - 1,200 komórek. Kliknij lewym przyciskiem myszy pole lokalizacji sortowania (po lewej lub po prawej), wybierz dodanie Wpis w menu i wybierz z menu populację do sortowania.
  4. Sortowanie komórek pod kątem testów CFC.
    UWAGA:     Sortowanie do testów CFC przeprowadza się wyłącznie na komórkach z produktu wzbogaconego w CD34 (Tabela 2, próbka 10).
    1. Załaduj próbkę 10, zarejestruj 2 000 - 3 000 zdarzeń i precyzyjnie dostosuj bramki sortowania, aby dopasować je do siły sygnału i populacji docelowych.
    2. Po zakończeniu konfiguracji pobierz komórki (Tabela 2, próbka 10). Zbierz dane zgodnie z opisem w kroku 2.2.3, dostosuj natężenie przepływu do 500 - 1,000 komórek/s i posortuj 800 - 1,200 komórek od i) bramki rozproszonej, ii) bramki CD34+, iii) bramki HSC, iv) bramki MPP-EMP i v) bramki LMP do oddzielnych probówek zawierających 3,6 ml pożywki CFC.
      nuta: Sortowanie do testów CFC przeprowadza się wyłącznie na komórkach z produktu wzbogaconego w CD34 (Tabela 3, próbka 10). Komórki z bramek Scatter i CD34+ muszą być sortowane indywidualnie, podczas gdy HSC, MPP-EMP i LMP mogą być sortowane jednocześnie do pozycji lewego i prawego uchwytu probówki.
    3. Wykonać wir i dozować 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej ze sterylnych, nietkankowych, poddanych kulturze szalek Petriego o wymiarach 3 x 3,5 cm. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10-14 dni w pojemniku wtórnym (np. na 15-centymetrowej szalce Petriego).
    4. W dniach 10 - 11 po posiewie policz poszczególne kolonie ze wszystkich trzech płytek na warunek, w oparciu o morfologię kolonii.

3. Modyfikacja genu HSPC CD34+ i regeneracja w ciągu dnia (Dzień 0)

  1. Rozcieńczyć 2,5 ml 1 μg/μl roztworu CH-296 do 50 μg/ml w 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS, patrz tabela materiałów).
  2. Przygotować kolby do transdukcji niskiego napięcia.
    1. Określić przybliżoną liczbę potrzebnych kolb poddanych działaniu kultur nietkankowych (innych niż TC) (zwykle na podstawie liczby komórek określonej w kroku 1.4). Zaplanuj płytki 1 x 107 komórek w 10 ml pożywki na kolbę T-75 (1 x 108 komórek łącznie wymagałoby 10 kolb) i dołącz jedną 12-dołkową płytkę niepoddawaną działaniu TC (symulowany warunek transdukcji). Dodać sterylny HBSS i 50 μg/ml CH-296 z kroku 3.1 do każdej kolby/płytki w stężeniu 2 μg/cm2. W przypadku kolb T-75 należy użyć 3 ml 50 μg/ml CH-296 + 7 ml HBSS; w przypadku płytki 12-dołkowej należy użyć 160 μl 50 μg/ml CH-296 + 340 μL HBSS na dołek.
    2. Pozostaw naczynia w spokoju w temperaturze pokojowej na czystej ławce lub w okapie przez 2 godziny. Odessać CH-296 i zastąpić go podobną objętością sterylnej HBSS + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować w temperaturze RT przez 30 minut, odessać HBSS/BSA i umyć naczynia podobną objętością sterylnego HBSS zawierającego 2,5% 1 M HEPES, pH 7,0. Odessać bezpośrednio przed posiewem komórek (etap 3.4).
      nuta: Postępując zgodnie z krokiem 3.2.2, nie dopuścić do wyschnięcia płytek/kolb. Płytki zawierające sterylne HBSS + 2,5% 1 M HEPES utrzymuje się w temperaturze 4 °C przez noc (tj. przygotowuje się w dniu -1).
  3. Zbierz i przeprowadź transdukcję komórek CD34+ od dnia -1.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml przepłukać luźno przylegające komórki poprzez wielokrotne, delikatne płukanie każdej kolby hodowlanej sterylnym HBSS. Upewnij się, że wszystkie komórki się odczepią (jeśli to konieczne, postukaj/uderz w kolbę, aby poluzować komórki).
    2. Odwirować komórki przy 800 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce transdukcyjnej do stężenia 1 x 106 komórek/ml. Po zebraniu wszystkich komórek określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    3. Dodać 1 ml zawiesiny komórek (1 x 106 komórek) do jednego dołka 12-dołkowej płytki pokrytej CH-296 (dla próbnej transdukowanej próbki kontrolnej). Podzielić pozostałe komórki między kolby T-75 (etap 3.2.2), dodając około 10 ml (1 x 107 komórek) na kolbę. Pozostawić komórki do przylegania do powłoki CH-296 przez inkubację w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut, z odpowietrzeniem nasadek.
    4. Rozmrozić pożywkę kondycjonowaną wirusem (VCM, Tabela materiałów) i określić miano w jednostkach zakaźnych na mililitr (IU/ml)28,29,30,31,32. Dodać odpowiednią objętość VCM do każdej kolby T-75 z kroku 3.3.3 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      nuta: Jeśli wykonujesz pojedynczą transdukcję, inkubuj przez noc; W przypadku podwójnej transdukcji powtórzyć ten krok około 6 - 8 godzin po pierwszej transdukcji bez fazy płukania/odzyskiwania, a następnie inkubować przez noc. Na przykład do jednej kolby (1 x 107 komórek) o pożądanej wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10, dodać 1 ml wirusa o stężeniu 1 x 108 j.m./ml.

4. Pobieranie komórek i przygotowanie do infuzji (Dzień 1)

  1. Zbierz komórki.
    1. Zbierz transdukowane i pozorowane komórki zgodnie z opisem w krokach 3.3.1 - 3.3.2. Wykonaj sekwencyjne płukanie 10 ml HBSS, przenosząc popłuczyny do stożkowej rurki z komórkami. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały usunięte z kolb, w razie potrzeby stukając w kolby.
    2. Odwirować zawiesiny komórek przy 800 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml HBSS. Połącz probówki zawierające komórki z tego samego stanu. Przepłukać każdy z nich 10 ml HBSS i dodać go do zawiesiny komórek. Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Doprowadź całkowitą objętość komórek do 50 ml w HBSS i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut.
  2. Wykonać puls prostaglandyny E2 (PGE2) i przygotować odczynniki do produktu infuzyjnego.
    1. Odessać supernatant i ponownie zawiesić transdukowane komórki (nie pozorowane) do 5 x 106/ml w pożywce HSPC bez cytokin. Dodać 10 mM PGE2 do końcowego stężenia 10 μM. Inkubować komórki na lodzie przez 2 godziny, delikatnie obracając je co 30 minut.
    2. Na etapie 4.2.1 należy inaktywować termicznie surowicę autologiczną (tabela materiałów), owijając pojemnik w papier woskowany i inkubując go w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Przygotować 2% surowicę autologiczną w HBSS (500 μl surowicy inaktywowanej termicznie + 24,5 ml HBSS), dobrze je wymieszać i przechowywać mieszaninę na lodzie do czasu użycia. Ponadto, podczas kroku 4.2.1, zbierz próbne transdukowane komórki na 12-dołkowej płytce, energicznie pipetując komórki w górę i w dół. Dodaj zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, przemyj je 3x 1 ml HBSS i dodaj popłuczyny do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Po 2 godzinach inkubacji PGE2 przemyć komórki 2x, odwirowując je przy 800 x g przez 5 minut i odrzucając supernatant. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości HBSS do zliczenia, używając hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      nuta: Komórki często zlepiają się po impulsie PGE2, co może powodować mniej wiarygodne zliczanie komórek. Jeśli tak, użyj liczby komórek z kroku 4.1.2 zamiast tej z kroku 4.2.3.
  3. Zarezerwować komórki próbne i transdukowane do kontroli jakości (etap 5) produktu infuzyjnego: 5 x 10 5 do 1 x 106 komórek do cytometrii przepływowej/sortowania komórek (etapy 5.1 i 5.3) oraz około 1 x 106 komórek do hodowli płynnej (etap 5.2) i reakcji łańcuchowej polimerazy kolonii (PCR) (etap 5.4).
  4. Przygotować produkt do infuzji.
    1. Z pozostałymi transdukowanymi komórkami wykonać trzecie płukanie w 50 ml HBSS, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml HBSS + 2% surowicy autologicznej (przygotowanej w kroku 4.2.2). Pobrać 10 ml roztworu do strzykawki o pojemności 20 ml wyposażonej w igłę o pojemności 16,5 g. Umyj probówkę 10 ml HBSS + 2% automatycznej surowicy i wciągnij płyn do tej samej strzykawki, aby uzyskać całkowitą objętość do 20 ml. Zakryć strzykawkę nasadką igły, oznaczyć strzykawkę i umieścić ją na lodzie do transportu/infuzji.
    2. Wprowadzić transdukowany produkt komórkowy do autologicznego gospodarza, znajdującego się w akredytowanym ośrodku badawczym na zwierzętach, za pomocą centralnego cewnika żylnego33,34. Monitoruj pełną morfologię krwi (CBC) i skład chemiczny krwi przeszczepionych zwierząt oraz wykonuj specyficzne dla badania testy oznaczania genów dostosowane do projektu1,6,19.

5. Kontrola jakości

UWAGA: Cytometria przepływowa i sortowanie komórek są wykonywane po wprowadzeniu komórek do zwierząt w ramach obserwacji opisanej w kroku 4.4.2. Dane z cytometrii przepływowej wykorzystuje się bezpośrednio po przeszczepieniu w celu określenia składu fenotypowo zdefiniowanych podzbiorów komórek macierzystych i progenitorowych w produkcie infuzyjnym (kroki 5.1 i 5.3), natomiast analizę testów CFC przeprowadza się 12-14 dni po infuzji w celu określenia skuteczności modyfikacji genów metodą PCR kolonii (krok 5.4).

  1. Wykonać cytometrię przepływową i sortowanie CFC produktu infuzyjnego.
    1. Analizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej i sortować i oczyszczać podzbiory CD34 do testów CFC, jak opisano w sekcji 2. Testy nasienne CFC z makietowanych i transdukowanych komórek CD34 (produkt infuzji po impulsie PGE2).
    2. Sortuj maksymalnie 800 komórek na warunek i oznaczaj CFC wirowo, płytkowo, kulturowo i zliczając, zgodnie z opisem w kroku 2.4. Po zliczeniu wybierz kolonie z testów CFC, aby przeprowadzić PCR kolonii zgodnie z opisem w kroku 5.4.
  2. Kultura płynna
    1. Komórki płytkowe do hodowli płynnej w pożywce HSPC w formacie 1 x 106/ml na płytkach niepoddanych działaniu TC. W 2, 5 i 12 dniu po transdukcji zbierz i policz komórki do cytometrii przepływowej. Sortowanie komórek do testów CFC nie jest wymagane.
    2. W dniach 2 i 5 ponownie podawaj 33% komórek w świeżej pożywce HSPC w proporcjach 1 x 106 / ml. Zamroź 33% komórek w buforze do ekstrakcji DNA w celu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Do cytometrii przepływowej należy użyć 33% komórek, jak opisano w krokach 2.1 i 2.2.
    3. Wykorzystaj te dane z kroku 5.2.2 do analizy składu fenotypowego hematopoetycznego potomstwa. Określ częstość występowania komórek CD34 + i fenotypowo zdefiniowanych podzbiorów, jak opisano w kroku 2.2.2 w każdej próbce. Porównaj skład komórek CD34+ w różnych warunkach, aby określić wpływ modyfikacji genów.
      nuta: Komórki CD34+ powinny zachowywać swoją ekspresję w całej hodowli i zawierać wszystkie podzbiory fenotypowe. Utrata komórek CD90 + CD45RA- lub nadreprezentacja podzbiorów fenotypowych może wskazywać na pośrednie lub bezpośrednie skutki modyfikacji genów.
  3. Określić ilościowo ekspresję transgenu (np. białka zielonej fluorescencji [GFP]) za pomocą cytometrii przepływowej (opcjonalnie i w zależności od konfiguracji doświadczalnej), dostosowując protokół z kroku 2.2.
    1. Dodaj trzy wykresy przepływu pokazujące SSC/transgen (np. SSC/GFP). Bramkuj pierwszy wykres na HSC, drugi na MPP-EMP, a trzeci na LMP. Wykreśl każdy w stosunku do transgenu (np. GFP) i utwórz bramki o nazwach odpowiednio HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+ i LMP-GFP+.
    2. Po zakończeniu hierarchia populacji musi zawierać dziewięć hierarchicznie zorganizowanych wpisów w następującej kolejności: 1) Wszystkie zdarzenia; 2) Rozproszenie; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      nuta: Jakakolwiek ekspresja transgenu później w hodowli płynnej (np. w 5. i 12. dniu) będzie lepiej odzwierciedlać skuteczność modyfikacji genów określoną przez PCR kolonii w kroku 5.4. Wcześniejsze punkty czasowe w hodowli płynnej mogą zawyżać ekspresję transgenu z powodu niezintegrowanych LV. Podobnie, sortowanie przepływowe komórek GFP+ do testów CFC w dniu 1 spowoduje powstanie wielu fałszywie dodatnich kolonii.
  4. Wykonaj PCR kolonii.
    1. Po zliczeniu w krokach 2.4.4 i 5.1.1 pobrać pojedyncze kolonie do 50 μl buforu do ekstrakcji DNA, używając pipety o pojemności 10 μl lub 20 μl, a następnie pipetować w górę i w dół, aby przenieść kolonie do jednej probówki z 8-probówkową nakrętką paskową do PCR. Wybierz osiem kolonii z warunku makiety i 88 kolonii z warunku transdukowanego, aby wygenerować jedną pełną 96-dołkową płytkę. Dodać 50 μl buforu do ekstrakcji DNA do każdej studzienki.
    2. Ekstrahować DNA z kolonii za pomocą termocyklera i następującego programu: 65 °C/20 min, 99 °C/10 min i 4 °C. Zaplanuj jak najszybsze przegrzanie DNA do -20 °C, aby uzyskać optymalną jakość.
    3. Wykonaj colony PCR w celu ilościowego określenia komórek transdukowanych LV, porównując liczbę kolonii LV+, przy użyciu starterów Lenti F / R, z całkowitymi koloniami, używając Actin F / R i starterów kontrolnych (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół ma na celu izolację i modyfikację genów NHP CD34+ HSPC, które następnie mogą być wprowadzone z powrotem do autologicznego gospodarza (Rysunek 1 i Rysunek 2). Postępując zgodnie z tym protokołem, zwykle uzyskujemy do 8 x 109 całkowitych WBC z zagruntowanego BM z makaków warkoczowych, a czasami dwukrotnie więcej z makaków rezusów. W obu gatunkach liczba HSPC CD34+, które wzb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria wektorów niskiego napięcia jest najlepiej scharakteryzowaną metodą modyfikacji genów typów komórek, takich jak HSPC CD34+, w celu późniejszego przeszczepu in vivo. Opisany tutaj protokół ma na celu maksymalizację liczby zmodyfikowanych genowo HSPC, które utrzymują się przez długi czas in vivo i zapewniają korzyści kliniczne pacjentom z różnymi chorobami złośliwymi, zakaźnymi i genetycznymi. Chociaż strategie edycji genów pojawiły się w ciągu ostatniej dekady, komórki zmodyfikowane LV są najlepiej ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Helen Crawford za przygotowanie tego rękopisu, Jimowi Woolace'owi za projekt graficzny oraz Veronice Nelson i Devikha Chandrasekaran za udział w tworzeniu protokołu. Opracowanie tego protokołu było wspierane przez granty z NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI135953 i AI138329 do H.P.K.) oraz National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 i U19 HL129902 do H.P.K.), a także NIH P51 OD010425 oraz, częściowo za pośrednictwem NIH/NCI Cancer Center, Dotacja P30 CA015704. H.P.K. jest badaczem medycyny molekularnej Markey i otrzymał wsparcie jako pierwszy laureat Katedry Badań nad Rakiem im. José Carrerasa/E. Donnalla Thomasa oraz Katedry Terapii Komórkowej i Genowej im. Freda Hutcha.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stemspam SFEM II ("HSPC") MediaStemCell09655
Zbilansowany roztwór soli HankaGibco14175095
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco14190-144
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122
Sulfotlenek dimetyluSigma AldrichD2650-100
100% etanolDecon labsM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ Retronektyna (2,5 ml, 1 &mikro; g/&mikro; L)TaKaRAT100B
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Szczurze anty-mysie kulki magnetyczneIgM Miltenyi Biotec130-047-301
Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)Peprotech300-07
Rekombinowana ludzka trombopoetyna (TPO)Peprotech300-18
Rekombinowana ludzka kinaza tyrozynowa podobna do FMS 3 (FLT-3)Peprotech300-19
Siarczan protaminySigmaP-4505
14 ml polipropylenowa rurka z okrągłym dnemCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
Separatory QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Kolumny MACS L25Miltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Kolby
T-75 poddane działaniu TCBioexpressT-3001-2
T-75 bez TCThermo-Fisher13680-57
Strzykawki 20 mlBD Biosciences302830
Igły 16,5 GBD Precyzyjna
BD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
8-probówkowe probówki do PCR z nasadką paskowąUSA scientific1402-2708
96-dołkowy termocyklerThermo-Fisher4375786
Filtry wstępnej separacjiMiltenyi Biotec130-041-407
sitko, komórka; BD Sokół; Sterylny; Siatka nylonowa; Rozmiar oczek: 70um; Kolor: biały; 50/CSfisher scientific352350
Defeoraliki UltracompeBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
mL Strzykawki Luer-LockThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm naczynie do hodowli komórkowychCorning430165
60 mm x 15 mm naczynie do hodowli komórkowychCorning
Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm x 25 mmCorning430599
Kolby niepoddane działaniu TCFalcon353133
Ekstrakcja DNA QiagenQiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Klon: 5E10Biolegend328110
PE-CF594 Mysz Anti-Human CD34 Klon: 563BD horyzont562449
Mysz APC-H7 Klon CD45RA anty-ludzki: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Mysz anty-NHP CD45 Klon: d058-1283BD Biosciences561291
Surowica autologicznapobrana od autologicznego gospodarza i kriokonserwowana przed mobilizacją i pobraniem CD34+ HSPCNie dotyczyBroda, B. C. i wsp. Wydajna i stabilna selekcja długoterminowych komórek macierzystych z udziałem naczelnych za pośrednictwem MGMT. Dziennik badań klinicznych. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Pożywki kondycjonowane wirusem (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, BC i wsp. Efektywna i stabilna selekcja długoterminowych komórek macierzystych zasiedlających za pośrednictwem MGMT u naczelnych innych niż ludzie. Dziennik badań klinicznych. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Przeciwciało anty-CD34, klon 12,8Kiem LabN/ABeard, BC i wsp. Wydajna i stabilna selekcja długoterminowych komórek macierzystych zasiedlających za pośrednictwem MGMT u naczelnych innych niż ludzie. Dziennik badań klinicznych. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Starter Lenti F: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAZintegrowane technologie DNAN/APeterson, CW i wsp. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).
Starter Lenti R: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAZintegrowane technologie DNAN/APeterson, CW i in. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).
Starter aktyny F: TCCTGTGGCACTCACGAAACTZintegrowane technologie DNANie dotyczyPeterson, CW i wsp. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).
Starter Actin R: GAAGCATTTGCGGTGGACGATZintegrowane technologie DNAN/APeterson, CW i wsp. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).
Termostrzykawki nasadka do strzykawki 305198 3 430196

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753(2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389(2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007(2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173(2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34(2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hematopoetyczne kom rki macierzystekom rki CD34 dodatniemodele naczelnych nieb d cych lud milentiwirusowa modyfikacja gen wanaliza cytometrycznatesty kolonogenneoczyszczanie szpiku kostnegoprotoko y sortowania kom rekmetody terapii genowejtechniki hodowli HSPC

Powiązane artykuły